第一篇：2007博士分子生物學進展考試題專題

分子生物學進展考試題

2007級博士研究生（基礎）用

一、iPS細胞研究最近成為熱點，并被《自然》和《科學》雜志評為2007年重大科學進展之一。試詳細論述iPS細胞的原理、具體鑒定方法，并對其應用前景和存在的問題加以評論。

二、三、基因表達調控研究中，常用EMSA 和ChIP技術。試分別詳細論述其原試詳細論述蛋白質相互作用研究的方法原理，并給出具體事例。理、具體方法，并比較兩者區別。

四、小分子RNA在基因表達調控中起到重要作用，試論述其作用原理并比較其異同。

五、六、試詳細介紹你最近所讀的一篇你最感興趣的科學論文。Real-time PCR的應用越來越廣泛。試論述其原理及如何應用。

第二篇：分子生物學技術在醫學檢驗中的應用進展

分子生物學技術在醫學檢驗中的應用進展

[摘要] 分子生物學技術是醫學檢驗的重要診療手段。本文概述醫學檢驗中常用的分子生物學技術，列舉其在臨床病原微生物檢驗、腫瘤診斷及評估、遺傳病診斷、免疫系統疾病診斷中的具體應用，分析分子生物學技術應用中應注意的問題，并對發展趨勢進行預測。

[關鍵詞] 分子生物學技術；醫學檢驗；應用；

進展分子生物學是以核酸、蛋白質等生物大分子為研究對象的學科，分子生物學技術即建立在核酸生化基礎上的一類研究手段，現已廣泛應用于醫學檢驗中。研究內容也從DNA鑒定、擴展到核酸及表達產物分析，技術不斷進步為原微生物檢驗、腫瘤診斷及評估、遺傳病診斷、免疫系統疾病診斷提供重要依據和創新思路。現就分子生物學技術在醫學檢驗中的應用進展進行綜述，試分析應注意的問題及預測發展趨勢。

醫學檢驗中常用的分子生物學技術概述

分子生物學技術的核心是聚合酶鏈反應(PCR)，能在最短的時間內擴增。由此衍生出新PCR技術，如原位PCR技術、實時定量PCR、鏈置換擴增技術、LCR、NASBA、TAS等。此外，生物芯片技術、核酸探針技術、生物傳感器、SELEX技術、循環核酸分析技術都極大的完善了檢驗技術，直接解釋生命規律，在臨床診斷和治療中意義重大。

分子生物學技術在臨床中的具體應用

2.1 病原微生物檢驗 PCR和生物芯片技術用于病原微生物檢驗術與傳統的培養鑒定、免疫測定相比，其具有高的敏感性，較短的耗時和更廣的適用范圍[1]。PCR通過向反應管中加入特異性引物可同時鑒定出單種或多種病原體，即便存在大量死菌也能得到準確結果，不受混合標本和微生物生長時間的限制。生物芯片技術則以其更高的靈敏性和高效率，同時檢測出上百種病原微生物，可用于快速查找樣本的耐藥基因指導臨床用藥。

2.2 腫瘤及遺傳病診斷 研究證實腫瘤及遺傳病幾乎都存在著一定的基因缺陷，只要找到人體中與基因相互作用的結合點，從基因水平診斷就能準確診斷。通過基因芯片判定靶基因P53抑癌基因的突變，通過分子蛋白質組學、生物傳感器和流式細胞術診斷腫瘤特異性標志物。在遺傳病中，分子生物技術能識別患病家族基因存在的特定多態性，常用技術有DNA限制性片段長度多態性分析，單鏈構象多態性分析，熒光原位雜交染色體分析，酶基因調控和微陣列技術。

2.3 免疫系統疾病診斷 免疫系統疾病診斷關鍵是確定基因水平上的調控表達。如在人類免疫缺陷病毒的研究中，分子生物納米技術即以抗體為基礎，用免疫分析和磁性修飾的方法來檢測免疫物質，通過酶、熒光劑、同位素把特異的抗體抗原與納米磁性微球固定，既能自動檢測人免疫缺陷病毒1型和2型抗體，為人類防治病毒性疾病提供了有力的武器。

分子生物學技術在檢驗應用的新進展

現階段分子生物學新技術的發展方興未艾，給人們提供了探索人類生命科學的工具，推動了檢驗學發展。分子生物技術最顯著的醫學成就是對遺產病中的致病基因的準確定位及克隆，早在1998年就完成了遺傳性耳聾的基因克隆；2003年SARS肆虐時，科學家就研制出專門診斷該病的基因芯片；2004年后實現了用多重PCR技術對我國新生兒多發的地中海貧血、苯丙酮尿癥、G6DP缺乏癥的產前和病例診斷；近年來，遺傳標記技術的進步，結合現有分子學研究技術，加速了遺傳基因圖譜的制作和相關疾病的基因檢測和鑒定，從而為醫學檢驗的加速發展提供了有效的載體。

存在問題及發展趨勢

現階段面臨的問題主要是技術相對復雜和儀器要求太高、藥品和反應盒昂貴等[2]，限制了臨床推廣。首先，合理選用檢驗項目的問題，分子生物學方法具有高特異性和高靈敏性，但臨床中仍要根據實際需要選用經濟合理的檢驗項目，如結核菌培養和涂片鏡檢就能達到目的，不必舍廉選貴，增加患者負擔。其次，疾病診斷過度依賴檢驗結果問題，應將臨床資料綜合考慮，不能僅靠分子生物學技術檢驗結果就妄下診斷，忽略標本取樣和檢驗過程中的操作不當及病程發展規律造成的假陽性或是假陰性，貽誤病情。再者，上級部門管理不足問題，國家相關部門要擔任監管的職責，參考國際慣例，制定符合我國醫學檢驗現狀的實驗操作管理規章制度，嚴格培訓檢驗人員，規范試劑的準入和儀器的管理，最大程度保證檢驗結果的可信度。

雖然分子生物技術在臨床推廣應用中存在著許多尚待解決的問題，但是它仍然顯現出了快速發展的趨勢。未來其發展會傾向于：①現有、僅停留在實驗室的分子生物學技術逐步向臨床實用型改進，降低實驗投入、簡化操作步驟，推進實驗過程全自動化的實施降低人為因素對結果的影響，根據臨床實際修正技術，提高檢驗的特異性和敏感性。②積極推進實驗室建設，加大儀器和檢驗人員的培訓投入，為分子生物學的臨床應用提供必要的基礎保障，以先進的、可持續性的實驗檢驗手段為臨床提供可靠的依據。

參考文獻

[1] Yuregir OO,Sahin FI,Yilmaz Z,et al.Fluorescent in situ hybrid-ization studies in multiple myeloma[J].Hematology,2009,14(2):90-94.[2] 李鵬.現代分子生物學技術在醫學檢驗中的應用[J].臨床和實驗醫學雜志,2007,3(6):161.PCR在現代醫學檢驗中的應用 關鍵詞：醫學檢驗應用PCR現代醫學檢驗

王耿新 劉德亮 王志群 陳獻業

山東省青島市腫瘤醫院 青島 266042

聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）又稱體外基因擴增技術或 DNA 擴增技術。自 1985 年美國 PE-Cetus 公司的 K.B Mullis 等人首創了 PCR 技術之后，它以相當驚人的速度被廣泛地應用于醫學及分子生物學等各個領域。現今，PCR 技術已成為一種對標本中特定的 DNA 片段進行分析研究和檢測鑒定的重要方法。近20 年來 PCR 技術在生物醫學等各個研究領域和臨床應用中發揮了重大的作用，在病原體鑒定、遺傳病診斷、免疫學研究、癌基因探索及治療等方面都作出了相應的貢獻。

1.PCR 技術的基本原理與特點 [1-2]

PCR 技術的基本原理是模仿 DNA 體內復制的機制，在體外進行擴增特異的 DNA 片段。它主要是由三個基本步驟組成的循環反應。首先是變性，用加熱的方法使雙鏈 DNA 解鏈成兩股單鏈；其次是復性，用降溫的辦法使這兩股單鏈按堿基互補的原則分別與加入的兩條人工合成的寡聚核苷酸鏈（引物）結合成雙鏈；最后是延伸，在合適的緩沖液、鎂離子及脫氧核苷酸存在的條件下，用 DNA 聚合酶進行催化，按堿基配對的原則合成互補鏈。引物從 3 '端進行延伸，合成的方向為 5 '端（一條人工合成的引物）至 3 '端，從而合成與模板 DNA 結構相同的片段。重復上述三步驟，變性→復性→引物延伸的過程，經過約 30 個周期的循環（每三個步驟為一周期，約需 2-3 分鐘），1-2 小時就能將所需基因擴增幾百萬倍，使極微量的所需 DNA 達到極易檢測的水平。其擴增效率公式為： Y=（1+X）n，式中 Y 為擴增數目，X 為放大效率，n 為循環次數。

PCR 技術具有敏感性高、特異性強、操作簡便、快速省時等特點。其靈敏度可達到 Pg 級，甚至達到 fg 級 [3] 水平，而被擴增的基因片段能與原基因片段保持不變。PCR 技術操作簡便、快速而易掌握，并且對標本要求不高。用過去的方法完成一項試驗少則幾周，多則幾個月。應用全自動 DNA 擴增儀，整個 PCR 過程均由電腦控制，只需數小時即可完成整個試驗過程，用極微量的粗制標本就可獲取目的產物。

2.常用的幾種 PCR 及主要用途 [4-5]

2.1 定量 PCR ：用于 mRNA 定量及轉錄水平的研究。

2.2 抗原捕獲 PCR（AC-PCR）：用于病毒感染的檢測。

2.3 不對稱 PCR（Asymmetric PCR）：用于制備探針或測序。

2.4 彩色 PCR（CCA-PCR）“用于檢測某些多型別病毒的混合感染。

2.5 原位逆轉錄 PCR（In Situ RT-PCR）：定位檢測細胞中 RNA 病毒感染。

2.6 逆轉錄 PCR（RT-PCR）：用于克隆 cDNA、檢測 RNA 病毒、cDNA 探針。

2.7 反向 PCR（inverted PCR）：用于擴增已知基因片段兩側的未知序列。

2.8 膜 PCR（membrane-bound PCR）：可去除污染的雜質或 PCR 產物殘留，檢測低豐度靶 DNA。

2.9 間接原位 PCR（Indirect In Situ PCR）：定位檢測細胞中 DNA 病毒感染，是目前應用較廣泛的一種原位 PCR 技術，其特異性比直接 PCR 強。

3.PCR 技術在醫學檢驗中的地位

現代醫學研究證明，人類疾病多數是直接或間接與基因有關 [6]，如腫瘤、糖尿病和心血管疾病等。在醫學實驗診斷中我們經歷了生化和免疫診斷的發展過程，由于各類擴增技術的出現使我們進入了基因診斷的新時代并成就了現代意義基因診斷的崛起。這將改變以往對疾病的表型認識和表型診斷，從本質上認識疾病和診斷疾病。在各類擴增技術中，PCR 的地位尤為突出。目前，全世界利用 PCR 技術診斷感染性疾病每年達幾千萬人次，其費用早已大幅下降，說明 PCR 有著巨大的潛在市場。美國臨床檢驗標準化委員會于 1995 年頒布了關于感染性疾病分子診斷應用范圍、條件和質量控制細則等準則文件 [7]。而國際臨床化學學會于 1998 年又發布了關于分子擴增在臨床診斷中應用的質量評估基礎的文件并對 PCR 操作的各個環節進行了詳細論述 [8]。由此可見，兩個權威性文件也都肯定了 PCR 技術在醫學檢驗方面的重要性。基因診斷可能將是以后的發展方向并作為疾病的常規診斷技術。

4.PCR 技術在醫學檢驗中的應用

4.1 PCR 技術在腫瘤方面的應用

目前，腫瘤發病的分子機制尚不完全清楚。研究表明，人類許多常見的腫瘤疾病與某些病毒病因及腫瘤相關基因的遺傳學改變有著密切的關系。PCR 技術的腫瘤病毒病因、腫瘤相關基因、腫瘤相關抑癌基因等研究方面已取得可喜成果。

據有關資料表明 [1，4] 前列腺癌、結腸癌和 Kaposi 肉瘤等與人巨細胞病毒（CMV）有關；鼻咽癌和 Burkitt 淋巴瘤與 EB 病毒有關；原發性肝癌與乙型肝炎病毒（HBV）有關；泌尿道腫瘤和食道腫瘤等與人乳頭瘤病毒（HPV）有關。人類腫瘤病毒病因中較為重要的一類病毒是 HPV，其中大部分只與良性增生有關，只有 16、18、31、35、39 等十余型與惡性腫瘤關系密切。PCR 在檢測 HPV，尤其是第 16、18 型有無感染，對子宮頸癌的早期診斷及預防有著顯著的意義。

目前，已知腫瘤相關基因有上百多種，但較常見的是 ras 家族的 H-ras、K-ras 和 N-ras 三種癌基因。它們的結構相似，其表達產物是 P21 蛋白。在不同腫瘤中 ras 家族癌基因的 H-ras、K-ras 點突變多集中在第 12 和 61 號密碼子上，而 N-ras 在第 13 號密碼子上多發生突變。PCR 在癌基因的研究方面主要是 ras 基因與腫瘤的關系。現已查明與 ras 基因突變有關 [1，2，4，9，10] 的腫瘤有幾十種。如：各種急性慢性白血病、精原細胞癌、惡性黑色素瘤、神經母細胞瘤、卵巢癌、胰腺病、肺癌、膀胱癌、結腸癌、子宮瘤等。Rb 基因 [11] 是人類最早（1986 年）發現的抑癌基因，其后又相繼發現了 P53、WT1、NF1、DCC、MCC、APC、P16 和 P21 等抑癌基因。在遺傳性視網膜母細胞瘤研究中發現位于 13 號染色體上 Rb 基因的缺失與癌變有關。在許多常見腫瘤，如骨肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等惡性腫瘤中，常發現該基因失活 [11]。在對 P53 基因的研究中 [12-14] 發現該基因的突變和缺失是許多腫瘤發生的原因，這些腫瘤主要有子宮頸癌、肝癌、成骨肉瘤等。遺傳學改變主要是引起癌基因激活和抑癌基因的失活，使基因發生突變、缺失、增加和易位等而導致了細胞癌變。PCR 不但能有效地檢測基因的突變、重排、易位等，而且能準確檢測癌基因表達量，可據此進行腫瘤早期診斷、鑒別、分型、分期、治療及預后評估等。

近年，剛興起的熒光定量逆轉錄（RT）-PCR [10] 在腫瘤診斷、治療和微轉移以及微小殘留病灶檢測等方面具有廣泛的應用價值。研究表明，癌細胞或癌前期細胞在進入血液循環以后，通過定量 RT-PCR 檢測外周血腫瘤特異性標志物 mRNA，可進行實體腫瘤的篩查，檢測腫瘤術后及淋巴轉移陰性的病人外周血腫瘤細胞的數量，以便估計腫瘤的復發和轉移，制訂合理的治療方案。另外，定量 RT-PCR 還可用于腫瘤耐藥基因（MDR1）[10] 表達水平檢測，為臨床篩選化療藥物及治療方法提供依據。

4.2 PCR 技術在遺傳病方面的應用

PCR 技術首次臨床應用 [10] 就是從檢測鐮狀細胞和 β-地中海貧血的基因突變開始的。十幾年來，該技術在遺傳病診斷的臨床應用方面獲得了極大的成功。它能用于檢測已知基因序列的任何遺傳病基因的突變，如倒位、缺失 / 插入、動態突變、部分高發的點突變及表達量的異常等都可通過基因分析直接檢測用于臨床進行診斷，像地中海貧血、血友病、杜氏肌營養不良癥、脆 X 綜合征、苯丙酮尿癥等這些遺傳性疾病。PCR 在遺傳病診斷及遺傳病預防與產前基因診斷方面具有明顯的應用價值，PCR 產物直接測序已成為檢測遺傳病基因突變的常用方法。另外，PCR 在鑒定編碼抗生素耐藥性基因 [10]，尤其是在細菌不攜帶同源性序列且取單個菌落進行 PCR 擴增時，具有較高的特異性和敏感性。

4.3 PCR 技術在感染性疾病方面的應用 目前 PCR 在醫學檢驗中對感染性疾病的診斷 [10，15] 極具突出，只要核酸序列是清楚的，就可以檢測到任何有限的病原體。一般實驗室可檢出 10-100 個基因拷貝，而目前，病原體抗原檢測方法一般需要 10 5 ～ 10 7 個病原體才能檢測到。PCR 技術的運用解決了免疫學檢測的“窗口期”問題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態。再者，抗體檢測不能判定是現癥感染還是既往感染時，也需要用 PCR 方法來確定。另外，病原體感染后的發病時間和病情輕重均與病原體數量有關。如艾滋病（AIDS）由人免疫缺陷病毒（HIV）感染后，可根據 HIV 檢測的含量預知發病的時間。因為 AIDS 潛伏期的長短和臨床癥狀的輕重與血液中的病毒量呈顯著相關。在其它病毒性疾病中也多半存在類似情況，這均需 PCR 來定量說明。

PCR 在 HBV 定量研究中表明，HBV 載量與肝炎的發生、發展、預后以及與藥物療效有關，并證明定量 PCR 是鑒別 HBV 感染各期的良好工具。該技術能有效地確定血清 HBeAg 轉陰和非活動性攜帶者病人的 HBV DNA 水平，而常規雜交法則對這些低病毒血癥的 HBV DNA 探測不到。在抗病毒治療中，通過定量 PCR 檢測 HBV 的載量，來觀察拉咪呋啶及多種聯合用藥治療慢性乙型肝炎的療效具有指導意義。

PCR 對某些傳染性疾病疫苗接種后感染的鑒別也是極為重要的。例如：腮腺炎病毒疫苗接種后感染的病例時有發生，是疫苗引起的還是野生型腮腺炎病毒引起的，這就需要一種行之有效的方法來進行鑒別，以往的血清學、病毒培養及探針雜交等方法都很難做到。

過去，對結核病等其他分支桿菌病的診斷方法雖然很多，但均不夠理想。簡便易行的方法經常查不到抗酸桿菌，也無法鑒別結核桿菌與其他分支桿菌。用分支桿菌培養的方法且陽性率較低又耗時，而麻風桿菌在體外又不能培養，主要靠感染組織的涂片或切片鏡檢。其他方法，如血清學、氣相色譜等方法的敏感性及特異性都不夠理想，PCR 技術的運用使上述問題得到了解決。還有 PCR 技術在技術性病監控和性病病原體的檢測方面也正在擴大，并列為監控手段和作為檢測的金標準。

5.PCR 技術在醫學檢驗應用中的問題 5.1 假陽性

通常 PCR 在醫學檢驗應用中所面臨的問題之一是擴增產物污染帶來的假陽性，而實驗室污染又是假陽性的主要因素。只要實驗室被擴增產物污染，擴增片段隨時都可能污染新的樣本并又被同一 PCR 反應體系擴增出來而產生假陽性。解決的根本措施就是在封閉狀態下進行擴增和產物分析。近年發展了一種熒光定量 PCR 技術，從根本上解決了 PCR 擴增產物污染和不能定量的問題。該技術把基因擴增 PCR、分子雜交和光化學融為一體，實現了對 PCR 擴增產物進行全過程的封閉，并進行實時動態檢測和自動分析結果，進一步提高了其特異性。由于造成假陽性的因素相對單一，因此假陽性并不是困惑檢驗工作的主要原因。

5.2 假陰性

PCR 假陰性的原因相對較為復雜，主要包括有儀器設備的質量、試劑開殼劑和操作問題、PCR 產物的電泳檢測時間及有關 PCR 反應的關鍵環節等。PCR 儀本身的質量問題能使擴增效率下降或造成非特異性擴增而出現假陰性或假陽性。離心機的質量問題或使用不正確，可造成離心標本模板不能分離而產生假陰性。試劑開殼劑和操作問題造成標本 DNA 沒有暴露出來，致使擴增無法進行而導致假陰性。PCR 產物的電泳檢測時間一般為 48h 以內，大于 48h 后帶型不規則甚致消失不出現擴增條帶而程現假陰性。PCR 反應的關鍵環節有模板核酸的制備、引物的質量與特異性、酶的質量及 PCR 循環條件等，在這些環節中操作不當都可引起假陰性。另外，Mg 2+ 濃度和物理因素變性等對 PCR 擴增效率影響也很大。Mg 2+ 濃度過高可降低 PCR 擴增的特異性，濃度過低則影響 PCR 擴增產量。而變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低異性擴增效率；退火溫度過高，影響引物與模板的結合而降低 PCR 擴增效率，最終都可導致 PCR 擴增失敗。還有靶序列變異使引物與模板失去互補序列，其 PCR 擴增也不會成功。

6.PCR 技術的應用前景 自從 PCR 技術誕生以來，隨著其深入不斷的發展與完善，許多與其相關的新類型及改良的新方法在不斷的涌現，這些派生出的新類型和新方法解決了以往傳統 PCR 的瓶頸問題。雖然，PCR 可對基因分析直接檢測用于臨床進行診斷，但大部分基因突變還是難以直接檢測。近年來，分子診斷技術最大突破就是集擴增、檢測和靶定量于一體的實時熒光 PCR 技術的問世。該技術的出現，對基因檢測和基因分型的應用范圍將進一步擴大，為 PCR 的臨床應用帶來曙光。因此，PCR 技術將有極大的發展空間和廣泛的應用前景，它將對腫瘤學、遺傳學、免疫學、微生物學、寄生蟲學和基因治療等進一步研究及臨床應用起著積極重要的作用。在現代醫學檢驗中，PCR 的應用將更加廣泛和深入。相信在不久的將來，隨著 PCR 技術的更進一步完善，它將作為常規檢驗方法進行全面普及，發揮更大的作用，為全人類健康做出更大的貢獻。

參考文獻

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第三篇：在分子生物學博士與地理信息學博士婚禮上的致辭(原創)

在分子生物學博士與地理信息學博士婚禮上的致辭

尊敬的各位領導、各位來賓，女士們、先生們：

大家中午好！歡迎各位親朋好友參加李海峰先生、王慧敏小姐的婚禮，受新娘父母的委托，由我擔任本場婚禮的司儀。

首先，我們為這一對新人的結合感到由衷的驕傲，大家知道：新郎李海峰先生是武漢大學的博士研究生，目前在廣州無限極博士后流動站從事研究工作；新娘王慧敏小姐是中國地質大學的碩士研究生，目前在武漢大學攻讀博士學位。在座的親朋好友當中，也有很多碩士、博士研究生，可以毫不夸張的說，兩位是江漢假日酒店開業以來學歷最高的一對新人，大家的到來使這里蓬蓽生輝，華堂添彩。

其次，我們這一對新人的結合可以說是佳偶天成，大家知道：新郎李海峰先生所研究的專業為分子生物學（molecular biology science），基于微觀的角度，從研究分子的結構和功能進而闡明生命現象的本質；新娘王慧敏小姐所研究的專業為地理信息系統（geographic information system），基于宏觀的角度，運用信息技術和數據分析的方法研究國家地理。一個是微觀世界的分子，一個是宏觀世界的地理，大家說這樣的結合是不是一種絕配！

最后，為我們今天這一對新人的結合送上希望和祝福：

一是希望你們孝順父母、尊重師長、關愛他人，運用作用力與反作用力的原理，用等量的愛回報父母師長對你們的饋贈；遵循能量守恒的原則，將大家的給予化成愛的分子，回報社會。

二是希望你們處理好學業、工作和生活的關系，對于你們而言學業和工作就像是銀河系，而日常生活像是太陽系，當太陽系在銀河系中運轉的時候，它自身的運轉也一刻沒有停歇，所以不要為了科學研究而忘卻生活。

三是希望你們正確對待愛情和婚姻的轉變，愛因斯坦的關于相對論曾經有一個注明的論斷，“到底是雞過馬路，還是馬路過雞，這取決于你的參考坐標。”其實，他想說的是，很多事情其實都不是非得分出一個對錯，這也許就是婚姻的真諦。

最后，我還要由衷地祝福兩位新人！愿你們的愛情充滿正能量，在今后的生活中不斷地發光、發熱。同時也衷心地祝福各位來賓，愿大家萬事如意，幸福安康！

第四篇：協和醫科大學2004年分子生物學(博士入學考試試題 回憶版)

協和醫科大學2004年分子生物學（博士）

1.名解:

同工酶 染色體 染色質 核基質 轉化 密碼子的偏嗜性 基因簇

2.簡答

為什么核酸和蛋白都是有方向的?

信號轉導的cAMP通路

什么是內切酶的星號活性

3.判斷對錯,說明理由

關于乳糖操縱子的4.論述

給定一個cDNA序列,如何表達,純化到蛋白質

5.填空

協和生化的老主任是誰(這道題好變態)

誰用什么實驗證明了核酸是遺傳物質

可以磷酸化的氨基酸是哪三個

帶苯環的氨基酸是哪三個

DNA在多少nm有最大的光吸收,為什么?

第五篇：分子生物學

分子生物技術在微生物鑒定中的應用

摘要：微生物多樣性是生物多樣性的重要組成部分。由于微生物和 動、植物 相比, 存在著多種顯著差異。而傳統的基于微生物培養與純種分離的技術具有很大的局限性，分子生物學及其有關技術的長足進展及其在為生物中的使用, 使微生物的研究進入了分子的階段。

關鍵詞：16SrDNA PCR 溫度梯度電泳 變性梯度凝膠電泳 微生物包括了從原核到真核的不同類群的生物: 細菌、放線菌、原生動物、真菌、部分藻類和病毒, 是生物多樣性的重要組成部分。此外, 微生物多樣性與其他生物類群相比有許多獨特之處, 包括: 1)生存環境多樣;2)生長、繁殖速度多樣;3)營養、代謝類型多樣;4)生活方式多樣。因而, 微生物多樣性的研究無論對于生態系統功能的完整理解, 還是對于微生物資源的利用和開發都具有特殊重要的意義[1]。微生物作為生態系統中極重要的一員, 對動植物的生長，生態系統中的能流和物質循環及環境污染物的降解和解毒等方面起著重要作用并且與人的生活健康息息相關。隨著微生物的不斷發現及研究，傳統微生物技術越來越不能滿足其發展的需要，最主要的不足是丟失了微生物的多樣性, 許多報道都指出, 在自然環境中有相當多的菌種(約90%-99%)用傳統方法無法培養出來[2].這對于微生物基因組學研究來說是很不利的.，導致研究的片面性并且效率低下。而分子生物學技術則避開了傳統微生物培養分離的環節, 而是采取直接從樣品中抽取所含微生物總DNA, 然后通過16S rDNA, PCR, RAPD, DGGE

和RFLP 等多種分子生物學研究手段, 對直接提取的總DNA進行分析, 了解其中所包含的微生物DNA 的種類和含量, 以研究樣品中微生物的實際組成, 同時可以利用直接提取得到的總DNA 建立基因文庫, 并從中篩選有用的基因。由于是直接從樣品中提取總DNA, 中間沒有任何篩選性的過程, 因此, 所得DNA 能夠準確地反映樣品中微生物的實際情況, 避免了傳統培養方法不能真實反映微生態實際情況的缺點, 也不會丟失樣品中存在的任何微生物,同時, 這種方法能夠很容易、大批量地取得同一環境下乃至不同環境下的不同微生物的同源基因, 為微生物比較基因組學研究開辟了道路.此外, 用直接提取的總DNA 構建的基因文庫, 包含了大量以前因為無法培養而不能獲得的微生物基因, 從這些文庫中發現全新的具有巨大應用價值的抗生素類、酶類及其他生物活性物質的基因應該是非常有潛力的。1．16SrRNA比較測序

16SrDNA是編碼原核生物16SrRNA的基因，長度約1500bp，存在于所有的原核生物的基因組中，由多個保守區和與之相間的多個可變區組成。保守區為所有細菌共有，細菌之間無顯著差異；可變區在不同細菌之間存在一定程度的差異，具有細菌屬或種特異[3]。2.PCR近年來,對環境樣品總DNA 進行PCR 擴增, 推動了利用分子標記技術研究微生物的多樣性。PCR技術是美國letus公司人類遺傳研究室的科學家與1983年發明的一種在體外快速擴增特異基因或DNA 序列的方法, 其目的是將極微量DNA大量擴增。該技術模仿生物體內DNA 的復制過程,首先使DNA 變性, 兩條鏈解開;然后使引物模板退火, 二者堿基配對;耐高溫的Taq DNA 聚合酶以4種dNTP為底物, 在引物的引導下合成與模板鏈互補的DNA 新鏈[4]。PCR 技術可在體外快速擴增DNA, 具有快速、簡便、靈敏度高的特點。當然常規 PCR技術也存在很多的問題，如出現假陽性、形成引物二聚體、傳統的PCR技術一次擴增只能檢測一種微生物、RNA病毒的PCR檢測操作繁瑣，中間污染環節多，易出現假陽性或假陰性結果等.為了彌補上面這些不足，一些新的PCR技術逐漸衍生出來并被用于實踐，如熱啟動PCR、巢式PCR、逆轉錄PCR、多重PCR、通用引物PCR、PCR單鏈構象多態性分析、隨機引物DNA 多態性擴增（RAPD）、限制性長度多態性分析（RFLP）、實時熒光PCR（real-time PCR）等[5]。3.電泳分離及其顯示方法

除過我們熟知的瓊脂糖凝膠電泳并用溴乙錠(EB)染色方法和聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE 分離)銀染方法外, 還有一些通過特殊的電泳分離技術而建立的分子標記, 如變性梯度凝膠電泳(DGGE), 可分離長度相同但是序列不同的DNA 片段的混合物。對于特異性引物PCR 擴增的環境微生物的16SrRNA 基因, 一般的電泳很難將序列不同的片段分開。DGGE膠在聚丙烯酰氨膠中添加了線性梯度的變性劑, 可以形成從低到高的線性梯度, 在一定溫度下, 同一濃度的變性劑中, 不同序列的產物，其部分解鏈程度不同。DNA 解鏈程度不同決定其電泳的遷移率, 結果不同的產物在凝膠上分離開。在變性條件適當的情況下, 該技術能分辨一個堿基對。DGGE 技術在微生物群落結構 的研究、微生物種群的動態分析、富集培養以及分離物的分析、16SDNA 同源性的分析中得到廣泛應用[6]。

溫度梯度電泳(TGGE)是利用不同構象的分子具有不同的變 性溫度來進行分離, 最先應用于DNA /RNA 的分子構象分析和序列變異分析, 是一種新出現的檢測點突變的電泳技術, 其最大特點上具有高分辨能力。單鏈構象多態性(SSCP)也是根據不同的結構對DNA在凝膠中遷移速率影響很大, 結果不同序列的DNA 片段在凝膠上得以高分辨率的分離。基因芯片可分為cDNA 芯片、寡核苷酸芯片及基因組芯片。在一定條件下, 載體上的核酸分子可以與來自樣品的序列互補的核酸片段雜交。如果把樣品中的核酸片段進行標記, 在專用的芯片閱讀儀上就可以檢測到雜交信號[7]。

分子生物學技術在環境微生物研究中的應用中rRNA 技術提供了一種擺脫傳統的純種培養方法而鑒定環境微生的途徑,并已被廣泛應用于微生物的各個領域。雖然當前,標準rRNA 技術的靈敏度還難以檢測到低豐度的(低于1/ 1 000)在群落中僅占很小比例的微生物種類, 從而使之在微生物生態以及環境學上的應用受到很大的限制。然而, rRNA 技術與其它的分子技術以及特別是與傳統的純種培養方法相結合, 具備分析微生物多樣性的巨大潛力。隨著這些新的分子方法的不斷改進以及rRNA 數據庫中序列信息的不斷增加, 我們能探知更多的未知的微生物世界。

參考文獻：

[1]楊永華，姚健.分子生物學方法在微生物多樣性研究中的應用[J].生物多樣性，2000 8(3):337-342.[2]李 紅,周友兵,陳炳耀,胡錦矗.分子生物學技術在微生物多樣性研究中的應用[J].河北大學學報(自然版),2003 12(23).[3]朱詩應，戚中田.１６ＳｒＤＮＡ擴增及測序在細菌鑒定與分類中的應用[J].微生物與感染,2013 8(2):104-109.[4，7] 高小朋, 張欠欠, 任桂梅.分子生物學技術在環境微生物研究中的應用[J].延安大學學報(自然科學版),2008 9(27)：27-45.[5] 路則寶，白現廣。分子生物學技術在微生物檢驗中的應用研究進展[J].紅河學院學報，2013 4（1）38-46.[6]雷正瑜.16RsDNA序列分析技術在微生物鑒定中的應用[J].湖北生態工程職業技術學院學報，2006 1（4）：35-45.