第一篇：微生物學實驗安排及要求

微生物學實驗安排

第六周： 1.培養(yǎng)基的制備；2.物品的包埋準備；3.高壓蒸汽滅菌； 第七、八周：4.樣品中微生物的分離；

1.抗生素產(chǎn)生菌的分離與抗菌活性檢測

2.（土壤中、植物體內(nèi)）拮抗植物病原菌的微生物分離及鑒定

3.高產(chǎn)蛋白酶菌株的分離與酶活性檢測

4.高產(chǎn)纖維素酶菌株的分離與酶活性檢測

5.高產(chǎn)脂肪酶菌株的分離與酶活性檢測

6.高產(chǎn)淀粉酶菌株的分離與酶活性檢測

7.噬菌體的分離及效價測定

8.光合細菌的分離及鑒定

9.抗藥性菌株的分離及抗藥性測定（例如如抗青霉素、鏈霉素等常用藥物）

10.（多環(huán)芳烴類、鄰苯二甲酸酯類有機污染物、苯酚、尿素）高效降解菌的分離鑒定及降解活性檢測

11.學生根據(jù)興趣自擬題目

要求：2~3人一組，各組自己查閱相關資料然后設計實驗方案主要包括樣品的采集、所用的培養(yǎng)基配方、分離方法、鑒定的方法、活性測定的方法等方面；各組長在3月18日前將實驗方案提交給所有指導教師：；魏靜lalsos@swu.edu.cn；徐耀波 xuyaobo@swu.edu.cn。郵件主題及文件命名：2010級*班*組+組長姓名+聯(lián)系電話）

第九周：5.微生物菌落的觀察；6.超凈工作臺的使用；7.微生物的分離純化；8.水中大腸菌群的檢測；

第十周：9.口腔微生物的染色觀察與顯微鏡油鏡的使用；

第十一周：10.細菌的革蘭氏染色；11.放線菌裝片的制作及觀察； 第十二周：12.酵母菌裝片的制作及觀察； 13.霉菌裝片的制作及觀察； 第十三周：14.酸奶的制作

第十四周：開放實驗——目標菌株鑒定及活性測定；

第十五周：實驗考核（無菌操作、制片觀察）；各組匯報實驗結(jié)果并提交實驗項目總結(jié)報告，要求按照正式發(fā)表的科研論文進行寫作。

第二篇：微生物學實驗技術考試要求

課程名稱：微生物學實驗技術（微生物專業(yè)）

一、考試的總體要求

微生物學實驗技術是微生物學和工業(yè)生物技術等專業(yè)技術人才最重要的專業(yè)基礎技能。通過本課程的考核，重點檢查考生對微生物學基本實驗技能及其原理和應用等掌握情況，主要包括微生物的染色與顯微觀察技術；微生物的分離純化與培養(yǎng)技術；微生物生長測定與生理生化技術、微生物遺傳育種技術以及分子微生物學實驗技術等。要求掌握實驗的設計原理、主要步驟、注意事項以及該實驗技術的適用對象等。

二、試題類型及比例

1、簡答題：約40%

2、問答題：約60%

三、考試形式及時間

考試形式為筆試?？荚嚂r間為3小時。

四、考試主要內(nèi)容

（一）微生物染色與顯微觀察技術

1.顯微鏡的使用及維護

2.細菌簡單染色、革蘭氏染色、芽孢染色與細菌形態(tài)觀察

3.酵母菌美蘭染色與酵母細胞形態(tài)觀察

4.霉菌的形態(tài)觀察

（二）微生物的分離純化與純培養(yǎng)技術

1.培養(yǎng)基的制備與滅菌（含玻璃器皿的包扎）

2.無菌操作技術

3.平板劃線、傾注平板與涂布平板分離技術

（三）微生物生長測定與生理生化技術

1.微生物大小與總數(shù)測定

2.平板菌落計數(shù)法及其它生長測定技術

3.微生物的生理生化試驗

4.水的衛(wèi)生細菌學檢驗

（四）微生物遺傳育種及分子微生物學實驗技術

1.從自然界中分離篩選特定類型的微生物

2.微生物誘變技術及特定突變型的篩選

3.微生物原生質(zhì)體制備與融合技術

4.細菌質(zhì)粒DNA的抽提與電泳檢測

5.細菌質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化

6.DNA的PCR擴增及其產(chǎn)物純化

五、主要參考書目

1.諸葛健，李華鐘主編，微生物學（第二版，實驗部分），科學出版社，2009

2.諸葛健，李華鐘，王正祥主編，微生物遺傳育種學（實驗部分），化學工業(yè)出版社，2009

3.諸葛健主編，工業(yè)微生物實驗與研究技術，科學出版社，2007

第三篇：微生物學實驗

細菌群體生長表現(xiàn)為細胞數(shù)目的增加或細胞物質(zhì)的增加。測定細胞數(shù)目的方法有顯微鏡直接計數(shù)法(direct microscopic count)、平板菌落計數(shù)法(plate count)、光電比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然數(shù)法(most probable number MPN)以及膜過濾法(membrane filtration)等。測定細胞物質(zhì)的方法有細胞干重的測定，細胞某種成分如氮的含量、RNA和DNA的含量測定，代謝產(chǎn)物的測定等?？傊?，測定微生物生長量的方法很多，各有優(yōu)缺點，工作中應根據(jù)具體情況要求加以選擇。本實驗主要介紹生產(chǎn)、科研工作中比較常用的顯微鏡直接計數(shù)法、平板菌落計數(shù)法和光電比濁計數(shù)法。

一 顯微鏡直接計數(shù)法

（一）目的要求

1．明確血細胞計數(shù)板計數(shù)的原理。

2．掌握使用血細胞計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。

（二）基本原理

顯微鏡直接計數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上(又稱計菌器)，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內(nèi)外常用的計菌器有：血細胞計數(shù)板、Peteroff-Hauser計菌器以及Hawksley計菌器等，它們都可用于酵母、細菌、霉菌孢子等懸液的計數(shù)，基本原理相同。后兩種計菌器由于蓋上蓋玻片后，總?cè)莘e為0.02mm3，而且蓋玻片和載波片之間的距離只有0.02mm，因此可用油浸物鏡對細菌等較小的細胞進行觀察和計數(shù)。除了用這些計菌器外，還有在顯微鏡下直接觀察涂片面積與視野面積之比的估算法，此法一般用于牛乳的細菌學檢查。顯微鏡直接計數(shù)法的優(yōu)點是直觀、快速、操作簡單。但此法的缺點是所測得的結(jié)果通常是死菌體和活菌體的總和。目前已有一些方法可以克服這一缺點，如結(jié)合活菌染色微室培養(yǎng)（短時間）以及加細胞分裂抑制劑等方法來達到只計數(shù)活菌體的目的。本實驗以血球計數(shù)板為例進行顯微鏡直接計數(shù)。另外兩種計菌器的使用方法可參看各廠商的說明書。

用血細胞計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)是一種常用的微生物計數(shù)方法。該計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各列有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分為九個大方格，中間的大方格即為計數(shù)室。血細胞計數(shù)板構(gòu)造如圖l5-1。計數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格(圖15—2)；另一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計數(shù)板，每一個大方格中的小方格都是400個。每一個大方格邊長為lmm，則每一個大方格的面積為lmm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度為0.lmm，所以計數(shù)室的容積為0.lmm3(萬分之一毫升)。

圖15—1 血細胞計數(shù)板構(gòu)造

（一）圖15—2 血細胞計數(shù)板構(gòu)造

（二）A.正面圖；B.縱切面圖； 放大后的方格網(wǎng)，中間大方格為計數(shù)室

1.血細胞計數(shù)板；2.蓋玻片；3.計數(shù)室

計數(shù)時，通常數(shù)五個中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成lml菌液中的總菌數(shù)。

設五個中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，如果是25個中方格的計數(shù)板，則

1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×104×B=50000A·B（個）

同理，如果是16個中方格的計數(shù)板，1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×16×104×B=32000A·B（個）

（三）器材

1．菌種 釀酒酵母

2．儀器或其他用具 血細胞計數(shù)板，顯微鏡，蓋玻片，無菌毛細滴管。

（四）操作步驟

l．菌懸液制備

以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當?shù)木鷳乙骸?/p>

2．鏡檢計數(shù)室

在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進行計數(shù)。

3．加樣品

將清潔干燥的血細胞計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數(shù)室，一般計數(shù)室均能充滿菌液。

取樣時先要搖勻菌液；加樣時計數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。

4．顯微鏡計數(shù)

加樣后靜止5min，然后將血細胞計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進行計數(shù)。

調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強弱適當，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易舌清楚計數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。

在計數(shù)前若發(fā)現(xiàn)菌液太濃或太稀，需重新調(diào)節(jié)稀釋度后再計數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5~10個菌體為宜。每個計數(shù)室選5個中格(可選4個角和中央的一個中格)中的菌體進行計數(shù)。位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，即作為兩個菌體計數(shù)。計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算樣品的含菌量。

5．清洗血細胞計數(shù)板

使用完畢后，將血細胞計數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風機吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復洗滌至干凈為止。

（五）實驗報告

l．結(jié)果

將結(jié)果記錄于下表中。A表示五個中方格中的總菌數(shù)；B表示菌液稀釋倍數(shù)。

各中格中菌數(shù)AB二室平均值菌數(shù)/ml

12345

第一室

第二室

2．思考題

(1)根據(jù)你的體會，說明用血細胞計數(shù)板計數(shù)的誤差主要來自哪些方面?應如何盡量減少誤差．力求準確?

(2)某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請設計1～2種可行的檢測方法。

二平板菌落計數(shù)法

（一）目的要求

學習習近平板菌落計數(shù)的基本原理和方法。

（二）、基本原理

平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞。統(tǒng)計菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)。但是，由于待測樣品往往不易完全分散成單個細胞，所以，長成的一個單菌落也可來自樣品中的2～3或更多個細胞。因此平板菌落計數(shù)的結(jié)果往往偏低。為了清楚地闡述平板菌落計數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colony-forming units，cfu)而不以絕對菌落數(shù)來表示樣品的活菌含量。

平板菌落計數(shù)法雖然操作較繁，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時間才能取得，而且測定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該計數(shù)方法的最大優(yōu)點是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測。

（三）器材

1．菌種 大腸桿菌菌懸液。

2．培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基。

3．儀器或其他用具lm1無菌吸管，無菌平皿，盛有4.5ml無菌水的試管，試管架，恒溫培養(yǎng)箱等。

（四）操作步驟

l．編號

取無菌平皿9套，分別用記號筆標明10-

4、10-

5、10-6。(稀釋度)各3套。另取6支盛有4.5mL無菌水的試管，依次標是10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-

5、10-6。

2．稀釋

用lmL無菌吸管吸取lmL已充分混勻的大腸桿菌菌縣液(待測樣品)，精確地放0.5ml至10-1的試管中，此即為10倍稀釋。將多余的菌液放回原菌液中。

OptionsEmail Replies將10-1試管置試管振蕩器上振蕩，使菌液充分混勻。另取一支lml吸管插入10?1試管中來回吹吸菌懸液三次，進一步將菌體分散、混勻。吹吸菌液時不要太猛太快，吸時吸管伸人管底，吹時離開液面，以免將吸管中的過濾棉花浸濕或使試管內(nèi)液體外溢。用此吸管吸取10-1菌液lmL，精確地放0.5mL至10-2試管中，此即為100倍稀釋?！溆嘁来晤愅?，整個過程如圖15-3所示。

放菌液時吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結(jié)果誤差較大。

3，取樣

用三支1mL無菌吸管分別吸取10-

4、10-5和10-6。的稀釋菌懸液各lmL，對號放入編好號的無菌平皿中，每個平皿放0.2mL。

不要用lmL吸管每次只靠吸管尖部吸0.2mL稀釋菌液放入平皿臼，這樣容易加大同一稀釋度幾個重復平板間的操作誤差。

圖15—3平板菌落計數(shù)操作步驟

4．倒平板．

盡快向上述盛有不同稀釋度菌液的平皿中倒入融化后冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基約15毫升/平皿，置水平位置迅速旋動平皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，而又不使培養(yǎng)基蕩出平皿或濺到平皿蓋上。由于細菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培養(yǎng)皿后，應盡快倒入融化并于已冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基，立即搖勻，否則細菌將不易分散或長成的菌落連在一起，影響計數(shù)。

待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5．計數(shù)

培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進行計算，每毫升中菌落形成單位(cfu)=同一稀釋度三次重復的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5

一般選擇每個平板上長有30~300個菌落的稀釋度計算每毫升的含菌量較為合適。同一稀釋度的三個重復對照的菌落數(shù)不應相差很大，否則表示試驗不精確。實際工作中同一稀釋度重復對照平板不能少于三個，這樣便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計，減少誤差。由10-

4、10-

5、10-6三個稀釋度計算出的每毫升菌液中菌落形成單位數(shù)也不應相差太大。

平板菌落計數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個連續(xù)稀釋度中的第二個稀釋度倒平板培養(yǎng)后所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右為好，否則要適當增加或減少稀釋度加以調(diào)整。

平板菌落計數(shù)法的操作除上述傾注倒平板的方式以外，還可以用涂布平板的方式進行。二者操作基本相同，所不同的是后者先將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基融化后倒平板，待凝固后編號，并于37℃左右的溫箱中烘烤30min，或在超靜工作臺上適當吹干，然后用無菌吸管吸取稀釋好的菌液對號接種于不同稀釋度編號的平板上，并盡快用無菌玻璃涂棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實驗臺上20～30min，使菌液滲入培養(yǎng)基表層內(nèi)，然后倒置37℃的恒溫箱中培養(yǎng)24～48h。

涂布平板用的菌懸液量一般以0.1ml較為適宜，如果過少菌液不易涂布開，過多則在涂布完后或在培養(yǎng)時菌液仍會在平板表面流動，不易形成單菌落。

五、實驗報告

1．結(jié)果

2．將培養(yǎng)后菌落計數(shù)結(jié)果填入下表

稀釋度10-410-510-6

Cfu數(shù)/平板123平均123平均123平均

每毫升中的cfu

2．思考題

(1)為什么融化后的培養(yǎng)基要冷卻至45℃左右才能倒平板?

(2)要使平板菌落計數(shù)準確，需要掌握哪幾個關鍵?為什么?

(3)試比較平板菌落計數(shù)法和顯微鏡下直接計數(shù)法的優(yōu)缺點及應用。

(4)當你的平板上長出的菌落不是均勻分散的而是集中在一起時，你認為問題出在哪里?

(5)用倒平板法和涂布法計數(shù)，其平板上長出的菌落有何不同?為什么要培養(yǎng)較長時間(48h)后觀察結(jié)果?

三 光電比濁計數(shù)法

一、目的要求

1．了解光電比濁計數(shù)法的原理。

2．學習、掌握光電比濁計數(shù)法的操作方法。

二、基本原理

當光線通過微生物菌懸液時，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定的范圍內(nèi)，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出(圖15-4)。因此，可用一系列已知菌數(shù)的菌懸液測定光密度，作出光密度—菌數(shù)標準曲線。然后，以樣品液所測得的光密度，從標準曲線中查出對應的菌數(shù)。制作標準曲線時，菌體計數(shù)可采用血細胞計數(shù)板計數(shù)，平板菌落計數(shù)或細胞干重測定等方法。本實驗采用血細胞計數(shù)板計數(shù)。

光電比濁計數(shù)法的優(yōu)點是簡便、迅速，可以連續(xù)測定，適合于自動控制。但是，由于光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分以及所采用的光波長等因素的影響。因此，對于不同微生物的菌懸液進行光電比濁計數(shù)應采用相同的菌株和培養(yǎng)條件制作標準曲線。光波的選擇通常在400~700nm之間，具體到某種微生物采用多少還需要經(jīng)過最大吸收波長以及穩(wěn)定性試驗來確定。另外，對于顏色太深的樣品或在樣品中還含有其他干擾物質(zhì)的懸液不適合用此法進行測定。

圖15—4 比濁法測定細胞濃度的原理

（三）器材

1．菌種 釀酒酵母培養(yǎng)液

2．儀器或其他用具 721型分光光度計，血細胞計數(shù)板，顯微鏡，試管，吸水紙，無菌吸管，無菌生理鹽水等。

（四）操作步驟

1．標準曲線制作

（1）編號 取無菌試管7支，分別用記號筆將試管編號為1、2、3、4、5、6、7。

（2）調(diào)整菌液濃度 用血細胞計數(shù)板計數(shù)培養(yǎng)24小時的釀酒酵母菌懸液，并用無菌生理鹽水分別稀釋調(diào)整為每毫升1×106、2×106、4×106、6×106、8×106、10×106、12×106含菌數(shù)的細胞懸液。再分別裝入已編好號的1至7號無菌試管中。

（3）測OD值 將1至7號不同濃度的菌懸液搖均勻后于560nm波長、1cm比色皿中測定OD值。比色測定時，用無菌生理鹽水作空白對照，并將OD值填入下表

管號12345678

細胞數(shù)106/ml

光密度（OD）

每管菌懸液在測定OD值時均必須先搖勻后再倒入比色皿中測定

(4)以光密度(OD)值為縱坐標，以每毫升細胞數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線。

2．樣品測定

將待測樣品用無菌生理鹽水適當稀釋，搖均勻后，用560nm波長、lcm比色皿測定光密度。測定時用無菌生理鹽水作空白對照。

各種操作條件必須與制作標準曲線時的相同，否則，測得值所換算的含菌數(shù)就不準確。

3．根據(jù)所測得的光密度值，從標準曲線查得每毫升的含菌數(shù)。

（五）實驗報告

l．結(jié)果

每毫升樣品原液菌數(shù)=從標準曲線查得每毫升的菌數(shù)×稀釋倍數(shù)

2．思考題

(1)光電比濁計數(shù)的原理是什么?這種計數(shù)法有何優(yōu)缺點?

(2)光電比濁計數(shù)在生產(chǎn)實踐中有何應用價值?

(3)本實驗為什么采用560nm波長測定酵母菌懸液的光密度?如果你在實驗中需要測定大腸桿菌生長的OD值，你將如何選擇波長?

四 大腸桿菌生長曲線的測定

(一)目的要求

1．通過細菌數(shù)量的測量了解大腸桿菌的生物特征和規(guī)律，繪制生長線。

2．復習光電比濁法測量細菌數(shù)量的方法。

(二)基本原理

大多數(shù)細菌的繁殖速率很快，在合適的條件下，一定時期的大腸桿菌細胞每20min分裂一次。將一定量的細菌轉(zhuǎn)入新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)細胞要經(jīng)歷延遲期，對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個階段。以培養(yǎng)時間為橫坐標，以細菌數(shù)目的對數(shù)或生長速率為縱坐標作圖所繪制的曲線稱為該細菌的生長曲線。不同的細菌在相同的培養(yǎng)條件下其生長曲線不同，同樣的細菌在不同的培養(yǎng)條件下所繪制的生長曲線也不相同。測定細菌的生長曲線，了解其生長繁殖規(guī)律，這對人們根據(jù)不同的需要，有效地利用和控制細菌的生長具有重要意義。

用于測定細菌細胞數(shù)量的方法已在上述實驗作了介紹。本實驗用分光光度計(spectrophotometer)進行光電比濁測定不同培養(yǎng)時間細菌懸浮液的OD值，繪制生長曲線。也可以直接用試管或帶有測定管的三角瓶(圖15-5)測定“klett units”值的光度計。如圖15—6所示，只要接種1支試管或1個帶測定管的三角瓶，在不同的培養(yǎng)時間(橫坐標)取樣測定，以測得的klett units為縱坐標，便可很方便地繪制出細菌的生長曲線。如果需要，可根據(jù)公式1 klett units=OD/0.002換算出所測菌懸液的OD值。

圖15—5 帶側(cè)臂試管的三角燒瓶

(三)器材

1．菌種 大腸桿菌

2．培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基70ml，分裝2支大試管(5ml/支)，剩余60ml裝入250ml的三角瓶。

3．儀器或其他用具 722型分光光度計，水浴振蕩搖床，無菌試管，無菌吸管等。

圖15—6 直接用試管測OD值

(四)操作步驟

1．標記

取11支無菌大試管，用記號筆分別標明培養(yǎng)時間，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h。

2．接種

分別用5ml無菌吸管吸取2.5ml大腸桿菌過夜培養(yǎng)液(培養(yǎng)10~12h)轉(zhuǎn)入盛有50ml LB液的三角瓶內(nèi)，混合均勻后分別取5ml混合液放入上述標記的11支無菌大試管中。

3．培養(yǎng)

將已接種的試管置搖床37℃振蕩培養(yǎng)(振蕩頻率250r/min)，分別培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，將標有相應時間的試管取出，立即放冰箱中貯存，最后一同比濁測定其光密度值。

4．比濁測定

用未接種的LB液體培養(yǎng)基作空白對照，選用600nm波長進行光電比濁測定。從早取出的培養(yǎng)液開始依次測定，對細胞密度大的培養(yǎng)液用LB液體培養(yǎng)基適當稀釋后測定，使其光密度值在0.1~0.65之內(nèi)(測定OD值前，將待測定的培養(yǎng)液振蕩，使細胞均勻分布)。

本操作步驟也可用簡便的方法代替：

1．用1ml無菌吸管取0.25ml大腸桿菌過夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入盛有3~5ml LB液的試管中、混勻后將試管直接插入分光光度計的比色糟中，比色糟上方用自制的暗盒將試管及比色暗室全部罩上，形成一個大的暗環(huán)境，另以1支盛有LB液但沒有接種的試管調(diào)零點，測定樣品中培養(yǎng)0h的OD值。測定完畢后，取出試管置37℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。

2．分別在培養(yǎng)0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16和20h，取出培養(yǎng)物試管按上述方法測定OD值。該方法準確度高、操作簡便。但須注意的是使用的2支試管要很干凈，其透光程度愈接近，測定的準確度愈高。

(五)實驗報告

1．結(jié)果

(1)將測定的OD600值填入下表：

培養(yǎng)時間對照 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20

光密度值OD600

(2)繪制大腸桿菌的生長曲線。

2．思考題

(1)如果用活菌計數(shù)法制作生長曲線，你認為會有什么不同？兩者各有什么優(yōu)缺點？

(2)細菌生長繁殖所經(jīng)歷的四個時期中，哪個時期其代時最短？若細胞密度為103/ml，培養(yǎng)4.5h后，其密度高達2×108/ml，計計算出其代時。

(3)次生代謝產(chǎn)物的大量積累在哪個時期？根據(jù)細菌生長繁殖的規(guī)律，采用哪些措施可使次生代謝產(chǎn)物積累更多？

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第四篇：微生物學實驗目的內(nèi)容與要求

一、微生物學實驗內(nèi)容與目的微生物學實驗內(nèi)容包括：培養(yǎng)基的制備及滅菌；從土壤中分離和純化微生物；細菌染色及形態(tài)觀察；放線菌、酵母菌和霉菌形態(tài)觀察；微生物顯微計數(shù)和大小測量；E.coli生長曲線的測定；細菌的生理生化反應；環(huán)境因素對微生物生長的影響；微生物的誘變育種；產(chǎn)淀粉酶菌株的分離純化；水和飲料中細菌學檢查；食用真菌的采集、分離和培養(yǎng)；抗藥性突變株的篩選。

微生物學實驗課的目的在于通過一系列實驗項目，使學生能比較熟練地掌握微生物學實驗的操作方法和技能；學會進行綜合實驗的設計、準備、操作和結(jié)果分析；培養(yǎng)學生對實驗原理、方法和結(jié)果的正確理解，仔細觀察，認真思考的科學素養(yǎng)和分析問題和解決問題的科學能力。

二、微生物學實驗室要求與安全

為了確保微生物學實驗課質(zhì)量，提高實驗效果，并保證實驗室的安全，特提出如下要求，希望共同遵守。

（1）實驗前須預習實驗內(nèi)容，了解實驗目的、方法和注意事項，寫出實驗設計方案。在課堂上注意聆聽老師對實驗內(nèi)容的講解，注意觀察教師的示范操作，以掌握實驗操作的要領。

（2）進入實驗室必須穿工作服，必要時還須戴口罩、帽子和手套，并做好實驗前的各項準備工作。

（3）非必需物品禁止帶入實驗室，帶入實驗室的物品應遠離操作區(qū)，放在指定的區(qū)域。

（4）實驗室內(nèi)不準大聲喧嘩、嬉戲，應保持實驗室的安靜、整潔和有序。不準在實驗室內(nèi)吸煙、飲水和進食，盡量避免用手觸摸頭、面部，防止感染，盡量減少室內(nèi)活動，以免引起風動。

（5）實驗中注意正確使用試劑，按操作規(guī)程使用儀器，遇到儀器故障時請老師幫助解決，切勿擅自折卸，否則因此而損壞儀器，應予以賠償。

（6）用過的污染物品應放到指定的地點，經(jīng)專人消毒滅菌之后再進行清洗，切勿亂丟或沖入水池中。禁止將本實驗室的物品帶出實驗室外。需送溫箱培養(yǎng)的物品，應標記好材料名稱、姓名、日期后送到指定位置。

（7）實驗過程中，切勿使用乙醇、乙醚、丙酮等易燃藥品接近火焰。如遇火險，應關閉電源，用濕布阻燃滅火，必要時使用滅火器。

（8）實驗完畢后應將桌面整理清潔，試劑、儀器放回原處，并將操作臺擦

拭干凈，打掃衛(wèi)生，關好水、電、門窗。

（9）離室前脫下工作服，反折放在指定的地方；雙手在2％來蘇液中浸泡5min左右，再用肥皂、清水洗凈，方可離開實驗室。

第五篇：2013年下期環(huán)境工程微生物學次實驗安排

環(huán)境工程微生物學實驗安排

實驗一光學顯微鏡的使用及微生物個體形態(tài)的觀察 實驗四微生物的大小測量、微生物的計數(shù)

1）環(huán)工一班：2013年11月10日（星期日）上午八點

實驗地點：工科三號樓A512房

2）環(huán)工二班：2013年11月10日（星期日）下午一點半

實驗地點：工科三號樓A512房

實驗三培養(yǎng)基的制備、滅菌

1）環(huán)工一班：2013年11月10日（星期日）下午一點半

實驗地點：工科三號樓A515房

2）環(huán)工二班：2013年11月10日（星期日）上午八點

實驗地點：工科三號樓A515房

實驗二微生物染色技術

1）環(huán)工一班：2013年11月11日（星期一）下午一點

實驗地點：工科三號樓A512房

2）環(huán)工二班：2013年11月11日（星期一）下午三點

實驗地點：工科三號樓A512房