第一篇：抽水實驗定滲透率方法總結

用抽水試驗確定滲透系數

1.抽水試驗資料整理

試驗期間，對原始資料和表格應及時進行整理。試驗結束后，應進行資料分析、整理，提交抽水試驗報告。

單孔抽水試驗應提交抽水試驗綜合成果表，其內容包括：水位和流量過程曲線、水位和流量關系曲線、水位和時間(單對數及雙對數)關系曲線、恢復水位與時間關系曲線、抽水成果、水質化驗成果、水文地質計算成果、施工技術柱狀圖、鉆孔平面位置圖等。并利用單孔抽水試驗資料編繪導水系數分區圖。

多孔抽水試驗尚應提交抽水試驗地下水水位下降漏斗平面圖、剖面圖。

群孔干擾抽水試驗和試驗性開采抽水試驗還應提交抽水孔和觀測孔平面位置圖(以水文地質圖為底圖)、勘察區初始水位等水位線圖、水位下降漏斗發展趨勢圖(編制等水位線圖系列)、水位下降漏斗剖面圖、水位恢復后的等水位線圖、觀測孔的S－t、S－lg t曲線[注]、各抽水孔單孔流量和孔組總流量過程曲線等。

注意：（1）要消除區域水位下降值；（2）在基巖地區要消除固體潮的影響；3）傍河抽水要消除河水位變化對抽水孔水位變化的影響。

多孔抽水試驗、群孔干擾抽水試驗和試驗性開采抽水試驗均應編寫試驗小結，其內容包括：試驗目的、要求、方法、獲得的主要成果及其質量評述和結論。

2.穩定流抽水試驗求參方法

求參方法可以采用Dupuit 公式法和Thiem公式法。(1)只有抽水孔觀測資料時的Dupuit 公式

承壓完整井：

潛水完整井：

式中 K——含水層滲透系數(m/d);Q—— 抽水井流量(m3/d);sw—— 抽水井中水位降深(m);M——承壓含水層厚度(m);R—— 影響半徑(m);

H——潛水含水層厚度(m);

h——潛水含水層抽水后的厚度(m);rw——抽水井半徑(m)。

(2)當有抽水井和觀測孔的觀測資料時的Dupuit 或Thiem公式 式中hw ——抽水井中水柱高度(m);

h1、h2——與抽水井距離為r1和r2處觀測孔（井）中水柱高度(m)，分別等于初始水位H0與井中水位降深s之差，h1= H0 –s1；h2= H0 –s2。

其余符號意義同前。

當前水井中的降深較大時，可采用修正降深。修正降深s’與實際降深s之間的關系為：s'=s-s2/2H。3.非穩定流抽水試驗求參方法

3.1承壓水非穩定流抽水試驗求參方法

(1)Theis 配線法

在兩張相同刻度的雙對數坐標紙上，分別繪制Theis 標準曲線W(u)-1/u 和抽水試驗數據曲線s-t，保持坐標軸平行，使兩條曲線配合，得到配合點M的水位降深[s]、時間[t]、Theis井函數[w(u)]及[1/u]的數值，按下列公式計算參數（r為抽水井半徑或觀測孔至抽水井的距離）：

以上為降深——時間法（s-t）。也可以采用降深---時間距離法（s-t/r2）、降深---距離法（s-r）進行參數計算。

(2)Jacob 直線圖解法

當抽水試驗時間較長，u= r2/(4at)<0.01時，在半對數坐標紙上抽水試驗數據曲線s-t為一直線（延長后交時間軸于t0，此時s=0.00m），在直線段上任取兩點t1、s1、t2、s2，則有

（3）Hantush 拐點半對數法

對半承壓完整井的非穩定流抽水試驗（存在越流量，K’/b’為越流系數），當抽水試驗時間較長，u= r2/(4at)<0.1時，在半對數坐標紙上抽水試驗數據曲線s-t，外推確定最大水位降深Smax，在s-lgt線上確定拐點Si = Smax/2，拐點處的斜率mi 及時間ti，則有(4)水位恢復法

當抽水試驗水位恢復時間較長，u= r2/(4at)<0.01時，在半對數坐標紙上繪制停抽后水位恢復數據曲線s-t，在直線段上任取兩點t1，s1，t2，s2，則有

(5)水位恢復的直線斜率法

當抽水試驗水位恢復時間較長，u= r2/(4at)<0.1時，在半對數坐標紙上繪制停抽后水位恢復數據曲線s-t，直線段的斜率為B，則有

3.2 潛水非穩定流抽水試驗求參方法

潛水參數計算可采用仿泰斯公式法、Boulton法和Numan法。(1)仿泰斯公式法

式中H0、hw——-初始水頭及抽水后井中水頭；

W(u)——泰斯井函數；

Q——抽水井的流量(m3/d)；

r——到抽水井的距離(m)； t——自抽水開始起算的時間(d)；

T——含水層的導水系數(m2/d)；T=Khm； hm ——-潛水含水層的平均厚度(m)； K——含水層的滲透系數(m/d)；

A——_含水層的導壓系數(1/d)；

m——潛水含水層的給水度。

具體計算時可采用配線法、直線圖解法、水位恢復法等。

（2）潛水完整井考慮遲后疏干的Boulton公式

可根據抽水早期、中期、晚期的觀測資料，采用相應的方法計算參數。（3）Numan法

對于潛水含水層完整井非穩定流抽水試驗，也可以采用Numan模型求參，具體求參過程可參閱《地下水動力學》等教科書。4.參數計算新技術新方法的應用

采用AQUIFERYTEST軟件（圖1）、數值模擬法（可采用GMS、MODFLOW、FEFLOW等軟件）以及肖長來教授提出的全稱曲線擬合法（圖2）等一些新的軟件、方法確定水文地質參數，效果非常好。

Conductivity:9.38E-2 m/d

圖1 AQUIFERYTEST軟件求參圖示

圖2 全稱曲線擬合法求參圖示

5.參數計算結果的驗證

上述參數計算結果的精度如何，取決于試驗場地水文地質條件的概化，也取決于觀測數據的精度。對于所求得的參數，應將其代入相應的公式，通過對比計算降深與實測降深的差值，分析所求參數的精度及其可靠性和代表性，最終確定抽水試驗場地的有代表性意義的參數值。

方法

（二）單孔穩定流抽水試驗，當利用抽水孔的水位下降資料計算滲透系數時，可采用下列公式：

當Q～s（或Δh

2）關系曲線呈直線時，1）承壓水完整孔：

(8.2.1-1)

2）承壓水非完整孔： 當M>150r，l/M>0.1時：

(8.2.1-2)

或當過濾器位于含水層的頂部或底部時：

3）潛水完整孔：

（8.2.1-3）（8.2.1-4）

4）潛水非完整孔： 當>150r，l＞0.1時：

（8.2.1-5）

或當過濾器位于含水層的頂部或底部時：

（8.2.1-6）

式中 K——滲透系數（m/d）；

Q——出水量（m/d）；

3s——水位下降值（m）；

M——承壓水含水層的厚度（m）；

H——自然情況下潛水含水層的厚度（m）；

h——潛水含水層在自然情況下和抽水試驗時的厚度的平均值（m）；

h——潛水含水層在抽水試驗時的厚度（m）； l——過濾器的長度（m）；

r——抽水孔過濾器的半徑（m）；

R——影響半徑（m）。當Q～s（或Δh）關系曲線呈曲線時，可采用插值法得出Q～s 代數多項式，即： 2 s＝a1Q+a2Q2+……anQn（8.2.1-7）

式中 a1、a2……an——待定系數。

注：a1宜按均差表求得后，可相應地將公式（8.2.1-1）、（8.2.1-2）、（8.2.1-3）中的Q/s和公式（8.2.1-4）、（8.2.1-5）、（8.2.1-6）中的 進行計算。當s/Q（或Δh2/Q）～Q關系曲線呈直線時，可采用作圖截距法求出a1后，按本條第二款代換，并計算。

單孔穩定流抽水試驗，當利用觀測孔中的水位下降資料計算滲透系數時，若觀測孔中的值s（或Δh2）在s（或Δh2）～lgr關系曲線上能連成直線，可采用下列公式：

1承壓水完整孔：

以1/a1代換，分別（8.2.2-1）潛水完整孔：

(8.2.2-2)

式中 s1、s2——在s～lgr關系曲線的直線段上任意兩點的縱坐標值（m）；

——在Δh～lgr關系曲線的直線段上任意兩點的縱坐標值（m）；

22r1、r2———在s（或Δh）～lgr關系曲線上縱坐標為s1、s2（或）的兩點至抽水孔的距

2離（m）。

單孔非穩定流抽水試驗，在沒有補給的條件下，利用抽水孔或觀測孔的水位下降資料計算滲透系數時，可采用下列公式： 1 配線法：

1)承壓水完整孔：

2）潛水完整孔：

式中 W（ｕ）——井函數；

S——承壓水含水層的釋水系數；

μ——潛水含水層的給水度。

2直線法：

當

1)承壓水完整孔：

<0.01時，可采用公式（8.2.2-1）、（8.2.2-2）或下列公式：

（8.2.3-5）水完整孔：

（8.2.3-6）

式中 s1、s2——觀測孔或抽水孔在s～lgt關系曲線的直線段上任意兩點的縱坐標值（m）；

——觀測孔或抽水孔在 Δh2～lgt關系曲線的直線段上任意兩點的縱坐標值（m）；

t1、t2——在s（或Δh）～lgt關系曲線上縱坐標為s1、s2（或）兩點

22的相應時間（min）。8.2.4單孔非穩定流抽水試驗，在有越流補給（不考慮弱透水層水的釋放）的條件下，利用s～lgt關系曲線上拐點處的斜率計算滲透系數時，可采用下式：

（8.2.4）

式中 r——觀測孔至抽水孔的距離（m）；

B——越流參數；

mi——s～lgt關系曲線上拐點處的斜率。

注：1 拐點處的斜率，應根據抽水孔或觀測孔中的穩定最大下降值的1/2確定曲線的拐點位置及拐點處的水位下降值，再通過拐點作切線計算得出。

越流參數，應根據確定越流參數B。，從函數表中查出相應的r/B，然后8.2.5 穩定流抽水試驗或非穩定流抽水試驗，當利用水位恢復資料計算滲透系數時，可采用下列公式： 停止抽水前，若動水位已穩定，可采用公式（8.2.4）計算，式中的mi值應采用恢復水位的曲線上拐點的斜率。停止抽水前，若動水位沒有穩定，仍呈直線下降時，可采用下列公式：

1）承壓水完整孔：（8.2.5-1）

2）潛水完整孔：

（8.2.5-2）

式中 tk——抽水開始到停止的時間（min）；

tT——抽水停止時算起的恢復時間（min）；

s——水位恢復時的剩余下降值（m）；

h——水位恢復時的潛水含水層厚度（m）。

注：1 當利用觀測孔資料時，應符合 當

<0.01時的要求。

如恢復水位曲線直線段的延長線不通過原點時，應分析其原因，必要時應進行修正。

利用同位素示蹤測井資料計算滲透系數時，可采用下列公式：

（8.2.6-1）

（8.2.6-2）

式中 Vf——測點的滲透速度（m/d）；

I——測試孔附近的地下水水力坡度； r——測試孔濾水管內半徑（m）；

r0——探頭半徑（m）；

t——示蹤劑濃度從 N0變化到Nt所需的時間（d）；

N0——同位素在孔中的初始計數率； Nt——同位素t時的計數率； Nb——放射性本底計數率； a——流場畸變校正系數。

方法

（三）在單孔抽水試驗中,由于沒有觀測孔,只能根據抽水試驗未穩定前的水位,做出降深-半對數時間圖,以圖解法來求滲透系數或根據水位恢復數據,以圖解法來求巖石滲透系數.像這種聯解方程,想用數學推導法來求解,是非常困難的.涉及冪函數和指數涵數.如一礦山的抽水試驗,涌水量為Q=1053噸/天,含水層厚度為m=241.3米,降深s=9.40米,抽水管徑r=0.084米.經過化簡和代入后為: k-0.085lgk=1.41113

可以用逼進法,在excel里計算.如k=1時,左邊的式子,其得數是小于1的,顯然不符合方程.如k=3時,左邊的式子,其得數是大于2的,顯然也是不符合方程.如k=2時,左邊的式子,其得數是介于1--2之間的,這樣就界定了k值的大致范圍

然后再分別計算

k=1.1 左邊的式子k-0.085lgk=1.0965 k=1.2,k-0.085lgk=1.19327

k=1.3,k-0.085lgk=1.2903

k=1.4,k-0.085lgk=1.38758

k=1.5,k-0.085lgk=1.4850 顯然k值小于1.5,大于1.4.然后再這個區間繼續計算k-0.085k的值,使之趨近于1.41113.在excel里,這種計算非常快捷.很快就可以得出k=1.4244 R=112.12

水文地質參數確定方法

確定水文地質參數的方法一般分為經驗數據法、經驗公式法、室內試驗法和野外試驗法四種。供水水文地質勘察中主要采用野外試驗法，因為野外試驗法求得的參數精確度較高。

經驗數據法 根據長期的經驗積累的數據，列成表格供需要時選用。滲透系數、壓力傳導系數、釋水系數、越流系數、彌散系數、降水入滲系數、給水度和影響半徑等都有經驗數據表可查。在評估地下水資源時，水文地質參數常采用經驗數據。

經驗公式法 考慮到某些基本規律列出的公式，并加上經驗的修正。滲透系數、給水度等都可按經驗公式計算，其值比選用經驗數據的精確度要高。

室內試驗法 在野外采取試件，利用試驗室的儀器和設備求取參數。滲透系數、給水度、降水入滲系數等水文地質參數，可通過室內試驗法求得。

野外試驗法 利用野外抽水試驗取得有關數據，再代入公式計算水文地質參數。其計算公式分穩定流公式和非穩定流公式。計算時根據含水層的狀態(潛水或承壓水)、井的完整性(完整井或非完整井)、邊界條件(傍河或其他邊界)、抽水孔狀態(單孔抽水或帶觀測孔抽水)等條件選擇。滲透系數、導水系數、壓力傳導系數、釋水系數、越流系數、給水度和影響半徑等，都可用野外抽水試驗法求得較精確的數據。野外確定降水入滲系數還可采用地下水均衡試驗場的實測數據，一般精度較高。

第二篇：學科德育滲透實驗總結

學科教學德育滲透實驗總結

郭春波

本學期我在學科教學活動中，充分發揮教材優勢，進行德育滲透的課題研究，讓德育與知識、技能有機地結合在一起，使學生在獲取知識的同時，也得到思想品德熏陶，促使青少年學生在學習中，不斷提高自身素質。

一、在教學中，堅持文道結合的原則，讓學生獲得思想品德教育能更具體、形象。

各個學科的知識都在一定程度上反映了人們的思想觀點，思想形成了學科知識的內在屬性，它們互相融合，互相滲透，脫離了教材，談品德，德育是空洞的說教；反之，沒有德育的教學，智育也是蒼白的。因此在具體的教學活動中，為了更好地實施教學，落實教學目標，德育智育結合，文道結合是必要的，對于具有豐富而生動德育教材學科的各學科而言，這一點更是關鍵。

在教學中，通過說服教育等方式，讓學生理解良好品格的養成需要堅持持久，在掌握一定學習技巧的同時，能更具體形象地獲得思想教育教學效果。從而樹立遠大的抱負，以飽滿的生命力投身到學習知識的大潮中去，將來回報祖國。青少年要勇敢的面對困難，而不是躲避困難。如果堅持下去，最終贏得勝利，就會有一種自豪感。這樣，學生在學習中，不單掌握一定的學習技能，而且在潛移默化中，逐漸確立正確的世界觀、人生觀。

二、在教學中，注意激發，培養學生真摯情感，使之成為學生積極向上的動力。

在德育過程中，動之以情，既是曉之以理的繼續，更是持之以恒導之以行的基礎，因而使受教育者獲得真摯情感，仍是教育成功的關鍵，是提高德育滲透效果的保證。各學科那些文質兼美的語言文字，就是一塊塊的情感天地，通過富有情感的教學，巧妙的教學手段，激發培養學生真摯情感，積極對學生進行情感教育，激發培養學生愛祖國、愛自然、愛生活的真摯情感，使學生在學習中不單掌握一定的知識技能，而且得到思想品德熏陶，不斷提高自己的道德情操。

總之，激發學生心底的真摯情感，才會使學生逐漸脫離低級趣味，而產生高尚的情感，形成高尚的道德情操，自覺追求真、善、美，樹立遠大的目標，并為之而奮斗。

三、深挖教材中的德育因素，加強對學生品德熏陶

教材中德育的內容，不可能像學科知識那樣處處明顯，它往往是內在的、深層的，個別隱蔽的，思想教育是滲透在學科知識的方方面面，與學科知識融二為一，這就要求我們在教學中進行德育滲透，不能僅停留在那些表面的內容上，而應當是深入挖掘教材內在的德育因素，各學科的德育，材料雖然豐富，同樣需要我們多方面深入挖掘，以提高德育滲透的成效，總而言之，只有深挖，才能加強德育滲透的力度，使青少年不斷增強自身素質，提高自身的道德情操。

四、把德育滲透到各種形式的實踐活動中去。

開展形式多樣的實踐活動，是對學習課堂教學的補充，是學生增強素質的另一途徑。課余時間組織活動豐富學生學科知識、技能，提高學生的素質，也使學生在潛移默化中得到思想熏陶，激發他們積極向上的情感,從而激發他們的愛國情感。

第三篇：高中生物實驗方法總結

1．顯微觀察法：如“觀察細胞有絲分裂”“觀察葉綠體和細胞質流動”“用顯微鏡觀察多種多樣的細胞”等。

2．觀色法：如“生物組織中還原糖、脂肪和蛋白質的鑒定”“觀察動物毛色和植物花色的遺傳”“DNA和RNA的分布”等。

3．同位素標記法（元素示蹤法）：如“噬菌體浸染細菌的實驗”“恩格爾曼實驗”等。

4．補充法：如用飼喂法研究甲狀腺激素，用注射法研究動物胰島素和生長激素，用移植法研究性激素等。

5．摘除法：如用“閹割法、摘除法研究性激素、甲狀腺激素或生長激素的作用”“雌蕊受粉后除去正在發育著的種子”等。

6．雜交法：如植物的雜交、測交實驗等。

7．化學分析法：如“番茄對Ca和Si的選擇吸收”“葉綠體中色素的提取和分離”等。

8．理論分析法：如“大、小兩種草履蟲的競爭實驗”“植物向性動物的研究”等。

9．模擬實驗法：如“滲透作用的實驗裝置”“分離定律的模擬實驗”等。

10．引流法：臨時裝片中液體的更換，用吸水紙在一側吸引，于另一側滴加換進的液體。

11．實驗條件的控制方法

⑴增加水中O2：泵入空氣或吹氣或放入綠色植物；

⑵減少水中O2：容器密封或油膜覆蓋或用涼開水；

⑶除去容器中CO2：NaOH溶液、Na2CO3溶液；

⑷除去葉中原有淀粉：置于黑暗環境（饑餓）；

⑸除去葉中葉綠素：酒精水浴加熱（酒精脫色）；

⑹除去植物光合作用對呼吸作用的干擾：給植株遮光；

⑺單色光的獲得：棱鏡色散或透明薄膜濾光；

⑻血液抗疑：加入檸檬酸鈉（去掉血液中的Ca2+）；

⑼線粒體提取：細胞勻漿離心；

⑽骨無機鹽的除去：HCl溶液；

⑾消除葉片中脫落酸的影響：去除成熟的葉片；

⑿消除植株本身的生長素：去掉生長旺盛的器官或組織（芽、生長點）；

⒀補充植物激素的方法：涂抹、噴灑、用含植物激素的羊毛脂膏或瓊脂作載體；

⒁補充動物激素的方法：口服（飼喂）、注射；

⒂阻斷植物激素傳遞：插云母片法。

12．實驗結果的顯示方法——實驗現象的觀測指標

⑴光合作用：O2釋放量或CO2吸收量或有機物生成量。例：水生植物可依氣泡的產生量或產生速率；離體葉片若事先沉入水底可依單位時間內上浮的葉片數目；植物體上的葉片可依指示劑（如碘液）處理后葉片顏色深淺。

⑵呼吸作用：O2吸收量或CO2釋放量或有機物消耗量

⑶原子或分子轉移途徑：同位素標記法或元素示蹤法

⑷細胞液濃度大小或植物細胞活性：質壁分離與復原

⑸溶液濃度的大小：U型管+半透膜

⑹甲狀腺激素作用：動物耗氧量、發育速度等

⑺生長激素作用：生長速度(體重、體長變化)

⑻胰島素作用：動物活動狀態（是否出現低血糖癥狀——昏迷）

⑼胰高血糖素作用：尿糖的檢測（在尿液中加班氏試劑進行沸水浴，看是否出現磚紅色沉淀）

⑽菌量的多少：菌落數、亞甲基藍褪色程度

⑾生長素作用及濃度高低的顯示：可通過去除胚芽鞘后補充生長素后的胚芽生長情況來判斷（彎曲、高度）

⑿淀粉：碘液（變藍色）

⒀還原性糖：斐林試劑/班氏試劑（沸水浴后生成磚紅色沉淀）

⒁CO2：Ca(OH)2溶液（澄清石灰水變渾濁)

⒂乳酸：pH試紙

⒃O2：余燼復燃

⒄蛋白質：雙縮脲試劑（紫色）

⒅脂肪：蘇丹Ⅲ染液(橘黃色）；蘇丹Ⅳ染液(紅色）

⒆DNA：二苯胺（沸水浴，藍色）、甲基綠（染色后，呈綠色）

⒇RNA：吡羅紅（呈紅色）、苔黑酚乙醇溶液

第四篇：消化實驗方法總結

《豆粕粉碎粒度與蛋白質體外消化率的關系研究》

采用胃蛋白酶-胰酶兩步法，通過體外模擬雞體消化道內環境來比較不同粉碎力度豆粕的蛋白消化率，從而確定適合肉仔雞生長的較適宜豆粕粉碎力度。

平均粒徑采用GB 6971-86 方法，體外試驗采用Boisen和Fernandez等體外模擬消化方法。胃蛋白酶最適濃度的選擇

1g豆皮→100ml三角瓶+25ml磷酸緩沖液（pH=6.0 0.01M）+10ml鹽酸（0.2M）→溫和攪拌+1ml(15mg/ml,30mg/ml,45mg/ml,60mg/ml,75mg/ml,90mg/ml)的新鮮胃蛋白酶溶液（由0.01M HCl 配制），pH=2.0 +0.5ml抑菌劑（青霉素+鏈霉素）→39℃恒溫水浴中震蕩6h,消化后+20%黃基水楊酸5ml→室溫靜置30min→抽濾→干燥后殘渣凱式定氮法測蛋白質含量→計算蛋白質和干物質消化率。確定最適胃蛋白酶濃度為75mg/ml.胰酶最適濃度選擇

在最適（75mg/m）胃蛋白酶液消化后的產物中加入10ml磷酸緩沖液（0.2M pH=6.8）+5mlNaoH(0.6M)+1ml(70mg/ml,90mg/ml,110mg/ml,130mg/ml,150mg/ml)的胰酶溶液（由磷酸二氫鉀緩沖液配制）pH=6.8→39℃恒溫水浴中震蕩18h→消化后+20%磺基水楊酸5ml→室溫靜置30min→抽濾，干燥后殘渣按照凱式定氮法測其蛋白質含量，計算粗蛋白和干物質消化率，確定最適胰酶濃度為110mg/ml。胃蛋白酶一胰酶兩步法測定過程[1]

分別稱取原樣和過篩豆粕于三角瓶中，4個重復，使用最適濃度測定不同粒度豆粕蛋白和干物質含量，并通過氨基酸自動分析儀測其氨基酸含量，計算粗蛋白、干物質和氨基酸消化率。《燕麥粉添加量對面包營養組分含量和淀粉體外消化性的影響》 淀粉體外水解動力學測定

1g樣品+50ml磷酸緩沖液（pH=6.9）→37℃水浴消化5min→取0.2ml消化上清液→1min后加入1mlα-淀粉酶溶液（40mg/ml 用DNS溶液配制）→37℃水浴繼續消化→每隔15min分別取消化液0.2ml于25ml試管中+0.8ml蒸餾水+1mlDNS→沸水浴中煮沸10min→取出后+15ml蒸餾水，搖勻→空白管調零，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖的含量。采用0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.50 mg/m L的葡萄糖溶液繪制標準曲表2，根據還原糖釋放量的變化比較淀粉的體外消化性。《苦蕎芽粉饅頭品質及體外模擬消化研究》 甲醇提取液的制備

參照Bojana(2011)提取樣品的方法并稍作修改。準確稱取5g待提取的苦蕎饅頭樣品浸沒于50ml甲醇/水（80/20，v/v）溶液中，用均質機攪拌使樣品破碎均質。樣品液超聲波提取15min，將懸浮液轉移至離心管中。原樣品再加入50ml甲醇/水（80/20，v/v），重復一次，合并提取液。2500r/min離心，取上清液于45℃水浴下蒸發至干，用甲醇重新溶解并定容到100ml，備用。酚含量測定

采用Folin–Ciocalteu法（FILIPCEV 2011）測定試樣的總酚含量，并稍作修改。取500μL蒸餾水，加入125μL的標準溶液或提取液后，再加入125Μl Folin–Ciocalteu試劑，充分混勻后加入1.25ml 7%碳酸鈉溶液，漩渦混勻后避光放置90min后于760nm處測定混合液的吸光值。以沒食子含量為縱坐標（μg/ml），吸光度為橫坐標，得回歸方程為y=0.014X+0.041（R2=0.995）。按照測定沒食子酸標準液吸光度的步驟測定待測液吸光度。黃酮含量測定

采用NaNo2-Al(NO)3方法測定。取一定濃度的樣品水溶液0.1ml與0.2ml 5%NaNO2溶液，漩渦混勻后室溫下放置6min，加入0.2ml 10%的ALCL3，振蕩后靜止6min，然后加入2ml 1M NaOH溶液，最后加水定容至5ml，放置15min后于波長510nm處測定混合液吸光值。以蘆丁含量為縱坐標（μg/ml），吸光度為橫坐標得回歸方程為y=0.007x+0.030（R2=0.991）。按照測定蘆丁標準液吸光度的步驟測定待測液吸光度。體外模擬消化過程

體外模擬消化過程參考Gawlik等人的方法，略作修改。

模擬唾液：2.38gNa2HPO4，0.19gKH2PO4，8gNacl和0.91gα-淀粉酶（220U/ml）溶于1升水中形成模擬唾液，用磷酸鹽緩沖液調節溶液為pH=6.75。

模擬胃液：0.32%胃蛋白酶溶于0.3mol/L的Nacl，用HCL調節溶液pH=1.2。模擬腸液：0.05g胰蛋白酶和0.3g膽汁溶于35ml的NaHCO3（0.1mol/l）。

體外提取過程（S0）：準確稱取6.0g蕎麥饅頭樣品浸沒于100ml甲醇水（80/20，v/v）溶液中，靜置6h，懸浮液轉移至離心管中，2500r/min離心10min，取上清液于45℃水浴下旋轉蒸發至干，用甲醇重新溶解并定容到10ml，-20℃保存，備用。

口腔消化過程（S1）：準確稱取6g樣品置于100ml的燒杯中并加入30ml模擬唾液，用均質機攪拌使樣品充分破碎均質后放入水浴搖床中，37℃振蕩10min。

胃腸消化過程（S2）：取出水浴搖床中的樣品，用3mol/l的鹽酸調節溶液體系至pH=1.5后加入30ml模擬胃液，置于40℃水浴搖床中振搖60min。反應結束后取5ml的樣液，于70℃的水浴鍋中加熱滅酶，經過模擬胃部消化的消化液用0.1mol/l的NaHCO3調節使溶液體系的pH=6，加入30ml膽汁胰酶的復合液，再分別加入5ml 1mol/l的Nacl和1mol/l KCl，置于37℃水浴震蕩120min模擬腸道消化，于70℃的水浴鍋中加熱滅酶，-20℃保存備用。每個樣品重復三次。

腸道吸收過程（S3）：將20ml剩余消化液轉移到透析袋中，并將透析袋置于裝有50ml PBS緩沖液的燒杯中，37℃水浴震蕩4h。將PBS緩沖液轉移到離心管中，-20℃保存備用，每個樣品重復三次。

《羊奶嬰兒配方奶粉中蛋白質體外模擬消化研究》 外模擬胃消化

體外模擬胃消化參照Johns[8]的方法并對其加以改進。將奶粉樣品用蒸餾水配制成蛋白質質量分數為1%的乳液，于37℃水浴中預熱10min，用1mol/L的HCl調乳液p H3。在每100m L乳樣中添加3×106U胃蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為3×106U)，于

37℃恒溫搖床上消化水解1.5h，然后用lmol/L的Na OH調節乳液p H值至7滅酶，測定其中蛋白質的胃消化率。體外模擬腸消化

體外模擬腸消化參照Johns[8]的方法并對其加以改進。將奶粉樣品用蒸餾水配制成蛋白質質量分數為1%的乳液，于37℃水浴中預熱10min，用1mol/L的Na OH調乳液p H7。在每100m L乳樣中添加1.25×105U胰蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為1.25×105U)，于37℃恒溫搖床上消化水解2h，然后沸水浴5min滅活，測定其中蛋白質的腸消化率。體外模擬總消化

體外模擬總消化參照Johns[8]的方法并對其加以改進。將奶粉樣品用蒸餾水配制成蛋白質質量分數為1%的乳液，于37℃水浴中預熱10min，用1mol/L的HCl調乳液p H3。在每100m L乳樣中添加3×106U胃蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為3×106U)，于37℃恒溫搖床上消化水解1.5h，然后用lmol/L的Na OH調節乳液p H值至7。再向每100m L乳樣中添加1.25×105U胰蛋白酶(即每克蛋白質對應的酶用量為1.25×105U)，于37℃恒溫搖床上消化水解2h，然后沸水浴5min滅活，測定其中蛋白質的總消化率。燕麥全粉中蛋白質體外消化的測定

燕麥蛋白質的體外消化實驗采用Wang[15]報道的體外消化模型進行,略有改動。具體操作如下:準確稱取一定質量的樣品分散于0.1 mol/L HCl中形成50 g/L的溶液,置于37℃水浴中預熱5 min,以酶∶底物為1∶ 100加入胃蛋白酶,在37℃恒溫振蕩器上反應,分別在不同的消化時間(0、10、30、60、120 min)取樣,用1 mol/L的NaOH調節pH7.0終止消化反應,120min所得的消化液調節pH7.0后,以酶∶底物為1∶ 100加入胰蛋白酶,在消化10、30、60、90、120min之后取樣分析。

第五篇：RT-PCR實驗方法總結

RT-PCR實驗方法總結大全

RT-PCR實驗有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：

1.做RT前必需測RNA濃度，逆轉錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。

2.RT按要求做，一般不會出太大問題。

3.PCR，按常規。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。

1）RT和PCR時的引物設計是不是一定要先知道目的基因的序列？必須

在RT時，引物設計有3種方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特異的下游引物。如果用a和b方法，是擴增的所有的cDNA（理論上），還要用此產物做PCR 的模板繼續擴增。

如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？http://www.ncbi.nlm.nih.gov問題：

在做RT-PCR遇到一怪現象，即對同一動物不同組織擴增同一段基因，結果從一種組織中可以擴出我的目的基因，條帶非常的好，而另一組織在同樣的條件下卻得到許多非特異性的條帶，嘗試其他條件同樣無法得到滿意的結果，百思不得其解！（注：已肯定該基因在兩種組織中都表達，且內參照在兩種組織都可擴增出來）

從這兩種組織中提取的RNA的量是不一樣的，我測過吸光度，差異還很大，會不會和這有關呢？ 請高手指教！解答：

1.RT-PCR有兩種做法：

條件具備的話可用kit進行一步法進行；若條件不太好的話可分兩步進行逆轉錄再PCR。但后來發現兩步法的結果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現象，我推測是體系更加單一比較利于PCR的進行，當然也可能是我買的kit不太好。（promega）。

2.RT-PCR應具備的條件

高質量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好產物短點）；若涉及粗略定量的話還應考慮RNA的濃度或是cDNA的濃度（如果由內標分子更好，但我發現其實很不容易將RNA的濃度以及內標分子的表達量調整的完全一樣）；體系的均一性等。3.RACE 我做過RACE（3’RACE是寶生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但現在再進行另一個同源基因的3‘RACE時卻怎么也P不出來，這兩個基因是由同一對引物擴增出來的，其中一個已經獲得了全序列（RACE的方法），而另一個基因的3’UTR卻增么也擴不出來，我推測是不是該基因的3‘UTR太長的緣故，我都快綠了，有無

RT-PCR的常用內標b－actin 和GAPDH的使用有選擇性嗎？比如不同的細胞，不同的刺激。有關內參：

RT-PCR內參照可以在一個管子里做（那樣也是圖好看一些），最好分開兩管，把除了引物之外的mixture統一配，拍照后，算目的基因和內參的比值，這就是基因表達的相對濃度。

問：我曾經作過同一管的PCR，內有actin 和目的基因引物。雖然可見到兩條均一條帶但圖片質量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。請教mxbdna2003，你是如何處理同一管的PCR的各成分的濃度？ 答： it should determined the amount of RNA.but it not for the quantitity of the PCR.it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR)and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much.but the amount just using “accurate piptte” is wrong.it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.在同一管中做RT，其實沒有什么問題，不需要taq魅加量，taq酶本來就是過量的^-^，（平時做pcr的時候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八兩就可以了，我想這肯定再很多貼子里應該都談到了。Mg就跟不能變了，一變整個體系就變了。能看到均一條帶就很好了。

關鍵是摸，十八摸（太少，只爭朝夕，開個玩笑）雖然用不著，但是摸上3、5摸總是必要的，首先遙分開摸，然后再一起摸，直到摸的好了，還要考慮比較的不同的模板中的量，所以我們不建議再同一管中進行，因為還有互相競爭抑制的問題，即使不同基因之間。

有關內參的建議：

一定要做內參的，每一次，我想。不作內參的結果是不可信的

電泳可以不一起跑，沒有關系，計算的是相對表達程度，著我在好幾封帖子里都談了，再說一邊我得觀點，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對表達量，不是絕對表達量，除非你能準確知道來自多少細胞，但是細胞還有死的呢。

2、以電泳為基礎的半定量RT-PCR本身是不可信的，作為實驗的粗篩是可以的，但不能作為最終結果的，3、半定量RT-PCR應該再兩管中進行，除非內參基因和目的基因表達相同，長度差不多，GC含量相似，或者實在窮的要省PCR管和taq。關于平臺期和線性期的問題，實際上線性期是指數期，只不過碰巧2的冥和2的倍數是相同的。看上去任何一個時期都可以，實際上是不對的，因為牽涉到酶促動力學的問題，這個我也不懂，有一些專門的文章，好像，涉及到很多化學的東西。我們學醫的，也沒必要知道那些，但是其中主要是因為模板引物酶原料和buffer之間的關系，這種反應單靠改變其中一種成分沒有用的，酶一直是過量，再加酶也沒用，引物ntp都是這樣。煙鬼正傳，最好選線性期的開始階段，但是要在你的凝膠成像分辨范圍內，所以選一個這兩種的契合點。給你一張圖你就明白了，再開始的時候酸的是切線，這 圖我在 *** 帖過。關于引物設計，再可能的情況下，除了常規要求之外，最好兼顧跨內含子（不過，根據要求，還可以專門設計隔內含子的，這樣還可以用于基因組PCR）、長度小于500bp－600bp等等。

引物當然要設計成一樣的退火溫度，即使不再一管中，也要一樣的，要在一臺機器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一個溫度，這樣任何幾個都可以拿來披，也不用查。

我反復說過了，別用軟件，就用眼睛看，軟件涉及的在好，有些基因在它出軟件的時候，還沒發現呢，跟不要說在基因組的位置和序列了，怎么考慮內含子的問題呢？

18s的引物也和著名的βactin一樣是設計的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用總RNA為模板，但是比actin和bubulin等可準多了，更不要說GAPDH這個破爛了。18s除了在細胞中更相同（量）外，主要是它占的比例遠遠高于看家基因，所以定量更加準確，我想，不知對不對，請幾位主任和eeflying指教。我認為，就像你用某一種東西的數量去概括，因該選那種多的東西，說一座房子是由2000塊磚造成的，比說又29根梁更準確吧。更不要說沒有看家基因不看家的缺點，因為他是服務于整個基因組表達譜什么的。PE有專門的用于實時PCR的內參試劑盒，就是用18s，不過我們看懂使用的那條序列，不知有沒有人用過，告知其序列和genbank號。

正好問一下，我查了一些序列，一直沒有去合成，主要是因為手上的actin的熒光探針還沒有完，當初和成了一堆。

有那位高手用過18s的內參，請問您的序列（我指的是模板的序列）？

原位雜交最好用RNA做探針，效果好一些，反正你有錢賣roche的盒子，而且量也能保證，因為轉錄過程嘛，沿著一條線突突地跑就是了。正義反義也容易理清。

我覺得做RT-PCR的方法和條件及應注意的事項就是那么幾條,許多專業書都有詳細的描述,但是許多人還是歷經多次磨難，有時就是得不出結果。因此，我認為因為每個人所要克隆的片斷不同，引物不同等，因此對不同的人來說還是有他自己的特殊性,我的以下經歷說明：做實驗時各人的情況不同,做不出時還是要好好動一下腦子。

記得我開始我的ＲＴ－PCR時，按常規方法，提取總ＲＮＡ后，首先用自己設計的下游引物進行逆轉錄，不斷改變反應條件，進行了Ｎ次均沒有結果。后來考慮到本人的克隆的PCR的片斷位于我們實驗另一位同學克隆的片斷當中，而該同學已經用RT-PCR克隆出她的片斷（盡管她用這些ＲＴ－ＰＣＲ產物做模版再進行ＰＣＲ時也沒辦法重復出她的產物），因此，我先用她的引物和條件擴增出她的片斷，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ產物作模板（有點改進，逆轉錄反應換用了９mers隨機引物），用我的引進物進行一般PCR，終于得到我的產物，測序結果完全正確。盡管我的這個經歷別人很人遇到，但足可以說明實驗可以有自己的模式，書本的知識和別人的經驗很重要，但有時也不定要受到書本框框和別人經驗的限制

請問： 引物的特異退火溫度怎樣設定？可以根據gc 和at含量算出嗎？可以用引物報告單上的Tm值嗎？ PCR時20微升體系中cDNA應加多少比較合適？MgCl2應加多少？各個成分的量有無確定標準？ 3 PCR結果跑電泳，actin有，但跑不出目的條帶，有幾種原因？與cDNA的量少有關嗎？Mg離子太多是否會抑制Taqase的活性？

一般來說引物報告單傷得是對的,也可以自己算,實際上重要的各條引物一致,剩下的可以摸的.20中是指體積還是量?只要不明顯改變體系的離子強度,加1,2ul都可以的.mg要調的,但我總覺得沒有書里講的那么玄乎,我都是常年不變的.如果內參照有,目的沒有,至少證明不是“美麗惹”的禍.原因書里應該都說了.在所有RNA實驗中，最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩定，一般反應不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內源性的RNA酶。

一、防止RNA酶污染的措施

1.所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。2.塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。

3.有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。4.配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經0.22μm濾膜過濾除菌。

5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。6.設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。

二、常用的RNA酶抑制劑

1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。

2.異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。

3.氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。

4.RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。

5.其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。mRNA的分離與純化

真核細胞的mRNA分子最顯著的結構特征是具有5’端帽子結構（m7G）和3’端的Poly(A)尾巴。絕大多數哺乳類動物細胞mRNA的3’端存在20-30個腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結構為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在于此。

mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA

一、試劑準備

1．3M醋酸鈉（pH 5.2）2．0.1M NaOH 3．1×上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經高壓消毒后按各成分確切含量，經混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。

4．洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS 5．無水乙醇、70%乙醇 6．DEPC

二、操作步驟

1．將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。2．用DEPC處理的1ml注射器或適當的吸管，將寡聚（dT）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。

3．使用1×上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。

4．將RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當RNA上樣液全部進入柱床后，再用1×上樣緩沖液洗柱，繼續收集流出液。

5．將所有流出液于65℃加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。6．用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內含物為無Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。7．用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly(A+)RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。

8．OD260測定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min。9．4℃離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。[注意：此時Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾干。

10.用適量的DEPC H2O溶解RNA。

三、注意事項

1．整個實驗過程必須防止Rnase的污染。2．步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級結構，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結合，否則會導致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。

3．十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會阻礙柱內液體流動，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。

4．寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯存，反復使用。每次使用前應該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。

5．一般而言，107哺乳動物培養細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，約相當于上柱總RNA量的1%-2%。

RNA酶保護試驗((RNase Protection Assay,RPA)是通過液相雜交的方式,用反義RNA探針與樣品雜交，以檢測RNA表達的技術。與Northern雜交和RT-PCR比較，RPA有以下幾個優點： 1． 檢測靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進行電泳，故損失小，提高了靈敏度。

2． 由于PCR擴增過程中效率不均一和反應“平臺”問題，基于PCR產物量進行分析所得數據的可靠性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此，分析的數據真實性較高。

3． 由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進行分析。

4． 步驟較少，耗時短。與Northern雜交相比，省去了轉膜和洗膜的過程。5． RNA-RNA雜交體穩定性高，無探針自身復性問題，無須封閉。6． 一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。7． 檢測分子長度可以任意設置，靈活性大。RPA的缺點是需要同位素標記探針。

一、試劑準備

1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。

2.雜交緩沖液 IPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。3.RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4)20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A(10mg/ml)8μl、RNase T1(250U/μl)1μl，加DEPC H2O至2ml

二、操作步驟 1．反義RNA可由含T7或SP6啟動子的重組質粒為模板制備，也可以用含啟動子的PCR產物為模板制備，本文介紹后者。（1）設計含T7啟動子的PCR引物

由于PCR產物將作為合成反義RNA的模板，所以一對引物中的下游引物5’-端要含T7啟動子序列:

T7啟動子序列為：5’-TAATACGACTCACTATAGGG

引物設計的其他要求與一般PCR引物的設計相同。PCR產物的長度決定了反義RNA探針的長度，具體設計時可考慮100-400bp長。最好采用巢式PCR，即先擴增出一較長的片段，再以該片段為模板擴增出較短的片段，以保證探針的特異性，如下圖所示：

上游引物

下游引物Ⅱ T7 啟動子序列

下游引物Ⅰ

（2）PCR

先用上游引物和下游引物Ⅰ進行PCR，再以PCR 產物為模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7進行二次PCR(具體操作參見PCR章節)。

（3）探針合成標記與純化

在0.5ml 離心管中加入下列試劑：

RNasin（40U/μl）0.5μl

GACU POOL GAC

（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM）2μl

[α-32P]UTP(10μCi/μl)2.5μl

DTT(二硫蘇糖醇，0.1M)1μl

5×轉錄 buffer 2μl

模板（50ng/μl）1μl

T7 RNA 聚合酶(15U)1μl

混合后，短暫離心，37OC保溫1hr。

加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。

加入：飽和酚 50μl 氯仿 50μl

酵母tRNA（2μg/μl）4μl

DEPC H2O 100μl

室溫下充分混勻，離心10000g×2min。取上層液置另一0.5 ml離心管中，加入100μl氯仿，混勻，離心10000g×2min。將上層液轉移至另一0.5ml 離心管中，再加入3M NaAc 10μl、預冷無水乙醇250μl，混勻后，-20OC靜置30min。4OC離心13500g×10min。棄上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗滌，4OC離心13500g×2min, 棄上清液。室溫下揮發殘留乙醇。加入50μl雜交緩沖液溶解沉淀，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測探針質量。（參見本節電泳步驟）。

2．雜交

（1）RNA提取后溶解在雜交緩沖液中，濃度為1μg/μl。

（2）取8μl RNA加入1-3μl探針（根據探針檢測結果調整）于0.5ml 離心管中。

（2）80OC保溫2min，然后40-45OC下雜交12-18hr。

3.消化

(1)雜交管于37 OC保溫15min，加入RNase消化液，37 OC保溫30min。

(2)加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混勻，37 OC保溫10min。

(3)加入65μl飽和酚和65μl氯仿，混勻，室溫離心，10000g×2min。

(4)轉移上層液到另一0.5離心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl異丙醇，混勻后，置-20OC 30min，4 OC離心,135000g×10min。

(5)棄上清液，室溫下揮發乙醇，加入5-8μl上樣緩沖液溶解沉淀。

4、電泳與放射自顯影

（1）配制凝膠：(50ml)

40%丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺（19：1）6.25ml

5×TBE 10ml 尿素 24g

加H2O至50ml

溶解后加入25%過硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混勻，注入電泳槽中，插入梳，待膠凝固。

（2）預電泳

以1×TBE為上下槽電泳緩沖液，加上電壓后進行預電泳，如果用測序電泳裝置，電壓應達2000v以上，功率設定為100w，溫度設為50 OC。待膠板溫度達50 OC時，暫停電泳，準備加樣。

（3）加樣

將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80 OC加熱2min，立即加樣到膠孔中，電泳1-2hr。（電泳條件同預電泳）。

（3）電泳結束后，打開膠板，用濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜，放置于暗盒中，暗室紅光下，壓上一張X片，蓋上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光結束后，將X光片顯影、定影、水洗、晾干。

三、注意事項

1．本實驗大部分為RNA操作，注意RNA酶的污染。

2．RNase消化液消化未雜交的單鏈RNA和探針RNA，當探針與樣品之間有堿基錯配時，錯配位點也將被消化，因此會產生片段較小的雜交片段。因此進行PCR時，采取盡量減少錯配的措施。

3、同位素對RNA合成有一定影響，有時會產生非全長的探針。因此，標記時間不宜過長。

4、RNase消化液有時會產生過度消化而無檢測信號，可以將消化液稀釋10-100倍后使用。

可能問題出在標本的保存：一般四小時之內就應處理，分離出細胞

說的是套式PCR,可以在你的第一次PCR兩個引物內,再設計一對引物進行第二次PCR就行了

如果你的第一次PCR剛好包括目的片段,那只好設計個更長的了 第二次的引物設計要求可以低一點 以50μl體系為例 引物各1μl 第一次PCR產物5μl

二次PCR和巢式PCR，即設計兩對引物進行擴增，不是一個概念，它是拿第一次的PCR產物，稀釋100-1000倍做模板，加入底物，從新進行擴增反應，以期增加產物的量

我做RT-PCR時,提總RNA時,都是用滅菌DEPC水,按1:100稀釋后測OD260和OD280,后根據公式:RNA濃度=OD260*稀釋度/25(ug/ul),后用1mg total RNA分離mRNA.做逆轉錄及PCR,效果很好.luoyu10 wrote: 各位大哥：

我有一個問題請教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低為多少，如果太低是不是會影響結果？

最低到1.8，最好2.0，我感覺稍微低一點影響不算太大。

問：我是ＲＴ－ＰＣＲ的新手，想請教引物如何設計？

好的引物所具有的令人滿意的特點：

* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。

* 選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。

* 設計5'端和中間區為G或C的引物。這會增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。

* 避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。

* 避免3'末端富含GC。設計引物時保證在最后5個核苷中含有3個A或T。* 避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。* 避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩定性。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當計算引物Tm值時并不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。有時候，僅有有限的序列信箱可供用于引物設計。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設計簡并引物。簡并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的堿基使用偏好，減少簡并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用簡并堿基，因為3'端最后3個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因為許多簡并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。

【經驗】如何確認RNA的質量 各位都知道，提取到質量良好的RNA（包括總RNA和mRNA，以下同）是非常困難，關于RNA的提取技術，我就不說了，為什么呢？或許各位非常關心呢，我是這樣想的，我可以看到的資料或者是廠家的說明書，各位也同樣可以看到的，內容當然都是一樣的了，所以實驗做的好不好，主要是心的投入多少的問題，所以希望大家自己多多思考啊！

以下兩種方法，相信大家都知道的： 1）檢測RNA溶液的吸光度 280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的，我們只看OD260/OD280（Ratio，R）。1.82.0時，我們認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的，不過要注意，當你用Tris作為緩沖液檢測吸光度時，R值可能會大于2（一般應該是<2.2的）。當R<1.8時，溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯，你可以根據自己的需要決定這份RNA的命運。當R>2.2時，說明RNA已經水解成單核酸了。

如果RNA的量夠，可在260nm（A260）用分光光度法測定RNA的得率，1個單位等于40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比值為2.0。A260/A230的比值還表明RNA的純度，其值小于2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇殘留，其值大于2.4，需用乙酸鹽，乙醇沉淀RNA。2）RNA的電泳圖譜

一般的，RNA的電泳都是用變性膠進行的，但是根據我的經驗，如果你僅僅是為了檢測RNA的質量是沒有必要進行如此麻煩的實驗的，用普通的瓊脂糖膠就可以了。

電泳的目的是在于檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認為RNA的質量是好的（見下圖）。

以上是我們常用的兩種方法，但是這兩種方法都無法明確的告訴我們RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我們很難察覺，但是大部分后續的酶學反應都是在37度以上并且是長時間進行的。這樣，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后續的實驗中就會有非常適合的環境和時間發揮它們的作用了，當然這時你的實驗也就完了。

下面，我們介紹一個可以確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。3）保溫試驗

方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。

時間到了之后，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當然，它們的條帶也要符合方法2中的條件），則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。

如果你的RNA樣本通過了保溫實驗的檢測并且你在后續的實驗中還是非常小心的防范RNA酶的騷擾，那么你的實驗應該是很難失敗了！