第一篇：新微生物學實驗復習提綱

微生物學實驗復習提綱

1.研究微生物學的基本技術有哪些？（顯微鏡技術、無菌技術、純種分離技術和純種培養技術）

2.光學顯微鏡又稱“復式顯微鏡”，由哪兩部分組成？顯微鏡的什么最為關鍵？為什么？

3.油鏡的放大倍數為多少？與其他物鏡相比，油鏡的使用比較特殊，需在載玻片與鏡頭間滴加什么？其什么作用？

4.影響顯微鏡分辨率的因素有哪些？（光源的波長、物鏡的鏡口角和鏡頭間介質的折射率）

5.油鏡使用后應怎樣處理？鏡油擦拭的正確方法是怎樣的？

6.制造接種環、接種針的金屬常用,原因是.7.培養皿的包裝一般以多少套作一包比較合適？5~8套。

8.滅菌吸管的包裝的注意事項：（1）吸管必須干燥;(2)處，塞一小段約1.5cm長的棉花（不能用脫脂棉）。作用是避免外界及口中雜菌吸入管內，并防止菌液等吸入口中。

9.空的玻璃器皿一般用，若用濕熱滅菌。則要多用幾層報紙包扎，外面最好加一層牛皮紙或鋁箔。

10.11.簡單染色的原理是什么？其主要操作步驟是什么？固定的作用是什么？染色過程中應注意哪些環節？

12.革蘭氏染的原理及步驟是什么？革蘭氏染色后的正確結果是什么顏色？

13.你認為哪些環節會影響革蘭氏染色結果的正確性？其中最關鍵的環節是什么？ 答：（1）涂片不宜過厚，以免脫色不完全造成假陽性；

（2）脫色，此環節最關鍵。脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌；脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。

（3）菌齡也影響染色結果。如陽性菌培養時間過長或已死亡及部分菌自行溶解了，會出現陰性反應。

14.酵母的死細胞和活細胞可通過哪些方式鑒別？

15.霉菌的直接制片觀察法常用什么染色劑？此染液的優點是什么？

16.細菌、放線菌、酵母菌和霉菌四大類微生物的菌落各有何特點？

17.為什么霉菌菌落的中央與邊遠、正面與反面在外形、顏色、構造等方面常有明顯的差別？放線菌、細菌和酵母菌呢？（理解）

18.測量微生物大小的工具是什么？包括哪兩部分？功能各是什么？

19.如何校正目鏡測微尺刻度？計算公式？更換不同放大倍數的目鏡活物鏡時，是否需要重新校正？

20.培養基按化學成分、物理狀態、用途劃分可分為哪幾種類型？

21.實驗常用的凝固劑是哪一種？固體培養基、半固體培養基及液體培養基加凝固劑瓊脂的量為多少？瓊脂在什么溫度下溶化？什么溫度下凝固？

22.配制培養基時應遵循哪些原則？配制培養基的一般方法和步驟是什么？配制培養基時不可用銅鍋或鐵鍋，原因是什么？調pH一般用什么試劑調？配制pH低的瓊脂培養基時，應怎樣配制？

23.培養基分裝時，液體分裝高度以試管的多少為宜，三角瓶的多少為宜？固體分裝高度以試管的多少為宜，三角瓶的多少為宜？半固體分裝高度以試管的多少為宜？

24.培養基滅菌時外用牛皮紙包扎的目的是什么？

25.擺斜面的正確方法是什么？

26.棉塞的作用是什么？正確的棉塞要求是什么？棉塞的長度多少在管口外，多少在管內為宜？作棉塞的棉花要求是什么？能否用脫脂棉？為什么？

27.培養基配好后，為什么必須立即滅菌？如果來不及滅菌應如何處理？

28.牛肉膏蛋白胨培養基、高氏Ⅰ號培養基、馬丁氏培養基、馬鈴薯（PDA）培養基、麥芽汁培養基或豆芽汁培養基分別培養什么微生物？

29.什么是選擇性培養基？試分析教材P98酵母菌富集培養基和Ashby無氮培養基的選擇原理。

30.什么是鑒別性培養基？試以EMB培養基為例，分析其鑒別作用的原理。

31.蛋白胨稱取時應怎樣？為什么？溶解可溶性淀粉的正確方法是什么？高氏Ⅰ號培養基中0.001%FeSO4 7H2O配制的正確方法是什么？

32.配制合成培養基加微量元素時最好用什么方法加入？天然培養基為什么不需要另加微量元素？

33.馬丁氏培養基中孟加拉紅、鏈霉素的作用是什么？鏈霉素應如何加入？

34.采用什么方法能分離到能分解并利用苯作為碳源和能源物質的細菌純培養？（以苯作為唯一碳源的選擇培養基）

答：①從苯含量較高的環境中采集土樣或水樣；②配制培養基，倒平板，一般僅以苯作為唯一碳源（A），另一種不含任何碳源作為對照（B）；③將樣品適當稀釋（十倍稀釋法），涂布A平板；④將平板置于溫度適當的條件下（37℃）培養，觀察是否有菌落產生；⑤將A平板上的菌落編號并分別轉接至B平板，置于相同溫度條件下培養（在B平板上生長的菌落可利用空氣中的CO2的自養型微生物）；⑥挑取在A平板上生長而不在B平板上生長的菌落，在一個新的A平板上劃線、培養，獲得單菌落，初步確定為可利用苯作為碳源和能源的微生物純培養物；⑦將初步確定的目標菌株轉接至以苯作為唯一碳源的液體培養基中進行搖瓶發酵實驗，利用相應的化學分析方法定量分析該菌株分解苯的情況。

35.什么是滅菌？消毒？列表比較高溫滅菌或消毒的各大方法的溫度、時間、適用對象？

36.干熱滅菌原理是什么？為什么干熱滅菌比濕熱滅菌所需要的溫度高，時間長？

37.在干熱滅菌過程中應注意哪些問題,為什么？

38.高壓蒸汽滅菌的關鍵技術是什么？（壓力上升之前需將鍋內冷空氣排盡）

39.高壓蒸汽滅菌開始之前，為什么要將鍋內的冷空氣排盡？滅菌完畢后，為什么待壓力降低“0”時才能打開排氣閥，開蓋取物？

免？

40.對含糖（如葡萄糖或乳糖等）培養基進行高壓蒸汽滅菌時，應采用大多壓力、多長時間滅菌為宜？

41.對血清、噬菌體濃縮液、氨基酸溶液、維生素溶液、抗生素溶液能否進行高壓蒸汽滅菌？應采用何種方法除菌為宜？

42.紫外線滅菌的原理及適用對象是什么？

43.過濾除菌法的適用對象是什么？缺點是什么？

44.微生物的平板分離純化技術是哪位科學家發明的？德國人科赫

45.微生物分離純化常用的方法有哪些？劃線法、單細胞挑取法、稀釋平板法、選擇培養基法

46.如果要從自然界中篩選能產高溫蛋白酶的菌株，你將如何完成？寫出簡明的實驗方案。

47.如果用牛肉膏蛋白胨培養基分離一種對青霉素具有抗性的細菌，你認為該如何做？

48.稀釋分離時，為什么要將已融化的瓊脂培養基冷卻到45～50左右才能傾入到裝有菌液的皿內？

49.在恒溫箱中培養微生物時為何培養皿均需倒置？（①防止培養基水分蒸發②防止冷凝水的流動造成平板表面的“交叉感染”，影響單個菌落的形成③防止外物掉在培養基上.）

50.請設計分離篩選下列微生物菌種的試驗方案（提示：包括采樣、稀釋液制備、培養基名稱、培養溫度、培養時間、分離純化方法等）

（1）土壤中鏈霉素產生菌的分離、純化

（2）啤酒泥或酒曲發酵窖泥中酵母菌的分離、純化

（3）甜酒藥曲或釀酒種曲中霉菌的分離、純化

51.常用菌種保藏方法有哪些？有何優缺點？

52.ATCC采用菌種保藏的方法是什么？

53.常用于測定微生物數量的方法有哪些？

54.什么是顯微直接計數法？工具是什么？此方法的優缺點？缺點怎樣克服？

55.利用血球計數板計數時，如何計數？計算公式？

56.簡述測定化學消毒劑的殺（抑）菌作用的濾紙片法。

57.某公司推出一種新型飲料，并聲稱是100％的純天然產品，不含防腐劑，利用你所掌握的微生物學知識，試設計一個簡單實驗來初步判斷此飲料是否含防腐劑。

58.根據深層瓊脂培養的特征來判斷好氧菌、微好氧菌、兼性厭氧菌、專性厭氧菌、耐氧厭氧菌。P103

59.什么是IMViC試驗？硫化氫試驗？作用是什么？各試驗的原理是什么？結果是什么？

60.我國衛生部門規定的飲用水標準是什么？1mL自來水中的細菌總數不可超過100個（37℃，培養24h），而1000mL自來水中的大腸菌群數則不能超過3個（37℃，培養24h）。

61.水中細菌總數和大腸菌群值各反映了什么？

62.水中細菌總數的測定的方法是什么？（平板菌落計數法）自來水、湖水采集的正確方法是什么？

63.水中大腸菌群的檢測方法---多管發酵法的基本原理？包括哪3個部分？陽性和陰性判斷的依據是什么？德漢氏小管起什么作用？溴甲酚紫起什么作用？

64.EMB培養基的鑒別大腸菌群原理是什么？EMB培養基含哪幾種主要成分？在檢查大腸菌群時，各起什么作用？（乳糖是碳源起選擇作用，大腸菌群能利用，而很多其他細菌不能利用；蛋白胨是氮源；NaCl是無機鹽；伊紅和美藍作為指示劑）大腸菌群在EMB培養基上的典型菌落特征是什么？

65.包括腸桿菌科的埃希氏菌屬（Escherichia）、腸桿菌屬（Enterobacter）、檸檬酸細菌屬（Citrobacter）和克雷伯氏屬（Klebsiella）。

66.影響微生物生長的主要因素有、和等。

67.細菌、放線菌、酵母菌、霉菌培養的溫度一般為多少？培養時間？

68.名詞解釋：無菌技術/操作、分辨率、菌落、菌苔、簡單染色法、革蘭氏染色法、培養基、鑒別培養基、選擇培養基、消毒、滅菌、純培養、石炭酸系數、大腸菌群

革蘭氏染色法：丹麥醫生Gram于1884年創立的，是細菌學中最重要的鑒別染色法。基本步驟是：結晶紫初染、碘液媒染、乙醇脫色、復染劑復染。染色結果為藍紫色的細菌為G+，紅色的細菌為G-。

無菌技術/操作：在分離、轉接及培養純培養物時防止其被其他微生物污染的技術。

純培養：在實驗室條件下由一個細胞繁殖而產生的后代。

實驗報告中的思考題要認真復習

第二篇：微生物學實驗

細菌群體生長表現為細胞數目的增加或細胞物質的增加。測定細胞數目的方法有顯微鏡直接計數法(direct microscopic count)、平板菌落計數法(plate count)、光電比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然數法(most probable number MPN)以及膜過濾法(membrane filtration)等。測定細胞物質的方法有細胞干重的測定，細胞某種成分如氮的含量、RNA和DNA的含量測定，代謝產物的測定等。總之，測定微生物生長量的方法很多，各有優缺點，工作中應根據具體情況要求加以選擇。本實驗主要介紹生產、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計數法、平板菌落計數法和光電比濁計數法。

一 顯微鏡直接計數法

（一）目的要求

1．明確血細胞計數板計數的原理。

2．掌握使用血細胞計數板進行微生物計數的方法。

（二）基本原理

顯微鏡直接計數法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計菌器)，于顯微鏡下直接計數的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內外常用的計菌器有：血細胞計數板、Peteroff-Hauser計菌器以及Hawksley計菌器等，它們都可用于酵母、細菌、霉菌孢子等懸液的計數，基本原理相同。后兩種計菌器由于蓋上蓋玻片后，總容積為0.02mm3，而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02mm，因此可用油浸物鏡對細菌等較小的細胞進行觀察和計數。除了用這些計菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細菌學檢查。顯微鏡直接計數法的優點是直觀、快速、操作簡單。但此法的缺點是所測得的結果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點，如結合活菌染色微室培養（短時間）以及加細胞分裂抑制劑等方法來達到只計數活菌體的目的。本實驗以血球計數板為例進行顯微鏡直接計數。另外兩種計菌器的使用方法可參看各廠商的說明書。

用血細胞計數板在顯微鏡下直接計數是一種常用的微生物計數方法。該計數板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個方格網，每個方格網共分為九個大方格，中間的大方格即為計數室。血細胞計數板構造如圖l5-1。計數室的刻度一般有兩種規格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格(圖15—2)；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，但無論是哪一種規格的計數板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為lmm，則每一個大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計數室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)。

圖15—1 血細胞計數板構造

（一）圖15—2 血細胞計數板構造

（二）A.正面圖；B.縱切面圖； 放大后的方格網，中間大方格為計數室

1.血細胞計數板；2.蓋玻片；3.計數室

計數時，通常數五個中方格的總菌數，然后求得每個中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個大方格中的總菌數，然后再換算成lml菌液中的總菌數。

設五個中方格中的總菌數為A，菌液稀釋倍數為B，如果是25個中方格的計數板，則

1mL菌液中的總菌數=A/5×25×104×B=50000A·B（個）

同理，如果是16個中方格的計數板，1mL菌液中的總菌數=A/5×16×104×B=32000A·B（個）

（三）器材

1．菌種 釀酒酵母

2．儀器或其他用具 血細胞計數板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細滴管。

（四）操作步驟

l．菌懸液制備

以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當的菌懸液。

2．鏡檢計數室

在加樣前，先對計數板的計數室進行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進行計數。

3．加樣品

將清潔干燥的血細胞計數板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數室，一般計數室均能充滿菌液。

取樣時先要搖勻菌液；加樣時計數室不可有氣泡產生。

4．顯微鏡計數

加樣后靜止5min，然后將血細胞計數板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數。

調節顯微鏡光線的強弱適當，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計數室方格線，或只見豎線或只見橫線。

在計數前若發現菌液太濃或太稀，需重新調節稀釋度后再計數。一般樣品稀釋度要求每小格內約有5~10個菌體為宜。每個計數室選5個中格(可選4個角和中央的一個中格)中的菌體進行計數。位于格線上的菌體一般只數上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作為兩個菌體計數。計數一個樣品要從兩個計數室中計得的平均數值來計算樣品的含菌量。

5．清洗血細胞計數板

使用完畢后，將血細胞計數板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風機吹干。鏡檢，觀察每小格內是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復洗滌至干凈為止。

（五）實驗報告

l．結果

將結果記錄于下表中。A表示五個中方格中的總菌數；B表示菌液稀釋倍數。

各中格中菌數AB二室平均值菌數/ml

12345

第一室

第二室

2．思考題

(1)根據你的體會，說明用血細胞計數板計數的誤差主要來自哪些方面?應如何盡量減少誤差．力求準確?

(2)某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請設計1～2種可行的檢測方法。

二平板菌落計數法

（一）目的要求

學習習近平板菌落計數的基本原理和方法。

（二）、基本原理

平板菌落計數法是將待測樣品經適當稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經過培養，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞。統計菌落數，根據其稀釋倍數和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數。但是，由于待測樣品往往不易完全分散成單個細胞，所以，長成的一個單菌落也可來自樣品中的2～3或更多個細胞。因此平板菌落計數的結果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計數的結果，現在已傾向使用菌落形成單位(colony-forming units，cfu)而不以絕對菌落數來表示樣品的活菌含量。

平板菌落計數法雖然操作較繁，結果需要培養一段時間才能取得，而且測定結果易受多種因素的影響，但是，由于該計數方法的最大優點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數或污染程度的檢測。

（三）器材

1．菌種 大腸桿菌菌懸液。

2．培養基 牛肉膏蛋白陳培養基。

3．儀器或其他用具lm1無菌吸管，無菌平皿，盛有4.5ml無菌水的試管，試管架，恒溫培養箱等。

（四）操作步驟

l．編號

取無菌平皿9套，分別用記號筆標明10-

4、10-

5、10-6。(稀釋度)各3套。另取6支盛有4.5mL無菌水的試管，依次標是10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-

5、10-6。

2．稀釋

用lmL無菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測樣品)，精確地放0.5ml至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。

OptionsEmail Replies將10-1試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支lml吸管插入10?1試管中來回吹吸菌懸液三次，進一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸人管底，吹時離開液面，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內液體外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精確地放0.5mL至10-2試管中，此即為100倍稀釋。……其余依次類推，整個過程如圖15-3所示。

放菌液時吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結果誤差較大。

3，取樣

用三支1mL無菌吸管分別吸取10-

4、10-5和10-6。的稀釋菌懸液各lmL，對號放入編好號的無菌平皿中，每個平皿放0.2mL。

不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀釋菌液放入平皿臼，這樣容易加大同一稀釋度幾個重復平板間的操作誤差。

圖15—3平板菌落計數操作步驟

4．倒平板．

盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養基與菌液混合均勻，而又不使培養基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。由于細菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養皿后，應盡快倒入融化并于已冷卻至45℃左右的培養基，立即搖勻，否則細菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計數。

待培養基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養箱中培養。

5．計數

培養48h后，取出培養平板，算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數，并按下列公式進行計算，每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復的平均菌落數×稀釋倍數×5

一般選擇每個平板上長有30~300個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個重復對照的菌落數不應相差很大，否則表示試驗不精確。實際工作中同一稀釋度重復對照平板不能少于三個，這樣便于數據統計，減少誤差。由10-

4、10-

5、10-6三個稀釋度計算出的每毫升菌液中菌落形成單位數也不應相差太大。

平板菌落計數法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個連續稀釋度中的第二個稀釋度倒平板培養后所出現的平均菌落數在50個左右為好，否則要適當增加或減少稀釋度加以調整。

平板菌落計數法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養基融化后倒平板，待凝固后編號，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺上適當吹干，然后用無菌吸管吸取稀釋好的菌液對號接種于不同稀釋度編號的平板上，并盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實驗臺上20～30min，使菌液滲入培養基表層內，然后倒置37℃的恒溫箱中培養24～48h。

涂布平板用的菌懸液量一般以0.1ml較為適宜，如果過少菌液不易涂布開，過多則在涂布完后或在培養時菌液仍會在平板表面流動，不易形成單菌落。

五、實驗報告

1．結果

2．將培養后菌落計數結果填入下表

稀釋度10-410-510-6

Cfu數/平板123平均123平均123平均

每毫升中的cfu

2．思考題

(1)為什么融化后的培養基要冷卻至45℃左右才能倒平板?

(2)要使平板菌落計數準確，需要掌握哪幾個關鍵?為什么?

(3)試比較平板菌落計數法和顯微鏡下直接計數法的優缺點及應用。

(4)當你的平板上長出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時，你認為問題出在哪里?

(5)用倒平板法和涂布法計數，其平板上長出的菌落有何不同?為什么要培養較長時間(48h)后觀察結果?

三 光電比濁計數法

一、目的要求

1．了解光電比濁計數法的原理。

2．學習、掌握光電比濁計數法的操作方法。

二、基本原理

當光線通過微生物菌懸液時，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定的范圍內，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出(圖15-4)。因此，可用一系列已知菌數的菌懸液測定光密度，作出光密度—菌數標準曲線。然后，以樣品液所測得的光密度，從標準曲線中查出對應的菌數。制作標準曲線時，菌體計數可采用血細胞計數板計數，平板菌落計數或細胞干重測定等方法。本實驗采用血細胞計數板計數。

光電比濁計數法的優點是簡便、迅速，可以連續測定，適合于自動控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細胞大小、形態、培養液成分以及所采用的光波長等因素的影響。因此，對于不同微生物的菌懸液進行光電比濁計數應采用相同的菌株和培養條件制作標準曲線。光波的選擇通常在400~700nm之間，具體到某種微生物采用多少還需要經過最大吸收波長以及穩定性試驗來確定。另外，對于顏色太深的樣品或在樣品中還含有其他干擾物質的懸液不適合用此法進行測定。

圖15—4 比濁法測定細胞濃度的原理

（三）器材

1．菌種 釀酒酵母培養液

2．儀器或其他用具 721型分光光度計，血細胞計數板，顯微鏡，試管，吸水紙，無菌吸管，無菌生理鹽水等。

（四）操作步驟

1．標準曲線制作

（1）編號 取無菌試管7支，分別用記號筆將試管編號為1、2、3、4、5、6、7。

（2）調整菌液濃度 用血細胞計數板計數培養24小時的釀酒酵母菌懸液，并用無菌生理鹽水分別稀釋調整為每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌數的細胞懸液。再分別裝入已編好號的1至7號無菌試管中。

（3）測OD值 將1至7號不同濃度的菌懸液搖均勻后于560nm波長、1cm比色皿中測定OD值。比色測定時，用無菌生理鹽水作空白對照，并將OD值填入下表

管號12345678

細胞數106/ml

光密度（OD）

每管菌懸液在測定OD值時均必須先搖勻后再倒入比色皿中測定

(4)以光密度(OD)值為縱坐標，以每毫升細胞數為橫坐標，繪制標準曲線。

2．樣品測定

將待測樣品用無菌生理鹽水適當稀釋，搖均勻后，用560nm波長、lcm比色皿測定光密度。測定時用無菌生理鹽水作空白對照。

各種操作條件必須與制作標準曲線時的相同，否則，測得值所換算的含菌數就不準確。

3．根據所測得的光密度值，從標準曲線查得每毫升的含菌數。

（五）實驗報告

l．結果

每毫升樣品原液菌數=從標準曲線查得每毫升的菌數×稀釋倍數

2．思考題

(1)光電比濁計數的原理是什么?這種計數法有何優缺點?

(2)光電比濁計數在生產實踐中有何應用價值?

(3)本實驗為什么采用560nm波長測定酵母菌懸液的光密度?如果你在實驗中需要測定大腸桿菌生長的OD值，你將如何選擇波長?

四 大腸桿菌生長曲線的測定

(一)目的要求

1．通過細菌數量的測量了解大腸桿菌的生物特征和規律，繪制生長線。

2．復習光電比濁法測量細菌數量的方法。

(二)基本原理

大多數細菌的繁殖速率很快，在合適的條件下，一定時期的大腸桿菌細胞每20min分裂一次。將一定量的細菌轉入新鮮液體培養基中，在適宜的條件下培養細胞要經歷延遲期，對數期、穩定期和衰亡期四個階段。以培養時間為橫坐標，以細菌數目的對數或生長速率為縱坐標作圖所繪制的曲線稱為該細菌的生長曲線。不同的細菌在相同的培養條件下其生長曲線不同，同樣的細菌在不同的培養條件下所繪制的生長曲線也不相同。測定細菌的生長曲線，了解其生長繁殖規律，這對人們根據不同的需要，有效地利用和控制細菌的生長具有重要意義。

用于測定細菌細胞數量的方法已在上述實驗作了介紹。本實驗用分光光度計(spectrophotometer)進行光電比濁測定不同培養時間細菌懸浮液的OD值，繪制生長曲線。也可以直接用試管或帶有測定管的三角瓶(圖15-5)測定“klett units”值的光度計。如圖15—6所示，只要接種1支試管或1個帶測定管的三角瓶，在不同的培養時間(橫坐標)取樣測定，以測得的klett units為縱坐標，便可很方便地繪制出細菌的生長曲線。如果需要，可根據公式1 klett units=OD/0.002換算出所測菌懸液的OD值。

圖15—5 帶側臂試管的三角燒瓶

(三)器材

1．菌種 大腸桿菌

2．培養基 LB液體培養基70ml，分裝2支大試管(5ml/支)，剩余60ml裝入250ml的三角瓶。

3．儀器或其他用具 722型分光光度計，水浴振蕩搖床，無菌試管，無菌吸管等。

圖15—6 直接用試管測OD值

(四)操作步驟

1．標記

取11支無菌大試管，用記號筆分別標明培養時間，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。

2．接種

分別用5ml無菌吸管吸取2.5ml大腸桿菌過夜培養液(培養10~12h)轉入盛有50ml LB液的三角瓶內，混合均勻后分別取5ml混合液放入上述標記的11支無菌大試管中。

3．培養

將已接種的試管置搖床37℃振蕩培養(振蕩頻率250r/min)，分別培養0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，將標有相應時間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最后一同比濁測定其光密度值。

4．比濁測定

用未接種的LB液體培養基作空白對照，選用600nm波長進行光電比濁測定。從早取出的培養液開始依次測定，對細胞密度大的培養液用LB液體培養基適當稀釋后測定，使其光密度值在0.1~0.65之內(測定OD值前，將待測定的培養液振蕩，使細胞均勻分布)。

本操作步驟也可用簡便的方法代替：

1．用1ml無菌吸管取0.25ml大腸桿菌過夜培養液轉入盛有3~5ml LB液的試管中、混勻后將試管直接插入分光光度計的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒將試管及比色暗室全部罩上，形成一個大的暗環境，另以1支盛有LB液但沒有接種的試管調零點，測定樣品中培養0h的OD值。測定完畢后，取出試管置37℃繼續振蕩培養。

2．分別在培養0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，取出培養物試管按上述方法測定OD值。該方法準確度高、操作簡便。但須注意的是使用的2支試管要很干凈，其透光程度愈接近，測定的準確度愈高。

(五)實驗報告

1．結果

(1)將測定的OD600值填入下表：

培養時間對照 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20

光密度值OD600

(2)繪制大腸桿菌的生長曲線。

2．思考題

(1)如果用活菌計數法制作生長曲線，你認為會有什么不同？兩者各有什么優缺點？

(2)細菌生長繁殖所經歷的四個時期中，哪個時期其代時最短？若細胞密度為103/ml，培養4.5h后，其密度高達2×108/ml，計計算出其代時。

(3)次生代謝產物的大量積累在哪個時期？根據細菌生長繁殖的規律，采用哪些措施可使次生代謝產物積累更多？

評論這張

第三篇：微生物學實驗考試題

《微生物學實驗》試題

1、在進行高壓蒸汽滅菌時，是否只要滅菌鍋壓力表到達所需的值時鍋內就能獲得所需的滅菌溫度？為什么？

2、在手提式高壓滅菌鍋的蓋上有哪些部件？它們各起什么作用？

3、高壓蒸汽滅菌鍋的操作有哪幾個步驟？每一步驟應注意哪些問題？

4、在微生物學實驗中，常用于配制固體培養基的凝固劑是什么？它有哪些特性？如何使用？

5、環境樣品梯度稀釋、涂布平板法分離微生物時，如何選擇不同稀釋梯度樣品的涂布順序？為什么？

6、在革蘭氏染色實驗中，為什么會出現假陽性和假陰性？如何避免？

7、在革蘭氏染色實驗中，不經復染這一步，能否區別革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌？為什么？

8、為何用計數板可以計得樣品中的總菌值？如何計算樣品中的菌體濃度？

9、血球計數板計數時，計數室內如有氣泡會對結果產生怎樣的影響？如何避免產生氣泡？

10、試分析血球計數板計數法的誤差來源，并提出減少誤差的方法和措施。

要求把題目和答案寫在實驗報告紙上，統一收齊后和第一次實驗報告一起送到我辦公室-生科樓104。

第四篇：微生物學實驗考核辦法

本科微生物學實驗考核辦法

考核方式：按學號順序逐一進場應考。考核內容共8項，每位同學通過抽簽考其中的一項內容。考核時間：每人限6分鐘內完成。

考核地點：微免實驗課上課的實驗室

考核內容及要求如下：

1、顯微鏡（油鏡）的使用和保護方法

（1）、提供一張細菌玻片標本，要求能正確使用油鏡觀察到細菌的基本形態。

（2）、掌握顯微鏡（油鏡）保護方法

2、血清對倍稀釋法

（1）、用生理鹽水將血清進行對倍稀釋，終濃度達到1/ 2、1/ 4、1 /8三個稀釋度。

（2）、掌握血清對倍稀釋的原理及方法，能正確使用刻度吸管。

3、玻片凝集試驗

（1）、要求用傷寒診斷血清，采用玻片凝集試驗的方法檢測待檢細菌是否為傷寒桿菌。

（2）、要求操作方法、步驟正確，能準確判斷結果。

（3）、無菌操作正確。

4、革蘭氏染色法

（1）、口試回答細菌涂片的制作方法

（2）、將一張已涂好的細菌玻片進行革蘭氏染色

（3）、要求染色步驟及各項染色時間正確，操作熟練。

5、細菌的劃線分離培養技術

（1）、將細菌分區劃線到普通瓊脂平碟上。

（2）、要求劃線分區正確，接種劃線手法正確、熟練。

（3）、無菌操作正確。

6、液體和半固體培養基的細菌接種方法（無菌操作）

（1）、將菌種接種到液體培養基和半固體培養基內。

（2）、要求各環節無菌操作正確。

7、細菌在培養基中生長情況及細菌特殊結構觀察

（1）、正確描述固體培養基的菌落、菌苔。

（2）、正確描述液體培養基中的細菌生長情況。

（3）、正確觀察出鏡下細菌的特殊結構。

8、抗酸染色法

（1）、正確回答抗酸染色的各個步驟（包括用加熱法或不加熱法 初染的時間）。

（2）、操作技術手法正確熟練

（3）、脫色程度控制較好。

注：經一次考核不及格者，可在全班同學考核結束后，允許補考一次。補考成績通過后只計及格。

第五篇：微生物學實驗總結

微生物學實驗總結

高熹

1120152430 時間如清風般從你我指間滑過,無聲無息,快得我們都不曾駐足一望,莫然回首間,本學期的微生物學實驗已接近尾聲。一學期的時間雖短，但老師的諄諄教誨、同學們的良好配合和嚴格的實驗操作，都將為微生物學實驗課程畫上一個完美的句號。

眾所周知，微生物學是一門實驗與理論高度結合的科目，是一門以實驗為基礎與生活生產息息相關的課程。需要我們不斷地做實驗，在實驗中觀察、分析相應的結果。所以我認為，要做好微生物學實驗要有以下的四個能力：

1、獨立思考能力

我想，在這個過程中，其中一個重要的感悟就是獨立思考的重要性。當在試驗中發現與預料過程所不符，那么必定是過程中出現錯誤，而尋找并解決的這個過程是書本中無法給予的。做實驗絕對不能人云亦云，要有自己的看法，這樣就要有充分的準備，若是做了也不知道是個什么實驗，那么做了也是白做。在實驗過程中，自己看書，獨立思考，最終解決問題，從而也就加深了我們對課本理論知識的理解，達到了“雙贏”的效果。

2、突破創新能力

實際上，在弄懂了實驗原理的基礎上，我們的時間是充分的，做實驗應該是游刃有余的，如果說創新對于我們來說是件難事，那改良總是有可能的。試著通過自己現有的知識，多想，多做，多總結，我想首先是作為一個求知者在追求知識的道路上必須堅守的原則，其次就是要敢于突破，我們都站在巨人的肩膀上，踮起腳尖即使觸不到天空，也可以更加拓寬自己的視野。

3、現代信息技術的使用能力

在微生物學實驗學習中，有很多特殊的、特定的實驗，如有毒有害物質參與且不易排污的實驗、不易操作或難以成功的實驗、需要反復觀察的實驗、反應慢導致單位課時中難以完成的實驗等。我們在研究改進措施的同時，也可以借助于現代信息技術手段制作視頻資料或多媒體課件進行輔助學習。

4、動手能力

動手操作對激發微生物學學習興趣、幫助理解微生物學知識、培養解決問題能力、創新能力等具有重要作用。尤其是微生物學這樣一種學科，動手能力的強弱與知識的掌握其實是同等重要的。如果動手能力太弱，所學習到的知識就無法通過有效的方式真正組織起來，那么學到的知識就只是輸入而沒有輸出，只有理論而沒有實踐，對于這樣一門學科，這樣的缺陷是致命的，而這樣的能力是必須具備的。

本學期我們一共完成了十個實驗，分別是：顯微鏡油鏡的使用、細菌形態觀察和細菌的革蘭氏染色、放線菌、酵母菌、霉菌的形態觀察和微生物的顯微鏡計數法、培養基的制備、周圍環境中微生物的觀察以及從土壤中分離純化微生物、細菌生長曲線的測定、環境因素對微生物生長發育的影響、細菌鑒定中常用的生理生化反應、微生物的誘變育種、水中大腸菌群的計數—MPN法、乳酸菌發酵實驗、甜酒釀發酵實驗、固定化酵母細胞發酵啤酒實驗。

通過這些微生物學實驗，不僅是對我理論課程的加深，更是對我實驗能力的 一個顯著的提高。其中，做實驗的過程中，我認為以下的幾點對于我未來的學習和科研具有重大意義：

1、嚴格的無菌操作，在微生物實驗中，由于空氣和環境中存在大量的微生物，所以很可能造成培養基的污染，影響最終的實驗結果，所以實驗中，無菌操作尤為重要。各種實驗用具要嚴格高溫滅菌，防止用具本身污染。實驗時，接種環、接種針、移液管口和涂布器等要在酒精燈下灼燒徹底，防止其上面附著著的微生物污染。在微生物實驗操作時，有條件要在超凈工作臺下操作，降低被污染的概率，相關操作也要在酒精燈附近進行。使用超凈工作臺時要嚴格紫外滅菌和打開排風扇，手和相關器材進入操作臺前要用酒精仔細擦拭，清除表面的微生物。無菌操作往往能決定著一個實驗的成敗，學會無菌操作尤為重要。

2、微生物實驗中儀器的使用，我學會了高壓滅菌鍋的使用，以前的實驗從未接觸過，并且還復習了紫外-可見分光光度計和分析天平等儀器的使用，使我更加熟練。

3、微生物實驗中，平板劃線和涂布是最重要的兩項操作，平板劃線要注意畫的連續性和可分辨性，平板涂布要涂均勻，否則都會影響后期的實驗觀察和結果。另外實驗中其他操作，比如稱量準確性，移液管的使用都很重要，所以操作要十分規范。

4、實驗中的部分思想對未來的科研工作尤為重要，比如每一步都要設立空白對照組，在實驗結果中做出比較討論，這在未來的自我進行的實驗設計中，這種思想的培養尤為重要。

5、另外，實驗中模式菌的學習和使用為未來科研打好良好基礎，比如典型的革蘭氏陰性菌大腸桿菌和典型的革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌都是實驗室的常用菌，如果未來還要從事微生物相關工作，這幾種模式菌都必不可少。

6、實驗結束后要及時觀察結果，過了兩天才去觀察，結果部分平板已長出菌苔，對實驗結果的觀察造成了很大的困難，所以，結果觀察同實驗操作一樣重要。

與實驗操作相比，本學期的微生物學另一個重要的是學會團隊的重要性，每個實驗憑借一己之力是無法完成的，而一個團隊就可以游刃有余。本學期的實驗讓我最感動是我們一個小組四名成員的精妙配合，造就了這學期的良好的微生物學實驗的結果

總之，這學期的實驗給我留下了深刻的印象，在最后，謝謝老師一學期的辛苦付出，為我未來的微生物學的學習和科研打好了良好的基礎。