第一篇：細胞凋亡檢測方法總結

1、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

PS轉移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為早期凋亡細胞，顯現（FITC+/PI-）。右上象限為獨立的核（FITC-/PI+）。

Annexin-V可以再鈣離子存在的情況下，和細胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸結合，而磷脂酰絲氨酸的外翻是細胞凋亡的早期事件。

PI是一種DNA染料，當細胞凋亡的晚期，細胞的細胞膜通透性增加，PI從而進入細胞核與DNA結合。

所以

Annexin-V陰性-PI陰性 代表正常細胞

Annexin-V陽性-PI陰性 代表凋亡早期的細胞

Annexin-V陽性-PI陽性 代表凋亡晚期的細胞或壞死的細胞

Annexin-V陰性-PI陽性 一般不存在這一群細胞，如果出現這一團細胞可能是PI標記時間過長，或者操作過于劇烈而傷害到原本正常的細胞。（還有一種說法是凋亡最后階段的細胞，細胞已經沒有細胞膜了說以不結合Annexin-V而只結合PI）

2.線粒體膜電位變化的檢測

實驗原理

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想熒光探針。可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時，JC-1 聚集在線粒體的基質(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產生紅色熒光（FL-2 通道）；在線粒體膜電位較低時，JC-1 不能聚集在線粒體的基質中，此時JC-1 為單體(monomer)，可以產生綠色熒光（FL-1 通道）。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。通過 JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉變可以很容易地檢測到細胞膜電位的下降，同時也可以用JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉變作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。

JC-1 單體的最大激發波長為 514nm，最大發射波長為 527nm；JC-1 聚合物(J-aggregates)的最大激發波長為 585nm，最大發射波長為 590nm。

A-C 為對照，細胞亞群(R1)在 FL-2和FL-1 通道同時顯示 JC-1 的熒光信號。D-F 顯示 JC-1在FL-2通道熒光信號降低的細胞亞群(R2)顯著增加，證明線粒體膜電位△Ψm 下降，細胞發生凋亡。凋亡與線粒體膜電位的去極化相關。細胞凋亡時線粒體膜電位發生去極化，JC-1進入線粒體以單體形式存在，僅在Fl-1通道有熒光。

檢測原理

正常細胞：JC-1聚集在線粒體內，形成多聚體，呈鮮紅色熒光，細胞質內有綠色；即紅光++，綠光++。

凋亡細胞：由于線粒體跨膜電位的破壞，不能聚集到線粒體內，紅色熒光減弱，單體的形式存在于胞質內發綠色熒光。即紅光+，綠光++

3、Caspase-3活性的檢測

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。

(1)Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚ADP-核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

(2)熒光分光光度計分析

檢測原理：活化的Caspsae與其特異性底物DEVD-pNA結合切割，釋放出游離pNA，通過測定其吸光度，根據其發光強度的高低代表其活化程度。

(3)流式細胞術分析

PharMingen 多克隆或單克隆 Caspase-3 抗體可以識別 Caspase-3 活化形式，它特異性識別由無活性的 Pro-Caspase-3 活化水解后的暴露的斷裂端, 熒光標記多克隆兔抗 Active-Caspase-3 抗體為流式細胞術分析凋亡細胞的 Caspase-3 而設計。1、2、3是早期凋亡現象；

4、5是晚期凋亡現象。

4、TUNEL法(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記)

細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。

5、DNA ladder 細胞凋亡晚期，核酸內切酶在核小體之間剪切核DNA，產生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。細胞經處理后，采用常規方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。在瓊脂糖凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。壞死細胞---連續性條帶。

一、形態學觀察方法

1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞表面有“出芽”現象。【蘇木精 — 伊紅染色法，(hematoxylin-eosin staining)，簡稱HE染色法。蘇木精染液為堿性，主要使細胞核內的染色質與胞質內的核糖體著紫藍色 ；伊紅為酸性染料，主要使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色。】

2、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。

3、臺盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，臺盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為臺盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性，區別壞死細胞有一定的幫助。

4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。

一、細胞凋亡的形態學檢測

1、光學顯微鏡和倒置顯微鏡

（1）未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。

（2）染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態。

2、熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：HO 33342(Hoechst 33342)，HO 33258(Hoechst 33258), DAPI。三種染料與 DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。

Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。

DAPI為半通透性，用于常規固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。

結果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質出現濃縮狀態；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體(圖1)。

3、透射電子顯微鏡觀察

結果評判：凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象（cavitations）的空泡結構(圖2)；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。圖2

七、凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在國際上首先報導的一個擁有自己知識產權的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素（FITC）標記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發現，凋亡早期TFAR19表達水平增高并出現快速核轉位現象，伴隨著細胞核形態學的變化，持續較長時間，在凋亡小體中仍然可見。同時我們發現，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉位早于磷脂酰絲氨酸（PS）外翻和細胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉位是細胞凋亡更早期發生的事件之一。進一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉位具有普遍意義，不同細胞凋亡早期均出現TFAR19高表達和核轉位。這為研究細胞凋亡早期所發生的事件，提供了一種新的技術和指標。

第二篇：細胞凋亡檢測方法小結

細胞凋亡檢測方法小結

一、定性和定量研究

只定性的研究方法：常規瓊脂糖凝膠電泳、脈沖場倒轉瓊脂糖凝膠電泳、形態學觀察（普通光學顯微鏡、透射電鏡、熒光顯微鏡）

進行定量或半定量的研究方法：各種流式細胞儀方法、原位末端標記法、ELISA定量瓊脂糖凝膠電泳。

二、區分凋亡和壞死

可將二者區分開的方法：瓊脂糖凝膠電泳，形態學觀察（透射電鏡是是區分凋亡和壞死最可靠的方法），Hoechst33342/PI雙染色法流式細胞儀檢測，AnnexinV/PI雙染色法流式細胞儀檢測等。

不能將二者區分開的方法：原位末端標記法、PI單染色法流式細胞儀檢測等。

三、樣品來源不同選擇 組織：主要用形態學方法(HE染色，透射電鏡、石蠟包埋組織切片進行原位末端標記，ELISA或將組織碾碎消化做瓊脂糖凝膠電泳)。

四、細胞凋亡檢測

1、早期檢測: 1)PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測 2)細胞內氧化還原狀態改變的檢測 3)細胞色素C的定位檢測 4)線粒體膜電位變化的檢測

2、晚期檢測：

細胞凋亡晚期中，核酸內切酶在核小體之間剪切核DNA，產生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。

對于晚期檢測通常有以下方法：

1)TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記)2)LM-PCR Ladder(連接介導的PCR檢測)3)Telemerase Detection(端粒酶檢測)

3、生化檢測：

1）典型的生化特征：DNA 片段化

2）檢測方法主要有：瓊脂糖凝膠電泳、原位末端標記（TUNEL）等 3）TUNEL（末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記）4）通過DNA末端轉移酶將帶標記的 dNTP（多為dUTP）間接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過酶聯顯色或熒光檢測定量分析結果。可做細胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養物等多種樣本的檢測。

4、LM-PCR Ladder(連接介導的PCR檢測)當凋亡細胞比例較小以及檢測樣品量很少（如活體組織切片）時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。通過LM-PCR,連上特異性接頭，專一性地擴增梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產生梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA標記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。

上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細胞受到其它損傷（如機械損傷，紫外線等）也會產生這一現象，因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。需結合其它的方法來檢測細胞凋亡。其它方法：

1）Telemerase Detection(端粒酶檢測)端粒酶是由RNA和蛋白組成，它可以自身RNA為模板逆轉錄合成端粒區重復序列，使細胞獲得“永生化”。正常體細胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘，表明細胞年齡、復制衰老或細胞凋亡的信號。研究發現，90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。2）mRNA水平的檢測

研究者們發現了很多在細胞凋亡時表達異常的基因，檢測這些特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種常用方法。據報道，Fas 蛋白結合受體后能誘導癌細胞中的細胞毒性T細胞（cytotoxic T cells）等靶細胞。Bcl-2 和bcl-X(長的)作為抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的調節物，它們的表達水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。用熒光定量PCR技術來檢測基因表達水平無疑比之前者更快更準確。通過檢測fas, bax-alpha 和 bcl-X(長的)基因的 mRNA表達水平來進行細胞凋亡的檢測。

5、細胞內氧化還原狀態改變的檢測：

正常狀態下,谷光苷肽(GSH)作為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被去除。當細胞內GSH的排除非常活躍時，細胞液就由還原環境轉為氧化環境，這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低，從而使細胞色素C（三羧酸循環中的重要組分）從線粒體內轉移到細胞液中，啟動凋亡效應器caspase的級聯反應。

6、細胞色素C的定位檢測

細胞色素C作為一種信號物質，在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞漿，結合Apaf-1（apoptotic protease activating factor-1）后啟動caspase級聯反應：細胞色素C/Apaf-1復合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

7、線粒體膜電位變化的檢測：

1）線粒體跨膜電位的耗散與細胞凋亡有密切關系

2）近年來陸續有報道說明線粒體跨膜電位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰絲氨酸暴露于細胞表面。而一旦線粒體跨膜電位耗散，細胞就會進入不可逆的凋亡過程。

3）在細胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由于線粒體內膜的通透性轉變，這是由于生成了動態的由多個蛋白質組成的位于線粒體內膜與外膜接觸位點的通透性轉變孔道(PT孔道)能穩定線粒體跨膜電位就能防止細胞凋亡。線粒體在細胞凋亡作用中的進一步證據：

1）若將純化的正常的線粒體與純化的細胞核在一起保溫，并不導致細胞核的變化。但若將誘導生成PT孔道的線粒體與純化的細胞核一同保溫，細胞核即開始凋亡變化。2）形態學觀察，看到細胞數目有限，統計學上的準確性受影響；

3）凝膠電泳檢測DNA破壞了細胞的完整性也不能測出凋亡細胞占總細胞的比例； 4）流式細胞術可檢測細胞、亞細胞及分子水平的特征性變化。用于流式細胞儀檢測的染料：

PI、Hoechst、EB、DAPI、丫啶橙等，其中PI、Hoechst最常用。PI和Hoechst33342雙標：

PI、Hoechst33342均可與細胞核DNA（或RNA）結合。但是PI不能通過正常的細胞膜，Hoechst則為膜通透性的熒光染料，故細胞在處于壞死或晚期調亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。正常細胞和中早期調亡細胞均可被Hoechst著色，但是正常細胞核的Hoechst著色的形態呈圓形，淡蘭色，內有較深的蘭色顆粒；而調亡細胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。

故PI著色為壞死細胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調亡細胞。PI和Annexin-V雙標：

磷脂酰絲氨酸（PS）正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期（或細胞損傷時）PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。

Annexin-V（green）可以和磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結合。因此細胞處于調亡或壞死時，Annexin-V可為陽性（早期的壞死細胞可能為陰性）。但是只有壞死的細胞PI是陽性

五、形態學觀察

1、普通光學顯微鏡觀察

2、透射電子顯微鏡觀察

3、熒光顯微鏡觀察

1、普通光鏡下觀察：

1)用蘇木素-伊紅（HE）染色：細胞核固縮碎裂、呈藍黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細胞），正常細胞核呈均勻淡藍色或藍色，壞死細胞核呈很淡的藍色或藍色消失

2)Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常細胞核的色澤均一，凋亡細胞染色變深，壞死細胞染色淺或沒染上顏色 直接用倒置顯微鏡觀察： 1）細胞體積變小，全面皺縮；

2）凋亡小體為數個圓形小體圍繞在細胞周圍。

2、透射電子顯微鏡觀察

凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。

細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀或呈折縫樣，部分染色質出現濃縮狀態；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。

3、熒光顯微鏡

常用的熒光染料：丫啶橙、PI、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等

Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI三種染料與DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。1）PI雙染色法基本原理

Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，能進入正常細胞膜而對細胞沒有太大得細胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高。DAPI為半通透性，用于常規固定細胞的染色。碘化丙啶(PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而將細胞核染紅。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。

注意事項：細胞凋亡時，其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結構的改變使其與染料結合的能力發生改變所致。在分析結果時應該注意。

六、細胞凋亡的分子生物學檢測方法: 細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30 ﹪的染色體DNA在Ca 2+和Mg2+依賴的核酸內切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3’-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進行缺口翻譯（nick translation），使低分子量的DNA標記或染色，然后分析凋亡細胞。TUNEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。過氧化物酶標記測定法

原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產生很強的顏色反應，特異準確的定位出正在凋亡的細胞，因而可在普通光學顯微鏡下進行觀察。

毛地黃植物是地高辛的唯一來源。在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結合的配體，因而非特異性反應很低。抗地高辛的特異性抗體與脊椎動物甾體激素的交叉反應不到1％，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細胞Fc受體非特異性的吸附作用。

本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養的或從組織中分離的細胞凋亡測定。(一)試劑配制

1、磷酸緩沖液PBS（pH7.4）：磷酸鈉鹽 50mM，NaCl 200mM。

2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。

3、含2%H2O2的PBS緩沖液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS緩沖液 98.0ml。

4、TdT酶緩沖液（新鮮配）：Trlzma堿 3.63g用 0.1N HCl調節pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸鈉 29．96g和氯化鈷0.238g。

5、TdT酶反應液：TdT酶32μl；TdT酶緩沖液 76μl，混勻，置于冰上備用。

6、洗滌與終止反應緩沖液：氯化鈉 17.4g；檸檬酸鈉 8.82g；ddH2O 1000ml 7、0.05％二氨基聯苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 臨用前過濾后，加過氧化氫至0.02%。8、0.5％甲基綠（pH4.0）：甲基綠0.5g；0.1M乙酸鈉100ml。9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。

10、過氧化物酶標記的抗地高辛抗體（ONCOR）

（二）實驗步驟

1、標本預處理：（1）石蠟包埋的組織切片預處理：將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min。用無水乙醇洗兩次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室溫水解15min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2min，然后按下述步驟2進行操作。

（2）冰凍組織切片預處理：將冰凍組織切片置10％中性甲醛中，于室溫固定10min后，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃處理5min，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進行操作。

（3）培養的或從組織分離的細胞的預處理：將約 5 × 107個/ml細胞于 4％中性甲醛室溫中固定 10min。在載玻片上滴加 50～100μl細胞懸液并使之干燥。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進行操作。

2、色缸中加入含2％過氧化氫的PBS，于室溫反應5min。用PBS洗兩次，每次5min。

3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1～5min。

4、用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應液，置濕盒中于37C反應 1hr（注意：陰性染色對照，加不含TdT酶的反應液）。

5、將切片置于染色缸中，加入已預熱到37℃的洗滌與終止反應緩沖液，于37℃保溫30min，每10min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動。

6、組織切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應30min。

7、用PBS洗4次，每次5min。

8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05％DAB溶液，室溫顯色3～6min。

9、用蒸餾水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。

10、于室溫用甲基綠進行復染10min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最后1次靜置30s。依同樣方法再用100％正丁醇洗三次。

11、用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、干燥后，在光學顯微鏡下觀察并記錄實驗結果。

（三）注意事項

一定要設立陽性和陰性細胞對照。陽性對照的切片可使用DNaseI部分降解的標本，陽性細胞對照可使用地塞米松（1μM）處理3-4hr的大、小鼠胸腺細胞或人外周血淋巴細胞。陰性對照不加TdT酶，其余步驟與實驗組相同。

第三篇：細胞凋亡總結

細胞凋亡 凋亡（apoptosis）一般是指機體細胞在發育過程中或在某些因素作用下，通過細胞內基因及其產物的調控而發生的一種程序性細胞死亡(programmed cell death)。一般表現為單個細胞的死亡，且不伴有炎癥反應。

1．細胞凋亡的意義 細胞凋亡普遍存在于生物界，既發生于生理狀態下，也發生于病理狀態下。由于細胞凋亡對胚胎發育及形態發生（morphogenesis）、組織內正常細胞群的穩定、機體的防御和免疫反應、疾病或中毒時引起的細胞損傷、老化、腫瘤的發生進展起著重要作用，并具有潛在的治療意義，至今仍是生物醫學研究的熱點。細胞凋亡過多可引起疾病發生，如：①愛滋病的發展過程中，CD4+T細胞數目的減少；②移植排斥反應中，細胞毒性T細胞介導的細胞死亡；③缺血及再灌注損傷，導致心肌細胞和神經細胞的凋亡增多；④神經系統退化性疾病（Alzheimer病、Parkinson's病）的重要原因是細胞凋亡的異常增加。神經細胞的凋亡參與老化及Alzheimer病的發生。Alzheimer氏病是一種常見的老年病，患者在臨床上表現為進行性的智力減退。⑤暴露于電離輻射可引起多種組織細胞的凋亡。細胞凋亡過少也可引起疾病發生：在腫瘤的發生過程中，誘導凋亡的基因如p53等失活、突變，而抑制凋亡的基因如bCL-2等過度表達，都會引起細胞凋亡顯著減少，在腫瘤發病學中具有重要意義；針對自身抗原的淋巴細胞的凋亡障礙可導致自身免疫性疾病；某些病毒能抑制其感染細胞的凋亡而使病毒存活。

2．細胞凋亡的形態變化 電鏡下細胞凋亡的形態學變化是多階段的，可分為 ①細胞漿濃縮，核糖體、線粒體等聚集，細胞體積縮小，結構更加緊密； ②染色質逐漸凝聚成新月狀附于核膜周邊，嗜堿性增強。細胞核固縮呈均一的致密物，進而斷裂為大小不一的片段：

③胞膜不斷出芽、脫落，細胞變成數個大小不等的由胞膜包裹的凋亡小體(apoptotic bodies)。凋亡小體內可含細胞漿、細胞器和核碎片，有的不含核碎片；④凋亡小體被具有吞噬功能的細胞如巨噬細胞、上皮細胞等吞噬、降解： ⑤凋亡發生過程中，細胞膜保持完整，細胞內容物不釋放出來，所以不引起炎癥反應。左圖 典型凋亡小體：染色質呈新月狀，并可見細胞器 右圖 凋亡細胞：凋亡細胞(↑)與鄰近細胞分離 細胞凋亡 光鏡下凋亡一般累及單個或少數幾個細胞，凋亡細胞呈圓形，胞漿紅染，細胞核染色質聚集成團塊狀。由于凋亡細胞迅速被吞噬，又無炎癥反應，因此，在常規切片檢查時，一般不易發現，但在某些組織如反應性增生的次級淋巴濾泡生發中心則易見到。病毒性肝炎時，嗜酸性小體形成即是細胞凋亡。

3．細胞凋亡的機制 細胞凋亡是一系列依賴能量的分子水平變化的終點，細胞凋亡過程包括以下4個階段，即：誘導啟動、細胞內調控、實施和凋亡細胞的吞噬搬運階段。

（1）誘導啟動 引起凋亡的信號可以來自細胞外，通過跨膜傳導對細胞內的調控分子起作用；也可以直接作用于細胞內的靶分子。一些跨膜作用的抑制因子(如生長因子、某些激素、細胞因子、某些病毒蛋白等)具有抑制凋亡的作用，有利于細胞的生存。當這些因子缺乏時，會激發細胞凋亡。另外一些跨膜作用的刺激因子通過受體與配體的結合而激活細胞凋亡程序，其中最重要的是腫瘤壞死因子受體家族。此外，尚有多種其它凋亡誘導因子。在胚胎發育過程中，形態發生蛋白、生長因子、分化因子對細胞凋亡可起促進作用，又可起抑制作用。

（2）細胞內調控 細胞內的某些特異蛋白與細胞死亡信號相連接，這些特異蛋白對細胞的死亡與否起決定作用。BCL-2蛋白家族(BCL-2 family of proteins)是調節線粒體通透性的主要成分，通過形成同源(BCL-2/BCL-2, Bax/Bax)和異源(BCL-2/Bax)二聚體對細胞凋亡進行調控。BCL-2同源二聚體抑制細胞凋亡，Bax同源二聚體促進細胞凋亡。此外，細胞表面受體Fas(CD95)，屬TNFR家族，當免疫細胞產生的Fas的配體與T細胞表面的Fas結合時，也啟動了死亡程序。這種Fas-Fas配體介導的凋亡在清除免疫反應(如自身免疫病)中被激活的淋巴細胞非常重要。細胞凋亡后的梯狀DNA 足葉乙甙誘導白血病細胞凋亡后的梯狀DNA

（3）凋亡的實施 細胞凋亡的實施是通過蛋白水解的一系列連鎖反應實現的。各種組織的細胞凋亡都要激活caspase家族。Caspase成員作為酶原的形式存在于細胞內，經裂解激活后，迅速啟動序列性酶解死亡程序，裂解細胞骨架和細胞核蛋白基質并激活了核酸內切酶。在內源性核酸內切酶作用下，DNA進行有控降解，產生長度為180～200 bp整倍數的DNA片段，這正好是纏繞組蛋白多聚體的長度，提示染色質DNA恰好是在核小體與核小體連接部被切斷。DNA瓊脂糖凝膠電泳出現ladder也成為檢測凋亡發生的重要標志。

（4）凋亡細胞的吞噬搬運 凋亡細胞碎片的表面有標志分子(血小板反應素、粘附糖蛋白)有利于臨近的巨噬細胞以及其他細胞的識別、吞噬和處理。凋亡細胞的吞噬搬運過程非常有效而迅速，凋亡細胞很快消失，不留痕跡，也無炎癥反應。

4．細胞凋亡與壞死的區別 凋亡 壞死

1機制 基因調控的程序化（programmed）細胞死亡，主動進行（自殺性）意外事故性（accident）細胞死亡，被動進行（他殺性）

2誘因 生理性或輕微病理性刺激因子誘導發生，如生長因子缺乏 病理性刺激因子誘導發生，如缺氧、感染、中毒 死亡范圍 多為散在的單個細胞 多為聚集的大片細胞

3形態特征 細胞固縮，核染色質邊集，細胞膜及各細胞器膜完整，膜可發泡成芽，形成凋亡小體 細胞腫脹，核染色質絮狀或邊集，細胞膜及各細胞器膜溶解破壞，溶酶體酶釋放，細胞自溶

4生化特征 耗能的主動過程，有新蛋白合成，DNA早期規律降解為180-200bp片段，瓊脂凝膠電泳呈特征性梯帶狀 不耗能的被動過程，無新蛋白合成，DNA降解不規律，片段大小不一，瓊脂凝膠電泳不呈梯帶狀

5周圍反應 不引起周圍組織炎癥反應和修復再生，但凋亡小體可被鄰近細胞吞噬 引起周圍組織炎癥反應和修復再生

細胞自噬

細胞自噬的生理功能

1及時清除細胞中隨時產生的“垃圾”（如破損或衰老的細胞器、長壽命蛋白質、合成錯誤或折疊錯誤的蛋白質等），2維持細胞自穩狀態.無論是腫瘤細胞還是正常細胞，保持一種基礎、低水平的自噬活性是至關重要的

3.同時，自噬的產物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物質，又可為細胞提供一定的能量和合成底物.可以說，細胞自噬就是一個“備用倉庫”.鑒于上述作用，在正常生理情況下，細胞自噬可以幫助細胞在缺乏營養的惡劣環境中生存.自噬也可為腫瘤細胞帶來幾大好處：

（1）首先，腫瘤細胞本身就具有高代謝的特點，對營養和能量的需求比正常細胞更高，但腫瘤微環境往往不能如意，如腫瘤發生初始期到血管發生之前、腫瘤長大發生血管崩塌時、腫瘤細胞脫離原發灶游走時等都會出現營養不足或供應中斷，而此時提高自噬活性可以有助于度過這一危機

（2）（2）當化療、放療后，腫瘤細胞會產生大量的破損細胞器、損壞的蛋白質等有害成分，此時提高自噬活性可及時清除這些有害物質，并提供應急的底物和能量為修復受損DNA贏得時間和條件.(3)另外，抑制細胞自噬可以導致細胞更容易發生凋亡，然而，細胞自噬在腫瘤的生成和癌癥的發展中到底扮演怎樣的角色，目前還沒有取得廣泛一致的意見.細胞自噬可以抑制細胞發生癌變，可能產生于以下幾種機制

(1)細胞自噬的抑制會加重壞死細胞的局部炎癥反應，從而導致腫瘤的生長(2)而細胞自噬可以清除壞死的細胞器，調整內源性的壓力，從而穩定基因組,減少細胞向癌細胞的轉變.(3)細胞自噬既可以加強細胞檢驗點的檢查作用，又起到了穩定基因組的作用，從而減少了細胞的癌變

第四篇：生物細胞凋亡總結

課程報告

都在說二十一世紀是生命科學的世紀，很榮幸能夠進入生物科學這個行業。

關于對自己所學專業，可能最初是興趣讓我來到這個專業，不是太清楚為什么會對這個專業有這么大的熱情，但真的很喜歡它。生物技術，最官方的定義是指人們以現代生命科學為基礎，結合其他基礎科學的科學原理，采用先進的科學技術手段，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產出所需產品或達到某種目的。生物技術是人們利用微生物、動植物體對物質原料進行加工，以提供產品來為社會服務的技術。它主要包括發酵技術和現代生物技術。現代生物技術綜合基因工程、分子生物學、生物化學、遺傳學、細胞生物學、胚胎學、免疫學、有機化學、無機化學、物理化學、物理學、信息學及計算機科學等多學科技術，可用于研究生命活動的規律和提供產品為社會服務等。

再我自己看來生物技術其實是一個既可以看做一個基礎學科也可以看做是一個很新興的，綜合性的學科。其實生物技術這是一個很綜合性的學科，現在和很多領域接軌，對我們而言這是機遇和挑戰。

對我自己而言，我想在生物技術這方面有所建樹，最主要的還是在科研方面能攻克一些難題，雖然可能現在想法不是太成熟但是我相信經過幾年的磨練與努力我能夠攻破這些難題。希望能夠在大一下就能夠進入實驗室，學一些基礎的實驗技能為以后自己做項目打下基礎。

然后關于自己的專業，現在我們所學的知識其實普遍落后，教科書的編排更新不及時，可能我們學到的東西可能學校外面已經開始產業化了，測序技術已經開始第四代了，而我們可能畢業前一年才開始學習切片制作，學習的東西很古老，再就是我們這個專業，并沒有像其他幾大理科領域一樣有清晰的邏輯和量化，這導致了很多小領域只有開頭和結果而沒有一個可復制的過程，而沒有可復制的過程就代表著無法帶領這個行業產業化，因此，這個行業在沒有開源的情況下就無法支撐這個領域下的大多數學生的溫飽，就只能節流，這樣就導致了本專業的人才無法繼續從事與本專業有關行業，轉而從事其他行業，從而導致人才流失，最終專業發展緩慢。而談到生物技術不得不說到它和其他行業接軌這一問題，的確，和其他領域接軌形成交叉學科是一個理想的出路，如合成生物學，生物信息學，的確給生物注入了一股生機。但是我們都知道越巨大的事物邁步子很大也很緩慢，何況在人才流失的情況下。

說到這里，可能真的學習這個專業我們更多的是在學習了基礎課程后，自己學習最新更新的知識，在老師的指導下自己收集資料自己進行實驗，再完成項目。

很多人對生物技術這個專業有很多的誤解，我們在完成自己研究項目的同時也有義務科普大眾。畢竟這也是吸引人才的重要途徑，同時也是解決本專業人才流失的好方法。

我自己有一個不成熟的想法，很久之前曾了解到俄羅斯的“永生計劃”它的設計活體意識轉移到機器人身上，對此幾乎大多數人是不看好，不支持的。而對于這個“永生計劃” 我有一個想法，癌細胞是無限增殖，如果我們能夠完全弄清楚癌細胞的增殖過程及機理，并能夠運用到人體衰老細胞中，對衰老細胞進行基因修飾添加經過改良的癌細胞中能夠無限增殖的基因，或許“永生”并非不可能。同樣的癌細胞的無限增殖基因或許也能在器官移植這一領域有所貢獻，也是利用無限增殖，讓器官細胞增殖，成長成完整的細胞。或許研究出癌細胞無限增殖的機理并提取其這個基因對人類會有很大貢獻。

至于疑惑這個方面就是在教材更新換代不及時的情況下，我們是否只能通過課外閱讀這些方式來擴展自己的知識面，還有就是技術的更新我們是否能夠跟的上，倘若有同學本科畢業便想進入行業工作，最新的技術他們又要從何學習。最后關于實驗室，畢竟如果想要真的從事生物研究該如何合理利用現有資源來完成自己的項目。

最后我個人的話最想獲得的是關于癌細胞無限增殖機理方面的指導，和我不成熟構想的可實施率。

以上是我個人對本專業的認識及理解，以及對未來設想。

謝謝老師閱讀，有不正確的地方請老師批評指正。

第五篇：細胞凋亡實驗技術總結

細胞凋亡實驗技術總結 一形態學檢測

1、光學顯微鏡和倒置顯微鏡觀察法

未染色細胞:凋亡細胞體積變小、變形，膜完整但出現發泡現象，晚期出現凋亡小體。貼壁細胞出現皺縮，變圓，脫落。染色細胞:姬姆薩染色，瑞氏染色等。凋亡細胞染色質濃縮，邊緣化，核膜裂解，染色質分割成塊狀，形成凋亡小體。

2、熒光顯微鏡檢測法-熒光染料

例如，碘化丙啶(PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI 能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。選用536nm 激發光，細胞核呈紅色熒光。

3、電子顯微鏡

收集細胞，2.5%戊二醛4°C 固定24h，1%四氧化鋨后固定，丙酮梯度脫水，經包埋劑浸透后環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。凋亡Ⅰ期的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象的空泡結構。Ⅱa 期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。

4、激光掃描共焦顯微鏡技術

FITC-AnnexinV+PI雙染，觀察凋亡過程中細胞膜PS表面的變化，并區分正常細胞(An-PI-)，早期凋亡細胞(An+PI-)，晚期凋亡細胞及壞死細胞(An+PI+)，細胞收集過程中出現的損傷細胞(An-PI+)。

二、細胞凋亡的生化及分子生物學檢測

1、DNA 斷裂檢測法

如使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，細胞凋亡時，核染色質凝聚，染色質DNA 在核小體單位之間的連接處斷裂。凋亡早期可形成50~300kbp 的DNA 大片段，晚期核酸內切酶在核小體之間剪切核DNA，產生大量長度在180~200bp 整數倍的寡核苷酸片段。

2、膜聯蛋白V 法

磷脂酰絲氨酸(PS)位于正常細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS 可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜表面。Annexin-Ⅴ(膜聯蛋白-V)是一種分子量為35-36KD 的Ca2+ 依賴性磷脂結合蛋白，與PS高親和力。將Annexin-Ⅴ進行熒光素或生物素標記，以標記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細胞凋亡的發生。

3、細胞凋亡的酶Caspase檢測

檢測Caspase活力可用免疫雜交技術分析酶原的加工和底物水解的產物，或用人工底物檢測酶活力，也可對活化的Caspase做親和標記。例如分析底物的水解產物，PARP(多聚ADP-核糖聚合酶)第一個被認識的caspase-3底物，它的相對分子質量為116000，水解后形成相對分子質量為85000 及相對分子質量為25000 的兩個片段，用抗相對分子質量為85000 片段的抗體檢測細胞是否發生凋亡。

4、線粒體膜勢能變化的檢測

線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結合到線粒體基質，其熒光的增強或減弱反映了線粒體內膜電負性的增高或降低流式細胞儀檢測細胞的熒光強度或熒光顯微鏡觀察，拍照正常細胞中, Rh123 能夠依賴線粒體跨膜電位進入線粒體基質，熒光強度減弱或消失。而凋亡時，線粒體膜完整性破壞，線粒體膜通透性轉運孔開放，引起線粒體跨膜電位的崩潰, Rh123 重新釋放出線粒體, 從而發出強黃綠色熒光。