第一篇：酵母轉化問題參考

Ways to Destroy Your Yeast Transformation

by Emily Crow on 27th of July, 2011 in Cell / Tissue Culture

Transforming yeast with DNA is a very similar process to transforming E.coli, but with just enough differences to trip you up if you let your attention slip.Whether you’re doing a yeast two-hybrid screen, or using yeast as a model system, here are a some mistakes to to avoid…

1.Forgetting to add single stranded DNA

While E.coli readily takes up double-stranded DNA, yeast requires the addition of single-stranded “carrier DNA” to enhance uptake of your plasmid or fragment.If you only add your plasmid to the transformation mix, chances are you’ll be confronted with a pristinely sterile plate after three days of incubation.2.Using old PEG

PEG(polyethylene glycol)is a crucial ingredient in the yeast transformation buffer.Unfortunately, it’s annoying to make and goes bad quickly.The percentage of PEG will make or break the success of your transformation;an old PEG solution has had a chance to evaporate, so that the water to PEG ratio is off.If you can stand it, make new PEG for every transformation.Otherwise, make it in small batches, and seal tightly with parafilm between uses to minimize evaporation.3.Using cells in stationary phase

Cells in log phase, or exponential growth, take up DNA with much better efficiency.This is not to say that cells from a stationary culture can’t be transformed – only that your successful transformation rate will be much lower.Your best bet is to use cells that are growing rapidly at the time of transformation.4.Using the wrong selective marker

A stupid mistake, but one that I’ve made more times than I’d like to admit.Double check to save yourself some tears!

5.Cutting corners when heat-shocking

This is a major difference between E.coliand yeast transformations: while E.coli is relatively delicate, and requires a heat-shock of less than a minute to take up DNA, the cell wall makes yeast more hardy and resistant to shock.Thus, for efficient transformation, yeast are generally heat-shocked for up to 45 minutes.I’ve gotten away with as little as 15 minutes, but any shorter and the transformation efficiency is drastically reduced.If you’re not in a hurry, let it go the whole 45 minutes, or you’ll get to experience the joy of doing it all over again.

第二篇：關于酵母類產品是否上稅問題

根據相關法律來分析，酵母細胞壁多糖和酵母自溶物無論是以原料還是添加劑形式，都應該要交稅，只有簡單處理的飼用酵母可以享受稅收優惠政策，稅率會低一些，稅率為13%，正常位17%。

（以下是各法律文件）

關于飼料產品免征增值稅問題的通知

根據國務院關于部分飼料產品繼續免征增值稅的批示，現將免稅飼料產品范圍及國內環節飼料免征增值稅的管理辦法明確如下：

一、免稅飼料產品范圍包括：

（一）單一大宗飼料。指以一種動物、植物、微生物或礦物質為來源的產品或其副產品。其范圍僅限于糠麩、酒糟、魚粉、草飼料、飼料級磷酸氫鈣及除豆粕以外的菜子粕、棉子粕、向日葵粕、花生粕等粕類產品。

（二）混合飼料。指由兩種以上單一大宗飼料、糧食、糧食副產品及飼料添加劑按照一定比例配置，其中單一大宗飼料、糧食及糧食副產品的參兌比例不低于95%的飼料。

（三）配合飼料。指根據不同的飼養對象，飼養對象的不同生長發育階段的營養需要，將多種飼料原料按飼料配方經工業生產后，形成的能滿足飼養動物全部營養需要（除水分外）的飼料。

（四）復合預混料。指能夠按照國家有關飼料產品的標準要求量，全面提供動物飼養相應階段所需微量元素（4種或以上）、維生素（8種或以上），由微量元素、維生素、氨基酸和非營養性添加劑中任何兩類或兩類以上的組分與載體或稀釋劑按一定比例配置的均勻混合物。

（五）濃縮飼料。指由蛋白質、復合預混料及礦物質等按一定比例配制的均勻混合物。

二、原有的飼料生產企業及新辦的飼料生產企業，應憑省級稅務機關認可的飼料質量檢測機構出具的飼料產品合格證明，向所在地主管稅務機關提出免稅申請，經省級國家稅務局審核批準后，由企業所在地主管稅務機關辦理免征增值稅手續。飼料生產企業飼料產品需檢測品種由省級稅務機關根據本地區的具體情況確定。

三、本通知自2001年8月1日起執行。2001年8月1日前免稅飼料范圍及豆粕的征稅問題，仍按照《國家稅務總局關于修訂“飼料”注釋及加強飼料征免增值稅管理問題的通知》（國稅發[1999]39號）執行

飼料類初加工免征企業所得稅

中華人民共和國財政部、國家稅務總局聯合發布財稅〔2008〕149號文印發了《享受企業所得稅優惠政策的農產品初加工范圍（試行）》（2008年版）

（二）飼料類初加工

1.植物類飼料初加工。通過碾磨、破碎、壓榨、干燥、釀制、發酵等簡單加工處理，制成的糠麩、餅粕、糟渣、樹葉粉。

2.動物類飼料初加工。通過破碎、烘干、制粉等簡單加工處理，制成的魚粉、蝦粉、骨粉、肉粉、血粉、羽毛粉、乳清粉。

3.添加劑類初加工。通過粉碎、發酵、干燥等簡單加工處理，制成的礦石粉、飼用酵母。

（三）牧草類初加工

通過對牧草、牧草種籽、農作物秸稈等，進行收割、打捆、粉碎、壓塊、成粒、分選、青貯、氨化、微化等簡單加工處理，制成的干草、草捆、草粉、草塊或草餅、草顆粒、牧草種籽以及草皮、秸稈粉（塊、粒）。

根據國家稅務總局《關于修訂“飼料”注釋及加強飼料征免增值稅管理問題的通知》（國稅發[1999]39號）的規定，用于動物飼養的糧食、飼料添加劑不屬于免稅范圍。根據《財政部 國家稅務總局關于若干農業生產飼料征免增值稅政策的通知》（財稅[2001]113號）的規定，生產銷售的除尿素以外的氮肥、除磷酸二銨以外的磷肥、鉀肥以及以免稅化肥為主要原料的復混費免征增值稅。飼料添加劑不屬于免稅范圍，應繳納增值稅，稅率為17%。

從飼料添加劑預混料生產和原料構成看，它是由五種或六種添加劑加上一種或兩種載體混合而成，添加劑的價值占預混料的７０％以上。按照國家稅務總局１９９３年１２月２５日印發的《均值稅部分貨物征稅范圍注釋》（國稅發〔１９９３〕１５１號）中“飼料”的解釋范圍的規定，飼料添加劑預混料難以歸入上述“飼料”的解釋范圍，因此，不能享受規定的“飼料”免征增值稅的待遇。

第三篇：轉化方法和酵母質粒抽提

酵母轉化（快速）

侯昕

1、挑單菌落于3ml 2XYPAD培養基中，30°C 200rpm培養至菌濃度為2X108 cell/ml。（約18h）。

2、用1.5ml離心管收集菌液兩次，每次1ml，13500rpm，常溫離心30秒。3、4、2mg/ml carrier DNA變性，100°C 5分鐘，置冰上備用。在菌中依次加入

50％PEG3350

240ul

1M LiAc

34ul 2mg/ml S.S.carrier DNA

50ul plasmid DNA(各1ug)

36ul 每加入一種后，要吸打混勻。5、6、42°C水浴1－3小時。

13500rpm離心1分鐘，吸棄上清。沉淀中加500ul水，吸打均勻，100ul涂皿。

7、30°C培養兩天

此方法可用于已知蛋白互做檢測，將兩個質粒共轉化。

2×YPAD：Yeast Extract

16g

2mg/ml carrier DNA：

Peptone

32g

鮭魚精DNA（Sima D1626）

Glucose

32g

溶于水，低溫放置過夜，滅

Adenine hemisulfate

80mg

菌后－20°C保存。

d2 H2O

800ml 酵母轉化（高效）

侯昕

1、挑酵母單菌落于100ml SC液體培養基中，30°C，200rpm搖至菌濃度為2X107 cell/ml（稀釋20倍，OD545或OD600為0.1）。※或挑酵母單菌落于50ml 2XYPAD液體培養基中，30°C，200rpm搖至菌濃度為2X108cell/ml（稀釋200倍，OD545或OD600為0.1）。

2、用兩個50ml離心管分別收集40ml菌液，3000g，常溫離心5分鐘。

3、將菌分別轉入兩瓶150ml 2XYPAD培養基中，擴大培養至菌濃度為2X107cell/ml。

4、用500ml離心管收集300ml菌液，3000g，5分鐘。用 200mlddH2O洗兩次，將菌轉入一個50ml離心管。

5、2mg/ml carrier DNA變性，100°C 5分鐘，置冰上備用。

6、配Mixture：

50％PEG3350

14.4Mml

1M LiAc

2.16ml 2mg/ml S.S.carrier DNA

3ml plasmid DNA＋ddH2O

2.04ml

7、把Mixture加入菌沉淀中，吸打均勻。

8、42°C水域熱激45分鐘；每5分鐘搖一下，使其受熱均勻。

9、3000g，離心5分鐘，棄上清，菌沉淀中加40ml水，吸打均勻，涂皿，100－200u/皿。

此方法可用于酵母雙雜交文庫篩選，建議分步轉化。

酵母質粒抽提

侯昕

1、收集菌液，10000g，離心10秒。

2、菌沉淀中加200ul YLS，牙簽打散。

3、加200ul 苯酚氯仿異戊醇（25：24：1），搖5分鐘，13000rpm，離心5分鐘。

4、將上層轉入一新離心管中，重復3。

5、將上層轉入一新離心管中，加20ul 3M NaOAc（pH5.2）、500ul乙醇，搖勻，10000g，4°C離心10－30分鐘。

6、750ul 75％乙醇洗，10000g，離心5－10分鐘。

7、重復6。

8、吹干，加10－20ul 水或TE。

此方法得到的質粒可用于電轉大腸桿菌

Yeast lysis solution（YLS）：

2％（v/v）

Triton X－100

1％（w/v）

SDS 100mM

NaCl 1mM

EDTA

第四篇：實驗總結的幾種高效釀酒酵母轉化方法

電轉法

設計方案一：

感受態制備：

1.挑一環酵母菌接種于5mL YEPD培養基中，30℃、250-300rpm培養過夜； 2.取1mL一級種子分別接種于兩瓶50mL YEPD培養基中，30℃、250-300rpm培養約16-18h(OD:1.3-1.5)；

3.于4℃離心收集菌體，用25mL冰無菌水洗滌一次后，細胞用10ml冰無菌水重懸，可換成較小的離心管； 4.加入1ml，pH7.5，10×TE緩沖液，搖晃均勻，再加入1ml 10×LiAc，旋轉搖勻，于30度輕輕搖動45min；

5.再加入0.4ml 1 mol/L DTT，并同時旋轉搖動，于30度輕輕搖動15min； 6.于4℃離心，棄上清（用槍吸），再用25mL冰無菌水洗滌；

7.2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗滌，離心收集菌體，棄上清（用槍吸）； 8.每管用100ul山梨醇溶解，分裝于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。電轉化：

1．向感受態細胞中加入約5～10ug（體積小于10 ul）的DNA，用槍吹吸均勻，轉移至預冷的電轉杯中，靜置5min；

2．擦干電轉杯，電擊，電擊參數：1.5KV，25uF，200歐姆；

3．立即加入1ml 預冷的山梨醇，轉移至EP管中，于30℃靜置1h； 4．離心，棄上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培養2h； 5．離心得菌體后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板進行涂板。

說明：該方法可直接采用50或100mL體系的一步法，即直接挑單菌落于YEPD中培養至預定菌濃，也可采用試管搖菌收集菌體制備感受態。

設計方案二：

感受態制備：

1.挑一環酵母菌接種于5mL YEPD培養基中，30℃、250-300rpm培養過夜； 2.取1mL一級種子分別接種于兩瓶50mL YEPD培養基中，30℃、250-300rpm培養約16-18h(OD:1.3-1.5)；

3.于4℃，5000rpm，5min離心收集菌體，用25mL冰無菌水洗滌后，細胞重懸于8ml處理液中（處理液配方：100 mM LiAc，10 mM DTT，0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5），室溫靜置30min；

4.4℃，5000rpm，5min離心收集菌體，用1.5mL 1mol/L預冷的山梨醇洗滌三次，離心條件一樣；

5.每管用100ul山梨醇溶解（以黃槍頭能吸取為宜，菌濃低時可適量少加入山梨醇），最后以80 ul的終體積轉移至EP管中（菌體太多可適當放棄部分），置于-70℃冰箱保存。電轉化：

1.向感受態細胞中加入約3ug（體積小于10ul）的DNA，用槍吹吸均勻，轉移至預冷的電轉杯中，靜置5min；

2.擦干電轉杯，電擊，電擊參數：2.0KV，25uF，200歐姆；

3.立即加入1ml 預冷的山梨醇，轉移至EP管中，于30℃靜置1h；

4.離心，棄上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培養2h； 5.離心得菌體后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板進行涂板。

說明：處理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT單獨于-20度保存，可配成100倍的貯備液。制備體系可按比例放大。

設計方案二特別適合于采用一步法制備感受態細胞 具體如下：

1.挑一環酵母菌接種于5mL YEPD培養基中或轉接于50mL YEPD中，在30℃、250-300rpm 條件下培養至OD=6-10（為防止菌體老化，可將50mL培養體系提早收獲細胞，取菌體時，以1mL/次，取菌兩次或三次不等，使用菌濃達到預定的OD:6-10）；

2.取1mL菌液分裝于EP管中，于4℃，12000rpm離心30s，棄上清； 3.收集菌體，用預冰的無菌水洗滌兩次，離心條件一樣；

4.所得菌體用1mL處理液（配方同上）于室溫下處理30min；

5.離心，棄上清，加入1ml 1M 預冷山梨醇，離心，棄上清，重復兩次； 6.最終用1M 預冷山梨醇溶解菌體至終體積為80 ul，于-70℃冰箱保存； 7.電轉方法同上。

8.每一步的離心均30s即可，在較短的時間內制備出的感受態轉化效率特別高。

備注：OD檢測均為600nm，空白參比為：YEPD，高濃測定時應稀釋測定。所有無菌水與山梨醇均在冰上預冷處理；在制備感受態階段，所有離心均在4℃條件下。

醋酸鋰轉化法

方案一：

1.挑一環酵母菌接種于5mL YEPD培養基中，30℃、200rpm培養過夜；

2.取1mL一級種子分別接種于兩瓶50mL YEPD培養基中，30℃、250-300rpm培養約5h(OD:0.5-0.8)；

3.于4℃，5000rpm，5min離心收集菌體； 4.25mL冰無菌水洗滌兩次，離心條件一樣； 5.用1mL 0.1M LiAc懸浮，離心收集菌體；

6.再用0.5mL 0.1M LiAc懸浮，以50 ul/管分裝于EP管中，置于冰上備用； 7.依次向上述50 ul感受態細胞中加入50% PEG3350 ：240ul、1M LiCl：36ul、2mg/ml 單鏈DNA：50ul、轉化DNA（5-10ug）：50ul； 8.劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體完全分布均勻（約1min）； 9.30℃水浴孵育30min；

10.42℃水浴熱休克20～25min；

11.13000rpm離心30s收集酵母菌體，重懸酵母于1ml YEPD培養基，30℃搖床

孵育4h；

12.離心收集沉淀菌體，取除約800 ul上清液，然后按每100 ul/板進行漲涂板。

方案二：

1、接種液體YEPD培養基，過夜培養至1-2×107cells/ml；

2、取1mL一級種子分別接種于兩瓶50mL YEPD培養基中，30℃、250-300rpm培養約5h(OD:0.5-0.8)；

3、收集細胞，并用無菌水清洗，之后用1ml無菌水重懸，并轉移到1.5ml離心管； 4、1ml TE/LiAC（10×TE[0.1 M Tris-HCI,0.01 M EDTA,pH 7.5]；lO×LiAc[1 M LiAc pH 7.5）清洗細胞，然后用1×TE/LiAC重懸至2×109 cells/ml； 5、1.5ml離心管中取50u懸浮液，用1ug轉化片段和50ug單鏈鮭魚精DNA混合；

6、加入300ul滅菌的40%PEG溶液，劇烈混勻； 7、30度振蕩培養30min； 8、42度水浴熱擊15min；

9、離心5s，用1ml 1×TE重懸，適當稀釋后涂布于選擇培養基。

附：

電轉法方案二中的處量液配制方法：

1.A液成份：100 mM LiAc，0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5；配制量：500mL。

1.1 稱取54.654g山梨醇，用適量dd無菌水溶解于500 mL容量瓶中； 1.2 事先配制1 M LiAc母液，再從LiAc母液中取50mL至1.1所述容量瓶中； 1.3 事先配好1M Tris-HCl（pH 7.5），再取5mL至1.1所述容量瓶中； 1.4 用dd無菌水定量至500mL，轉移至試劑瓶中，于4℃保存。2.B液成份（母液）：1 M DTT

配制量：20mL。2.1 稱取3.09g DTT，加入到50mL小燒杯內； 2.2 加入20 mL的0.01M NaOAc(pH5.2)，溶解后使用0.22um濾器過濾除菌； 2.3 適量分成小份后，-20℃保存。

3.在使用時按每50mL菌體量用8mL處理液（A+B）。以50mL菌體為例：取A 液8mL，再取80ul 1 M DTT 于小三角瓶中混勻，備用。

第五篇：酵母雙雜交技術研究進展

酵母雙雜交技術研究進展

提 要 酵母雙雜交技術是一種有效的真核活細胞內研究方法，在蛋白質相互作用的研究方面得到了廣泛的應用并取得了許多有價值的重要發現。作為一個完整的實驗系統，它自建立以來經過了不斷的改進與完善，不僅進一步提高了實驗結果的可靠性與精確性，而且在此基礎上又發展了反向雙雜交，三雜交及核外雙雜交等多項技術。這些都將對功能基因組學和蛋白質組學的研究起到促進作用。

0 引言

隨著分子生物學研究尤其是人類基因組計劃的迅速發展，大量關于基因結構的信息不斷涌現，對這些信息進行系統研究以了解新基因功能的要求也日益迫切。這不僅需要利用計算機進行生物信息學的分析和預測，而且必須結合生物學實驗獲取證據。為適應同時對多個基因或蛋白進行研究的發展趨勢，已出現了很多新技術，如DNA微陣列技術（DNA micoarry）,基因表達的系列分析（SAGE）,肽質譜分析法，蛋白雙向膠電泳技術及酵母雙雜交技術（Yeast Two-Hybrid System）等。其中酵母雙雜交技術以其簡便，靈敏，高效以及能反映不同蛋白質之間在活細胞內的相互作用等特點在基因功能的研究中得到了廣泛的應用。酵母雙雜交技術的基本原理

1989年，Song和Field建立了第一個基于酵母的細胞內檢測蛋白間相互作用的遺傳系統〔1〕。很多真核生物的位點特異轉錄激活因子通常具有兩個可分割開的結構域，即DNA特異結合域（DNA-binding domain，BD）與轉錄激活域（Transcriptional activation domain，AD）。這兩個結構域各具功能，互不影響。但一個完整的激活特定基因表達的激活因子必須同時含有這兩個結構域,否則無法完成激活功能。不同來源激活因子的BD區與AD結合后則特異地激活被BD結合的基因表達。基于這個原理，可將兩個待測蛋白分別與這兩個結構域建成融合蛋白，并共表達于同一個酵母細胞內。如果兩個待測蛋白間能發生相互作用，就會通過待測蛋白的橋梁作用使AD與BD形成一個完整的轉錄激活因子并激活相應的報告基因表達。通過對報告基因表型的測定可以很容易地知道待測蛋白分子間是否發生了相互作用。

酵母雙雜交系統由三個部分組成：(1)與BD融合的蛋白表達載體，被表達的蛋白稱誘餌蛋白(bait)。(2)與AD融合的蛋白表達載體，被其表達的蛋白稱靶蛋白(prey)。(3)帶有一個或多個報告基因的宿主菌株。常用的報告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株則具有相應的缺陷型。雙雜交質粒上分別帶有不同的抗性基因和營養標記基因。這些有利于實驗后期雜交質粒的鑒定與分離。根據目前通用的系統中BD來源的不同主要分為GAL4系統和LexA系統。后者因其BD來源于原核生物，在真核生物內缺少同源性，因此可以減少假陽性的出現。酵母雙雜交技術的應用現狀

酵母雙雜交技術產生以來，它主要應用在以下幾方面：(1）檢驗一對功能已知蛋白間的相

互作用。(2）研究一對蛋白間發生相互作用所必需的結構域。通常需對待測蛋白做點突變或缺失突變的處理。其結果若與結構生物學研究結合則可以極大地促進后者的發展。(3)用已知功能的蛋白基因篩選雙雜交cDNA文庫，以研究蛋白質之間相互作用的傳遞途徑。(4)分析新基因的生物學功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫。然后根據釣到的已知基因的功能推測該新基因的功能。常見問題的解決與改進

酵母雙雜交系統應用中常遇到的問題一是假陽性較多，二是轉化效率偏低。所謂假陽性就是:在待研究的兩個蛋白間沒有發生相互作用的情況下,報告基因被激活。主要原因是由于BD融合誘餌蛋白有單獨激活作用,或者這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結合,則也可單獨激活報告基因的表達。因此,為排除假陽性就需要作嚴格的對照試驗。應對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑒定。目前幾個公司推出的酵母雙雜系統都采用了多個報告基因,且每個報告基因的上游調控區各不相同,這可減少大量的假陽性。另外,報告基因通常整合到染色體上,可以使基因表達水平穩定,消除了由于質粒拷貝數變化引起基因表達水平波動而造成的假陽性。即使根據嚴格的對照實驗證明確實發生了蛋白間的相互作用，還應對以下方面進行分析：

(1)這種相互作用是否會在細胞內自然發生,即這一對蛋白在細胞的正常生命活動中是否會在同一時間表達且定位在同一區域。

（2)某些蛋白如是依賴于遍在蛋白的蛋白酶解途徑的成員,它們具有普遍的蛋白間的相互作用的能力。

（3)一些實際上沒有任何相互作用的但有相同的模體(motif)如兩個親a-螺旋的蛋白質間可以發生相互作用。十年來,酵母雙雜交技術一直在消除假陽性方面不斷改進,并且已取得較好的效果。

在酵母雙雜交的應用中有時也會遇到假陰性現象。所謂假陰性，即兩個蛋白本應發生相互作用,但報告基因不表達或表達程度甚低以至于檢測不出來。造成假陰性的原因主要有兩 方面：一是融合蛋白的表達對細胞有毒性。這時應該選擇敏感性低的菌株或拷貝數低的載體。二是蛋白間的相互作用較弱，應選擇高敏感的菌株及多拷貝載體。目前假陰性現象雖不是實驗中的主要問題,但也應予以重視。

轉化效率是酵母雙雜交文庫篩選時成敗的關鍵之一，特別是對低豐度cDNA庫進行篩選時，必須提高轉化效率。轉化時可采用共轉化或依次轉化，相比之下共轉化省時省力。更重要的是如果單獨轉化會發生融合表達蛋白對酵母細胞的毒性時,共轉化則可以減弱或消除這種毒性。一種更有效的方法是將誘餌蛋白載體與靶蛋白載體分別轉入不同接合型的單倍體酵母中,通過兩種接合型單倍體細胞的雜交將誘餌蛋白與靶蛋白帶入同一個二倍體細胞。目前很多機構建立了大量的cDNA文庫和基因組文庫，但這些文庫大多無法直接用于雙雜交系統的篩選。而文庫的質量對于轉化和篩選又非常關鍵。因此，大量構建適用于酵母雙雜交的文庫非常必要。現已出現一種采用體內重組技術來達到這個目的的方法。酵母雙雜交技術的新發展

酵母雙雜交技術在應用中發揮了巨大的作用，但人們也注意到了它有一定的局限性。為此發展了多種適應不同目的需要的改型的雙雜交技術。

反向雙雜交技術 在研究中檢測并鑒定出那些能阻斷兩個蛋白間相互作用的因素有重要意義。在研究那些能使相互作用被阻斷的因素(如尋找哪些結構域上發生突變可使相互作用中

斷或那些分子可以阻斷相互作用)時，傳統的雙雜交技術有較大的局限性。因此，反向雙雜交系統(Reverse Two-Hybrid System)應運而生。這項技術的特點是采取了反選擇篩選策略。根據反選擇設計的不同，大致可以分為兩類。一類是用便于反選擇的URA3或CYH2基因作為報告基因。URA3基因編碼尿嘧啶合成途徑中的重要酶：乳清酸核苷5’-磷酸脫羧酶，它能把5’-氟乳清酸（5’-FOA）轉變為細胞毒性物質，使細胞無法生長。反之，在能生長的細胞中，外界因素已使蛋白間的相互作用不能發生，而我們想知道的正是這些因素。因此，只要對存活的克隆進行檢測就可以得到結果。Vidal等人用這種技術發現了影響轉錄因子E2F1中與DP1相互作用必需區內的點突變。另一類是將常規報告基因(如HIS3)置于大腸桿菌轉座子Tn10編碼的tet-抑制因子(TetR)/操縱基因控制之下。待測蛋白之間發生相互作用后首先激活tet-R基因表達抑制因子TetR,TetR結合到tet操縱基因后就抑制了報告基因的表達，結果轉化子不能生長。只有當待測蛋白之間的相互作用被某種因素所阻斷而無法激活tet-R基因時，報告基因才能擺脫tet操縱基因的控制而表達，使轉化子獲得在選擇培養基上生長的能力。Shih 等人利用這種方法鑒定出cAMP-應答元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)中磷酸化位點的Ser133突變會阻斷其與輔助激活因子(CREB結合蛋白)的相互作用。

三雜交技術 在許多細胞內信號傳遞過程中，兩個蛋白間的相互作用常涉及到其它的大分子。如蛋白，激酶，RNA,多肽及其它大分子。在研究這些大分子對蛋白間相互作用的影響過程中發展了一種新的技術系統——三雜交系統(Three-Hybrid System)，其本質與雙雜交是相同的，只是需通過第三個分子的介導把兩個雜交蛋白帶到一起。例如小配體三雜交系統(Small Ligand Three-Hybrid System)是利用可以滲透的二聚體化學誘導物(Chemical Inducers of Dimerization,CIDs)作橋梁，將AD和BD融合蛋白連接到一起，激活報道基因的表達。研究較多的是免疫抑制劑FK506。Belshaw等將FK506與環孢菌素A(Cyclosporin

A)構建成異源二聚體，它能把分別與FK506和環孢菌素A有相互作用的AD和BD融合蛋白拉倒一起，激活報告基因。Licitra將FK506與地米塞松(dexamethasone)通過共價鍵連接成二聚體。通過實驗進一步證實了FK506與蛋白FKBP-12間的特異性相互作用，表明用這種方法鑒定蛋白與小分子間的相互作用是切實可行的。RNA與蛋白之間的相互作用是許多細胞生命活動的基礎，例如mRNA的翻譯，早期發育以及RNA病毒的感染等。然而可用于這方面研究的簡便方法卻很少。RNA三雜交系統(RNA Three-Hybrid System)的建立為分析RNA與蛋白之間的相互作用提供了有效的手段。這個系統主要是由一個RNA分子和兩個都能結合該RNA的蛋白質組成。此RNA的一部分與一個已知蛋白結合后就可利用它的另一部分去篩選新的RNA結合蛋白。因此這種技術既可檢測由RNA介導的兩個蛋白質之間的相互作用，也可篩選鑒定新的蛋白結合RNA。Putz等把HIV-1病毒Rev蛋白的突變體RevM10與Gal4 DB域融合作為誘餌蛋白，利用該RevM10蛋白能識別并結合其靶RNA中Rev蛋白反應元件(Rev responsive element,RRE)的作用去篩選同樣也能與此RNA結合并已與Gal4 AD域融合的未知蛋白。根據同樣的原理，如將一個已知RNA與RRE融合形成雜合RNA分子并配以RevM10-Gal4 DB融合蛋白作為誘餌，便可用于篩選該RNA結合蛋白的cDNA克隆。SenGupta 等利用RNA噬菌體衣殼蛋白能識別結合其基因組內一種21核苷酸的RNA莖環結構的特性，將RNA噬菌體衣殼蛋白與Lex DB域融合，構建成可用于尋找體內的RNA結合蛋白的酵母三雜交系統。

核外雙雜交技術 在傳統的酵母雙雜交系統中，蛋白之間的相互作用是在細胞核內發生的。因此,它不能檢測某些在核外蛋白之間的相互作用。為了克服這種局限性，近年來有人建立了核外雙雜交技術。其中SRS 和USPS就是這種技術的兩個代表。SRS也稱Sos蛋白召集系統(Sos Recruitment System)。它的基本原理是分別將待測蛋白X與哺乳動物細胞的一種鳥苷交換因子(EGF)Sos蛋白融合；將Y蛋白與錨定在酵母細胞膜上的Src肉豆寇烯化信

號蛋白融合，并使它們共表達于一個cdc25-2基因溫度敏感型突變的酵母菌株內。由于該菌株中cdc25-2基因編碼的EGF蛋白在36℃條件下不能激活細胞膜上的Ras蛋白，Ras途徑不通。所以細胞無法在36℃條件下生存。但如果待測蛋白X與Y之間發生相互作用就能把Sos蛋白帶到細胞膜上并激活附近的Ras蛋白，從而打通Ras途徑，使該菌株獲得在36℃條件下生存的能力。Aronheim等用此技術鑒別出了一些新的c-Jun相互作用蛋白，并分離到了一個AP-1抑制因子JDP2。USPS也稱為基于遍在蛋白的裂解蛋白感受器(Ubiquitin-based Split Protein Sensor)。它的設計是根據這樣一個事實，即真核細胞中遍在蛋白與某一蛋白之間新生成的融合會被遍在蛋白特異的蛋白酶(UBPs)迅速切開，但這種切割只有當遍在蛋白正確折疊時才會發生。研究發現，遍在蛋白基因的N端和C端這兩部分即使分離，只要共表達與同一個細胞內，它們仍能正確折疊。將待測蛋白X與帶有點突變的遍在蛋白N端片段融合，將待測蛋白Y與下游接有報告蛋白的正常遍在蛋白C端片段融合，并使它們共表達與同一個細胞內。因遍在蛋白N端片段內含有點突變，它與C端片段之間不能自然形成正確的折疊。只有當蛋白X和Y之間發生相互作用時才能克服點突變的影響，使遍在蛋白的兩端形成正確折疊，從而引來UBPs切除與C端片段連接的報告蛋白。此技術建立之初是通過Western blot檢測有無被切下的報告蛋白來判斷待測蛋白之間是否發生了相互作用的，所以操作比較繁瑣，不便于推廣。最近有人對它作了改進，以一種融合的轉錄激活因子PLV作為報告蛋白。PLV一旦被從遍在蛋白C端片段上切下，它就會進入細胞核內激活特定的報告基因，如：LacZ 和HIS3等。這樣就可以根據轉化細胞是否生長及顯色來判斷待測蛋白之間有無相互作用。因此極大地簡化了操作步驟，提高了篩選效率。酵母雙雜交技術發展與應用的趨勢

在后基因組時代更具意義且更能發揮酵母雙雜交技術的領域是研究生命活動中的網絡調節。第一個具有開拓性的工作是Bartel利用酵母雙雜交技術建立了一個T7-噬菌體的網絡調節圖(linkage-map)。Fromont-Racine等對篩選到的陽性克隆進行鑒定測序，并將它們分為5類，然后對其中的四類(非編碼序列除外)通過15輪的篩選與分析，繪制出一張綜合了酵母蛋白相互作用的全局性信息圖。這是以往的實驗所難以獲得的。

為適應功能基因網絡調控研究的需要，CLONTECH公司在Merck-Washington大學的EST項目研究成果基礎上，采用了與傳統建庫方式完全不同的細胞內同源重組方法，以高通量規模構建了一種陣列模式的酵母雙雜交cDNA文庫。它主要有以下特點：

(1)來源于多種組織器官和細胞系，因此含有幾乎所有基因的cDNA；

（2）所含各種cDNA的豐度趨于平衡；

（3)含有較長的插入序列，但不是全長cDNA序列。

這樣既避免了5’非編碼區可能存在的終止密碼阻礙融合蛋白的翻譯，又保證了表達出的蛋白構象接近于天然。這種建庫方法不僅減少了工作量，而且在雙雜交中新發現的相互作用蛋白種類也明顯增多。

最后，有必要指出的是，酵母雙雜交技術必須與其它技術結合才能有利于對實驗結果作出更為完整和準確的判斷。

胡文峰

2007040380106