第一篇：酵母表達(dá)系統(tǒng)使用心得

Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)使用心得

甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)有不少優(yōu)點(diǎn)，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表達(dá)系統(tǒng)最為人熟知，并廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)。雖然說(shuō)酵母表達(dá)操作簡(jiǎn)單表達(dá)量高，但是在實(shí)際操作中，并不是每個(gè)外源基因都能順利得到高表達(dá)的。不少人在操作中會(huì)遇到這樣那樣的問(wèn)題，收集了部分用戶在使用EasySelect Pichia Expression System這個(gè)被譽(yù)為最簡(jiǎn)單的畢赤酵母表達(dá)的經(jīng)典試劑盒過(guò)程中的心得體會(huì)。其中Xiang Yang是來(lái)自美國(guó)喬治城大學(xué)（Georgetown University）Lombardi癌癥中心（Lombardi Cancer Center），部分用戶來(lái)自國(guó)內(nèi)。甲醇酵母部分優(yōu)點(diǎn)：

1.屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，具有一定的蛋白質(zhì)翻譯后加工，有利于真核蛋白的表達(dá)； 2.AOX強(qiáng)效啟動(dòng)子，外源基因產(chǎn)物表達(dá)量高，表達(dá)產(chǎn)物可以達(dá)到每升數(shù)克的水平； 3.酵母培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、高密度發(fā)酵等操作接近原核生物，遠(yuǎn)較真核系 統(tǒng)簡(jiǎn)單，非常適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；

4.可以誘導(dǎo)表達(dá)，也可以分泌表達(dá)，便于產(chǎn)物純化；

5.可以甲醇代替IPTG作為誘導(dǎo)物，部分甲醇酵母更可以用工業(yè)甲醇替代葡萄糖作為碳源，生產(chǎn)成本低。

產(chǎn)品性能：優(yōu)點(diǎn)——使用簡(jiǎn)單，表達(dá)量高，His-tag便于純化；缺點(diǎn)——酵母表達(dá)蛋白有時(shí)會(huì)出現(xiàn)蛋白切割問(wèn)題。

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種能高效表達(dá)重組蛋白的酵母品種，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達(dá)出來(lái)的蛋白可以進(jìn)行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長(zhǎng)速度快，可以將表達(dá)的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，方便蛋白純化。

畢赤酵母表達(dá)載體pPICZ在多克隆位點(diǎn)（MCR）3'端帶有his-tag和c-myc epitopes，這些tag有利于常規(guī)檢測(cè)和純化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表達(dá)，并且在表達(dá)后α-factor可以自動(dòng)被切除。在進(jìn)行克隆的時(shí)候，如果你選擇的是EcoRI，那么只需在目標(biāo)蛋白中增加兩個(gè)氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列選用的是Zeocin抗生素作為篩選標(biāo)記，而誘導(dǎo)表達(dá)的載體需要甲醇——甲醇比一般用于大腸桿菌表達(dá)誘導(dǎo)使用的IPTG便宜。第一步——構(gòu)建載體

Xiang Yang：pPICZ系列有許多克隆位點(diǎn)可供選擇，同時(shí)也有三種讀碼框以便不用的用戶需要。

紅葉山莊：有關(guān)是選擇pPIC9K還是pPICZ系列？pPIC9K屬于穿梭質(zhì)粒，也可以在原核表達(dá)，而pPICZ系列比較容易操作，大腸和畢赤酵母均用抗Zeocin篩選（PIC9K操作麻煩一點(diǎn)，大腸用amp抗性，而畢赤酵母先用His缺陷篩選陽(yáng)性克隆，在利用G418篩選多拷貝），而且對(duì)于大小合適（30—50KD）的蛋白在產(chǎn)量上是pPIC9K無(wú)法比擬的。

leslie：要做畢赤酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)，首先當(dāng)然就要了解這個(gè)可愛(ài)的酵母了（橢圓形，肥嘟嘟的，十分可愛(ài)），她和大腸桿菌長(zhǎng)得有較大區(qū)別（大腸桿菌是桿狀的），因此在培養(yǎng)的過(guò)程中要區(qū)別這兩種菌體，除了氣味，濃度，顏色以外，也可以取樣到顯微鏡中觀測(cè)。大家做畢赤表達(dá)的時(shí)候應(yīng)該都遇過(guò)這種情況吧，表達(dá)過(guò)程中染菌（我們實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)污染過(guò)各種顏色形狀的細(xì)菌，那真是一段可怕的經(jīng)歷），如果在不知情的情況下繼續(xù)做下去，那可以就是浪費(fèi)大把的

時(shí)間了。

基本熟悉了畢赤酵母，了解了她生長(zhǎng)的喜好（多糖偏酸環(huán)境），生長(zhǎng)的周期等等情況后，當(dāng)然更多的精力還是應(yīng)該花在表達(dá)的目的蛋白上，我的表達(dá)蛋白有些恐怖，有100KD，本來(lái)當(dāng)然應(yīng)該放在大腸桿菌中表達(dá)，但是為了分泌表達(dá)（其實(shí)后來(lái)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌pET系列分泌表達(dá)系列也不錯(cuò)）和糖基化修飾（主要是這個(gè)方面，因?yàn)槲业牡鞍资侨嗽吹模磉_(dá)出來(lái)用于酵母雙雜，因此需要有完備的糖基化修飾）。這樣我的DNA片段由于較長(zhǎng)，所以在做克隆的時(shí)候也要非常小心，需要注意的是：

①酶切位點(diǎn)不能出現(xiàn)在目的DNA片段中——如果片段長(zhǎng)無(wú)法避免，可以采用平末端連接；

②雖然α-factor可以自動(dòng)切除，但是在設(shè)計(jì)表達(dá)的時(shí)候，如果在N端不能出現(xiàn)任何多余的aa（比如藥物蛋白表達(dá)），需要特別留意（說(shuō)明書(shū)上有詳細(xì)說(shuō)明：P13）；

③有三種不同的讀碼框（對(duì)于pPICZα系列來(lái)說(shuō)就是對(duì)上α-factor序列），在設(shè)計(jì)克隆的時(shí)候要反復(fù)確定自己的讀碼框是否正確，這可是致命的問(wèn)題；

④無(wú)論pPICZ還是pPICZα都有TGA（終止密碼子），但是pPICZ系列沒(méi)有ATG（起始密碼子），有人認(rèn)為酵母啟動(dòng)子與外源基因的ATG之間的距離越短對(duì)于表達(dá)的該基因越有利；

⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入終止密碼子；

⑥Pichia的密碼子與釀酒酵母的相似，有關(guān)基因表達(dá)偏好密碼子的問(wèn)題有人認(rèn)為沒(méi)有必要更換，有人認(rèn)為一定要換，個(gè)人認(rèn)為以產(chǎn)量為主要目的的可以考慮更換基因密碼子，而如果片段過(guò)長(zhǎng)就比較麻煩，不過(guò)有許多真核保守蛋白其實(shí)是和酵母密碼子相似的；

⑦克隆菌株需要有recA，endA，試劑盒帶有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意帶有篩選抗生素Zeocin的培養(yǎng)基要用低鹽培養(yǎng)基（NaCl減半），這主要是因?yàn)榕掠绊懙娇股刈饔茫╖eocin平板要避光保存）；

⑧測(cè)序引物可以用α-factor信號(hào)引物，也可以用5'AOX1引物；

⑨如果需要高量表達(dá)，可以考慮做克隆的時(shí)候串聯(lián)基因片段進(jìn)行表達(dá)，另外也可以在轉(zhuǎn)化酵母的時(shí)候重復(fù)轉(zhuǎn)化。

⑩目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr這樣的序列，因?yàn)檫@個(gè)序列是激活蛋白水解酶的作用底物，會(huì)影響表達(dá)，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x這樣的序列（x=任何氨基酸），因?yàn)檫@些序列容易受到容酶體的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser這樣的氨基酸。除此之外許多高A+T含量的基因通常會(huì)由于提前終止而不能有效轉(zhuǎn)錄，也需要多加注意。

第二步就是將線性化的DNA轉(zhuǎn)化入Pichia酵母中：

Xiang Yang：EasySelect試劑盒準(zhǔn)備了三種菌株：X33，GS115和KM71H。我傾向于選擇X33，因?yàn)檫@個(gè)菌株轉(zhuǎn)化率和表達(dá)量相對(duì)而言較高，如果你有電轉(zhuǎn)儀（electroporator），可以嘗試一下。如果沒(méi)有的話，EasySelect也準(zhǔn)備了化學(xué)轉(zhuǎn)化試劑——EasyComp Transformation，但是由于轉(zhuǎn)化率的緣故，我建議使用電轉(zhuǎn)儀。

leslie：在得到了正確的序列之后就可以準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化畢赤酵母了，試劑盒攜帶有的是X-33，GS115和KM71H這三種畢赤酵母（另外常用的還有SMD1168），每種酵母的特點(diǎn)有些不盡相同

（Manual上寫(xiě)的很清楚），其中X-33由于是野生型，因此耐受性比較好，如果擔(dān)心轉(zhuǎn)化率的話可以考慮這種酵母菌，而GS115與X33一樣都是屬于MUT＋表現(xiàn)型，也就是說(shuō)可以在含甲醇的培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)，但是據(jù)說(shuō)會(huì)對(duì)外源基因表達(dá)有影響，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，但是也有利于翻譯后加工，比如形成二硫鍵，糖基化等等，另外SMD1168則是基因組中的Pep4基因發(fā)生突變，造成蛋白水解酶活性的喪失，可以保護(hù)表達(dá)產(chǎn)物免受降解，促進(jìn)表達(dá)量的提高。

一般來(lái)說(shuō)，如果是胞內(nèi)表達(dá)，應(yīng)盡量用Mut－細(xì)胞，這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對(duì)較多(約占Pp總分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰膽堿酯酶B變異鏈的含量占到90%，使下游純化更易進(jìn)行。而對(duì)于分泌蛋白的表達(dá)，無(wú)論是甲醇利用慢(Mut-)還是甲醇利用快(Mut+)的細(xì)胞都可應(yīng)用，如在人血清白蛋白(HSA)(為分泌型蛋白)的表達(dá)中就看不出兩種類型的細(xì)胞之間有什么明顯差別。

所以一般手冊(cè)都會(huì)建議同時(shí)在這幾種菌株中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，這主要是因?yàn)椴煌幕蛟诓煌慕湍妇锌赡鼙磉_(dá)量截然不同，因此在最開(kāi)始的時(shí)候建議多用幾種酵母菌實(shí)驗(yàn)。

另外有個(gè)保存問(wèn)題，原始酵母菌一定要保存好，因?yàn)榻湍冈趥鞔啻魏髸?huì)影響其轉(zhuǎn)化率和表達(dá)量，所以一方面分多管分裝保存于-80℃，另一方面如果出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化或者表達(dá)的問(wèn)題，在其它方面都沒(méi)有出錯(cuò)的前提下可以考慮重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。

在準(zhǔn)備酵母菌的同時(shí)也需要準(zhǔn)備質(zhì)粒，由于酵母菌轉(zhuǎn)化對(duì)轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的要求較高，量也較大（5-10ug），因此許多時(shí)候都會(huì)用PEG大提質(zhì)粒，或者用大提試劑盒，總而言之要準(zhǔn)備好足夠量的質(zhì)粒，并且不要忘記也要同時(shí)準(zhǔn)備空載體以做對(duì)照。在轉(zhuǎn)化前質(zhì)粒需要進(jìn)行線性化，這主要是為了增加重組率（EasySelect試劑盒表達(dá)量高的一個(gè)重要原因也就在于其原理是將目的片段整合到載體上，大大的增加了目的片段的表達(dá)）。線性化位點(diǎn)個(gè)人認(rèn)為也會(huì)影響到表達(dá)量，對(duì)于基因片段不大的蛋白可以考慮用幾個(gè)線性化位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化篩選，但是如果片段大，就有可能供選擇的機(jī)會(huì)少，而且也有可能遇上沒(méi)有合適的線性化位點(diǎn)的情況，這個(gè)時(shí)候也不是說(shuō)不能進(jìn)行表達(dá)，但是準(zhǔn)備的質(zhì)粒就要增加10倍，另外也可以進(jìn)行部分酶切（即先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，掐定時(shí)間和酶量保證被切開(kāi)的質(zhì)粒有部分是在線性化位點(diǎn)切開(kāi)而基因片段保存完好）。

在線性化之后的質(zhì)粒就可以酒精沉淀回收了——中間步驟需要使酶失活，說(shuō)明書(shū)建議是熱失活或者EDTA，個(gè)人認(rèn)為前者比較好，主要是擔(dān)心EDTA對(duì)于轉(zhuǎn)化的影響，另外這三種酶失活的溫度都是65℃/20min。沉淀回收之后是離心10分鐘，用80%的酒精洗滌后風(fēng)干，這一步需要多加注意保證風(fēng)干完全，因?yàn)橛袑?shí)驗(yàn)證明殘留的酒精對(duì)于轉(zhuǎn)化的影響頗大。

接下來(lái)就是酵母轉(zhuǎn)化了，這是令許多人頭疼的一步，也是影響實(shí)驗(yàn)決定表達(dá)的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)化方法有不少，例如電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，其方法的難易程度和轉(zhuǎn)化率高低呈反向遞減的，也就是說(shuō)電轉(zhuǎn)最容易，轉(zhuǎn)化率較高（但要求有電轉(zhuǎn)儀），而原生質(zhì)體最麻煩，而且效果不好（比較傳統(tǒng)），因此不建議使用，EasySelect說(shuō)明書(shū)上這么建議，并且也詳細(xì)說(shuō)明了電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化（EasyComp和LiCl）方法的過(guò)程，可以按部就班。需要注意的是（電轉(zhuǎn)過(guò)程）：

①最好每次都從平板上挑酵母菌，用培養(yǎng)過(guò)的酵母放置時(shí)間不要超過(guò)一個(gè)星期；

②擴(kuò)大培養(yǎng)的濃度一定要控制好，個(gè)人認(rèn)為不需要OD600達(dá)到1.3-1.5，1.0-1.3的就好，這個(gè)時(shí)候的酵母比較新鮮，轉(zhuǎn)化率比較高； ③整個(gè)感受態(tài)制作過(guò)程中一定要在冰上操作，離心最好也用冷凍離心機(jī)，這是影響轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵——為了進(jìn)一步保證這一點(diǎn)，無(wú)菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和電轉(zhuǎn)杯都要預(yù)冷；

④電轉(zhuǎn)儀需要預(yù)熱，所以準(zhǔn)備感受態(tài)的時(shí)候就可以把電轉(zhuǎn)儀打開(kāi)了，電轉(zhuǎn)后山梨醇的加入要快，曾有人做實(shí)驗(yàn)證明晚一秒就會(huì)降低轉(zhuǎn)化的數(shù)量級(jí)，雖然不一定可信，但是我個(gè)人也認(rèn)為這個(gè)過(guò)程要快，電轉(zhuǎn)后可以看看時(shí)間，如果時(shí)間過(guò)短（比如(4)就可能說(shuō)明雜質(zhì)較多，會(huì)影響轉(zhuǎn)化率；

⑤轉(zhuǎn)化后溫育是個(gè)增加同源重組，增加存活率的過(guò)程，需要注意不要感染了大腸桿菌，再加入培養(yǎng)基30℃搖一段時(shí)間，可以取部分涂板（不同濃度抗生素），或者也有人將菌短暫離心，棄去上清，剩余全部涂板以保證轉(zhuǎn)化率。

(化學(xué)轉(zhuǎn)化)

如果沒(méi)有電轉(zhuǎn)儀，LiCl轉(zhuǎn)化是一種可供選擇的方法，轉(zhuǎn)化率是102到103cfu/ug。

主要過(guò)程為： 取過(guò)夜活化培養(yǎng)的菌液按1：1000接種于15ml新鮮的YPD液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8-1.0；4℃，4500rpm離心5分鐘，用8ml冰預(yù)冷的無(wú)菌水洗滌菌體，傾除洗滌液，用1mL，4℃，4500rpm離心5分鐘，沉淀用50μl冰預(yù)冷的100mmol/L LiCl懸浮，最后定容至80-90ml。

LiCl轉(zhuǎn)化 取適量單鏈鮭精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上備用，取上述制備好的感受態(tài)細(xì)胞12 000rpm，離心15s，吸棄LiCl溶液，按順序依次加入 50%PEG240ml 1mmol/L LiCl

ml 單鏈鮭精DNA

25ml 線性化質(zhì)粒DNA 10 ml(約10mg)用吸頭反復(fù)吹打，使細(xì)胞沉淀與加入的溶液混勻，30℃靜置溫育30min，42℃熱擊20-25min，4500rpm離心10min，吸棄轉(zhuǎn)化液，細(xì)胞沉淀加1ml YPD培養(yǎng)基于30℃ 200 rpm培養(yǎng)2-4hr，取轉(zhuǎn)化混合液100ml涂布含100μg/mL ZeocinTM 的YPDS平板，30℃培養(yǎng)2-3天。

第三步——挑克隆篩選

Xiang Yang：在protocol中用了許多篇幅來(lái)指導(dǎo)這一步，包括如何去通過(guò)平板篩選，觀測(cè)生長(zhǎng)速率來(lái)確定Mut表現(xiàn)型等。這個(gè)過(guò)程需要3到5天，而我一般只用用了4個(gè)小時(shí)進(jìn)行PCR（AOX引物）篩選。

leslie：完成轉(zhuǎn)化后就是克隆鑒定的過(guò)程了，包括高拷貝篩選，PCR鑒定和表型鑒定的過(guò)程，其中我做的比較多的是PCR鑒定（因?yàn)楸容^快），具體過(guò)程protocol上說(shuō)的很清楚，其實(shí)也很簡(jiǎn)單，就是凍融破菌進(jìn)行菌落PCR，但是其中許多具體細(xì)節(jié)問(wèn)題也挺讓人頭痛的，第一就是破壁的問(wèn)題，許多人用PCR方法進(jìn)行鑒定都無(wú)法得到結(jié)果，甚至在表達(dá)出了以后還是無(wú)法得到這張鑒定圖片，主要原因之一就是無(wú)法正常釋放酵母基因組，一般通過(guò)培養(yǎng)菌然后進(jìn)行沸水和-20℃冷凍循環(huán)過(guò)程裂解細(xì)胞在目的蛋白片段比較合適的范圍以內(nèi)是可以得到好的結(jié)果的，但是有時(shí)候片段過(guò)長(zhǎng)，模壁就會(huì)阻礙擴(kuò)增，所以我們實(shí)驗(yàn)室會(huì)用蝸牛酶（很便宜的酶來(lái)的）來(lái)幫助溶菌，我看許多實(shí)驗(yàn)室也會(huì)這么做，不過(guò)加入的時(shí)間不同而已，其次也有奢侈的用試劑盒的。

第二就是是模板量，個(gè)人建議模板真的不要加太多了，按照說(shuō)明書(shū)的上的5ul我覺(jué)得還是多了，而且建議總體積不用這么大，當(dāng)然加入模板的量也與自己培養(yǎng)菌的濃度以及用來(lái)凍融的菌數(shù)量有關(guān)。其次是假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，在Mut-和Mut+情況是不一樣的，如果用的是5'AOX引物，KM71H會(huì)出現(xiàn)3.6kb的片段，而Mut+則會(huì)出現(xiàn)AOX1基因原本長(zhǎng)度的片段——大約長(zhǎng)2.2kb，因此如果的基因片段長(zhǎng)度相似，要注意區(qū)分。建議PCR過(guò)程中使用多對(duì)引物進(jìn)行反應(yīng)，包括自己基因的，α-factor的，5'AOX的，都可以，反正各種對(duì)照多了有利于比較——當(dāng)然前提是你不能暈了頭。

掉了毛的鴕鳥(niǎo)：巴斯德畢赤酵母包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄終止子(5’AOX1和3’AOX1),他們被多克隆位點(diǎn)分開(kāi),外源基因可在此插入,此外，載體中還包含組氨酸脫氫酶基因(HIS4)選擇標(biāo)記（HIS4區(qū)的整合方式為位點(diǎn)特異性單交換引起的基因插入，整合后使組氨酸缺陷型宿主（his4）恢復(fù)野生型.HIS4區(qū)或AOX1區(qū)位點(diǎn)的整合都使轉(zhuǎn)化子具有HIS4基因，因而可利用表型差異進(jìn)行篩選，酵母GS115具有組氨醇脫氫酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的載體而具有HIS＋表型以篩選轉(zhuǎn)化子.）及3’AOX1區(qū),當(dāng)整合型載體轉(zhuǎn)化受體菌感受態(tài)細(xì)胞時(shí),他的5’AOX1和3’AOX1能與染色體上的同源基因重組,從而使整個(gè)載體和外源基因插入到受體菌染色體上，在加入甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基中,外源基因在5’AOX1啟動(dòng)子的控制下表達(dá).在載體中引入Tn903Kanr基因(抗G418)有助于篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)與抗G418的能力有關(guān),通過(guò)篩選抗G418能力強(qiáng)的酵母即可獲得高拷貝轉(zhuǎn)化子.外源基因是以同源重組的方式插入到酵母菌的染色體中,因此不易丟失，多次傳代后酵母仍能穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白，具有良好的遺傳穩(wěn)定性.第四步——表達(dá)

Xiang Yang：將你的克隆在YPD培養(yǎng)基中培育到OD600值達(dá)到6.0，就可以離心收菌。用表達(dá)培養(yǎng)基（比如BMMY）重懸沉淀，在30oC培育過(guò)夜。

leslie：篩選鑒定出自己的重組子可以說(shuō)什么都不能證明，還是要看這一步的酵母表達(dá)，有許多人在酵母表達(dá)上花費(fèi)了大量的時(shí)間——不同于大腸桿菌的兩天出結(jié)果，一次畢赤酵母的表達(dá)就需要起碼一周的時(shí)間，篩選了上百上千的克隆，但是仍然是竹籃打水一場(chǎng)空，我個(gè)人建議如果在篩選完3批以上就可以放棄這一批轉(zhuǎn)化的酵母菌，另外調(diào)整進(jìn)行重新轉(zhuǎn)化。

另外剛開(kāi)始的時(shí)候可以用小量表達(dá)，可以用5ml：生長(zhǎng)慢型，生長(zhǎng)快型，陰性對(duì)照（空質(zhì)粒），陽(yáng)性對(duì)照（可以是曾經(jīng)表達(dá)成功的重組子）和沒(méi)有進(jìn)行轉(zhuǎn)化的酵母菌的單克隆，BMGY中培養(yǎng)到OD值2-6，離心收菌（如果怕污染或者麻煩，可以放置酵母菌一段時(shí)間，一半為20-30分鐘，讓菌沉淀下來(lái)，小心傾倒去上清培養(yǎng)基獲得菌），轉(zhuǎn)入BMMY中誘導(dǎo)表達(dá)，這些步驟都需要在超凈工作臺(tái)里進(jìn)行，如果要區(qū)分是否染菌，可以取一些到顯微鏡下觀察，或者聞氣味（酸甜的是酵母），觀顏色（乳白色的是酵母）。除此之外，如果是小量表達(dá)，有可能會(huì)在沒(méi)有達(dá)到4天的時(shí)間培養(yǎng)基就干了，所以可以適當(dāng)補(bǔ)充一些，以及在搖床里放置盛有無(wú)菌水的深口瓶，來(lái)保持搖床里濕度。

誘導(dǎo)物甲醇注意要在超凈臺(tái)中打開(kāi)，可以分裝到滅過(guò)菌的瓶子中——當(dāng)然甲醇是不能滅菌的，而且也要注意在用酒精燈過(guò)甲醇瓶口的時(shí)候要小心，如果真的引起爆炸那可就損失大了。另外如果覺(jué)得每天添加甲醇麻煩，也有人用一次性注射器透過(guò)紗布添加甲醇，這個(gè)方法可能會(huì)造成染菌，慎選。說(shuō)到紗布就想到了通氣性問(wèn)題，酵母在無(wú)氧和有氧的情況下都可以存活，但是在甲醇誘導(dǎo)的情況下畢赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧氣量對(duì)于這一基因的表達(dá)影響重大，但是由于害怕感染大腸桿菌，紗布裹的也不能太少，最好專辟出一個(gè)搖床進(jìn)行三十度酵母表達(dá)，這樣可以考慮將紗布減少到3—5層，同時(shí)需要注意的是搖瓶?jī)?nèi)菌液體積不要超過(guò)10-30%。

每天取樣出來(lái)進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，能這樣最好，不過(guò)每天做膠跑膠染色真的很麻煩，可以匯集一批同時(shí)跑，不過(guò)樣品一定要煮過(guò)凍存，而且每次取樣不要反復(fù)凍融，最好分裝保存——因?yàn)榈鞍捉?jīng)煮沸變性會(huì)不穩(wěn)定，容易降解。另外為了防止蛋白在分泌出來(lái)的過(guò)程就降解了（特別是小分子蛋白），也可以通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值抑制蛋白水解酶的活性（這一方面說(shuō)明書(shū)講解得詳細(xì)），還可以加入酪蛋白氨基酸等保護(hù)物質(zhì)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制蛋白水解酶 的活性來(lái)防止表達(dá)產(chǎn)物降解。

如果使用的是分泌型培養(yǎng)基，按道理收集培養(yǎng)基上清就可以進(jìn)行下一步分析了，但是由于培養(yǎng)基中的蛋白濃度PAGE膠一般是檢測(cè)不出來(lái)的——除非你的表達(dá)蛋白量非常大。所以需要進(jìn)行濃縮，方法有TCA法，硫酸氨鹽析，PEG沉淀，透析，超濾等等，當(dāng)然最簡(jiǎn)單的就是煮沸蒸發(fā)水分濃縮了。另外跑膠的時(shí)候同時(shí)對(duì)照酵母胞內(nèi)蛋白，以防沒(méi)有分泌出來(lái)。SDS-PAGE的配置參見(jiàn)分子克隆，注意你的蛋白大小與膠的濃度的對(duì)應(yīng)性，如果小到20kD以下，可以考慮用tricine膠，不過(guò)是個(gè)需要全盤(pán)重新準(zhǔn)備的過(guò)程，要考慮清楚。如果選用的載體是帶有信號(hào)肽的，雖說(shuō)是分泌表達(dá)好純化，但實(shí)際上畢赤酵母本身還是有本底表達(dá)的，而且有時(shí)候會(huì)造成假陽(yáng)性，所以最后表達(dá)過(guò)程需要用Western blot或者Elasa，通常都是用WB，具體的細(xì)節(jié)可見(jiàn)Western Blotting前傳：想成為高手嗎？系列文章，另外要提一句的是，如果本身蛋白沒(méi)有合適抗體（如果是利用從大腸表達(dá)出來(lái)的蛋白做出的抗體也有可能與用真核系統(tǒng)表達(dá)出來(lái)的蛋白無(wú)法發(fā)生免疫作用），可以選用anti-myc或者anti-his的，前提當(dāng)然是你的蛋白沒(méi)有提前終止。

其它在表達(dá)中可能出現(xiàn)的情況包括表達(dá)量低，沒(méi)有分泌表達(dá)（針對(duì)pPICZa系列），頭兩天蛋白量較大，無(wú)法重復(fù)，表達(dá)出來(lái)的蛋白偏大等等，需要分各個(gè)方面分析原因，比如蛋白明明加上了信號(hào)肽，但是就是無(wú)法分泌出來(lái)，這可能是蛋白結(jié)構(gòu)在通過(guò)細(xì)胞膜的時(shí)候受到了阻礙，可能需要重新轉(zhuǎn)化，更換線性化位點(diǎn)或者更換菌株；如果蛋白表達(dá)第一天較高，但是之后越來(lái)越少，這很有可能是蛋白降解了或者產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)表達(dá)；畢赤酵母無(wú)法重復(fù)的問(wèn)題比較嚴(yán)重，許多情況下在第一次獲得了高量表達(dá)之后就再怎么也重復(fù)不了這個(gè)結(jié)果，遇到這種情況真是令人非常痛苦，可是除了重新摸索條件還能怎么樣呢？而表達(dá)出來(lái)的蛋白分子量偏大則是個(gè)正常現(xiàn)象，除了糖基化以外還有其它原因，比如二聚體，這些需要進(jìn)行WB或進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

第五步——發(fā)酵和產(chǎn)物純化

Xiang Yang：我用的是HisTraP Columns（GE Healthcare），經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的純化之后我可以得到90%的目的蛋白。我的目的蛋白是一個(gè)大小為45kDa，可以通過(guò)二硫鍵形成反向平行二聚體(antiparallel homodimer)的糖蛋白，經(jīng)過(guò)純化，我通過(guò)一個(gè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(cell proliferation assay)檢測(cè)了其活性，結(jié)果表明表達(dá)出來(lái)的蛋白在體外有完全的活性。并且我也在體外利用受體分析了蛋白結(jié)合活性，與對(duì)照(通過(guò)大腸桿菌和Bacular細(xì)胞未帶tag的蛋白)相比，his-tag有一點(diǎn)副作用。

伊可麗：由于在搖瓶培養(yǎng)中巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的水平往往不能準(zhǔn)確地反映罐發(fā)酵中的表達(dá)情況，使之成為令人頭痛的問(wèn)題。主要原因是在搖瓶培養(yǎng)中，培養(yǎng)液的pH值無(wú)法控制，培養(yǎng)物通氣不充分及無(wú)法控制添加碳源的最適速率。但是為了避免對(duì)每一個(gè)表達(dá)菌株進(jìn)行繁瑣的發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)，仍需摸索表達(dá)菌株的搖瓶培養(yǎng)條件，使其產(chǎn)物的表達(dá)量與預(yù)期的發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果相近。

總而言之，EasySelect系統(tǒng)是一個(gè)便于操作的酵母表達(dá)系統(tǒng)，我已經(jīng)使用這一系統(tǒng)表達(dá)過(guò)15個(gè)類似物了，每一個(gè)我都獲得了超過(guò)1mg/1升培養(yǎng)液的純化蛋白。

第二篇：畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)介

巴斯德畢赤酵母及啟動(dòng)子

1.1 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)介

隨著蛋白異源表達(dá)的飛速發(fā)展，越來(lái)越多的表達(dá)系統(tǒng)被建立并得到應(yīng)用。酵母作為單細(xì)胞真核生物，因具有比較完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力，仍表現(xiàn)出不可比擬的優(yōu)勢(shì)。以甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母（Methylotrophic yeast）-畢赤酵母為代表的第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)，是近年來(lái)被公認(rèn)的最有效的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，已有多種外源蛋白在該宿主系統(tǒng)中獲得了成功表達(dá)[1]。作為生產(chǎn)外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各種不同功能的表達(dá)載體，已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。表達(dá)的蛋白質(zhì)包括酶、膜蛋白、抗原、抗體和調(diào)節(jié)蛋白等[2,3]。

畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)是近年來(lái)發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛的一種真表達(dá)系統(tǒng)。它是甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母菌，有兩個(gè)乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）碼基因AOX1和AOX2，兩者序列相似，AOX1基因嚴(yán)格受甲醇誘導(dǎo)和調(diào)控。當(dāng)甲醇為唯一碳源時(shí)，AOX1啟動(dòng)子可被甲醇誘導(dǎo)，啟動(dòng)乙醇氧化酶的表達(dá)，從而用甲醇進(jìn)行代謝[4]。含AOX1啟動(dòng)子的質(zhì)粒可用來(lái)促進(jìn)編碼外源蛋白的目的因的表達(dá)。

隨著Invitrogen公司開(kāi)發(fā)的一系列畢赤酵母表達(dá)試劑盒的應(yīng)用，目前用該統(tǒng)已成功表達(dá)出了數(shù)以千計(jì)的來(lái)自細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、植物、無(wú)脊椎動(dòng)物、包括人在內(nèi)的脊椎動(dòng)物以及病毒等的具有生物學(xué)功能的外源蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)[5,6]。1.1.1 P.Pastoris表達(dá)載體及其元件

由于畢赤酵母沒(méi)有穩(wěn)定的附加質(zhì)粒，表達(dá)載體需與宿主染色體發(fā)生同源重組，外源基因表達(dá)框架整合于染色體中以實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)整合表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)在于保持外源基因穩(wěn)定性并可產(chǎn)生多拷貝基因。典型的畢赤氏酵母表達(dá)載體含有醇氧化酶基因的調(diào)控序列，主要的結(jié)構(gòu)包括：5′AOX1啟動(dòng)子片段、多克隆位點(diǎn)(MCS)、轉(zhuǎn)錄終止和 polyA形成基因序列(TT)、篩選標(biāo)記(His4或 Zeocin)、3′AOX1基因片段，作為一個(gè)能在大腸桿菌中繁殖擴(kuò)增的穿梭質(zhì)粒，它還有部分pBR322質(zhì)粒或COLE1序列。如果是分泌型表達(dá)載體，在多克隆位點(diǎn)的前面，外源基因的5′端和啟動(dòng)子的3′端之間插人了分泌作用的信號(hào)肽序列。在這個(gè)分泌信號(hào)的引導(dǎo)下，外源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中經(jīng)修飾和加工后能夠由胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞外，將成熟的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外。目前所采用的表達(dá)體均為穿梭質(zhì)粒，先在大腸桿菌保存、復(fù)制、擴(kuò)增，然后線性化后被導(dǎo)入宿主母細(xì)胞。

常用的表達(dá)載體包括胞內(nèi)表達(dá)載體及分泌表達(dá)載體如下表：

表1 常用表達(dá)載體及其選擇標(biāo)記

表達(dá)方式 載體名稱 pPICZA,B,C

胞內(nèi)表達(dá) pPIC6A,B,C PGAPZA,B,C

啟動(dòng)子 AOX1 AOX1 GAP

選擇標(biāo)記 Zeocin blasticidin Zeocin pPIC3.5K PAO815 PFLD pPICZαA,B,C pPIC6αA,B,C 分泌表達(dá) PGAPZαA,B,C pPIC9k pFLDα

AOX1 AOX1 FLD AOX1 AOX1 GAP AOX1 FLD

His4 kanmycin ampicillin His4 ampicillin Zeocin ampicillin Zeocin blasticidin Zeocin

His4 kanmycin ampicillin Zeocin ampicillin

1.1.2 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)

自從1987年Cregg等首次用巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）作為宿主表達(dá)外源蛋白以來(lái),作為一種新的高效的表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母越來(lái)越引起人們的重視，到1995年，已有四十多種外源蛋白在該宿主菌中獲得表達(dá)。而最近幾年每年報(bào)道的在畢赤酵母中表達(dá)的外源基因就有幾十種，且一年比一年多，它除了具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作和高密度發(fā)酵等特性之外，同釀酒酵母等傳統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)相比，它還具有以下的優(yōu)勢(shì):（1）含有特有的強(qiáng)有力的AOX（醇氧化酶基因）啟動(dòng)子，用甲醇可嚴(yán)格地調(diào)控外源基因的表達(dá)；

（2）培養(yǎng)成本低，產(chǎn)物易分離。畢赤酵母所用發(fā)酵培養(yǎng)基十分廉價(jià)，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余為無(wú)機(jī)鹽，培養(yǎng)基中不含蛋白，有利于下游產(chǎn)品分離純化；而釀酒酵母所用誘導(dǎo)物一般為價(jià)格較高的半乳糖；

（3）外源蛋白基因遺傳穩(wěn)定。外源基因能以高拷貝數(shù)整合到畢赤酵母基因組中，不易丟失并能夠到高表達(dá)菌株；

（4）作為真核表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母具有真核生物的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能。

1.2

AOX啟動(dòng)子序列分析現(xiàn)狀

啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的順式元件，也是基因工程表達(dá)載體的一個(gè)重要元件。啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平上的重要作用，不僅決定了基因的表達(dá)水平，也決定了基因表達(dá)的時(shí)空順序[7,8]，可以說(shuō)啟動(dòng)子活性的高低在很大程度上影響著基因表達(dá)最終產(chǎn)物的表達(dá)水平。所以找到一個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)功能較好的啟動(dòng)子，對(duì)于外源蛋白高效表達(dá)的研究具有重要的意義。目前，已有不少的啟動(dòng)子被克隆和功能鑒定[9]。

新型疫苗主要包括亞單位疫苗、基因缺失疫苗、核算疫苗、重組活載體疫苗等，盡管大多數(shù)被認(rèn)為較為安全，但往往都需要免疫刺激性強(qiáng)的佐劑來(lái)提高免疫效果。菌蛻疫苗可通過(guò)發(fā)酵大量生產(chǎn)且無(wú)需加入佐劑即可獲得堅(jiān)強(qiáng)的免疫效果。

目前，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中較常用的表達(dá)載體有兩類[10]：種是分泌型表達(dá)載體(如pPIC9K)，另一種是組成型表達(dá)載體(如pGAPZB)。前者(以pPIC9K為例)含有的醇氧化酶啟動(dòng)子pAOX1，可以在甲醇的誘導(dǎo)下高效表達(dá)。該載體自身攜帶有α 分泌信號(hào)肽，可以將外源蛋白直接分泌到胞外。后者(以pGAPZB 為例)含有三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子pGAP，可以在多種碳源如葡萄糖、甘油、甲醇或油酸條件下表達(dá)外源蛋白，且不需添加誘導(dǎo)物[11]。

在啟動(dòng)子功能的研究中，多數(shù)是利用報(bào)告基因的表達(dá)量來(lái)達(dá)到功能研究的目的，常用的報(bào)告基因有綠色熒光蛋白GFP(green fluorescent protein)、紅色熒光蛋白R(shí)FP(red fluorescent protein)β-葡糖醛酸糖苷酶GUS(β-glucuronidase)和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT(chloramphenicolacetyltransferase)等[12,13]。在前期的工作中，克隆了啟動(dòng)子pScgpd，并在巴斯德畢赤酵母中研究了AOX1 啟動(dòng)子的功能[14]。實(shí)驗(yàn)以人血清白蛋白(HSA）作為報(bào)告基因，在Pichia pastoris GS115中表達(dá)。

到目前為止，利用AOX啟動(dòng)子表達(dá)的蛋白有很多，例如：在AOX1(醇氧化酶)啟動(dòng)子調(diào)控下，類似天然抗菌肽大小的magainin 及cecA-mil 蛋白獲得分泌表達(dá)[15]；人前列腺特異性抗原的表達(dá)[16]；重組木糖異構(gòu)酶的分泌和表達(dá)[17]；人骨唾液酸蛋白的表達(dá)等[18]。

第三篇：酵母表達(dá)系統(tǒng)概述及相關(guān)研究進(jìn)展

酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展和前景

(XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX學(xué)院)

摘要：酵母表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)真核生物蛋白方面已經(jīng)得到廣泛而成功的應(yīng)用，表達(dá)出的重組蛋白表現(xiàn)出較高甚至比原物種體內(nèi)的蛋白質(zhì)更高的生物活性。近年來(lái)，利用釀酒酵母和畢赤巴斯德氏酵母表達(dá)人源蛋白或肽類活性物以及其它中間體取得了新的進(jìn)展。本文主要從上游設(shè)計(jì)，重組表達(dá)，分離純化和活性驗(yàn)證等方面進(jìn)行了總結(jié)，并且對(duì)未來(lái)更好的利用酵母生產(chǎn)藥物等活性物質(zhì)作出展望。

關(guān)鍵詞：酵母表達(dá)系統(tǒng)；蛋白分泌：異源基因；糖基化修飾；人源活性藥物

引言

酵母作為一種表達(dá)外源基因的宿主菌, 既具有操作簡(jiǎn)單, 生長(zhǎng)快等特點(diǎn), 又具有真核細(xì)胞的翻譯后修飾加工系統(tǒng)。在表達(dá)某些基因工程產(chǎn)品時(shí), 可以大規(guī)模生產(chǎn), 從而有效地降低成本。常用的酵母表達(dá)系統(tǒng)有釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng), 甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母表達(dá)系統(tǒng)和裂殖酵母表達(dá)系統(tǒng)。釀酒酵母（Saccharomyces.cerevisiae）在分子遺傳學(xué)方面被人們的認(rèn)識(shí)最早，也是最先作為外源基因表達(dá)的酵母宿主。但由于釀酒酵母的局限，1983 年美國(guó)Wegner 等人最先發(fā)展了以甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母（methylotrophic yeast）為代表的第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)。其中畢赤酵母（P.pastoris）是繼S.cerevisiae 之后被迅速推廣的一種外源基因表達(dá)的宿主菌。

釀酒酵母難于高密度培養(yǎng)，分泌效率低，幾乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白質(zhì)，也不能使所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)正確糖基化，而且表達(dá)蛋白質(zhì)的C端往往被截短。因此，一般不用釀酒酵母做重組蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主菌。但是，可以通過(guò)基因敲除或改造用釀酒酵母表達(dá)亞單位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)或非蛋白活性物質(zhì)及其中間體（如青蒿素，色素）。與原核和其它真核表達(dá)系統(tǒng)相比，巴斯德畢赤酵母作為重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)有以下優(yōu)點(diǎn)

[1]：（1）生長(zhǎng)速率快，易于高密度培養(yǎng)（2）在幾乎不含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中具有高水平產(chǎn)率

（3）消除了內(nèi)源毒性和噬菌體感染（4）易于對(duì)具有明確特征的酵母表達(dá)載體進(jìn)行操作（5）對(duì)畢赤酵母的噬菌體對(duì)人沒(méi)有病原性（6）具有多種翻譯后修飾包括多肽折疊，糖基化，乙酰化，甲基化，蛋白質(zhì)降解調(diào)控以及定位至亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（7）能夠構(gòu)建分泌的蛋白，這樣只需從生長(zhǎng)培養(yǎng)基中提純而不必收集酵母本身細(xì)胞。

基因工程與酵母表達(dá)系統(tǒng)

即使酵母表達(dá)系統(tǒng)具有一些優(yōu)勢(shì)，但在用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)等藥物時(shí)，還需要選擇合適的載體并對(duì)宿主菌的某些代謝途徑進(jìn)行改造，使之利于目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)，要用于工業(yè)生產(chǎn)，還需根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)化培養(yǎng)條件，比如pH，溫度，溶氧量，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)，特殊添加劑等。

釀酒酵母的表達(dá)載體有自主復(fù)制型和整合型，自主復(fù)制型質(zhì)粒通常有30個(gè)或更多的拷貝，含有自動(dòng)復(fù)制序列(automaticreplicating sequence，ARS)，能夠獨(dú)立于酵母染色體外進(jìn)行復(fù)制，如果沒(méi)有選擇壓力，這些質(zhì)粒往往不穩(wěn)定。整合型質(zhì)粒不含ARS，必需整合到染色體上，隨染色體復(fù)制而復(fù)制。整合過(guò)程是高特異性的，但是拷貝數(shù)很低。為此，人們?cè)O(shè)計(jì)了pMIRY2(for multiple integration into ribosomal DNin yeast)質(zhì)粒，旨在將目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇為酵母基因組中串聯(lián)存在的150個(gè)重復(fù)序列)，因此利用pMIRY2質(zhì)粒可以得到100個(gè)以上的拷貝。值得注意的是，釀酒酵母表達(dá)的外源蛋白質(zhì)往往被高度糖基化，糖鏈上可以帶有40個(gè)以上的甘露糖殘基，糖蛋白的核心寡聚糖鏈含有末端僅1,3甘露糖，致使產(chǎn)物的抗原性明顯增強(qiáng)。

畢赤酵母的表達(dá)載體多采用整合型載體，即將異源基因通過(guò)載體整合進(jìn)酵母基因組中，這是由于沒(méi)有適合畢赤酵母的游離型表達(dá)載體。所有巴斯德氏畢赤酵母的表達(dá)載體都是一個(gè)表達(dá)組件，它由一個(gè)啟動(dòng)子序列（大多是AOX1啟動(dòng)子），一個(gè)來(lái)自AOX1的轉(zhuǎn)錄終止序列用以指導(dǎo)3’終止過(guò)程和mRNA的多聚腺苷酸化，在它們之間有一個(gè)或多個(gè)克隆位點(diǎn)用以插入外源基因。這樣的設(shè)計(jì)保證了產(chǎn)物(cap-AOX1 5′UTR-ORF-3′UTR-polyA)是一個(gè)成熟的mRNA以適應(yīng)畢赤酵母的細(xì)胞體系，確保了信息的穩(wěn)定性和有效性。檢測(cè)表達(dá)所用的標(biāo)記基因一般是HIS4（組氨醇脫氫酶基因），有時(shí)也用kan（卡那霉素抗性基因）或Sh ble.此外，有時(shí)為了防止酵母自身蛋白酶對(duì)所要表達(dá)的異源蛋白的降解，會(huì)使用蛋白酶缺陷突變型或降低發(fā)酵溫度，保證目的蛋白的產(chǎn)量和得率。發(fā)酵過(guò)程一般分兩個(gè)階段，第一階段是細(xì)胞以甘油為碳源生長(zhǎng)，甘油耗盡后進(jìn)入第二階段，加入甲醇誘導(dǎo)AOX1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄翻譯，從而使異源基因表達(dá)，生產(chǎn)目標(biāo)蛋白。

酵母表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展

1． 利用釀酒酵母生產(chǎn)青蒿素前體——青蒿酸

青蒿素（Artemisinin）是目前治療瘧疾的高效藥物，這主要是由于瘧原蟲(chóng)（Plasmodium falciparum）逐漸對(duì)其它藥物產(chǎn)生了抗藥性。現(xiàn)在青蒿素的產(chǎn)量遠(yuǎn)達(dá)不到需求量，所以Jay D.Keasling 等人通過(guò)釀酒酵母生產(chǎn)它的前體——artemisinic acid，成本低，環(huán)保，可作為高質(zhì)[2]R

量和可靠的青蒿素來(lái)源。這個(gè)實(shí)驗(yàn)通過(guò)改造甲羥戊酸途徑，引入兩個(gè)來(lái)自青蒿（Artemisia annua）的外源酶amorphadiene synthase(ADS)和cytochrome P450 monooxygenase(CYP71AV1)使釀酒酵母獲得將amorpha-4,11-diene氧化為artemisinic acid的三步途徑。同時(shí)，還導(dǎo)入了CYP71AV1的天然氧化還原配體CPR(cytochrome P450 oxidoreductase)，在這之前，還需將法尼基焦磷酸即FPP（farnesyl pyrophosphate）的合成途徑修飾，減少它用于固醇的合成，使之更多的用于合成amorphadiene。然后，利用改造的釀酒酵母EPY224生產(chǎn)artemisinic acid，不僅純度較高，易于提取分離，而且不受氣候影響。

2．利用畢赤巴斯德氏酵母生產(chǎn)人源抗菌肽——LL-37

抗菌肽是生物體抵御外源性病原體的防御反應(yīng)中所產(chǎn)生的一類小分子多肽。許多傳統(tǒng)的抗生素具有毒副作用且能夠誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生，發(fā)展克服耐藥性問(wèn)題的新型抗生素顯得越來(lái)越重要。抗菌肽具有分子質(zhì)量小、水溶性好、耐熱性強(qiáng)、無(wú)免疫原性、抗菌譜廣和作用機(jī)制獨(dú)特等特點(diǎn)，還有研究表明，hCAP（Human cathelicidin antimicrobial peptide）是人皮膚在受傷或炎癥刺激下，嗜堿性粒細(xì)胞分泌的一種防御或抗微生物的肽，在人類中只有LL-37一種。固相化學(xué)合成技術(shù)可以生產(chǎn)像肽這樣較短的氨基酸序列，不過(guò)成本太高。Yong-Seok Kim等人[3]利用pGAPZ-E（pGAPZB載體的游離形式）將編碼成熟LL-37的111bp的基因片段采用電穿孔方法轉(zhuǎn)化到P.pastoris X-33中，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，表達(dá)的重組LL-37通過(guò)LC-ESI-MS/MS檢測(cè)確定，發(fā)現(xiàn)有5kDa的LL-37條帶。酵母的表達(dá)出來(lái)的LL-37的粗提取物對(duì)Micrococcus luteus具有抑制活性。表達(dá)載體采用GAP強(qiáng)啟動(dòng)子，另外還進(jìn)行了有a-MF外分泌信號(hào)的載體pGAPZaA，結(jié)果采用這個(gè)載體的X-33培養(yǎng)物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)胞外分泌的LL-37.另外還利用蛋白酶缺陷型菌株SMD1168H進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，LL-37在其中的表達(dá)水平與在X-33中的沒(méi)有顯著差異。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了利用游離型表達(dá)載體在P.pastoris X-33中可以成功表達(dá)LL-37，并且具有生物活性，可以用于生產(chǎn)這類抗菌肽藥物。

3．人源化的畢赤酵母生產(chǎn)糖蛋白類藥物

人體內(nèi)，除了抗體外的大多數(shù)糖蛋白的半衰期和治療潛力依賴于末端的唾液酸化，這是由于一個(gè)糖蛋白的其它末端糖比如甘露糖，N-乙酰葡糖胺和半乳糖等會(huì)被體內(nèi)的糖特異性受體或凝集素識(shí)別并被清除，也就失去療效了。酵母和絲狀真菌在表達(dá)這類糖蛋白方面具有一定前景。用酵母表達(dá)在人體內(nèi)具有活性的糖蛋白需要進(jìn)行很多基因刪除或修飾，Tillman U.Gerngross等人[4]利用畢赤酵母構(gòu)建出能表達(dá)重組紅細(xì)胞生成素（EPO）的菌株P(guān).pastoris YSH597。這個(gè)菌株是在以前的菌株RDP762基礎(chǔ)上利用pSH926載體引入了5個(gè)新的外源基因構(gòu)建成的，為的是使這個(gè)酵母能完成人源的末端唾液酸化。對(duì)天然酵母的改造設(shè)計(jì)到四個(gè)酵

母特異性糖酰化基因的敲除和14個(gè)異源基因的導(dǎo)入。利用SDS-PAGE和HPLC提純分離的重組EPO具有與劑量相關(guān)的生物學(xué)活性。EPO是一種高度糖基化的蛋白質(zhì)，利用酵母表達(dá)需要在N-乙酰葡糖胺或甘露糖等修飾后再加上人源的唾液酸化過(guò)程，才能產(chǎn)生有活性的EPO（已經(jīng)進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)）。這項(xiàng)研究表明利用酵母生產(chǎn)EPO等同類糖蛋白具有可行性，不僅能節(jié)省時(shí)間，而且節(jié)約成本，大量生產(chǎn)以緩解對(duì)這類醫(yī)療藥物的需求。

酵母表達(dá)的糖蛋白不同于哺乳動(dòng)物表達(dá)的雜合型或復(fù)雜型糖蛋白，而是高甘露糖型或過(guò)度甘露糖化糖蛋白。楊曉鵬等人[5]在前期成功敲除畢赤酵母α-1,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(Och1p)基因、阻斷畢赤酵母過(guò)度糖基化，獲得畢赤酵母過(guò)度糖基化缺陷菌株GJK01(ura3、och1)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了PGE-URA3-PNOI-GAP-signal-MDSI載體，通過(guò)表達(dá)不同物種來(lái)源的α-1,2-甘露糖苷酶I(MDSI)的活性區(qū)與酵母自身定位信號(hào)的融合蛋白，并通過(guò)DSA-FACE(基于DNA 測(cè)序儀的熒光輔助糖電泳)分析篩選報(bào)告蛋白HSA/GM-CSF(人血清白蛋白與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子融合蛋白)的糖基結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)編碼釀酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶(MnsI)基因的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)與帶有完整C-端催化區(qū)的擬南芥MDSI基因融合表達(dá)時(shí)，畢赤酵母工程菌株能夠合成Man5GlcNAc2 哺乳動(dòng)物甘露糖型糖蛋白。這為在酵母體內(nèi)合成類似于哺乳動(dòng)物雜合型或復(fù)雜型糖基化修飾的糖蛋白奠定了基礎(chǔ)。

4．在巴斯德氏畢赤酵母中高水平表達(dá)一種合成酶——植酸酶

植酸（Phytate）,即肌醇六磷酸（IP6），是植物種子中磷元素的主要儲(chǔ)存形式, 普遍存在于植物性食品和飼料。人和單胃動(dòng)物畜禽和魚(yú)類等缺乏內(nèi)源性植酸酶不能利用有機(jī)植酸磷。飼料中常添加無(wú)機(jī)磷酸鹽以滿足單胃動(dòng)物的磷營(yíng)養(yǎng)需求，隨之產(chǎn)生了諸多問(wèn)題，最主要的是植酸作為一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，在體內(nèi)絡(luò)合多種礦質(zhì)元素和蛋白質(zhì)等，常引起人和單胃動(dòng)物各種營(yíng)養(yǎng)不良癥，而且未被利用的植酸磷被微生物降解釋放無(wú)機(jī)磷易引發(fā)水體磷污染。植酸酶（Phytase）是一類特殊的正磷酸單酯磷酸水解酶，催化植酸水解生成低級(jí)肌醇磷酸衍生物和無(wú)機(jī)磷酸，在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)、資源環(huán)境保護(hù)和人類健康等領(lǐng)域愈來(lái)愈顯示出巨大的應(yīng)用潛力和研究?jī)r(jià)值。植酸酶普遍存在于植物、真菌、酵母和細(xì)菌，其中微生物植酸酶因活性高、生產(chǎn)比較容易等諸多優(yōu)點(diǎn)，對(duì)其研究和開(kāi)發(fā)最為廣泛和深入。Ai-Sheng Xiong等人利用一種擔(dān)子菌隔孢伏革菌(Peniophora lycii)的植酸酶[6]（一種6’-植酸酶）基因，優(yōu)化出適合P.pastoris的密碼子的基因序列——phy-pl-sh，連接上信號(hào)肽MF4I的基因，采用含有AOX1啟動(dòng)子的pPIC9K載體，轉(zhuǎn)化并使畢赤酵母GS115合成并分泌了植酸酶，產(chǎn)量為12.2g/L.控制的培養(yǎng)條件是：30°C，pH5.5，溶氧量30%，高密度培養(yǎng)。酶蛋白檢測(cè)和酶活測(cè)試發(fā)現(xiàn)，酶的糖基化較嚴(yán)重，用水解酶Endo Hf在37°C下處理提純的酶蛋白4h，得到的片段較均一，且在pH4.5下具有最大

酶活力。對(duì)基因穩(wěn)定性和酶的熱穩(wěn)定性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)效果良好，此外他們還利用DNA Shuffling獲得了幾種熱穩(wěn)定的酶的候選基因，這項(xiàng)研究表明利用畢赤巴斯德氏酵母生產(chǎn)6’-植酸酶具有很大潛力，可以用于工業(yè)生產(chǎn)。

5．畢赤酵母表達(dá)大分子類藥物

在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)具有生物活性的CTP-SOD 融合蛋白，顯著地提高了SOD 保護(hù)HeLa 細(xì)胞免受氧化損傷的能力。細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽(CTP，一種能夠攜帶外源大分子穿過(guò)細(xì)胞膜，定位于細(xì)胞質(zhì)的短肽)運(yùn)輸人銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)跨過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，可以提高其生物利用度。李沛志等[7]利用P.pastoris GS115(his4-)及其整合型分泌表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K轉(zhuǎn)化表達(dá)了融合蛋白CTD-SOD。首先，設(shè)計(jì)含有CTD轉(zhuǎn)導(dǎo)肽基因序列的融合基因，連接至pPIC9K 質(zhì)粒并用它轉(zhuǎn)化E.coli Top10并進(jìn)行菌落PCR篩選，抽提出重組質(zhì)粒并電擊轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母，將轉(zhuǎn)化成功的酵母接種到Y(jié)PD 培養(yǎng)基中，通過(guò)加入甲醇至終濃度0.5％誘導(dǎo)表達(dá)。培養(yǎng)結(jié)束后分析發(fā)酵液中誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)量，純化后并進(jìn)行對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用測(cè)試。本研究成功地在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)了具有生物活性的CTP-SOD 融合蛋白，發(fā)酵上清中重組蛋白的含量為156.5 mg/L。純化得到的CTP-SOD 分子量約為22.5 kDa。CTP-SOD 預(yù)處理Hela 細(xì)胞可顯著地提高了鄰苯三酚(Progallol)誘導(dǎo)氧化脅迫下HeLa 細(xì)胞的存活率，較野生型SOD 相比具有較強(qiáng)的保護(hù)作用。但是，CTP 和其他種類的PTD（蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域，Protein transduction domain）相比是否更有利于SOD或其他在細(xì)胞質(zhì)中起作用的藥物發(fā)揮功能都有待進(jìn)一步深入的研究來(lái)證明，具有跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的新一代藥物運(yùn)輸載體PTD 將會(huì)促進(jìn)多肽、核酸等大分子藥物的快速發(fā)展，為生物大分子藥物的應(yīng)用帶來(lái)更廣闊的前景。

在哺乳動(dòng)物中, 三葉型家族(trefoil factorfamily, TFFs)蛋白通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞遷移，促進(jìn)細(xì)胞增殖，對(duì)抗細(xì)胞凋亡等過(guò)程參與黏膜的修復(fù)并維持其完整性。Bm-TFF2, 一種從大蹼鈴蟾皮膚分泌物中分離得到的兩棲類三葉因子, 具有比人三葉因子更強(qiáng)的生物學(xué)活性。余果宇等人

[8]以Bm-TFF2 的cDNA 為模板, 利用PCR 方法擴(kuò)增Bm-TFF2 基因, 然后插到含有AOX1 啟動(dòng)子和α-因子信號(hào)肽序列的表達(dá)載體pPIC9K 中, 采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行分泌表達(dá), 并用G418 篩選高拷貝整合轉(zhuǎn)化子。SDS-PAGE 和Western blotting 都檢測(cè)到Bm-TFF2 被分泌性表達(dá)于酵母上清。在1%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)不同時(shí)間后, 重組蛋白在72 h 的表達(dá)量最大, 可達(dá)50 mg/ L;而不同濃度的飽和硫酸銨沉淀菌液上清時(shí), 80%的飽和硫酸銨沉淀量最大。這些結(jié)果表明, 重組質(zhì)粒Bm-TFF2-pPIC9K 成功構(gòu)建并在真核細(xì)胞中高效表達(dá), 這為進(jìn)一步研究Bm-TFF2 的生物學(xué)活性及其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

6．畢赤酵母在表達(dá)病毒蛋白用于疫苗和診斷方面的應(yīng)用

人輪狀病毒的VP7 基因目前已有用大腸埃希氏菌、乳酸桿菌，植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)的報(bào)道，而酵母表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。利用巴斯德畢赤酵母表達(dá)輪狀病毒的保護(hù)性抗原VP7，以制備輪狀病毒基因工程疫苗，可為預(yù)防輪狀病毒感染提供一條有效途徑。盧穎等人

[9]將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒VP7-pPICZαA 經(jīng)SacⅠ線性化后，通過(guò)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，然后Zeocin平板篩選并進(jìn)行PCR鑒定及Mut 表型篩選，成功構(gòu)建VP7 基因的重組酵母表達(dá)系統(tǒng)，為進(jìn)一步表達(dá)VP7 基因提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

為了分析真核體系中表達(dá)的乙型腦炎病毒E蛋白的生物學(xué)特性，張健等人[10]以乙腦病毒SA-14 株為代表，構(gòu)建了E 蛋白基因的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)。首先，應(yīng)用RT-PCR 法擴(kuò)增乙型腦炎病毒E蛋白表達(dá)基因，定向克隆入載體pPICZαA，然后將重組質(zhì)粒以PmeⅠ線性化并電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115 感受態(tài)細(xì)胞，最后用Zeocin篩選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物約為1 350 bp，定向克隆獲得pPICZαA-E 表達(dá)載體，經(jīng)測(cè)序結(jié)果與Genbank 相應(yīng)序列比較，核苷酸序列同源性為100%，電轉(zhuǎn)化得到巴氏畢赤酵母重組菌株GS115-E，提取其基因組DNA 經(jīng)PCR鑒定與預(yù)期相符。本研究構(gòu)建的乙型腦炎病毒E 基因畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)為進(jìn)一步進(jìn)行E蛋白真核表達(dá)研究奠定了基礎(chǔ)。

酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)病毒蛋白抗原還在血清學(xué)診斷方面有所進(jìn)展。于天飛等人[11]在多酵母表達(dá)系統(tǒng)（GS115/pPIC9-TY，GS115/pPIC9K-ts（Mut+），KM71/pPIC9-ts）中表達(dá)了含有豬傳染性胃腸炎病毒S 基因B 和C 抗原位點(diǎn)片段。經(jīng)檢測(cè)表明，不同類型酵母表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)量和抗原性差異不大，研究中獲得的重組蛋白為建立TGE血清學(xué)檢測(cè)方法提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)．本試驗(yàn)所獲得蛋白為PRCV S蛋白缺失部分，以此重組蛋白作為診斷抗原建立的血清學(xué)診斷方法可望避免潛在的PRCV感染對(duì)檢測(cè)TGE的干擾，得出篩選生長(zhǎng)速度較快的GS115/pPIC9-TY適合作為今后進(jìn)一步應(yīng)用的候選重組菌．

總結(jié)

由于酵母表達(dá)外源蛋白，特別是藥用蛋白質(zhì)的種種優(yōu)勢(shì)，促使研究人員不斷改進(jìn)酵母的遺傳特性和生理特性。這些突破更加提高了酵母在生產(chǎn)藥用蛋白中的應(yīng)用。在工作中對(duì)不同來(lái)源、不同作用特點(diǎn)外源蛋白的研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用，畢赤酵母表達(dá)體系是一個(gè)很好的選擇，我們需要綜合考慮這一表達(dá)體系的上述特點(diǎn)，對(duì)目的外源蛋白基因進(jìn)行相應(yīng)的改造，設(shè)計(jì)合理的構(gòu)建策略，使重組外源蛋白按我們的要求進(jìn)行表達(dá)，有助于獲得大量有活性的表達(dá)產(chǎn)物。相信這一表達(dá)體系的采用和不斷深入研究勢(shì)必為基因工程藥物的發(fā)展提供加速度。

參考文獻(xiàn)

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第四篇：做酵母四個(gè)月的心得

還有個(gè)奇怪的現(xiàn)象，2天的時(shí)候克隆直徑不到2MM，還是乳白色的，長(zhǎng)到第3天后居然變成粉紅色的了，有的板紅色的程度更深一些

查資料，考慮有2個(gè)原因：1，長(zhǎng)的時(shí)間太長(zhǎng)，菌種老化了

2，培養(yǎng)板上的Ade含量不足，產(chǎn)生了代謝產(chǎn)物是粉紅色的(這一現(xiàn)象別人在實(shí)驗(yàn)中也出現(xiàn)了)

3.也有人解釋說(shuō)是后期ade不足

般酵母雙雜交的bait序列不超過(guò)2000bp比較合適，這是因?yàn)?/p>

1、酵母的密碼子和人的密碼子有偏好性的差異，當(dāng)基因超過(guò)2000bp后，密碼子偏好性的累積效應(yīng)造成蛋白翻譯困難；

2、過(guò)大的bait蛋白的空間位阻效應(yīng)會(huì)影響Gal4的AD和BD的互做，就會(huì)造成即使bait和prey有互做時(shí)，Gal4的BD和AD沒(méi)有互做，從而不能激活報(bào)告基因表達(dá)。你的基因2346bp，對(duì)酵母來(lái)說(shuō)，翻譯比較困難，所以，酵母生長(zhǎng)緩慢，你可以考慮將你的基因分成兩段，分別用于篩庫(kù)。

第五篇：暢言語(yǔ)音教具系統(tǒng)使用心得

暢言語(yǔ)音教具系統(tǒng)使用心得

作為一名農(nóng)村小學(xué)的英語(yǔ)教師，我一直都有一個(gè)愿望：讓學(xué)生在每節(jié)課的課堂上都能聽(tīng)到地地道道的英語(yǔ)口語(yǔ)，師生暢言語(yǔ)音在課堂上用英語(yǔ)暢所欲言。但是由于多方原因，要達(dá)到這種境界似乎很難。

最近“暢言智能語(yǔ)音教具系統(tǒng)”的到來(lái)，讓我的教學(xué)工作有了新的起色。一開(kāi)始看到暢言智能教具，并沒(méi)有在意。后來(lái)在慢慢的摸索，逐步使用的過(guò)程中，我終于體驗(yàn)到了它強(qiáng)大而奇妙的功能。現(xiàn)在，我在教學(xué)中已越來(lái)越離不開(kāi)它了。我認(rèn)為這套教具對(duì)于英語(yǔ)教師自身素質(zhì)、英語(yǔ)課堂教學(xué)效果和學(xué)生的綜合能力等各方面的提高有著重大作用。

下面就簡(jiǎn)單談?wù)勈褂脮逞哉Z(yǔ)音教具的體會(huì)：

一、簡(jiǎn)單方便易操作，提高教學(xué)效率。

首先，暢言智能語(yǔ)音教具系統(tǒng)用法非常簡(jiǎn)單，教師只需用識(shí)別筆點(diǎn)擊課本上的內(nèi)容，主機(jī)就朗讀相應(yīng)的英文單詞、句子，唱歌曲歌謠等等，不但節(jié)省了錄音機(jī)倒帶的時(shí)間，而且解放了教師。這樣一來(lái)教師可以巡視、關(guān)注每一個(gè)學(xué)生的情況，了解學(xué)生學(xué)習(xí)效果，適時(shí)指導(dǎo)，增大了課堂容量。

其次，識(shí)別筆可以一筆多用，除了點(diǎn)擊要播放的內(nèi)容以外，識(shí)別筆的激光燈可以當(dāng)作教鞭使用，引導(dǎo)學(xué)生觀看要學(xué)習(xí)的目標(biāo)；識(shí)別筆上的任意功能鍵還可以幫助維護(hù)課堂秩序，提醒學(xué)生們集中注

意力；另外在課堂上需要結(jié)束學(xué)生熱烈討論的時(shí)候，用此鍵可以起“喚醒”和“終止”的作用，提高了各個(gè)教學(xué)環(huán)節(jié)的學(xué)習(xí)效果。

二、優(yōu)化英語(yǔ)課堂，調(diào)動(dòng)學(xué)生學(xué)習(xí)英語(yǔ)的積極性。

傳統(tǒng)的英語(yǔ)課堂教學(xué)，組織形式單一。只有老師的講解、提問(wèn)、學(xué)生的回答、跟錄音機(jī)反復(fù)讀，很難吸引學(xué)生的注意力，智能語(yǔ)音教具系統(tǒng)給這樣的課堂注入了新的活力。

暢言智能語(yǔ)音教具中語(yǔ)音合成，自制教具的功能，可以把任意實(shí)物，圖片，卡片等制成生動(dòng)有趣的有聲教具，讓他們自己開(kāi)口說(shuō)英語(yǔ)，還可以利用人與主機(jī)對(duì)話交流，使英語(yǔ)課堂變得更加直觀、形象、真實(shí)、從而課堂變得生動(dòng)活潑有趣。例如，在講動(dòng)物單詞的時(shí)候，我自己錄制了貓和狗的叫聲，來(lái)引入單詞教學(xué)；講蔬菜水果單詞時(shí)，我將相應(yīng)單詞讀音輸入識(shí)別碼中，然后貼到相應(yīng)圖片上，用筆一點(diǎn)就能說(shuō)話，這樣一來(lái)，學(xué)生覺(jué)得很奇妙，自然興趣就提高了。還可以利用合成聲音，選擇女聲或男聲朗讀，使學(xué)生在純正的語(yǔ)言中感知英語(yǔ)。并通過(guò)有聲實(shí)物，標(biāo)準(zhǔn)聲音，有聲圖片等把枯燥的單詞，抽象的敘述以生動(dòng)活潑的形象顯現(xiàn)出來(lái)，使學(xué)生的大腦變得異常興奮，注意力非常集中，學(xué)習(xí)的積極性隨之調(diào)動(dòng)起來(lái)。

三、提高教師自身素質(zhì)，促進(jìn)學(xué)生的發(fā)展。

暢言智能語(yǔ)音教具系統(tǒng)提供的“發(fā)音評(píng)測(cè)”、“中英文朗讀”功能為我們教師自身發(fā)展提供了很好的學(xué)習(xí)工具，在一定程度上也促進(jìn)了學(xué)生的發(fā)展。

“發(fā)音評(píng)測(cè)”相當(dāng)于隨時(shí)隨地的口語(yǔ)校正“老師”，利用它可以對(duì)教師自己的發(fā)音進(jìn)行測(cè)試，比較差異，提高發(fā)音的標(biāo)準(zhǔn)度。也可以對(duì)學(xué)生單詞、句子和篇章的發(fā)音準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)測(cè)，系統(tǒng)立即打分，得出錯(cuò)對(duì)辨率，我們可以對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，改正錯(cuò)誤的發(fā)音。

“中英文朗讀”功能中的“每日推薦”板塊提供了大量的英文閱讀材料，是老師提升英語(yǔ)閱讀及聽(tīng)力能力的絕妙的好機(jī)會(huì)，每日內(nèi)容不同，涉及面廣，我們不需要花大量的時(shí)間和精力去尋找或購(gòu)買英語(yǔ)報(bào)刊等，很輕松地就能增加我們的課外知識(shí)，提高我們的語(yǔ)言綜合運(yùn)用能力。

除此之外，暢言智能語(yǔ)音教具系統(tǒng)還有許多重要的功能：

第一，暢言智能語(yǔ)音教具系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了中英文對(duì)照朗讀功能，這 是區(qū)別于其他英語(yǔ)語(yǔ)音教具的一大亮點(diǎn)。

一般的語(yǔ)音教具僅能播放英語(yǔ)課文的朗讀，很難實(shí)現(xiàn)英漢同步播放。為了能更好的利用暢言智能語(yǔ)音教具軟件系統(tǒng)解決此類矛盾，服務(wù)于現(xiàn)代英語(yǔ)教學(xué)，我的想法是：在語(yǔ)音合成過(guò)程中同時(shí)輸入英文和中文，對(duì)發(fā)音人進(jìn)行配合選擇，這樣便可以聽(tīng)取中英文對(duì)照的朗讀，解決了部分學(xué)生的聽(tīng)力理解較差的難題。具體的做法是將手頭的中英文對(duì)照文本，或者是一段中文一段英文的文本上傳至?xí)逞灾悄苷Z(yǔ)音教具軟件，在軟件的“高級(jí)朗讀模式”中，可以用中文發(fā)音人（“中文男聲”或者“中文女聲”）來(lái)朗讀中文，用英文發(fā)音人（“英文男聲”或者“英文女聲”）來(lái)朗讀英文，這樣，就可以聽(tīng)到中英文對(duì)照朗讀了。若有的中英文對(duì)

照文本，英文較簡(jiǎn)單只需要朗讀英文部分，而中文部分不需要朗讀，那么可以這樣設(shè)置：選擇英文部分，選擇英文男聲或女聲發(fā)音人；選擇中文部分，選擇“不朗讀”即可。

第二，借助暢言智能語(yǔ)音教具中英文“高級(jí)朗讀模式”你還可以根據(jù)課文的難易，學(xué)生的反應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)朗讀的速度，獲取最佳的聽(tīng)覺(jué)效果。

第三，系統(tǒng)軟件上附帶的“生詞表”可以說(shuō)是一本“活字典”，不僅可以幫助教師和學(xué)生查找任何一個(gè)生疏的單詞，還可以點(diǎn)讀、跟讀、模仿，一定程度上降低了學(xué)生出現(xiàn)啞巴英語(yǔ)的可能性。從“生詞表”中，可以看到生詞以字母順序進(jìn)行排列，當(dāng)鼠標(biāo)指向某個(gè)詞語(yǔ)或短語(yǔ)時(shí)，會(huì)給出詞語(yǔ)相應(yīng)的解釋，使用者可以點(diǎn)擊“試聽(tīng)”來(lái)聽(tīng)取標(biāo)準(zhǔn)的讀音。最為便捷的是，用戶還可以任意搜索需要的詞語(yǔ)或者選擇是否需要顯示詞語(yǔ)的解釋，這樣為使用者提供了很大的方便。

總之，智能語(yǔ)音教具的到來(lái)，對(duì)我們廣大英語(yǔ)教師來(lái)講真是增添了一個(gè)好幫手，它給我們帶來(lái)了很大的的方便，豐富了教學(xué)手段，使課堂生動(dòng)起來(lái)，給學(xué)生帶來(lái)了學(xué)習(xí)英語(yǔ)的好環(huán)境，大大調(diào)動(dòng)了學(xué)生學(xué)習(xí)英語(yǔ)的積極性，增強(qiáng)了學(xué)習(xí)興趣。相信，在我和它以后相處的日子里，我會(huì)進(jìn)一步加深對(duì)它的認(rèn)識(shí)，更好的將它應(yīng)用于現(xiàn)代英語(yǔ)教學(xué)中。