第一篇：馬瑞發(fā)言稿

尊敬的領(lǐng)導(dǎo)，老師們

大家好！我是寶雞寶雞高新區(qū)派往鳳縣支教的老師馬瑞。今天，我非常高興作為支教老師代表發(fā)言。首先，請(qǐng)?jiān)试S我代表全體支教老師，感謝教育局和學(xué)校領(lǐng)導(dǎo)這一年來對(duì)我們?cè)诠ぷ魃系闹С趾托刨嚕谏钌系年P(guān)心和幫助。

城區(qū)學(xué)校有優(yōu)越的教學(xué)資源和先進(jìn)的教育理念，教育局也常常給我們創(chuàng)造展示學(xué)習(xí)的機(jī)會(huì)，我有幸成為一名城區(qū)教師，今天的成長與進(jìn)步與城區(qū)學(xué)校密不可分。因此，作為一名人民教師，我有責(zé)任，也有義務(wù)為教育的均衡發(fā)展，為社會(huì)的和諧，貢獻(xiàn)一點(diǎn)微小的力量。懷著教書育人的夢(mèng)想，我來到了這里，即使路遠(yuǎn)山遙，但還是擋不住我實(shí)現(xiàn)夢(mèng)想的步伐。

初來黃牛埔中心小學(xué)時(shí)，一切都是那么陌生，但是領(lǐng)導(dǎo)和同事們的關(guān)心幫助，讓我感受到了家的感覺，這便讓我很快投入到工作學(xué)習(xí)中。

在黃小工作的一年中，我成長了許多。當(dāng)然這要感謝黃小的領(lǐng)導(dǎo)對(duì)我的工作能力的信任和支持，給了我一個(gè)很好的歷練機(jī)會(huì)。在上一學(xué)年中，我擔(dān)任四年級(jí)一個(gè)班的班主任工作以及語文教學(xué)，六年級(jí)的數(shù)學(xué)教學(xué)。這些工作繁雜瑣碎，但我并沒有放棄，而是把它當(dāng)成自己人生中的一筆寶貴財(cái)富。這一年，我認(rèn)真工作，把自己融入到這個(gè)集體當(dāng)中，按照學(xué)校規(guī)定嚴(yán)格要求自己，和同事們探討教育教學(xué)問題。借鑒身邊同事們的班級(jí)管理經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合自己本班情況以及自己的創(chuàng)新想法，正確引導(dǎo)山區(qū)孩子們的學(xué)習(xí)生活?，F(xiàn)在孩子們也漸漸長大了。除此之外，我也很注重自己專業(yè)素質(zhì)的提高，堅(jiān)持與同課頭老師互相聽評(píng)課，時(shí)刻關(guān)注教育新聞，注重教育理論的學(xué)習(xí)，將自己的教學(xué)想法大膽的在課堂上實(shí)施。工作的同時(shí)，我時(shí)刻記著自己還是一名學(xué)習(xí)者。學(xué)習(xí)鄉(xiāng)村教師在艱苦的辦公環(huán)境中無私奉獻(xiàn)教育事業(yè)的精神，他們的耐心，細(xì)心，愛心感化著我。讓我明白了一名合格的人名教師，無論在什么條件下都應(yīng)該將愛崗敬業(yè)，無私奉獻(xiàn)作為自己的信念。

在工作的一年中，我曾經(jīng)也因?yàn)楦鞣N原因想過放棄，但當(dāng)我走進(jìn)校園，聽到孩子們朗朗的讀書聲，下課圍著你問問題時(shí)，問我一聲聲“老師好”時(shí)，我為自己退縮的想法感到慚愧，我是一名老師，教書育人是我的職責(zé)，它是無條件的，我怎么能因?yàn)闂l件的好壞而選擇教育呢？

在工作的一年中，我深深的體會(huì)到了，鄉(xiāng)村學(xué)校的閉塞。這里不僅缺乏好的硬件設(shè)施，而且更缺乏先進(jìn)的理念，信息來源比較狹窄。孩子們普遍缺乏應(yīng)有的愛，缺乏科學(xué)的家庭教育。但是這里孩子也有求知的夢(mèng)想，每周要走好多山路，尋求自己的求學(xué)之路。在知識(shí)的面前，他們?nèi)琊囁瓶省Ｃ慨?dāng)給他們講一些新東西時(shí)，他們的眼神讓我震驚。所以，我覺得這里需要我，需要更多優(yōu)秀的老師。每個(gè)孩子都有求知的權(quán)利，作為老師更應(yīng)該在求學(xué)之路助他們一臂之力。

參加工作不到三年，而我兩年的寶貴時(shí)間將在黃小度過，我感到很自豪，我相信這將成為我人生一種特殊的經(jīng)歷。因此，在后面一年的工作當(dāng)中，我繼續(xù)嚴(yán)格要求自己，盡職盡責(zé)，做到耐心細(xì)心搞教育，創(chuàng)新性工作，將愛的種子播撒在這里。

我的講話完畢，謝謝大家！

第二篇：2013個(gè)人工作總結(jié)-馬瑞

2013個(gè)人工作總結(jié)

——馬瑞

一年的工作轉(zhuǎn)瞬又將成為歷史，辭舊迎新，2014年即將來

臨。新的一年意味著新的起點(diǎn)、新的機(jī)遇、新的挑戰(zhàn)。總結(jié)過去，展望未來是為了“決心再接再厲，更上一層樓”，在即將過去的一年，取得成績的同時(shí)，我也找到了工作中的不足。當(dāng)然我還有許多需要領(lǐng)導(dǎo)批評(píng)指正的不足之處，有待進(jìn)一步優(yōu)化和解決。自動(dòng)化東部試采維護(hù)班組的一員，在認(rèn)真落實(shí)上級(jí)領(lǐng)導(dǎo)安排各項(xiàng)工作同時(shí)，結(jié)合平時(shí)維護(hù)的實(shí)際情況和運(yùn)行中不斷發(fā)現(xiàn)眾多問題，現(xiàn)將這一年的工作總結(jié)如下：

一、日常重點(diǎn)工作：

1、響應(yīng)上級(jí)冬防保溫，保證裝置平穩(wěn)運(yùn)行的工作方針，通過開展相關(guān)冬防保溫工作，總結(jié)工作經(jīng)驗(yàn)，完善冬防保溫工作，冬季運(yùn)行工作。加密巡檢，確保儀表不凍堵，對(duì)未加電伴熱保溫不好的地方也及時(shí)跟催聯(lián)系電站盡快對(duì)其加電伴熱保證冬季能夠正常的成產(chǎn)運(yùn)行。

2、自投產(chǎn)以來東部試采計(jì)量分離器LV閥出現(xiàn)大量的故障。給生產(chǎn)及自動(dòng)計(jì)量帶來了很大的麻煩，影響了生產(chǎn)穩(wěn)定和安全隱患，自項(xiàng)目部引進(jìn)了便攜式超聲波流量計(jì)后每天對(duì)無法自動(dòng)計(jì)量的單機(jī)進(jìn)行手動(dòng)計(jì)量，徹徹底底的解決了單井的計(jì)量問題。

3、每十天對(duì)東部集輸各單井進(jìn)行一次日常檢查巡檢，對(duì)儀表的準(zhǔn)確率、完好率、進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。及時(shí)上報(bào)整改存在的問題和隱患，提高生產(chǎn)事故的預(yù)見性。同時(shí)逐步形成自動(dòng)化工作開展的指導(dǎo)思路，做到風(fēng)險(xiǎn)可控、隱患及時(shí)發(fā)現(xiàn)、及時(shí)防范、及時(shí)解決的工作模式。

二、檢修工作：

1、檢修工作，共有52口單井的700多臺(tái)儀表的拆裝及效驗(yàn)其中包括壓力變送器、溫度變送器、溫度計(jì)、硫化氫氣體檢測(cè)儀、可燃?xì)怏w檢測(cè)儀。保證儀表的校驗(yàn)率達(dá)到95%以上

2、自控閥的保養(yǎng)。

3、遠(yuǎn)傳液位計(jì)與就地液位計(jì)共計(jì)90多臺(tái)的拆檢及清洗。

4、所有單井控制柜的吹掃及檢查

在此次檢修中由于站外單井分散、距離相對(duì)較遠(yuǎn)等客觀因素，這就要求我們對(duì)人員的分配要合理，人員的調(diào)配要恰當(dāng)、人員的分工要明確。我們?nèi)匀豢朔谉岬南娜铡⒐ぷ鞯姆敝?、任?wù)的緊迫等困難，歷時(shí)18天圓滿完的成了此次檢修工作。

三、重大問題整改工作

1、自處理廠投產(chǎn)以來東部試采大部分單井火炬無法點(diǎn)燃經(jīng)過我們查看相關(guān)資料和分析后發(fā)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)火炬點(diǎn)火燃料氣過大，經(jīng)手動(dòng)調(diào)試后能夠正常點(diǎn)火使用。

2、東部集輸大部分單井語音呼叫系統(tǒng)由主控室打往各個(gè)單井現(xiàn)場(chǎng)不能擴(kuò)音，現(xiàn)場(chǎng)人員無法接收，經(jīng)檢查處理后部分單井由于電話內(nèi)主板已燒壞無法進(jìn)行擴(kuò)音。在與甲方領(lǐng)導(dǎo)協(xié)調(diào)及廠家技術(shù)人員溝通后，廠家予以更換后出現(xiàn)的問題都已解決能夠正常使用。

四、新單井投產(chǎn)調(diào)試工作：

1、新單井投產(chǎn)調(diào)試工作自2013-2014也不斷增加了新井其中包括：東部試采的ZG7-

1、ZG7-

2、ZG6、TZ26-H11、ZG6-

2、TZ721-

8、ZS1C、TZ62-TH、TZ62-H16、TZ62-H17、TZ62-H14、ZG541H、TZ721-H6、TZ62-H15、82-TH、等以上

單井系統(tǒng)調(diào)試及儀表日常維護(hù)與檢查工作。

回首過去，我們盡職盡責(zé)，任勞任怨。展望未來，我們胸有成竹，信心百倍。相信在全體員工的共同努力下，我們的業(yè)務(wù)水平將再現(xiàn)高點(diǎn)，公司的明天也會(huì)更加的美好、強(qiáng)大！我們自動(dòng)化維護(hù)班組也會(huì)在不斷的學(xué)習(xí)中進(jìn)步，不斷的工作中升華，圓滿順利的實(shí)現(xiàn)下一年的目標(biāo)和計(jì)劃。我堅(jiān)信：沒有比腳更長的路，沒有比肩更高的峰！努力造就實(shí)力，態(tài)度決定高度，這就是我們力量的源泉，沖鋒的戰(zhàn)旗，智慧的搖籃！

第三篇：瑞馬公司介紹

瑞馬公司介紹

一、公司簡介：

“瑞馬”品牌誕生于1886年的意大利都靈鎮(zhèn)，歷經(jīng)200余年的發(fā)展，如今瑞馬己成為一個(gè)歷史悠久的品牌。瑞馬的熱能設(shè)備暢銷世界，享譽(yù)全球，成為歐洲熱能領(lǐng)域的領(lǐng)跑者。

瑞馬熱能技術(shù)設(shè)備(國際)有限公司旗下有多個(gè)生產(chǎn)基地，員工人數(shù)超過20000名，12家跨國公司及5個(gè)代表處，產(chǎn)品暢銷至60多個(gè)國家和地區(qū)。瑞馬熱能技術(shù)設(shè)備(國際)有限公司為提升服務(wù)，進(jìn)一步打開亞洲國際市場(chǎng)，2009年瑞馬進(jìn)駐中國，引進(jìn)自己的先進(jìn)生產(chǎn)技術(shù)，注入資金聯(lián)手建造了自己在中國的4S服務(wù)基地——中山羽順熱能技術(shù)設(shè)備有限公司，并于2010年8月份正式投產(chǎn)，從而大大提高了對(duì)中國客戶的銷售、服務(wù)能力。

瑞馬一貫重視技術(shù)創(chuàng)新及產(chǎn)品質(zhì)量，投入大量資金用于燃燒、鍋爐和供熱等領(lǐng)域的技術(shù)研發(fā)。瑞馬重視節(jié)約能源和對(duì)環(huán)境的保護(hù)，大舉進(jìn)軍熱電聯(lián)供、再生與新型能源領(lǐng)域(例如太陽能集熱板技術(shù))，瑞馬一直致力于供熱系統(tǒng)的技術(shù)開發(fā)，使其完美無缺，并制定了能耗效率和節(jié)能環(huán)境保護(hù)方面的新標(biāo)準(zhǔn)。

瑞馬致力為客戶提供安全可靠，技術(shù)領(lǐng)先的解決方案，也可根據(jù)客戶需求量身定制我們的服務(wù)。我們有信心把產(chǎn)品與服務(wù)做到更優(yōu)和更好，自信與能力是我們走向卓越的法寶。

二、公司發(fā)展歷程1、1799年，菲利普·魯本發(fā)明煤氣照明和取暖兩用裝置的專利產(chǎn)品； 2、1800年，魯本將這種設(shè)備用于飯店進(jìn)行照明和取暖；

3、1822年，意大利米蘭理工大學(xué)阿斯·瑞馬先生改進(jìn)了這種設(shè)備，改為立式，并在自己的餐館和旅館里安裝使用；

4、1824年，阿斯·瑞馬先生的這種立式采暖設(shè)備被詹姆斯·巴頓看中，采購100套用于自己的旅館，得到了用戶的贊美；

5、1825年，阿斯·瑞馬在意大利都靈鎮(zhèn)成立了自己的工廠，開始大批量生產(chǎn)； 6、1886年，阿斯·瑞馬以自己的名字命名給工廠起了新名，并組建了股份公司，同年10月“瑞馬”第一款壁掛式采暖爐出世；

7、1915年，“瑞馬”壁掛爐開始了全球事業(yè)性的拓展；

8、1980年，“瑞馬”壁掛爐進(jìn)入亞洲市場(chǎng)，總部設(shè)在了中國香港；

9、2000年，“瑞馬”壁掛爐進(jìn)入中國內(nèi)陸市場(chǎng)，任命馬瑞先生為中國區(qū)執(zhí)行總裁；

10、2006年，“瑞馬”暖通設(shè)備有限公司中國銷售公司在廣東順德成立，在中國西北、華北開始了戰(zhàn)略性的業(yè)務(wù)拓展；

11、2008年，應(yīng)中國區(qū)銷售需要，決定在中國自產(chǎn)自銷，總部前往中國對(duì)壁掛爐廠家進(jìn)行生產(chǎn)、檢測(cè)審核，12、2009年，瑞馬進(jìn)駐中國，引進(jìn)自己的先進(jìn)生產(chǎn)技術(shù)，注入資金聯(lián)手建造了中山羽順熱能技術(shù)設(shè)備有限公司，13、2010年，進(jìn)行了公司的改制和革新，同年8月，新型生產(chǎn)線安裝調(diào)試合格，第一臺(tái)合格產(chǎn)品成功下線；

14、2011年，意大利瑞馬熱能技術(shù)設(shè)備有限公司精心打造的中國制造基地廣東中山羽順熱能技術(shù)設(shè)備有限公司掛牌成立，并將意大利瑞馬壁掛爐的全套先進(jìn)技術(shù)注入羽順公司，成功研發(fā)推出10余款新型壁掛式采暖爐和大型立式模塊采暖鍋爐；

15、2011年12月，根據(jù)年底統(tǒng)計(jì)，作為新的工廠第一年出貨量就達(dá)到15000余臺(tái)，在行業(yè)里受到贊揚(yáng)。

第四篇：本科生畢業(yè)論文馬瑞 修正

本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）

題

目

南四湖環(huán)棱螺基因組DNA的提取與鑒定

姓

名

馬瑞

學(xué)號(hào)

2008142463

院

系

生命科學(xué)學(xué)院

專

業(yè)

生物科學(xué)

指導(dǎo)教師

曲志才

職稱

教授

2012 年 5 月 20日 曲阜師范大學(xué)教務(wù)處制

目錄

摘要 ……………………………………………………………………………………1 關(guān)鍵詞 …………………………………………………………………………………1 Abstract …………………………………………………………………………………1 Key words ………………………………………………………………………………1 引言 ………………………………………………………………………………………1 1 實(shí)驗(yàn)材料及方法 ………………………………………………………………………2 1.1 實(shí)驗(yàn)材料 ……………………………………………………………………………2 1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 ……………………………………………………………………………2 1.3 實(shí)驗(yàn)器具 ……………………………………………………………………………3 1.4 實(shí)驗(yàn)方法 ……………………………………………………………………………3 1.4.1 從環(huán)棱螺肌肉組織中提取基因組DNA……………………………………………3 1.4.2 瓊脂糖凝膠電泳 …………………………………………………………………3 1.4.3 DNA濃度、純度及質(zhì)量檢測(cè)………………………………………………………4 2 結(jié)果與分析 ……………………………………………………………………………4 2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果…………………………………………………………4 2.2 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果…………………………………………………………4 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析………………………………………………………………………6 3 討論 ……………………………………………………………………………………6 3.1 DNA電泳沒出現(xiàn)條帶的原因…………………………………………………………6 3.2 DNase的來源以及防止DNase的措施………………………………………………6 3.3 肌肉組織的不同保存方法對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響……………………………………………7 3.4 實(shí)驗(yàn)材料的不同研磨方法對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響……………………………………………7 3.5 檢測(cè)基因組DNA提取效果的方法……………………………………………………7 致謝 …………………………………………………………………………………………8 參考文獻(xiàn) ……………………………………………………………………………………8

南四湖環(huán)棱螺基因組DNA的提取與鑒定

生物科學(xué)專業(yè)學(xué)生 馬瑞

指導(dǎo)教師 曲志才

摘要：基因組DNA的提取技術(shù)是分子生物學(xué)研究中經(jīng)常應(yīng)用的最重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。DNA作為遺傳信息的載體，是分子水平實(shí)驗(yàn)操作的重要對(duì)象，純度高、濃度高、完整性好的基因組DNA為基因的下游操作可以提供良好的保證。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的酚-氯仿抽提法，以南四湖環(huán)棱螺的腹足肌肉組織為材料分離提取高質(zhì)量的基因組DNA, 用來進(jìn)行以后的DNA克隆測(cè)序等實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)采用在-20℃條件下保存的肌肉組織為材料，利用SDS裂解細(xì)胞，蛋白酶K消化大部分蛋白質(zhì)，最后用酚+氯仿+異戊醇除去剩余的蛋白質(zhì)，通過異丙醇沉淀，得基因組DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳可檢測(cè)所提取基因組DNA的濃度和質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：基因組DNA；田螺；肌肉組織；酚-氯仿-異戊醇

Extraction and identification of genomic DNA from Nansihu river snail

Student majoring in Biological science

Name MaRui

Tutor

Qu Zhicai Abstract：Genomic DNA extraction method in application of molecular biology research is often the most important experimental techniques.As the carrier of genetic information, DNA is an important object of genetic manipulation.High purity, high concentration, integrity, good genomic DNA for gene downstream operations can provide a good guarantee.In this study the phenol-chloroform-isoamyl alcohol method was used to extract genomic DNA from muscle tissue of Nansihu river snail, which will be used for the experimental study of the DNA sequencing.It was used the muscle tissue which was preserved in-20℃ refrigeration, using SDS to lyse cells.Most of the protein was digested by proteinase K and the remaining protein was removed by phenol-chloroform-isoamyl alcohol.Through using isopropanol, genomic DNA can be precipitated.Agarose gel electrophoresis can detect the concentration and quality of extracted genomic DNA.Key words: genomic DNA;river snail;Muscle tissue;phenol-chloroform-isoamyl alcohol

引言 在基因工程中，核酸分子是主要的研究對(duì)象，因此核酸的分離、提取是分子生物學(xué)研究中很重要的技術(shù)。DNA作為遺傳物質(zhì)的載體，是分子水平實(shí)驗(yàn)操作的重要對(duì)象，純度高、濃度高、完整性好的基因組DNA為基因的下游操作可以提供良好的保證。因此基因組DNA的提取是基因工程操作中最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，獲得完整性良好的基因組DNA一直都是致力于基因工程研究的分子生物學(xué)者所面臨的挑戰(zhàn)性課題。盡管目前已經(jīng)建立起許多基因組DNA分離提取方法并開發(fā)出若干DNA 分離提取試劑盒，但是，仍有不少實(shí)驗(yàn)材料由于富含的DNA酶、多糖、多酚等物質(zhì)或者降解DNA，或者與DNA 形成難溶物等方式嚴(yán)重干擾DNA 的提取，常常導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。就目前應(yīng)用較為廣泛的DNA提取方法而言，高鹽法提取DNA雖然便捷，但所提取的DNA純度較低，穩(wěn)定性較差，影響基因下游操作。酚-氯仿抽提法已經(jīng)廣泛用于提取多種動(dòng)、植物組織和細(xì)胞的基因組DNA，是比較常用的方法。本實(shí)驗(yàn)采用的就是酚-氯仿抽提法，原理是：SDS可以裂解組織細(xì)胞，使DNA從細(xì)胞中釋放出來，蛋白酶K可消化部分蛋白質(zhì)，并使DNA與蛋白質(zhì)分離。通過水浴加熱充分反應(yīng)后，加入酚-氯仿-異戊醇等有機(jī)溶劑，DNA和變性的蛋白質(zhì)分別位于整個(gè)體系的水層和中間層，從而分離。異丙醇能夠奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水，得以沉淀，從而得到純化的基因組DNA。

南四湖是山東省第一大淡水湖泊，其自然資源豐富，盛產(chǎn)魚、蝦等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，葦、蓮等多種水生植物。南四湖的田螺屬于軟體動(dòng)物門，腹足綱，田螺科，環(huán)棱螺屬。環(huán)棱螺的分布廣泛、種群密度大，它與水產(chǎn)養(yǎng)殖、醫(yī)學(xué)寄生蟲、環(huán)境保護(hù)等方面的研究關(guān)系極為密切。多數(shù)淡水腹足類動(dòng)物的個(gè)體小、數(shù)量多、耐污染性強(qiáng)，它們以水中的小型藻類、有機(jī)質(zhì)等為食，其自身又是魚類的天然餌料，對(duì)于維持水體的生態(tài)平衡和治理水體的富營養(yǎng)化等方面都有著重要的作用，近些年來受到國內(nèi)外學(xué)者的高度重視。因此,對(duì)于這樣一個(gè)與人類生活息息相關(guān)的物種,提取其基因組DNA是完全有必要的。同時(shí)，分離出純度高、濃度高、完整性好的基因組DNA可以為許多后備實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備，如Southern雜交，PCR，基因定位，基因組文庫的構(gòu)建，基因組測(cè)序等，而且在分子水平對(duì)環(huán)棱螺分類地位的研究成效在很大程度上取決于提取的基因組DNA 的質(zhì)量?；诖?，本實(shí)驗(yàn)主要研究從南四湖環(huán)棱螺肌肉組織中快速有效地提取高純度的基因組DNA。本研究采用酚-氯仿抽提法,目的在于分析研究南四湖環(huán)棱螺基因組DNA適宜的提取條件,并且分離出純度高完整的基因組DNA，為分子生物學(xué)的深入研究奠定了基礎(chǔ)。材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所采用的環(huán)棱螺取自南四湖，2011年采集的標(biāo)本于95%的酒精中-20℃冷凍保存，2012年采集的標(biāo)本進(jìn)行活體解剖后，直接存放于-20℃冰箱中冷凍保存。根據(jù)所采集環(huán)棱螺標(biāo)本的形態(tài)特征大致分為三種（詳見表1）

表1 三種不同環(huán)棱螺采集信息

銅銹環(huán)棱螺 梨形環(huán)棱螺 方形環(huán)棱螺

采集點(diǎn) 南四湖5號(hào) 南四湖18號(hào) 南四湖7號(hào)

采集時(shí)間 2012年4月 2011年7月 2012年4月

采集個(gè)數(shù) 14 17

1．2 實(shí)驗(yàn)試劑

（1）分離緩沖液：10mmol/L Tris-HCl(PH 8.0)100mmol/L EDTA 100mmol/L NaCl（2）10%SDS：裂解組織細(xì)胞（3）蛋白酶K：消化部分蛋白質(zhì)

（4）酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）：除去少量蛋白質(zhì)（苯酚：使蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)分子溶于酚相，DNA分子溶于水相。氯仿：一是使蛋白質(zhì)變性，沉淀，通過離心除去：二是抽提水相里微量的苯酚，防止損傷核酸；三是除去樣品中的脂溶性雜質(zhì)。異戊醇：一是減少蛋白質(zhì)變形過程中產(chǎn)生的氣泡；二是有助于分相，使離心后上層含DNA的水相，中層變性蛋白質(zhì)相，及下層有機(jī)溶劑相保持穩(wěn)定）（5）氯仿-異戊醇（24:1）：除去少量蛋白質(zhì)

（6）異丙醇：奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水，易于沉淀（7）70%乙醇：洗滌DNA（8）TE緩沖液：1×TE（9）瓊脂糖

（10）上樣緩沖液（溴酚藍(lán)）：電泳時(shí)跑在DNA前面，防止DNA跑出凝膠（11）電泳緩沖液（1x TAE）

（12）溴化乙錠：嵌合劑，顯示DNA位置 1.3 實(shí)驗(yàn)器具

移液槍、槍頭、槍頭臺(tái)、EP管、離心管、試劑瓶、量筒、研缽、飯盒、大瓷鋼、三角燒瓶、電子天平、電泳儀、低溫離心機(jī)、DNA離心濃縮儀、蒸汽滅菌鍋、冰箱、滅菌箱、手套、口罩、錫箔紙等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 從環(huán)棱螺肌肉組織中提取基因組DNA（1）準(zhǔn)備試驗(yàn)：配置試劑，現(xiàn)配現(xiàn)用的試劑要當(dāng)天配制，其余的放入冰箱內(nèi)備用；槍頭、EP管等塑料試劑要用報(bào)紙包扎起來，放入高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，120-121℃高壓滅菌20min，再放入干燥箱內(nèi)烘干備用；剪刀、鑷子等儀器用錫紙包扎好于滅菌箱內(nèi)200℃大約6h，備用；

（2）實(shí)驗(yàn)所用的環(huán)棱螺腹足肌肉組織材料，一部分取自95%的酒精中-20℃冷凍保存的肌肉組織，一部分取自剛解剖后立即-20℃冷凍的新鮮肌肉組織，取300-400mg組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于肌肉組織的研磨，在實(shí)驗(yàn)過程中采取三種不同的方式:第一，在研缽中用剪子將組織剪碎，分別放入4個(gè)1.5mL的離心管中；第二，用剪子將組織剪成小塊后，加入研磨器進(jìn)行研磨，在研磨過程中加入無菌水，以保證研磨充分，分別倒入4個(gè)1.5mL的離心管中，離心1min，取上清，保留沉淀；第三，用剪子將組織剪成小塊后，在研缽中加入液氮，在冷凍的條件下迅速進(jìn)行研磨，研磨成粉末狀后，用藥匙分裝到4個(gè)1.5mL的離心管中。每個(gè)管中約70-100mg組織。向每個(gè)管中依次加入540μL TE緩沖液，60μL SDS，50μL蛋白酶K，充分震蕩混勻；

（3）55℃水浴加熱2-4h后取出，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇，輕輕顛倒混勻，4℃，12000r/min離心10min；

（4）將上清移至新的離心管中（這時(shí)EP管中已經(jīng)分層，三層，中間為蛋白質(zhì)，吸取上清是一定不能吸到中間層，以免混入雜質(zhì)），加入等體積酚-氯仿-異戊醇，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，4℃，12000r/min離心10min（再次離心的目的主要是再一次去除雜質(zhì)，使DNA充分溶解出來）；

（5）將上清移至新的離心管中，加入等體積氯仿-異戊醇，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，4℃，12000r/min離心10min；

（6）將上清移至新的離心管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，4℃，12000r/min離心10min；

（7）棄上清，向沉淀中加入70%乙醇洗滌沉淀，12000r/min離心5min，棄上清保留沉淀，干燥5-10min，加入25μL TE緩沖液溶解，得到基因組總DNA。

1.3.2 瓊脂糖凝膠電泳

（1）用膠帶將膠板的兩端封好，插上梳子；（2）電泳膠的制備（1%）

瓊脂糖0.3 g，加入30mL TAE緩沖液，充分加熱到沸騰無泡沫，冷卻到大約60℃，再向膠中加入溴化乙錠 2?L；

（3）倒膠：將融化的凝膠倒入膠模中（不要出現(xiàn)氣泡），凝膠厚度大約在3-5 mm之間，在凝膠完全凝固后（室溫下30-40 min），撕去膠帶，輕輕拔出梳子；

（4）點(diǎn)樣：取5?L提取的基因組DNA溶液，與溴酚藍(lán)混合后，慢慢將混合物加入上樣孔中；

（5）小心地將玻璃板移至裝有電泳緩沖液TAE的電泳槽中，且使緩沖液沒過膠面。電泳槽中的緩沖液最好與制膠所用的緩沖液是同一批次的，若兩種緩沖液中的離子強(qiáng)度及pH不一致，將影響核酸的遷移率；

（6）通電，使DNA向陽極移動(dòng)。采用80V電壓進(jìn)行電泳；（7）當(dāng)溴酚藍(lán)在凝膠中移出適當(dāng)距離后（約1 h），切斷電流，取出玻璃板，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄結(jié)果。

1.3.3 DNA濃度、純度及質(zhì)量檢測(cè)

（1）取原液15μL，加TE緩沖溶液稀釋到750μL(稀釋50倍)，混勻，移至石英比色杯中，以750μL TE緩沖溶液為參比，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA在波長260nm、280nm處的吸收值。

（2）用以下公式進(jìn)行計(jì)算：

DNA濃度(μg/μL)= D260×n(稀釋倍數(shù))×50(μg/mL)÷1000； 得率(μg/g)=DNA 量(μg)/樣品量(g)； 根據(jù)OD260/ OD280判斷DNA的純度。

2、結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

圖1 三種不同環(huán)棱螺基因組DNA提取效果電泳圖

1.銅銹環(huán)棱螺基因組DNA；2.梨形環(huán)棱螺基因組DNA;3.方形環(huán)棱螺基因組DNA

三種環(huán)棱螺的肌肉組織均可以跑出較為清晰的條帶，即三種環(huán)棱螺均可以提出較為完整的基因組DNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酚-氯仿抽提法可以有效的進(jìn)行南四湖環(huán)棱螺基因組DNA的提取，并可以為許多后備實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。但是各條帶均有或多或少的拖尾現(xiàn)象，說明在實(shí)驗(yàn)過程中存在DNA的降解（圖1）。

2.2 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

用酚-氯仿抽提法提取三種不同環(huán)棱螺基因組DNA的紫外檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 三種不同環(huán)棱螺基因組DNA的紫外檢測(cè)結(jié)果 2 OD260 0.252 0.149

OD280 0.138 0.085

OD260/OD280 1.827 1.750

dsdsDNA濃度（μg/μL）dsDNA得率（μg/g）

0.6300 0.3725

189 111.75 3 0.371 0.203 1.828 0.9275 278.25 注：1.銅銹環(huán)棱螺基因組DNA；2.梨形環(huán)棱螺基因組DNA;3.方形環(huán)棱螺基因組DNA A

B

C

圖2 三種不同環(huán)棱螺基因組DNA的光譜掃描曲線 A為銅銹環(huán)棱螺基因組DNA的光譜掃描；B為梨形環(huán)棱螺基因組DNA的光譜掃描；

C為方形環(huán)棱螺基因組DNA的光譜掃描

從表2中可以看出，3種不同環(huán)棱螺基因組DNA的OD260/OD280比值都在1.70－1.85之間，說明提取的DNA純度較高，用相同的方法提取不同種環(huán)棱螺的基因組DNA，都能夠得到較高純度。然而所提取的基因組DNA仍然存在污染，銅銹環(huán)棱螺和方形環(huán)棱螺DNA的OD260/OD280比值大于1.8，說明存在RNA污染，而梨形環(huán)棱螺DNA的OD260/OD280比值小于1.8，說明存在蛋白質(zhì)污染。即便如此，從表中的數(shù)據(jù)可以看出，所提取的基因組DNA的濃度和得率均較為理想，說明酚-氯仿抽提法適合不同種環(huán)棱螺基因組DNA的提取。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，酚-氯仿抽提法可以有效的進(jìn)行南四湖不同種環(huán)棱螺基因組DNA的提取，并可以為許多后備實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備，如PCR，基因組文庫的構(gòu)建，基因組測(cè)序等。

實(shí)驗(yàn)過程中，由于很多因素的影響，如外界污染源的污染，加入有機(jī)溶劑酚-氯仿-異戊醇或氯仿-異戊醇顛倒混勻時(shí)過于劇烈導(dǎo)致基因組DNA斷裂，水浴時(shí)間不充分使得細(xì)胞未能充分破裂釋放DNA，從而導(dǎo)致一直未能夠取得較滿意的結(jié)果。異丙醇沉淀的步驟時(shí)，絮狀沉淀有很多，但是不全部是DNA，還含有不少未除凈的蛋白質(zhì)（留在點(diǎn)樣孔中）以及RNA（跑在前面），所以電泳的條帶沒有理想中的效果，會(huì)出現(xiàn)蛋白質(zhì)雜質(zhì)以及降解的DNA、RNA。然而目的條帶基因組DNA仍然能夠跑出來，可以繼續(xù)基因組文庫的構(gòu)建以及基因的克隆、測(cè)序等后續(xù)操作。

3、討論

3.1 DNA電泳沒出現(xiàn)條帶的原因

（1）所提取的DNA樣品量太少或者樣品中DNA已經(jīng)被內(nèi)源性DNase降解。（2）操作時(shí)沒有嚴(yán)格按照提DNA的要求做，一般需要帶手套，最好帶上口罩，所有塑料用品需要高壓蒸汽滅菌，實(shí)驗(yàn)的過程要在超凈臺(tái)上操作，盡量不讓外源的DNA酶降解DNA。（3）研磨不充分，或者加入分離緩沖液、SDS、蛋白酶K之后，水浴時(shí)間不足，細(xì)胞未能充分破裂釋放DNA。（4）加入有機(jī)溶劑酚-氯仿-異戊醇或氯仿-異戊醇后，顛倒混勻時(shí)過于劇烈，從而導(dǎo)致DNA斷裂。（5）DNA未能與蛋白質(zhì)充分分離，當(dāng)除去蛋白質(zhì)時(shí)，DNA隨蛋白質(zhì)一起被除去。（6）加入異丙醇沉淀離心10min后，DNA依然懸浮，未能沉淀到離心管底部，易隨著液體被倒掉。這時(shí)，可以用移液槍小心吸出液體，再加入70%的乙醇洗滌，離心后，DNA可以沉淀。（7）在用移液槍吸取上清液時(shí)，未用剪過的槍頭，從而在吸取時(shí)導(dǎo)致DNA鏈斷裂。

3.2 DNase的來源以及防止DNase的措施

要進(jìn)行PCR，基因組文庫的構(gòu)建以及基因組測(cè)序就需要得到完整的基因組DNA；而要得到完整的基因組DNA需要最大限度地抑制提取過程中內(nèi)源性及外源性DNase對(duì)DNA的降解。內(nèi)源性DNase始終存在于肌肉組織中，最適pH值在7.0附近，活性在pH5～6區(qū)域穩(wěn)定。外源性DNase穩(wěn)定且廣泛存在，操作者的手、唾液等含有較豐富的DNA酶，實(shí)驗(yàn)用試劑、器具等都含有DNase。DNase的活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活。鎂離子存在條件下，DNase I可隨機(jī)剪切雙鏈DNA的任意位點(diǎn)；二價(jià)錳離子存在條件下，DNase I可在同一位點(diǎn)剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個(gè)核苷酸突出的粘末端。依據(jù)DNase的這一性質(zhì)，在Tris-HCl緩沖液中加入EDTA，EDTA可以螯合二價(jià)陽離子，抑制DNase的活性。

然而不能因?yàn)榧尤肓薊DTA就放松了防止外界環(huán)境中DNase污染的警惕性。需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，避免任何可能的污染，是保證實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。為此，必須作到以下幾點(diǎn)：

1.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)專門辟出操作區(qū)，離心機(jī)，移液器，試劑等均應(yīng)專用。電泳槽、制膠板先用蒸餾水洗滌然后用70％的酒精處理，并且應(yīng)保持清潔，定期行除菌。

2.操作過程中應(yīng)戴一次性橡膠手套，并經(jīng)常更換，以防止手、臂上的細(xì)菌和真菌以及人體自身分泌的DNA酶帶到試管或污染用具。避免在操作中說話聊天。也可以戴口罩以防止引起DNA酶污染。

3.盡量使用一次性的塑料制品，槍頭、EP管等都應(yīng)該用新的，以防交叉污染。

4．在抽提過程中，若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多，可以增加抽提次數(shù)。盡量在低溫下操作，如果條件不容許，在室溫下操作的時(shí)間要盡可能的短。

5.DNA電泳的電泳液和膠必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

6.所用玻璃器皿、鑷子剪刀等需先置于高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。3.3 肌肉組織的不同保存方法對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響

本實(shí)驗(yàn)所用的田螺肌肉組織材料實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行了兩種不同的處理方式。

在第一種處理方式中，將采集的田螺標(biāo)本浸泡于95%的乙醇中，并于-20℃的冰箱中冷凍保存一年。一年后取出田螺標(biāo)本，解剖，取肌肉組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，難以提出DNA。推測(cè)難以取得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因是多方面的，而主要原因可能是經(jīng)過長時(shí)間乙醇的處理，肌肉組織變得堅(jiān)韌，剪成粉末并加入SDS，蛋白酶K，進(jìn)行水浴后難以將細(xì)胞充分裂解釋放DNA，于是DNA則隨蛋白質(zhì)一起被除去；另一個(gè)原因則可能是經(jīng)過長時(shí)間的保存，肌肉組織中的DNA已經(jīng)被降解。

第二種處理方式，是將剛采集的新鮮田螺進(jìn)行活體解剖，取其肌肉組織于-20℃的冰箱中冷凍保存，并在短期內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。-20℃冷凍保存的原因是防止DNA被DNase降解（最好是在-70℃保存，由于實(shí)驗(yàn)條件限制，采取-20℃冷凍保存）。新鮮的田螺肌肉組織較軟，進(jìn)行充分研磨后加入SDS，蛋白酶K進(jìn)行水浴，短時(shí)間內(nèi)就可以使得細(xì)胞充分裂解，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)步驟做了充分的準(zhǔn)備。從而使取得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果成為可能。3.4 實(shí)驗(yàn)材料的不同研磨方法對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響

本實(shí)驗(yàn)，采取了三種方式對(duì)環(huán)棱螺肌肉組織進(jìn)行研磨，具體的操作與實(shí)驗(yàn)效果如下： 第一種方式，是用鑷子和剪子在研缽中將肌肉組織剪碎，盡量剪成粉末，來保證與SDS蛋白酶K的充分反應(yīng)。然而，新鮮的肌肉組織較濕潤，難以剪成粉末狀，達(dá)到理想效果。從而在除去蛋白質(zhì)時(shí)，由于DNA未充分釋放，使得不少DNA隨蛋白質(zhì)一起被除去，造成實(shí)驗(yàn)材料的浪費(fèi)，從而跑出的電泳條帶顏色較淺，甚至無法跑出條帶。

第二種方式是采用玻璃研磨器，將已經(jīng)剪成小塊的肌肉組織進(jìn)行充分研磨，并加入無菌水將其研磨成漿，分裝入離心管中后離心1min，研磨好的組織沉淀到管底，將水吸出，加入后續(xù)藥品。這個(gè)方式可以使組織細(xì)胞與SDS，蛋白酶K充分反應(yīng)，DNA得以充分釋放，從而為跑出理想的條帶做準(zhǔn)備。但是這個(gè)方法步驟復(fù)雜，耗時(shí)較長，并且易在研磨過程中受到DNase的污染。

第三種方式是在研缽中將肌肉組織剪碎的基礎(chǔ)上，加入液氮，在液氮冷凍下將實(shí)驗(yàn)材料迅速研磨成粉末，分裝入離心管中，加入后續(xù)藥品。采用液氮是實(shí)驗(yàn)中最常用也是最為正規(guī)的方式，在保證了研磨充分從而使得組織與藥品充分反應(yīng)的同時(shí)，也加快了研磨速度，有效的避免了DNase的污染。

3.5 檢測(cè)基因組DNA提取效果的方法

對(duì)于實(shí)驗(yàn)中所提取的基因組DNA的提取質(zhì)量，一般可采取三種方法進(jìn)行檢測(cè)。除了本實(shí)驗(yàn)中所采用的瓊脂糖凝膠電泳的方法和紫外分光光度法以外，還有PCR擴(kuò)增法：PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min后，按照94℃變性30s，48℃退火30s，72℃延伸1min的循環(huán)參數(shù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min終止反應(yīng)。反應(yīng)體系的組成為：dNTP混合物，10×PCR buffer，正向引物，反向引物（根據(jù)所擴(kuò)增的區(qū)域選擇引物），模板DNA，Taq酶，最后用雙蒸水補(bǔ)足20μL。PCR產(chǎn)物在含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中電泳分離，用凝膠成像系統(tǒng)記錄產(chǎn)物條帶。

致謝

從開始寫作至本論文最終定稿，總共花費(fèi)了我一個(gè)月以來所有的業(yè)余時(shí)間。雖說在繁忙的工作之余要完成這樣一篇論文的確不是一件很輕松的事情，但我內(nèi)心深處卻滿含深深的感激之情。論文是在導(dǎo)師曲志才教授的悉心指導(dǎo)下完成的。導(dǎo)師淵博的專業(yè)知識(shí)，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，精益求精的工作作風(fēng)，誨人不倦的高尚師德，嚴(yán)以律己、寬以待人的崇高風(fēng)范，樸實(shí)無華、平易近人的人格魅力對(duì)我影響深遠(yuǎn)。不僅使我樹立了遠(yuǎn)大的學(xué)術(shù)目標(biāo)、掌握了基本的研究方法，還使我明白了許多待人接物與為人處世的道理。是曲導(dǎo)師讓我能夠靜靜地坐下來，在知識(shí)的海洋里吸取更多的營養(yǎng)，從而能夠?yàn)樽约哼M(jìn)一步地加油充電。本論文從選題到完成，每一步都是在導(dǎo)師的指導(dǎo)下完成的，傾注了導(dǎo)師大量的心血。在此，謹(jǐn)向?qū)煴硎境绺叩木匆夂椭孕牡母兄x！由于本理論水平比較有限，論文中的有些觀點(diǎn)以及對(duì)企業(yè)示例的歸納和闡述難免有疏漏和不足的地方，歡迎老師和專家們指正。

本論文的順利完成，離不開各位老師、同學(xué)、朋友和學(xué)校的關(guān)心和幫助。在此感謝師姐陳思、師妹焦玉蓮、師弟呂甲強(qiáng)、丁吉順同學(xué)等等的指導(dǎo)和幫助；感謝實(shí)驗(yàn)室的所有老師和同志的指導(dǎo)和幫助；感謝曲阜師范大學(xué)的支持和幫助。沒有他們的幫助和支持是沒有辦法完成我的學(xué)位論文的，同窗之間的友誼永遠(yuǎn)長存！參考文獻(xiàn)

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第五篇：瑞馬嘉豐公司簡介10-17

瑞馬嘉豐公司簡介

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樣本大綱

封面1P

跨頁形象頁2P

公司簡介1P

智慧豪宅概覽1P

智能控制系統(tǒng)1P（4Sight和iPhone）

私家影院娛樂系統(tǒng)1P（3D視覺，4D觸覺體驗(yàn)）

聲學(xué)檢測(cè)設(shè)計(jì)系統(tǒng)1P

光學(xué)與照明系統(tǒng)1P（低碳環(huán)保概念形象圖，文字簡明扼要）

多室音視頻系統(tǒng)1P

戶內(nèi)外電動(dòng)遮陽系統(tǒng)1P

溫度控制和保全與監(jiān)控1P

案例賞析1P

社區(qū)云服務(wù)管理系統(tǒng)（概念頁）1P

戰(zhàn)略合作品牌LOGO頁 1P

封底1P

整體顏色，紅，灰，黑，白。風(fēng)格，簡潔，大氣，高端，體現(xiàn)科技感，做行業(yè)概念引導(dǎo)。