第一篇：消化實驗方法總結

《豆粕粉碎粒度與蛋白質體外消化率的關系研究》

采用胃蛋白酶-胰酶兩步法，通過體外模擬雞體消化道內環境來比較不同粉碎力度豆粕的蛋白消化率，從而確定適合肉仔雞生長的較適宜豆粕粉碎力度。

平均粒徑采用GB 6971-86 方法，體外試驗采用Boisen和Fernandez等體外模擬消化方法。胃蛋白酶最適濃度的選擇

1g豆皮→100ml三角瓶+25ml磷酸緩沖液（pH=6.0 0.01M）+10ml鹽酸（0.2M）→溫和攪拌+1ml(15mg/ml,30mg/ml,45mg/ml,60mg/ml,75mg/ml,90mg/ml)的新鮮胃蛋白酶溶液（由0.01M HCl 配制），pH=2.0 +0.5ml抑菌劑（青霉素+鏈霉素）→39℃恒溫水浴中震蕩6h,消化后+20%黃基水楊酸5ml→室溫靜置30min→抽濾→干燥后殘渣凱式定氮法測蛋白質含量→計算蛋白質和干物質消化率。確定最適胃蛋白酶濃度為75mg/ml.胰酶最適濃度選擇

在最適（75mg/m）胃蛋白酶液消化后的產物中加入10ml磷酸緩沖液（0.2M pH=6.8）+5mlNaoH(0.6M)+1ml(70mg/ml,90mg/ml,110mg/ml,130mg/ml,150mg/ml)的胰酶溶液（由磷酸二氫鉀緩沖液配制）pH=6.8→39℃恒溫水浴中震蕩18h→消化后+20%磺基水楊酸5ml→室溫靜置30min→抽濾，干燥后殘渣按照凱式定氮法測其蛋白質含量，計算粗蛋白和干物質消化率，確定最適胰酶濃度為110mg/ml。胃蛋白酶一胰酶兩步法測定過程[1]

分別稱取原樣和過篩豆粕于三角瓶中，4個重復，使用最適濃度測定不同粒度豆粕蛋白和干物質含量，并通過氨基酸自動分析儀測其氨基酸含量，計算粗蛋白、干物質和氨基酸消化率。《燕麥粉添加量對面包營養組分含量和淀粉體外消化性的影響》 淀粉體外水解動力學測定

1g樣品+50ml磷酸緩沖液（pH=6.9）→37℃水浴消化5min→取0.2ml消化上清液→1min后加入1mlα-淀粉酶溶液（40mg/ml 用DNS溶液配制）→37℃水浴繼續消化→每隔15min分別取消化液0.2ml于25ml試管中+0.8ml蒸餾水+1mlDNS→沸水浴中煮沸10min→取出后+15ml蒸餾水，搖勻→空白管調零，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖的含量。采用0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.50 mg/m L的葡萄糖溶液繪制標準曲表2，根據還原糖釋放量的變化比較淀粉的體外消化性。《苦蕎芽粉饅頭品質及體外模擬消化研究》 甲醇提取液的制備

參照Bojana(2011)提取樣品的方法并稍作修改。準確稱取5g待提取的苦蕎饅頭樣品浸沒于50ml甲醇/水（80/20，v/v）溶液中，用均質機攪拌使樣品破碎均質。樣品液超聲波提取15min，將懸浮液轉移至離心管中。原樣品再加入50ml甲醇/水（80/20，v/v），重復一次，合并提取液。2500r/min離心，取上清液于45℃水浴下蒸發至干，用甲醇重新溶解并定容到100ml，備用。酚含量測定

采用Folin–Ciocalteu法（FILIPCEV 2011）測定試樣的總酚含量，并稍作修改。取500μL蒸餾水，加入125μL的標準溶液或提取液后，再加入125Μl Folin–Ciocalteu試劑，充分混勻后加入1.25ml 7%碳酸鈉溶液，漩渦混勻后避光放置90min后于760nm處測定混合液的吸光值。以沒食子含量為縱坐標（μg/ml），吸光度為橫坐標，得回歸方程為y=0.014X+0.041（R2=0.995）。按照測定沒食子酸標準液吸光度的步驟測定待測液吸光度。黃酮含量測定

采用NaNo2-Al(NO)3方法測定。取一定濃度的樣品水溶液0.1ml與0.2ml 5%NaNO2溶液，漩渦混勻后室溫下放置6min，加入0.2ml 10%的ALCL3，振蕩后靜止6min，然后加入2ml 1M NaOH溶液，最后加水定容至5ml，放置15min后于波長510nm處測定混合液吸光值。以蘆丁含量為縱坐標（μg/ml），吸光度為橫坐標得回歸方程為y=0.007x+0.030（R2=0.991）。按照測定蘆丁標準液吸光度的步驟測定待測液吸光度。體外模擬消化過程

體外模擬消化過程參考Gawlik等人的方法，略作修改。

模擬唾液：2.38gNa2HPO4，0.19gKH2PO4，8gNacl和0.91gα-淀粉酶（220U/ml）溶于1升水中形成模擬唾液，用磷酸鹽緩沖液調節溶液為pH=6.75。

模擬胃液：0.32%胃蛋白酶溶于0.3mol/L的Nacl，用HCL調節溶液pH=1.2。模擬腸液：0.05g胰蛋白酶和0.3g膽汁溶于35ml的NaHCO3（0.1mol/l）。

體外提取過程（S0）：準確稱取6.0g蕎麥饅頭樣品浸沒于100ml甲醇水（80/20，v/v）溶液中，靜置6h，懸浮液轉移至離心管中，2500r/min離心10min，取上清液于45℃水浴下旋轉蒸發至干，用甲醇重新溶解并定容到10ml，-20℃保存，備用。

口腔消化過程（S1）：準確稱取6g樣品置于100ml的燒杯中并加入30ml模擬唾液，用均質機攪拌使樣品充分破碎均質后放入水浴搖床中，37℃振蕩10min。

胃腸消化過程（S2）：取出水浴搖床中的樣品，用3mol/l的鹽酸調節溶液體系至pH=1.5后加入30ml模擬胃液，置于40℃水浴搖床中振搖60min。反應結束后取5ml的樣液，于70℃的水浴鍋中加熱滅酶，經過模擬胃部消化的消化液用0.1mol/l的NaHCO3調節使溶液體系的pH=6，加入30ml膽汁胰酶的復合液，再分別加入5ml 1mol/l的Nacl和1mol/l KCl，置于37℃水浴震蕩120min模擬腸道消化，于70℃的水浴鍋中加熱滅酶，-20℃保存備用。每個樣品重復三次。

腸道吸收過程（S3）：將20ml剩余消化液轉移到透析袋中，并將透析袋置于裝有50ml PBS緩沖液的燒杯中，37℃水浴震蕩4h。將PBS緩沖液轉移到離心管中，-20℃保存備用，每個樣品重復三次。

《羊奶嬰兒配方奶粉中蛋白質體外模擬消化研究》 外模擬胃消化

體外模擬胃消化參照Johns[8]的方法并對其加以改進。將奶粉樣品用蒸餾水配制成蛋白質質量分數為1%的乳液，于37℃水浴中預熱10min，用1mol/L的HCl調乳液p H3。在每100m L乳樣中添加3×106U胃蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為3×106U)，于

37℃恒溫搖床上消化水解1.5h，然后用lmol/L的Na OH調節乳液p H值至7滅酶，測定其中蛋白質的胃消化率。體外模擬腸消化

體外模擬腸消化參照Johns[8]的方法并對其加以改進。將奶粉樣品用蒸餾水配制成蛋白質質量分數為1%的乳液，于37℃水浴中預熱10min，用1mol/L的Na OH調乳液p H7。在每100m L乳樣中添加1.25×105U胰蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為1.25×105U)，于37℃恒溫搖床上消化水解2h，然后沸水浴5min滅活，測定其中蛋白質的腸消化率。體外模擬總消化

體外模擬總消化參照Johns[8]的方法并對其加以改進。將奶粉樣品用蒸餾水配制成蛋白質質量分數為1%的乳液，于37℃水浴中預熱10min，用1mol/L的HCl調乳液p H3。在每100m L乳樣中添加3×106U胃蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為3×106U)，于37℃恒溫搖床上消化水解1.5h，然后用lmol/L的Na OH調節乳液p H值至7。再向每100m L乳樣中添加1.25×105U胰蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為1.25×105U)，于37℃恒溫搖床上消化水解2h，然后沸水浴5min滅活，測定其中蛋白質的總消化率。燕麥全粉中蛋白質體外消化的測定

燕麥蛋白質的體外消化實驗采用Wang[15]報道的體外消化模型進行,略有改動。具體操作如下:準確稱取一定質量的樣品分散于0.1 mol/L HCl中形成50 g/L的溶液,置于37℃水浴中預熱5 min,以酶∶底物為1∶ 100加入胃蛋白酶,在37℃恒溫振蕩器上反應,分別在不同的消化時間(0、10、30、60、120 min)取樣,用1 mol/L的NaOH調節pH7.0終止消化反應,120min所得的消化液調節pH7.0后,以酶∶底物為1∶ 100加入胰蛋白酶,在消化10、30、60、90、120min之后取樣分析。

第二篇：消化總結

消化內科護理百日安全無差錯活動總結

根據護理部開展“以病人為中心，消除隱患，保障安全，避免和減少護理差錯”為主題的“護理百日安全無差錯”活動實施方案的要求，4月21號至7月31號止，科室根據護理部召開全體護士長及差錯管理委員會會議有關通知要求，認真進行了行動部署工作： 全體護理人員統一思想，提高認知，明確目標，積極參與

3月24日護士長及差錯委員會參加了護理百日安全無差錯會議，認真聽取了護理部的方案后，次晨會即傳達并組織學習該會議內容，同時貫徹落實。使每個人都能理解本次活動的重要意義，明白人人都是參與者，人人都是責任人的重要性。結合實際，落實安全無差錯

4月21至7月31日期間，我科護理人員共發生護理缺陷25 例，4月26號發生不可避免的不良事件1例，4月29日發生由于護理人員之間未及時做好溝通而至的加用藥錯誤1例，6月24日發生1例院內壓瘡事件。在此期間做到差錯，不良事件不隱瞞，及時匯報護理部及科主任，次晨會進行分析討論，由當事人對差錯，不良事件進行過程描述，人人發言，深刻剖析，總結經驗，吸取教訓。

在實施期間，針對特殊患者，特殊護理人員，特殊時間段等，護士長及質控小組成員加強督查，同時落實了年初制定的每位護理人員均參與科室護理質量自查工作，力爭將缺陷和差錯杜絕在萌芽狀態。在此期間每位護理人員相互協作，相互幫助，相互提醒，相互監督，下班前進行反思三分鐘，討論回顧當日工作中是否存在有

漏缺項，強化護理人員責任意識，安全意識，落實護理工作中查對制度，提高護理人員整體素質，杜絕差錯事故的發生。

2013年同期月2014年同期對比：

2013年4月21至7月31 2014年4月21至7月31 ***0差錯不良事件缺陷502015102013年4月21至7月312014年4月21至7月31差錯 1

不良事件 2

缺陷

25

3025

第三篇：高中生物實驗方法總結

1．顯微觀察法：如“觀察細胞有絲分裂”“觀察葉綠體和細胞質流動”“用顯微鏡觀察多種多樣的細胞”等。

2．觀色法：如“生物組織中還原糖、脂肪和蛋白質的鑒定”“觀察動物毛色和植物花色的遺傳”“DNA和RNA的分布”等。

3．同位素標記法（元素示蹤法）：如“噬菌體浸染細菌的實驗”“恩格爾曼實驗”等。

4．補充法：如用飼喂法研究甲狀腺激素，用注射法研究動物胰島素和生長激素，用移植法研究性激素等。

5．摘除法：如用“閹割法、摘除法研究性激素、甲狀腺激素或生長激素的作用”“雌蕊受粉后除去正在發育著的種子”等。

6．雜交法：如植物的雜交、測交實驗等。

7．化學分析法：如“番茄對Ca和Si的選擇吸收”“葉綠體中色素的提取和分離”等。

8．理論分析法：如“大、小兩種草履蟲的競爭實驗”“植物向性動物的研究”等。

9．模擬實驗法：如“滲透作用的實驗裝置”“分離定律的模擬實驗”等。

10．引流法：臨時裝片中液體的更換，用吸水紙在一側吸引，于另一側滴加換進的液體。

11．實驗條件的控制方法

⑴增加水中O2：泵入空氣或吹氣或放入綠色植物；

⑵減少水中O2：容器密封或油膜覆蓋或用涼開水；

⑶除去容器中CO2：NaOH溶液、Na2CO3溶液；

⑷除去葉中原有淀粉：置于黑暗環境（饑餓）；

⑸除去葉中葉綠素：酒精水浴加熱（酒精脫色）；

⑹除去植物光合作用對呼吸作用的干擾：給植株遮光；

⑺單色光的獲得：棱鏡色散或透明薄膜濾光；

⑻血液抗疑：加入檸檬酸鈉（去掉血液中的Ca2+）；

⑼線粒體提取：細胞勻漿離心；

⑽骨無機鹽的除去：HCl溶液；

⑾消除葉片中脫落酸的影響：去除成熟的葉片；

⑿消除植株本身的生長素：去掉生長旺盛的器官或組織（芽、生長點）；

⒀補充植物激素的方法：涂抹、噴灑、用含植物激素的羊毛脂膏或瓊脂作載體；

⒁補充動物激素的方法：口服（飼喂）、注射；

⒂阻斷植物激素傳遞：插云母片法。

12．實驗結果的顯示方法——實驗現象的觀測指標

⑴光合作用：O2釋放量或CO2吸收量或有機物生成量。例：水生植物可依氣泡的產生量或產生速率；離體葉片若事先沉入水底可依單位時間內上浮的葉片數目；植物體上的葉片可依指示劑（如碘液）處理后葉片顏色深淺。

⑵呼吸作用：O2吸收量或CO2釋放量或有機物消耗量

⑶原子或分子轉移途徑：同位素標記法或元素示蹤法

⑷細胞液濃度大小或植物細胞活性：質壁分離與復原

⑸溶液濃度的大小：U型管+半透膜

⑹甲狀腺激素作用：動物耗氧量、發育速度等

⑺生長激素作用：生長速度(體重、體長變化)

⑻胰島素作用：動物活動狀態（是否出現低血糖癥狀——昏迷）

⑼胰高血糖素作用：尿糖的檢測（在尿液中加班氏試劑進行沸水浴，看是否出現磚紅色沉淀）

⑽菌量的多少：菌落數、亞甲基藍褪色程度

⑾生長素作用及濃度高低的顯示：可通過去除胚芽鞘后補充生長素后的胚芽生長情況來判斷（彎曲、高度）

⑿淀粉：碘液（變藍色）

⒀還原性糖：斐林試劑/班氏試劑（沸水浴后生成磚紅色沉淀）

⒁CO2：Ca(OH)2溶液（澄清石灰水變渾濁)

⒂乳酸：pH試紙

⒃O2：余燼復燃

⒄蛋白質：雙縮脲試劑（紫色）

⒅脂肪：蘇丹Ⅲ染液(橘黃色）；蘇丹Ⅳ染液(紅色）

⒆DNA：二苯胺（沸水浴，藍色）、甲基綠（染色后，呈綠色）

⒇RNA：吡羅紅（呈紅色）、苔黑酚乙醇溶液

第四篇：RT-PCR實驗方法總結

RT-PCR實驗方法總結大全

RT-PCR實驗有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：

1.做RT前必需測RNA濃度，逆轉錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。

2.RT按要求做，一般不會出太大問題。

3.PCR，按常規。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。

1）RT和PCR時的引物設計是不是一定要先知道目的基因的序列？必須

在RT時，引物設計有3種方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特異的下游引物。如果用a和b方法，是擴增的所有的cDNA（理論上），還要用此產物做PCR 的模板繼續擴增。

如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？http://www.ncbi.nlm.nih.gov問題：

在做RT-PCR遇到一怪現象，即對同一動物不同組織擴增同一段基因，結果從一種組織中可以擴出我的目的基因，條帶非常的好，而另一組織在同樣的條件下卻得到許多非特異性的條帶，嘗試其他條件同樣無法得到滿意的結果，百思不得其解！（注：已肯定該基因在兩種組織中都表達，且內參照在兩種組織都可擴增出來）

從這兩種組織中提取的RNA的量是不一樣的，我測過吸光度，差異還很大，會不會和這有關呢？ 請高手指教！解答：

1.RT-PCR有兩種做法：

條件具備的話可用kit進行一步法進行；若條件不太好的話可分兩步進行逆轉錄再PCR。但后來發現兩步法的結果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現象，我推測是體系更加單一比較利于PCR的進行，當然也可能是我買的kit不太好。（promega）。

2.RT-PCR應具備的條件

高質量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好產物短點）；若涉及粗略定量的話還應考慮RNA的濃度或是cDNA的濃度（如果由內標分子更好，但我發現其實很不容易將RNA的濃度以及內標分子的表達量調整的完全一樣）；體系的均一性等。3.RACE 我做過RACE（3’RACE是寶生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但現在再進行另一個同源基因的3‘RACE時卻怎么也P不出來，這兩個基因是由同一對引物擴增出來的，其中一個已經獲得了全序列（RACE的方法），而另一個基因的3’UTR卻增么也擴不出來，我推測是不是該基因的3‘UTR太長的緣故，我都快綠了，有無

RT-PCR的常用內標b－actin 和GAPDH的使用有選擇性嗎？比如不同的細胞，不同的刺激。有關內參：

RT-PCR內參照可以在一個管子里做（那樣也是圖好看一些），最好分開兩管，把除了引物之外的mixture統一配，拍照后，算目的基因和內參的比值，這就是基因表達的相對濃度。

問：我曾經作過同一管的PCR，內有actin 和目的基因引物。雖然可見到兩條均一條帶但圖片質量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。請教mxbdna2003，你是如何處理同一管的PCR的各成分的濃度？ 答： it should determined the amount of RNA.but it not for the quantitity of the PCR.it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR)and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much.but the amount just using “accurate piptte” is wrong.it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.在同一管中做RT，其實沒有什么問題，不需要taq魅加量，taq酶本來就是過量的^-^，（平時做pcr的時候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八兩就可以了，我想這肯定再很多貼子里應該都談到了。Mg就跟不能變了，一變整個體系就變了。能看到均一條帶就很好了。

關鍵是摸，十八摸（太少，只爭朝夕，開個玩笑）雖然用不著，但是摸上3、5摸總是必要的，首先遙分開摸，然后再一起摸，直到摸的好了，還要考慮比較的不同的模板中的量，所以我們不建議再同一管中進行，因為還有互相競爭抑制的問題，即使不同基因之間。

有關內參的建議：

一定要做內參的，每一次，我想。不作內參的結果是不可信的

電泳可以不一起跑，沒有關系，計算的是相對表達程度，著我在好幾封帖子里都談了，再說一邊我得觀點，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對表達量，不是絕對表達量，除非你能準確知道來自多少細胞，但是細胞還有死的呢。

2、以電泳為基礎的半定量RT-PCR本身是不可信的，作為實驗的粗篩是可以的，但不能作為最終結果的，3、半定量RT-PCR應該再兩管中進行，除非內參基因和目的基因表達相同，長度差不多，GC含量相似，或者實在窮的要省PCR管和taq。關于平臺期和線性期的問題，實際上線性期是指數期，只不過碰巧2的冥和2的倍數是相同的。看上去任何一個時期都可以，實際上是不對的，因為牽涉到酶促動力學的問題，這個我也不懂，有一些專門的文章，好像，涉及到很多化學的東西。我們學醫的，也沒必要知道那些，但是其中主要是因為模板引物酶原料和buffer之間的關系，這種反應單靠改變其中一種成分沒有用的，酶一直是過量，再加酶也沒用，引物ntp都是這樣。煙鬼正傳，最好選線性期的開始階段，但是要在你的凝膠成像分辨范圍內，所以選一個這兩種的契合點。給你一張圖你就明白了，再開始的時候酸的是切線，這 圖我在 *** 帖過。關于引物設計，再可能的情況下，除了常規要求之外，最好兼顧跨內含子（不過，根據要求，還可以專門設計隔內含子的，這樣還可以用于基因組PCR）、長度小于500bp－600bp等等。

引物當然要設計成一樣的退火溫度，即使不再一管中，也要一樣的，要在一臺機器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一個溫度，這樣任何幾個都可以拿來披，也不用查。

我反復說過了，別用軟件，就用眼睛看，軟件涉及的在好，有些基因在它出軟件的時候，還沒發現呢，跟不要說在基因組的位置和序列了，怎么考慮內含子的問題呢？

18s的引物也和著名的βactin一樣是設計的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用總RNA為模板，但是比actin和bubulin等可準多了，更不要說GAPDH這個破爛了。18s除了在細胞中更相同（量）外，主要是它占的比例遠遠高于看家基因，所以定量更加準確，我想，不知對不對，請幾位主任和eeflying指教。我認為，就像你用某一種東西的數量去概括，因該選那種多的東西，說一座房子是由2000塊磚造成的，比說又29根梁更準確吧。更不要說沒有看家基因不看家的缺點，因為他是服務于整個基因組表達譜什么的。PE有專門的用于實時PCR的內參試劑盒，就是用18s，不過我們看懂使用的那條序列，不知有沒有人用過，告知其序列和genbank號。

正好問一下，我查了一些序列，一直沒有去合成，主要是因為手上的actin的熒光探針還沒有完，當初和成了一堆。

有那位高手用過18s的內參，請問您的序列（我指的是模板的序列）？

原位雜交最好用RNA做探針，效果好一些，反正你有錢賣roche的盒子，而且量也能保證，因為轉錄過程嘛，沿著一條線突突地跑就是了。正義反義也容易理清。

我覺得做RT-PCR的方法和條件及應注意的事項就是那么幾條,許多專業書都有詳細的描述,但是許多人還是歷經多次磨難，有時就是得不出結果。因此，我認為因為每個人所要克隆的片斷不同，引物不同等，因此對不同的人來說還是有他自己的特殊性,我的以下經歷說明：做實驗時各人的情況不同,做不出時還是要好好動一下腦子。

記得我開始我的ＲＴ－PCR時，按常規方法，提取總ＲＮＡ后，首先用自己設計的下游引物進行逆轉錄，不斷改變反應條件，進行了Ｎ次均沒有結果。后來考慮到本人的克隆的PCR的片斷位于我們實驗另一位同學克隆的片斷當中，而該同學已經用RT-PCR克隆出她的片斷（盡管她用這些ＲＴ－ＰＣＲ產物做模版再進行ＰＣＲ時也沒辦法重復出她的產物），因此，我先用她的引物和條件擴增出她的片斷，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ產物作模板（有點改進，逆轉錄反應換用了９mers隨機引物），用我的引進物進行一般PCR，終于得到我的產物，測序結果完全正確。盡管我的這個經歷別人很人遇到，但足可以說明實驗可以有自己的模式，書本的知識和別人的經驗很重要，但有時也不定要受到書本框框和別人經驗的限制

請問： 引物的特異退火溫度怎樣設定？可以根據gc 和at含量算出嗎？可以用引物報告單上的Tm值嗎？ PCR時20微升體系中cDNA應加多少比較合適？MgCl2應加多少？各個成分的量有無確定標準？ 3 PCR結果跑電泳，actin有，但跑不出目的條帶，有幾種原因？與cDNA的量少有關嗎？Mg離子太多是否會抑制Taqase的活性？

一般來說引物報告單傷得是對的,也可以自己算,實際上重要的各條引物一致,剩下的可以摸的.20中是指體積還是量?只要不明顯改變體系的離子強度,加1,2ul都可以的.mg要調的,但我總覺得沒有書里講的那么玄乎,我都是常年不變的.如果內參照有,目的沒有,至少證明不是“美麗惹”的禍.原因書里應該都說了.在所有RNA實驗中，最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩定，一般反應不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內源性的RNA酶。

一、防止RNA酶污染的措施

1.所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。2.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。

3.有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。4.配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經0.22μm濾膜過濾除菌。

5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。6.設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。

二、常用的RNA酶抑制劑

1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。

2.異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。

3.氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。

4.RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。

5.其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。mRNA的分離與純化

真核細胞的mRNA分子最顯著的結構特征是具有5’端帽子結構（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數哺乳類動物細胞mRNA的3’端存在20-30個腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結構為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在于此。

mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA

一、試劑準備

1．3M醋酸鈉（pH 5.2）2．0.1M NaOH 3．1×上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經高壓消毒后按各成分確切含量，經混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。

4．洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS 5．無水乙醇、70%乙醇 6．DEPC

二、操作步驟

1．將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。2．用DEPC處理的1ml注射器或適當的吸管，將寡聚（dT）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。

3．使用1×上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。

4．將RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當RNA上樣液全部進入柱床后，再用1×上樣緩沖液洗柱，繼續收集流出液。

5．將所有流出液于65℃加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。6．用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內含物為無Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。7．用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly(A+)RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。

8．OD260測定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min。9．4℃離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。[注意：此時Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾干。

10.用適量的DEPC H2O溶解RNA。

三、注意事項

1．整個實驗過程必須防止Rnase的污染。2．步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級結構，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結合，否則會導致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。

3．十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會阻礙柱內液體流動，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。

4．寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯存，反復使用。每次使用前應該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。

5．一般而言，107哺乳動物培養細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，約相當于上柱總RNA量的1%-2%。

RNA酶保護試驗((RNase Protection Assay,RPA)是通過液相雜交的方式,用反義RNA探針與樣品雜交，以檢測RNA表達的技術。與Northern雜交和RT-PCR比較，RPA有以下幾個優點： 1． 檢測靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進行電泳，故損失小，提高了靈敏度。

2． 由于PCR擴增過程中效率不均一和反應“平臺”問題，基于PCR產物量進行分析所得數據的可靠性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此，分析的數據真實性較高。

3． 由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進行分析。

4． 步驟較少，耗時短。與Northern雜交相比，省去了轉膜和洗膜的過程。5． RNA-RNA雜交體穩定性高，無探針自身復性問題，無須封閉。6． 一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。7． 檢測分子長度可以任意設置，靈活性大。RPA的缺點是需要同位素標記探針。

一、試劑準備

1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。

2.雜交緩沖液 IPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。3.RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4)20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A(10mg/ml)8μl、RNase T1(250U/μl)1μl，加DEPC H2O至2ml

二、操作步驟 1．反義RNA可由含T7或SP6啟動子的重組質粒為模板制備，也可以用含啟動子的PCR產物為模板制備，本文介紹后者。（1）設計含T7啟動子的PCR引物

由于PCR產物將作為合成反義RNA的模板，所以一對引物中的下游引物5’-端要含T7啟動子序列:

T7啟動子序列為：5’-TAATACGACTCACTATAGGG

引物設計的其他要求與一般PCR引物的設計相同。PCR產物的長度決定了反義RNA探針的長度，具體設計時可考慮100-400bp長。最好采用巢式PCR，即先擴增出一較長的片段，再以該片段為模板擴增出較短的片段，以保證探針的特異性，如下圖所示：

上游引物

下游引物Ⅱ T7 啟動子序列

下游引物Ⅰ

（2）PCR

先用上游引物和下游引物Ⅰ進行PCR，再以PCR 產物為模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7進行二次PCR(具體操作參見PCR章節)。

（3）探針合成標記與純化

在0.5ml 離心管中加入下列試劑：

RNasin（40U/μl）0.5μl

GACU POOL GAC

（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM）2μl

[α-32P]UTP(10μCi/μl)2.5μl

DTT(二硫蘇糖醇，0.1M)1μl

5×轉錄 buffer 2μl

模板（50ng/μl）1μl

T7 RNA 聚合酶(15U)1μl

混合后，短暫離心，37OC保溫1hr。

加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。

加入：飽和酚 50μl 氯仿 50μl

酵母tRNA（2μg/μl）4μl

DEPC H2O 100μl

室溫下充分混勻，離心10000g×2min。取上層液置另一0.5 ml離心管中，加入100μl氯仿，混勻，離心10000g×2min。將上層液轉移至另一0.5ml 離心管中，再加入3M NaAc 10μl、預冷無水乙醇250μl，混勻后，-20OC靜置30min。4OC離心13500g×10min。棄上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗滌，4OC離心13500g×2min, 棄上清液。室溫下揮發殘留乙醇。加入50μl雜交緩沖液溶解沉淀，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測探針質量。（參見本節電泳步驟）。

2．雜交

（1）RNA提取后溶解在雜交緩沖液中，濃度為1μg/μl。

（2）取8μl RNA加入1-3μl探針（根據探針檢測結果調整）于0.5ml 離心管中。

（2）80OC保溫2min，然后40-45OC下雜交12-18hr。

3.消化

(1)雜交管于37 OC保溫15min，加入RNase消化液，37 OC保溫30min。

(2)加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混勻，37 OC保溫10min。

(3)加入65μl飽和酚和65μl氯仿，混勻，室溫離心，10000g×2min。

(4)轉移上層液到另一0.5離心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl異丙醇，混勻后，置-20OC 30min，4 OC離心,135000g×10min。

(5)棄上清液，室溫下揮發乙醇，加入5-8μl上樣緩沖液溶解沉淀。

4、電泳與放射自顯影

（1）配制凝膠：(50ml)

40%丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺（19：1）6.25ml

5×TBE 10ml 尿素 24g

加H2O至50ml

溶解后加入25%過硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混勻，注入電泳槽中，插入梳，待膠凝固。

（2）預電泳

以1×TBE為上下槽電泳緩沖液，加上電壓后進行預電泳，如果用測序電泳裝置，電壓應達2000v以上，功率設定為100w，溫度設為50 OC。待膠板溫度達50 OC時，暫停電泳，準備加樣。

（3）加樣

將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80 OC加熱2min，立即加樣到膠孔中，電泳1-2hr。（電泳條件同預電泳）。

（3）電泳結束后，打開膠板，用濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜，放置于暗盒中，暗室紅光下，壓上一張X片，蓋上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光結束后，將X光片顯影、定影、水洗、晾干。

三、注意事項

1．本實驗大部分為RNA操作，注意RNA酶的污染。

2．RNase消化液消化未雜交的單鏈RNA和探針RNA，當探針與樣品之間有堿基錯配時，錯配位點也將被消化，因此會產生片段較小的雜交片段。因此進行PCR時，采取盡量減少錯配的措施。

3、同位素對RNA合成有一定影響，有時會產生非全長的探針。因此，標記時間不宜過長。

4、RNase消化液有時會產生過度消化而無檢測信號，可以將消化液稀釋10-100倍后使用。

可能問題出在標本的保存：一般四小時之內就應處理，分離出細胞

說的是套式PCR,可以在你的第一次PCR兩個引物內,再設計一對引物進行第二次PCR就行了

如果你的第一次PCR剛好包括目的片段,那只好設計個更長的了 第二次的引物設計要求可以低一點 以50μl體系為例 引物各1μl 第一次PCR產物5μl

二次PCR和巢式PCR，即設計兩對引物進行擴增，不是一個概念，它是拿第一次的PCR產物，稀釋100-1000倍做模板，加入底物，從新進行擴增反應，以期增加產物的量

我做RT-PCR時,提總RNA時,都是用滅菌DEPC水,按1:100稀釋后測OD260和OD280,后根據公式:RNA濃度=OD260*稀釋度/25(ug/ul),后用1mg total RNA分離mRNA.做逆轉錄及PCR,效果很好.luoyu10 wrote: 各位大哥：

我有一個問題請教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低為多少，如果太低是不是會影響結果？

最低到1.8，最好2.0，我感覺稍微低一點影響不算太大。

問：我是ＲＴ－ＰＣＲ的新手，想請教引物如何設計？

好的引物所具有的令人滿意的特點：

* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。

* 選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。

* 設計5'端和中間區為G或C的引物。這會增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。

* 避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。

* 避免3'末端富含GC。設計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。* 避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。* 避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩定性。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當計算引物Tm值時并不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。有時候，僅有有限的序列信箱可供用于引物設計。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設計簡并引物。簡并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的堿基使用偏好，減少簡并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用簡并堿基，因為3'端最后3個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因為許多簡并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。

【經驗】如何確認RNA的質量 各位都知道，提取到質量良好的RNA（包括總RNA和mRNA，以下同）是非常困難，關于RNA的提取技術，我就不說了，為什么呢？或許各位非常關心呢，我是這樣想的，我可以看到的資料或者是廠家的說明書，各位也同樣可以看到的，內容當然都是一樣的了，所以實驗做的好不好，主要是心的投入多少的問題，所以希望大家自己多多思考啊！

以下兩種方法，相信大家都知道的： 1）檢測RNA溶液的吸光度 280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。1.82.0時，我們認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的，不過要注意，當你用Tris作為緩沖液檢測吸光度時，R值可能會大于2（一般應該是<2.2的）。當R<1.8時，溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯，你可以根據自己的需要決定這份RNA的命運。當R>2.2時，說明RNA已經水解成單核酸了。

如果RNA的量夠，可在260nm（A260）用分光光度法測定RNA的得率，1個單位等于40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比值為2.0。A260/A230的比值還表明RNA的純度，其值小于2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇殘留，其值大于2.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA。2）RNA的電泳圖譜

一般的，RNA的電泳都是用變性膠進行的，但是根據我的經驗，如果你僅僅是為了檢測RNA的質量是沒有必要進行如此麻煩的實驗的，用普通的瓊脂糖膠就可以了。

電泳的目的是在于檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認為RNA的質量是好的（見下圖）。

以上是我們常用的兩種方法，但是這兩種方法都無法明確的告訴我們RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我們很難察覺，但是大部分后續的酶學反應都是在37度以上并且是長時間進行的。這樣，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后續的實驗中就會有非常適合的環境和時間發揮它們的作用了，當然這時你的實驗也就完了。

下面，我們介紹一個可以確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。3）保溫試驗

方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。

時間到了之后，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當然，它們的條帶也要符合方法2中的條件），則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。

如果你的RNA樣本通過了保溫實驗的檢測并且你在后續的實驗中還是非常小心的防范RNA酶的騷擾，那么你的實驗應該是很難失敗了！

第五篇：實驗總結-細胞培養方法

一、培養細胞常用配置

培養基的配置：基礎培養基500ml+胎牛血清50ml+雙抗5ml 凍存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清 依次比例酌量配置。超凈工作臺常規配置

移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精燈1盞，液器1臺，斜架1臺，酒精噴壺1個，酒精棉球缸1個，污缸1個，常規耗材：培養瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），槍頭（1ml、200μl、10μl），培養皿，6/24/48/96孔板，醫用脫脂棉球，凍存管 所需試劑：培養基，胎牛血清，雙抗，DMSO，胰酶，75%酒精……

實驗前準備：所需的各項高壓后的耗材及污物缸放于超凈工作臺內，用酒精噴壺噴灑實驗臺面，并關閉工作臺打開紫外燈照射30min后開始實驗操作。培養基及胰酶恢復常溫后使用，可37℃水浴5-10min

二、細胞復蘇 步驟：

1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養液（DMEM），恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。超凈臺內準備一支15ml離心管備用。

3.將所需的培養基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺面內，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后需再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4.從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入37℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液融化至黃豆粒大小后迅速取出。

5.將細胞懸液移入15ml離心管，緩慢加入4ml培養液，離心（1000r/min，5min）。6.取出2個培養皿并做好標記（復蘇日期等），提前加入5-10ml培養液；離心結束后用1ml培養液懸液混懸沉淀細胞后分別加入培養皿內。

7.將培養基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。8.將培養瓶放入培養箱內培養

注意事項：

1.取細胞的過程中注意帶好防凍手套。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。

2.凍存液的問題：凍存液的配置已是常識，在這里不作詳述，但二甲基亞砜（DMSO）對細胞不是完全無毒副作用，在常溫下，二甲基亞砜對細胞的毒副作用較大，因此，必須在1-2min內使凍存液完全融化。如果復蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷，二甲基亞砜（DMSO）最好選擇進口產品。

3.離心前須加入少量培養液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高，注意加入少量培養液可稀釋其濃度，以減少對細胞的損傷。

4.離心問題：目前主要有兩種見解。一種是解凍后的細胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養瓶中進行培養，第二天換液。因為離心的目的是兩個，去除 DMSO，去除死細胞，這個是標準流程，但對一般人來說，把握不好離心轉速和時間，轉的不夠活細胞沉底的少，細胞就全被扔掉了，轉過了活細胞會受壓過大，死亡。此外在操作過程中容易污染，所以不推薦。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞砜（DMSO），DMSO對細胞有一定的毒副作用，所以須將離心后的液體前倒凈，且一定倒干凈。

5.凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15m培養液

6.復蘇細胞分裝的問題：復蘇1管細胞一般可分裝到2-3只培養皿中，分裝過多，細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁。

7.加培養基的量放入問題：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度，從如果你加培養基的太少，那么DMSO的濃度就會比較大，就會影響細胞生長，從以前的資料來看，DMSO的濃度在小于0.5%的時候對一般細胞沒有什么影響，還有一個說法是1％。所以如果你的凍存液的濃度是 10％DMSO的話那么加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度

8.原理：在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。

三、培養液的更換

1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養液（DMEM），恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。

3.將所需的培養基確保瓶身干凈后酒精消毒放于工作臺面內，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋。4.將培養皿蓋內口朝上放在架子上，將培養皿內的培養液懸空倒進污缸 5．拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養基瓶內吸取5-10ml培養基再懸空移入培養皿內，將培養皿蓋在酒精燈上消毒2-3次后蓋上。6.將培養基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。7.將培養瓶放入培養箱內培養

每天定時觀察細胞生長情況，一般72-96h后，細胞生長密度大于90%，即可進行細胞的傳代。

四、細胞傳代

1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養液，胰酶，恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。

3.將所需的培養基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺面內，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。

4.將培養皿蓋內口朝上放在架子上，將培養皿內的培養液懸空倒進污缸。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1-2ml胰酶液，懸空沿皿壁加入培養皿內。

5.將培養皿來回傾倒使胰酶浸沒整個皿底的細胞層，計時越1-3min（消化時間根據細胞不同時間不同），對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個細胞脫落，鏡下觀察到細胞都變圓時為胰酶消化的最適時機。（若看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落，或鏡下細胞多有菱角則需繼續消化）。用移液器將胰酶吸凈。

6.吸取1ml培養基于培養皿內，并用移液器吸取少量的培養基輕柔的反復沖洗培養瓶壁5-8次，使貼壁細胞完全脫落于培養基內再輕輕吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀態。

7.取1或2個新的培養皿，然后將細胞培養基均勻的分到2或3個培養瓶內（注意原來傳代時使用的培養瓶可繼續傳代使用），進行1傳2或1傳3的培養。8.拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養基皿內吸取5-10ml培養基懸空移入每個培養皿內，將培養皿蓋在酒精燈上消毒2-3次蓋上，在皿蓋上做好實驗標記。

9.將培養基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。

10.將培養瓶放入培養箱內培養。注意整個培養箱底托盤內一定要放高壓后的水，且定期更換確保無菌。

每天定時觀察細胞生長情況，一般72-96h后，細胞生長密度大于90%，即可進行細胞的傳代或保株。

五、細胞株的保存

原理：細胞凍存最常用的技術是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護劑的緩慢冷凍法凍存細胞。細胞在不加任何保護劑的情況下直接冷凍，細胞內外的水分會很快形成冰晶，從而引起一系列不良反應。如細胞脫水使局部電解質濃度增高，pH值改變，部分蛋白質由于上述原因而變性，引起細胞內部空間結構紊亂，溶酶體膜由此遭到損傷而釋放出溶酶體酶，使細胞內結構成分造成破壞，線粒體腫脹，功能丟失，并造成能量代謝障礙。胞膜上的類脂蛋白復合體也易破壞引起細胞膜通透性的改變，使細胞內容物丟失。如果細胞內冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造成細胞核DNA空間構型發生不可逆的損傷，而致細胞死亡。因此，細胞冷凍技術的關鍵是盡可能地減少細胞內水分，減少細胞內冰晶的形成。采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，且對細胞無明顯毒性。慢速冷凍方法又可使細胞內的水分滲出細胞外，減少胞內形成冰結晶的機會，從而減少冰晶對細胞的損傷。

實驗步驟：

選擇處于對數生長期的細胞，在凍存前一天最好換液。將多個培養瓶中的細胞培養液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養液。用吸管吸取培養液反復吹打瓶壁上的細胞，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產細胞則不要消化處理。然后將細胞收集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘)。加入凍存管中，再加入1ml配置好的凍存液后放入梯度降溫盒，放入-80℃冰箱中。

1.紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態，用酒精消毒操作者的雙手。

2.培養液，胰酶，二甲基亞砜DMSO，胎牛血清（解凍），梯度降溫盒恢復常溫，恒溫水浴箱37℃預熱20min，備用。

3.將所需的培養基，胰酶確保瓶身干凈消毒后放于工作臺面內，點燃酒精燈，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。

4.將培養瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，蓋放于酒精燈右側后將培養瓶內的培養液懸空倒進污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養瓶內。

5.將培養皿蓋內口朝上放在架子上，將培養皿內的培養液懸空倒進污缸。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1-2ml胰酶液，懸空沿皿壁加入培養皿內。6.將培養皿來回傾倒使胰酶浸沒整個皿底的細胞層，計時越1-3min（消化時間根據細胞不同時間不同），對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個細胞脫落，鏡下觀察到細胞都變圓時為胰酶消化的最適時機。（若看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落，或鏡下細胞多有菱角則需繼續消化）。用移液器將胰酶吸凈。

6.吸取1ml培養基于培養皿，并用移液器吸取少量的培養基輕柔的反復沖洗培養瓶壁5-8次，使貼壁細胞完全脫落于培養基內再輕輕吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀態。

7.將懸浮細胞吸入15ml離心管內，加入4ml培養基離心1000r/min，5min 8.預先配制凍存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清。按需要配置一定數量備用 9.棄去培養基，用凍存液進行重懸混勻后，將1ml含有細胞的凍存液移入凍存管內，擰緊瓶蓋，做好實驗標記。

10.將培養基，胰酶瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。

8.將凍存管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱過夜，次日再放于-80℃的冰箱內3-4天，最后存放于-196℃的液氮灌內長期保存。或直接放入梯度降溫盒內，放入-80℃冰箱內過夜后最后存放于液氮罐內。（梯度降溫盒內為甲醇，使用5次需要更換，每次使用需做好標記，使用前需恢復常溫）

六、細胞轉染

RNA干擾（RNA interference, RNAi）: ? 是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。基因沉默，主要有轉錄前水平的基因沉默(TGS)和轉錄后水平的基因沉默(PTGS)兩類:TGS是指由于DNA修飾或染色體異染色質化等原因使基因不能正常錄;

? PTGS是啟動了細胞質內靶mRNA序列特異性的降解機制。有時轉基因會同時導致TGS和PTGS。

? 由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，（長度超過三十的dsRNA會引起干擾素毒性）所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領域。

? 病毒基因、人工轉入基因、轉座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內，并利用宿主細胞進行轉錄時，常產生一些dsRNA。宿主細胞對這些dsRNA迅即產生反應。

作用機制

1)其胞質中的核酸內切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小片段RNA（大約21～23 bp），即siRNA。

2)siRNA在細胞內RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內一些酶（包括內切酶、外切酶、解旋酶等）結合形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。

3)RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區進行特異性結合，RISC具有核酸酶的功能，在結合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。

4)siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進一步放大，最終將靶mRNA完全降解。

5)RNAi發生于除原核生物以外的所有真核生物細胞內。需要說明的是，由于dsRNA抑制基因表達具有潛在高效性，任何導致正常機體dsRNA形成的情況都會引起不需要的相應基因沉寂。所以正常機體內各種基因有效表達有一套嚴密防止dsRNA形成的機制。

脂質體轉染原理：

1.脂質體是磷脂分散在水中時形成的脂質雙分子層，又稱為人工生物膜。最初，人們只是運用脂質體模擬生物膜，研究膜的構造及功能，從而發現了膜的融合及內吞作用，因而可用作外源物質進入細胞的載體 2.陽離子脂質體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹人內，形成DNA一脂復合體，也能被表面帶負電荷的細胞膜吸附，再通過膜的融合或細胞的內吞作用，偶爾也通過直接滲透作用，將DNA傳遞進入細胞，形成包涵體或進入溶酶體其中一小部分DNA能從包涵體內釋放，并進入細胞質中，再進一步進入核內轉錄、表達

DNA轉染步驟

1.轉染前一天接種細胞于6孔板，0.5-2×105每孔，2ml無抗生素培養基每孔，第二天轉染時細胞達到90-95%每孔。

2.轉染前半小時換Opti-MEM無血清培養基1.5ml。

3.A液：DNA 5ug 加入245ul Opti-MEM無血清培養基，輕輕混勻。

4.B液：脂質體使用前輕輕混勻，脂質體10ul 加入245ul Opti-MEM無血清培養基，輕輕混勻，室溫靜止5min。

5.B液加入A液，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。

6.將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細胞中，邊滴加變前后左右十字交叉搖晃。

7.孵箱37℃培養48h（轉染時間待定）。8.第二天看細胞狀態來決定是否換液。9.同時設立細胞對照組，空白轉染組。

siRNA轉染步驟

1)轉染前一天接種細胞于6孔板（40x104），2ml無抗生素培養基每孔，第二天轉染時細胞達到50-60%每孔。

2)轉染前半小時換Opti-MEM無血清培養基1.5ml。

3)A液：siRNA 5ul（共100pmol）加入245ul Opti-MEM無血清培養基，輕輕混勻。（siRNA按照說明書稀釋）4)B液：脂質體（RNAimax）使用前輕輕混勻，脂質體10ul 加入245ul Opti-MEM無血清培養基，輕輕混勻，室溫靜止5min。

5)B液加入A液，用槍輕輕混勻，室溫靜止20min。

6)將混合液均勻分散慢慢滴加到6孔板細胞中，邊滴加變前后左右十字交叉搖晃。

7)孵箱37℃培養48h（轉染時間待定）。8)第二天看細胞狀態來決定是否換液。9)同時設立細胞對照組，空白轉染組。

使用RNAiMAX和AGS cell用于siRNA在6孔板上進行轉染實驗

1)提前配制GAPDH，NC，NV-FAM及各片段siRNA的20uM的稀釋液，取附贈的DEPC水至管內，打開離心管前先離心，將附在管壁上的凍干粉離心下來 2)溶解時滴加適量的DEPC水后蓋上管蓋，震蕩溶解：NC，NC-FAM溶解加入62.5ulDEPC水，其他siRNA片段加入125ul DEPC水

3)取6只EP管，分別標記GAPDH，NC，NV-FAM，三個片段名稱，從管內吸取20ul的稀釋液分裝后

4)將稀釋液至于-80度冰箱保存。

? 轉染前一天，在6孔板上接種40x104AGS cell，再取一個35mm培養皿接種40x104AGS cell，每孔放2ml不含抗生素的生長培養基。使細胞在轉染的時候有50-60%的融合率

? 從細胞中除去生長培養基

? 每個孔中加入1.5ml新鮮不含血清的培養基，并準備如下混合物 1)A液：(取7個EP管，分別標記空白，GAPDH，NC,NC-FAM,三個片段)。在250ul的opti-mem終加入100pmol siRNA（稀釋好的siRNA濃度為20uM，100pmol的siRNA需要取5ul），混合均勻

2)B液：（取一個EP管標記RNAiMAX），RNAiMAX 使用前搖勻，在250ul X7.2=1800ul的opti-mem加入6ul X7.2=43.2ul的RNAiMAX，稀釋RNAiMAX混勻后并在室溫下溫育5min 3)混合A液和B液，混勻B液后吸取256ul至A液中室溫下溫育20min ? 將混合物混勻后加入到含AGS的6孔板與35mm培養皿中，每孔終體積為2ml，則加入混合液500ul，并輕搖混勻 ? 在37℃的二氧化碳培養箱中培養5-6小時 ? 更換含血清的培養基并培養細胞24-48小時 24-48小時后收細胞跑WB，看沉默效果