第一篇：分子生物學(xué)新技術(shù)作業(yè)

名詞解釋：

Metabolomics：代謝組學(xué)是通過考察生物體系（細(xì)胞、組織或生物體）受刺激或擾動后（如將某個特定的基因變異或環(huán)境變化后），其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時間的變化，來研究生物體系的一門科學(xué)。

MicroRNA：miRNA是由21~25個核苷酸組成的非編碼RNA；它通過與靶基因的3-UTR的配對，促進(jìn)mRNA的降解或抑制mRNA的翻譯從而抑制其靶基因的表達(dá)；它在生物體生長發(fā)育、細(xì)胞增值、分化、凋亡以及人類各種疾病等的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

問答題

1.代謝組學(xué)的輔助研究手段有哪些，各有何特點？

（1）氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) ：特點：串聯(lián)兩個色譜柱，高分辨率、高靈敏度、高峰容量。

（2）液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) ：適用于短時間內(nèi)選定靶標(biāo)化合物的檢測；UPLC相對于傳統(tǒng)的HPLC有更好的分離效率、峰容量、及靈敏度，提供更適合與質(zhì)譜聯(lián)用的接口，有助于檢出更多的代謝物。提高方法通量、靈敏度，改善與質(zhì)譜聯(lián)用的定性定量結(jié)果。UPLC與質(zhì)譜聯(lián)用為代謝組學(xué)研究提供更加高效、靈敏的研究平臺。

（3）毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) ：以毛細(xì)管為分離通道, 采用高壓直流電場為驅(qū)動力的的新型液相分離技術(shù)，通過離子化合物的質(zhì)荷比（m/z）不同造成遷移速率不同來實現(xiàn)分離。適用于普通反相色譜柱不易保留的離子性代謝物的分離分析

（4）核磁共振技術(shù)：基于具有自旋性質(zhì)的原子核在核外磁場的作用下，吸收射頻輻射而產(chǎn)生的能級躍遷譜學(xué)。主要用于反應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)中的H和C原子的位置信息。

2.MicroRNA的研究方法有哪些？

（1）miRNA基因芯片技術(shù)：高通量檢測miRNA表達(dá)情況的最佳選擇；（2）PAGE/Northern blotting雜交法：可用于miRNA表達(dá)水平的定量檢測，還能與RNA marker結(jié)合使用檢測miRNA分子的大小，用來排除其他小分子RNA的污染；（3）原位雜交：可直觀顯示生物體miRNA的時間和組織特異性表達(dá)譜；（4）miRNA實時定量PCR：可高度靈敏地檢測出低豐度表達(dá)地靶分子，適用于高通量篩選。

3.舉例探討代謝組學(xué)在臨床研究中有哪些應(yīng)用？

藥物研發(fā)，疾病研究，植物代謝組學(xué)，微生物代謝組學(xué)，中藥現(xiàn)代化。如：應(yīng)用實例：Yang Jun 等運用安捷倫公司的高效液相色譜系統(tǒng)配合API公司的Q-TRAPLC液相質(zhì)譜系統(tǒng)。研究50個健康人和慢性乙肝病人的血清樣本，經(jīng)過脫蛋白處理。經(jīng)過去噪音，峰型尖銳化等處理。使用PLS-DA處理代謝數(shù)據(jù)，研究確定了代謝物標(biāo)記分子；微生物菌株細(xì)胞提取物的代謝分析（糖酵解，磷酸戊糖循環(huán)）；2型糖尿病小分子丙酮醛修飾胰島素檢驗診斷方案等。

4.談?wù)凪icroRNA與疾病相關(guān)性

MicroRNA與人類疾病包括腫瘤、糖尿病、炎癥、心臟疾病、病毒感染等的發(fā)生密切相關(guān)。MicroRNA造成疾病發(fā)生的可能原因有：突變、基因表達(dá)失活、低效轉(zhuǎn)錄等原因造成的microRNA表達(dá)下調(diào)；啟動子區(qū)域基因擴(kuò)增或突變等原因造成的microRNA表達(dá)上調(diào)等。MicroRNA引發(fā)腫瘤的可能原因：（1）microRNA與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡密切相關(guān)，而腫瘤則是由細(xì)胞增殖、分化、凋亡功能紊亂而引發(fā)的 ；（2）許多microRNA的基因位于基因組中易發(fā)生斷裂、移位、缺失等變異的區(qū)域 ；（3）與正常組織相比，在惡性腫瘤和腫瘤細(xì)胞株中普遍存在著對microRNA的表達(dá)失控。MicroRNA引發(fā)糖尿病的可能原因：（1）MicroRNA參與胰島素的合成分泌調(diào)節(jié)；（2）MicroRNA對血糖代謝起著直接或間接的調(diào)控作用；（3）MicroRNA與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。

第二篇：分子生物學(xué)作業(yè)

分子生物學(xué)作業(yè)

一、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)特點?

1DNA有兩條反向平行的脫氧核苷酸(兩條鏈的走向為5＇-3＇和3＇到5＇)，圍繞一中心軸(假想軸)構(gòu)成右手螺旋結(jié)構(gòu)。

2磷酸基與脫氧核糖在外側(cè)彼此間以磷酸二酯鍵相連，構(gòu)成DNA的骨架主鏈。

3兩條鏈間存在堿基互補配對:A與T或G與C配對形成氫鍵，稱為堿基互補原則。

4螺旋的穩(wěn)定因素為氫鍵和堿基堆砌力。

5螺旋的直徑為2nm，螺距為3.4nm。

二、轉(zhuǎn)座作用機(jī)理及遺傳學(xué)效應(yīng)？

（1）機(jī)理：在基因組中可以移動的一段DNA序列稱作轉(zhuǎn)座子，一個轉(zhuǎn)座子由基因組的一個位置轉(zhuǎn)移到另一個位置的過程叫轉(zhuǎn)座。可以分為復(fù)制性轉(zhuǎn)座和非復(fù)制性轉(zhuǎn)座。復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，這個轉(zhuǎn)座子被復(fù)制，所移動和轉(zhuǎn)位的是原轉(zhuǎn)座子的拷貝，需要解離酶；非復(fù)制性轉(zhuǎn)座中原始轉(zhuǎn)座子作為一個可移動的實體被直接移位，需要轉(zhuǎn)座酶。

（2）DNA轉(zhuǎn)座會引起插入突變、產(chǎn)生新的基因、影響插入位置臨近基因的表達(dá)并使宿主表型改變、產(chǎn)生染色體畸變以及引起生物進(jìn)化。

3.原核生物和真核生物基因組特點：

（1）原核生物一般只有一個環(huán)狀的DNA分子，其含有的基因為一個基因組；真核生物基因組指一個物種的單倍體染色體組所含有的一整套基因。

（2）原核生物的染色體分子量較小，基因組含有大量單一順序；真核生物基因組存在大量的非編碼序列，如內(nèi)含子外顯子等，還有復(fù)雜譜系。

（3）原核生物DNA在細(xì)胞中央，成為類核；真核生物有細(xì)胞核，DNA以染色體形式存在。

（4）原核基因組序列由DNA序列組成外，還可能有RNA；真核基因組由DNA序列組成。

（5）除了主要的染色體，原核生物中還有質(zhì)粒及轉(zhuǎn)座因子；真核生物中的細(xì)胞器也含有DNA，并可以自主復(fù)制。

第三篇：網(wǎng)絡(luò)新技術(shù)大作業(yè)

網(wǎng)絡(luò)新技術(shù)的發(fā)展

20世紀(jì)90年代以來，隨著通信與計算機(jī)技術(shù)的蓬勃發(fā)展和不斷融合，信息技術(shù)革命迅速興起，網(wǎng)絡(luò)新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，人類跨入信息網(wǎng)絡(luò)時代已成為客觀發(fā)展的必然趨勢，信息已被公認(rèn)為一種重要的的戰(zhàn)略資源，社會信息化和經(jīng)濟(jì)網(wǎng)絡(luò)化已成為新時代的重要標(biāo)志。網(wǎng)絡(luò)技術(shù)是一個新老更替、優(yōu)勝劣汰的發(fā)展過程，必然被新的、更加先進(jìn)的技術(shù)所取代。

回顧網(wǎng)絡(luò)發(fā)展的歷程，不難發(fā)現(xiàn)在信息網(wǎng)絡(luò)發(fā)展的各個階段出現(xiàn)了大量網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，其中有些技術(shù)已經(jīng)落伍而被淘汰了，有些技術(shù)依然發(fā)展出強(qiáng)大的生命力，還有些技術(shù)煥發(fā)出嶄新的活力，具有很好的應(yīng)用前景。網(wǎng)絡(luò)技術(shù)就像生物界的人和生物一樣，它的發(fā)展是一個新老更替、優(yōu)勝劣汰的過程，落后、陳舊的技術(shù)必將被先進(jìn)、嶄新的技術(shù)所取代，這是自然接一個永遠(yuǎn)不變的規(guī)律。網(wǎng)絡(luò)新技術(shù)主要是指近年來涌現(xiàn)的有關(guān)計算機(jī)網(wǎng)絡(luò)和通信網(wǎng)絡(luò)的先進(jìn)技術(shù)，其內(nèi)容非常寬泛，主要包括傳送網(wǎng)新技術(shù)、接入網(wǎng)新技術(shù)、交換網(wǎng)技術(shù)、互聯(lián)網(wǎng)新技術(shù)、移動無線網(wǎng)新技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)管理新技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)服務(wù)新技術(shù)。

近年來在局域網(wǎng)內(nèi)廣泛使用的一種遠(yuǎn)程訪問技術(shù)VPN，即虛擬專用網(wǎng)絡(luò)。虛擬專用網(wǎng)絡(luò)功能是：在公用網(wǎng)絡(luò)上建立專用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行加密通訊。在企業(yè)網(wǎng)絡(luò)中有廣泛應(yīng)用。VPN網(wǎng)關(guān)通過對數(shù)據(jù)包的加密和數(shù)據(jù)包目標(biāo)地址的轉(zhuǎn)換實現(xiàn)遠(yuǎn)程訪問。第二次實驗的課題就是VPN實驗，該實驗的要求就是配置L2TP協(xié)議，理解VPN的工作原理。VPN的協(xié)議有三種，L2TP協(xié)議（第2層隧道化協(xié)議）、PPTP協(xié)議（點對點隧道協(xié)議）、L2F協(xié)議（第2層轉(zhuǎn)發(fā)），實驗內(nèi)容是采用一條網(wǎng)線替換公網(wǎng)，即采用一條網(wǎng)線連上路由器的LAN口，在用戶和LNS之間建立一條隧道，配置的過程中啟用IPSEC安全協(xié)議認(rèn)證模式為CHAP，這對VPN隧道的信息具有保密作用，設(shè)置的用戶密碼和隧道密碼要在用戶側(cè)和LNS兩端保持一致性。VPN由網(wǎng)絡(luò)類型的差異分為了Client-LAN和LAN-LAN 類型，配置L2TP協(xié)議的VPN實驗應(yīng)該是用的Client-LAN 類型，即遠(yuǎn)程訪問式的VPN，它提供了一種安全的遠(yuǎn)程訪問手段。實現(xiàn)VPN的關(guān)鍵技術(shù)有隧道化協(xié)議、實驗中使用的是L2TP協(xié)議，認(rèn)證協(xié)議、L2TP隧道協(xié)議采用的是PPP的認(rèn)證協(xié)議即是CHAP認(rèn)證協(xié)議，加密技術(shù)由IPSec ESP提供。在配置L2TP實驗中了解到了L2TP有兩種實現(xiàn)模式，一種是將L2TP集成到遠(yuǎn)程用戶主機(jī)即這種配置稱為自愿模式。另一種是將L2TP

安裝于NAS即這種配置稱為強(qiáng)制模式。也知道了L2TP協(xié)議的工作流程是L2TP將PPP分組進(jìn)行隧道封裝并在不同的傳輸媒體上傳輸，首先要在傳輸?shù)膬啥私⑺淼涝谒淼纼?nèi)再建立會話連接，待連接完畢既可以進(jìn)行數(shù)據(jù)傳輸了，此時的用戶數(shù)據(jù)是以PPP幀封裝的，改PPP幀在被L2TP幀封裝。會話結(jié)束后，先猜出繪畫鏈接在拆除隧道。至此，完成了一次數(shù)據(jù)傳輸?shù)娜^程。

隨著網(wǎng)絡(luò)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，IPv4的缺陷和不足越來越明顯促而使得Ipv6的誕生。第一次是實驗的內(nèi)容即是IPV6實驗，實驗的目的是理解掌握IPV6協(xié)議的工作原理與作用并能簡單操作捕獲分析IPV6數(shù)據(jù)包。通過該實驗對IPV6有一點的了解。在Ethereal軟件分析協(xié)議類型為ICMPv6協(xié)議類型的數(shù)據(jù)包確定首部各個字段的值得知

1、版本號(Version，4位)，這個子段的大小與IPv4中的版本號域是相同的。但是，這個字段的使用是有限的。IPv6與IPv4的信息包不是通過版本字段的版本值來區(qū)分的，而是通過2層封裝（例如，Ethernet或者PPP）中的協(xié)議類型來區(qū)分的。

2、下一個報頭（NextHeader，8位），這個8位的選擇器，用來標(biāo)識緊跟在IPv6報頭后面的報頭的類型。如圖5.3所示可以看出該字段的值為ICMPV6（0x3a），它的使用與IPv6協(xié)議中下一個報頭域的使用是一樣的。

3、源地址（SourceAddress，128位），信息包的發(fā)信方的地址。如圖5.3所示可以看出該字段的值為10::1。

4、、目的地址（DestinationAddress，128位），信息包的預(yù)期接收者的地址。如果有路由報頭，該地址可能不是該信息包最終接收者的地址。如圖5.3所示可以看出該字段的值為10::2。采用IPv6的最基本原因是從根本上解決IPv4存在的地址限制和龐大路由表問題以及支持移動接入，其次采用IPv6可以開發(fā)很多新應(yīng)用，如P2P（在線游戲）、3G、家庭網(wǎng)絡(luò)等。第三、IPv6采用流類別和流標(biāo)記實現(xiàn)優(yōu)先級，可實現(xiàn)非默認(rèn)的服務(wù)質(zhì)量或?qū)崟r的服務(wù)等特殊處理。第四、采用IPv6可以實現(xiàn)即插即用，有利于支持移動節(jié)點，大量小型家電和通信設(shè)備的應(yīng)用。第五、IPv6內(nèi)置IPSec，可提供IP層的安全性。云計算是基于互聯(lián)網(wǎng)的相關(guān)服務(wù)的增加、使用和交付模式，通常涉及通過互聯(lián)網(wǎng)來提供動態(tài)易擴(kuò)展且經(jīng)常是虛擬化的資源。第三次實驗網(wǎng)絡(luò)存儲系統(tǒng)配置就類似一個FTP服務(wù)器。其簡單工作原理為：IPVS網(wǎng)絡(luò)視頻存儲設(shè)備經(jīng)過互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，對終端設(shè)備IP地址的訪問，從而進(jìn)行終端設(shè)備視頻及其他多種信息的存儲。也能理解和把網(wǎng)絡(luò)存儲系統(tǒng)歸為云計算。云計算使用分布式計算、并行計算、網(wǎng)格計算發(fā)展而來的，是一種新興的商業(yè)計算模型。其特點和優(yōu)勢歸于以下幾點，1、虛擬化

2、易擴(kuò)縮

3、可靠

4、高效、5靈活。云計算的服務(wù)層次為基礎(chǔ)設(shè)施

即服務(wù)（IaaS），平臺即服務(wù)（PaaS）和軟件即服務(wù)（SaaS）。云計算的出現(xiàn)對軟件的開發(fā)和測試頁存在著一定的影響。作為一種新型的計算模式，云計算利用高速互聯(lián)網(wǎng)的傳輸能力使數(shù)據(jù)的處理過程由個人計算機(jī)或服務(wù)器轉(zhuǎn)到互聯(lián)網(wǎng)上的計算機(jī)集群中，給用戶帶來空前的計算能力。雖然目前的云計算還不能很好地解決所有問題，但是未來一定會有越多的云計算系統(tǒng)被投入使用，云計算自身也會不斷地完善，從而成為工業(yè)界和學(xué)術(shù)界的另一研究熱點。云計算系統(tǒng)已經(jīng)成為下一代IT的發(fā)展趨勢，但是關(guān)于云系統(tǒng)的安全性、自治性、服務(wù)QoS、服務(wù)描述發(fā)現(xiàn)、云間交互等方面的研究仍顯不足，仍需要進(jìn)一步深入研究。網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的發(fā)展和時代進(jìn)步的需求逐漸形成了現(xiàn)在的三網(wǎng)融合，即指電信網(wǎng)、廣播電視網(wǎng)、互聯(lián)網(wǎng)在向?qū)拵ㄐ啪W(wǎng)、數(shù)字電視網(wǎng)、下一代互聯(lián)網(wǎng)演進(jìn)過程中，三大網(wǎng)絡(luò)通過技術(shù)改造，其技術(shù)功能趨于一致，業(yè)務(wù)范圍趨于相同，網(wǎng)絡(luò)互聯(lián)互通、資源共享，能為用戶提供語音、數(shù)據(jù)和廣播電視等多種服務(wù)。三網(wǎng)融合也有其獨具的優(yōu)勢：

1、使網(wǎng)絡(luò)從各自獨立的專業(yè)網(wǎng)絡(luò)向綜合性網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)變，網(wǎng)絡(luò)性能得以提升，資源利用率水平進(jìn)一步提高。

2、信息服務(wù)將由單一業(yè)務(wù)轉(zhuǎn)向文字、話音、數(shù)據(jù)、圖像、視頻等多媒體綜合業(yè)務(wù)通過手機(jī)視頻看到客戶的貨的大致情況，并立即決定派什么樣的車去提貨，發(fā)完貨以后，客戶也能隨時自主追。

3、有利于極大地減少基礎(chǔ)建設(shè)投入，并簡化網(wǎng)絡(luò)管理，降低維護(hù)成本。

4、將使網(wǎng)絡(luò)從各自獨立的專業(yè)網(wǎng)絡(luò)向綜合性網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)變，網(wǎng)絡(luò)性能得以提升，資源利用水平進(jìn)一步提高。

5、三網(wǎng)融合是業(yè)務(wù)的整合，它不僅繼承了原有的話音、數(shù)據(jù)和視頻業(yè)務(wù)，而且通過網(wǎng)絡(luò)的整合，衍生出了更加豐富的增值業(yè)務(wù)類型，如圖文電視、VOIP、視頻郵件和網(wǎng)絡(luò)游戲等，極大地拓展了業(yè)務(wù)提供的范圍。

6、三網(wǎng)融合打破了電信運營商和廣電運營商在視頻傳輸領(lǐng)域長期的惡性競爭狀態(tài)，各大運營商將在一口鍋里搶飯吃，看電視、上網(wǎng)、打電話資費可能打包下調(diào)。

Ad Hoc 網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，Ad Hoc網(wǎng)絡(luò)是一種采用了分組交換技術(shù)的無線自組織網(wǎng)絡(luò)，Ad Hoc網(wǎng)絡(luò)作為一種新穎的移動計算機(jī)網(wǎng)絡(luò)，將以其獨特的特點開創(chuàng)出一種新的移動計算和無線通信模式。由于Ad hoc網(wǎng)絡(luò)的特殊性，它的應(yīng)用領(lǐng)域與普通的通信網(wǎng)絡(luò)有著顯著的區(qū)別。它適合被用于無法或不便預(yù)先鋪設(shè)網(wǎng)絡(luò)設(shè)施的場合、需快速自動組網(wǎng)的場合等。針對Ad hoc網(wǎng)絡(luò)的研究是因軍事應(yīng)用而發(fā)起的。因此，軍事應(yīng)用仍是Ad hoc網(wǎng)絡(luò)的主要應(yīng)用領(lǐng)域，但是民用方面，Ad hoc網(wǎng)絡(luò)也有非常廣泛的應(yīng)用前景。

P2P網(wǎng)絡(luò)，被叫做對等網(wǎng)絡(luò)或?qū)Φ扔嬎悖且环N有別于傳統(tǒng)C/S模式的分布式網(wǎng)絡(luò)。近年來，對等網(wǎng)絡(luò)技術(shù)迅速成為信息網(wǎng)絡(luò)界關(guān)注的熱點技術(shù)之一。按網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)和發(fā)展歷史，對P2P網(wǎng)絡(luò)分為四個類型或發(fā)展階段。第一代：集中式中央服務(wù)器管理的P2P網(wǎng)絡(luò)，以Napster[16]為代表。第二代：分布式P2P網(wǎng)絡(luò)，每個節(jié)點即是服務(wù)器又是客戶端。第三代：混合型P2P網(wǎng)絡(luò)，采用了分布式服務(wù)器或者超級節(jié)點。第四代：多源文件傳輸機(jī)制。目前的P2P應(yīng)用主要體現(xiàn)在五大領(lǐng)域：文件共享和交換、對等計算、協(xié)同工作、搜索引擎和娛樂休閑。P2P將主要通過三個方面影響未來：

1、P2P算法可能有很大的機(jī)會，世界變得越來越非集中化和連接化，需要對P2P算法來克服課擴(kuò)展匿名和鏈接問題。

2、P2P應(yīng)用最有可能成功，如Napster。

3、P2P平臺可能廣泛采用JXTA，從而是不同的P2P應(yīng)用可互相兼容。P2P網(wǎng)絡(luò)借貸平臺在英美等發(fā)達(dá)國家發(fā)展已相對完善，這種新型的理財模式已逐漸被身處網(wǎng)絡(luò)時代的大眾所接受。一方面出借人實現(xiàn)了資產(chǎn)的收益增值，另一方面借款人則可以用這種方便快捷地方式滿足自己的資金需求。

21世紀(jì)的科技特征就是數(shù)字化、網(wǎng)絡(luò)化和信息化的時代，它是一個以網(wǎng)絡(luò)話為核心的信息時代。隨著時代的發(fā)展，科技的創(chuàng)新，我們需要從現(xiàn)有的技術(shù)中找到不足之處，吸取經(jīng)驗創(chuàng)造更好更適合我們的新技術(shù)，和時代一起與時俱進(jìn)。創(chuàng)建更美好更先進(jìn)更高科技的時代。

第四篇：分子生物學(xué)

分子生物技術(shù)在微生物鑒定中的應(yīng)用

摘要：微生物多樣性是生物多樣性的重要組成部分。由于微生物和 動、植物 相比, 存在著多種顯著差異。而傳統(tǒng)的基于微生物培養(yǎng)與純種分離的技術(shù)具有很大的局限性，分子生物學(xué)及其有關(guān)技術(shù)的長足進(jìn)展及其在為生物中的使用, 使微生物的研究進(jìn)入了分子的階段。

關(guān)鍵詞：16SrDNA PCR 溫度梯度電泳 變性梯度凝膠電泳 微生物包括了從原核到真核的不同類群的生物: 細(xì)菌、放線菌、原生動物、真菌、部分藻類和病毒, 是生物多樣性的重要組成部分。此外, 微生物多樣性與其他生物類群相比有許多獨特之處, 包括: 1)生存環(huán)境多樣;2)生長、繁殖速度多樣;3)營養(yǎng)、代謝類型多樣;4)生活方式多樣。因而, 微生物多樣性的研究無論對于生態(tài)系統(tǒng)功能的完整理解, 還是對于微生物資源的利用和開發(fā)都具有特殊重要的意義[1]。微生物作為生態(tài)系統(tǒng)中極重要的一員, 對動植物的生長，生態(tài)系統(tǒng)中的能流和物質(zhì)循環(huán)及環(huán)境污染物的降解和解毒等方面起著重要作用并且與人的生活健康息息相關(guān)。隨著微生物的不斷發(fā)現(xiàn)及研究，傳統(tǒng)微生物技術(shù)越來越不能滿足其發(fā)展的需要，最主要的不足是丟失了微生物的多樣性, 許多報道都指出, 在自然環(huán)境中有相當(dāng)多的菌種(約90%-99%)用傳統(tǒng)方法無法培養(yǎng)出來[2].這對于微生物基因組學(xué)研究來說是很不利的.，導(dǎo)致研究的片面性并且效率低下。而分子生物學(xué)技術(shù)則避開了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)分離的環(huán)節(jié), 而是采取直接從樣品中抽取所含微生物總DNA, 然后通過16S rDNA, PCR, RAPD, DGGE

和RFLP 等多種分子生物學(xué)研究手段, 對直接提取的總DNA進(jìn)行分析, 了解其中所包含的微生物DNA 的種類和含量, 以研究樣品中微生物的實際組成, 同時可以利用直接提取得到的總DNA 建立基因文庫, 并從中篩選有用的基因。由于是直接從樣品中提取總DNA, 中間沒有任何篩選性的過程, 因此, 所得DNA 能夠準(zhǔn)確地反映樣品中微生物的實際情況, 避免了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法不能真實反映微生態(tài)實際情況的缺點, 也不會丟失樣品中存在的任何微生物,同時, 這種方法能夠很容易、大批量地取得同一環(huán)境下乃至不同環(huán)境下的不同微生物的同源基因, 為微生物比較基因組學(xué)研究開辟了道路.此外, 用直接提取的總DNA 構(gòu)建的基因文庫, 包含了大量以前因為無法培養(yǎng)而不能獲得的微生物基因, 從這些文庫中發(fā)現(xiàn)全新的具有巨大應(yīng)用價值的抗生素類、酶類及其他生物活性物質(zhì)的基因應(yīng)該是非常有潛力的。1．16SrRNA比較測序

16SrDNA是編碼原核生物16SrRNA的基因，長度約1500bp，存在于所有的原核生物的基因組中，由多個保守區(qū)和與之相間的多個可變區(qū)組成。保守區(qū)為所有細(xì)菌共有，細(xì)菌之間無顯著差異；可變區(qū)在不同細(xì)菌之間存在一定程度的差異，具有細(xì)菌屬或種特異[3]。2.PCR近年來,對環(huán)境樣品總DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 推動了利用分子標(biāo)記技術(shù)研究微生物的多樣性。PCR技術(shù)是美國letus公司人類遺傳研究室的科學(xué)家與1983年發(fā)明的一種在體外快速擴(kuò)增特異基因或DNA 序列的方法, 其目的是將極微量DNA大量擴(kuò)增。該技術(shù)模仿生物體內(nèi)DNA 的復(fù)制過程,首先使DNA 變性, 兩條鏈解開;然后使引物模板退火, 二者堿基配對;耐高溫的Taq DNA 聚合酶以4種dNTP為底物, 在引物的引導(dǎo)下合成與模板鏈互補的DNA 新鏈[4]。PCR 技術(shù)可在體外快速擴(kuò)增DNA, 具有快速、簡便、靈敏度高的特點。當(dāng)然常規(guī) PCR技術(shù)也存在很多的問題，如出現(xiàn)假陽性、形成引物二聚體、傳統(tǒng)的PCR技術(shù)一次擴(kuò)增只能檢測一種微生物、RNA病毒的PCR檢測操作繁瑣，中間污染環(huán)節(jié)多，易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果等.為了彌補上面這些不足，一些新的PCR技術(shù)逐漸衍生出來并被用于實踐，如熱啟動PCR、巢式PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR、多重PCR、通用引物PCR、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、隨機(jī)引物DNA 多態(tài)性擴(kuò)增（RAPD）、限制性長度多態(tài)性分析（RFLP）、實時熒光PCR（real-time PCR）等[5]。3.電泳分離及其顯示方法

除過我們熟知的瓊脂糖凝膠電泳并用溴乙錠(EB)染色方法和聚丙烯酰氨凝膠電泳(PAGE 分離)銀染方法外, 還有一些通過特殊的電泳分離技術(shù)而建立的分子標(biāo)記, 如變性梯度凝膠電泳(DGGE), 可分離長度相同但是序列不同的DNA 片段的混合物。對于特異性引物PCR 擴(kuò)增的環(huán)境微生物的16SrRNA 基因, 一般的電泳很難將序列不同的片段分開。DGGE膠在聚丙烯酰氨膠中添加了線性梯度的變性劑, 可以形成從低到高的線性梯度, 在一定溫度下, 同一濃度的變性劑中, 不同序列的產(chǎn)物，其部分解鏈程度不同。DNA 解鏈程度不同決定其電泳的遷移率, 結(jié)果不同的產(chǎn)物在凝膠上分離開。在變性條件適當(dāng)?shù)那闆r下, 該技術(shù)能分辨一個堿基對。DGGE 技術(shù)在微生物群落結(jié)構(gòu) 的研究、微生物種群的動態(tài)分析、富集培養(yǎng)以及分離物的分析、16SDNA 同源性的分析中得到廣泛應(yīng)用[6]。

溫度梯度電泳(TGGE)是利用不同構(gòu)象的分子具有不同的變 性溫度來進(jìn)行分離, 最先應(yīng)用于DNA /RNA 的分子構(gòu)象分析和序列變異分析, 是一種新出現(xiàn)的檢測點突變的電泳技術(shù), 其最大特點上具有高分辨能力。單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)也是根據(jù)不同的結(jié)構(gòu)對DNA在凝膠中遷移速率影響很大, 結(jié)果不同序列的DNA 片段在凝膠上得以高分辨率的分離。基因芯片可分為cDNA 芯片、寡核苷酸芯片及基因組芯片。在一定條件下, 載體上的核酸分子可以與來自樣品的序列互補的核酸片段雜交。如果把樣品中的核酸片段進(jìn)行標(biāo)記, 在專用的芯片閱讀儀上就可以檢測到雜交信號[7]。

分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用中rRNA 技術(shù)提供了一種擺脫傳統(tǒng)的純種培養(yǎng)方法而鑒定環(huán)境微生的途徑,并已被廣泛應(yīng)用于微生物的各個領(lǐng)域。雖然當(dāng)前,標(biāo)準(zhǔn)rRNA 技術(shù)的靈敏度還難以檢測到低豐度的(低于1/ 1 000)在群落中僅占很小比例的微生物種類, 從而使之在微生物生態(tài)以及環(huán)境學(xué)上的應(yīng)用受到很大的限制。然而, rRNA 技術(shù)與其它的分子技術(shù)以及特別是與傳統(tǒng)的純種培養(yǎng)方法相結(jié)合, 具備分析微生物多樣性的巨大潛力。隨著這些新的分子方法的不斷改進(jìn)以及rRNA 數(shù)據(jù)庫中序列信息的不斷增加, 我們能探知更多的未知的微生物世界。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊永華，姚健.分子生物學(xué)方法在微生物多樣性研究中的應(yīng)用[J].生物多樣性，2000 8(3):337-342.[2]李 紅,周友兵,陳炳耀,胡錦矗.分子生物學(xué)技術(shù)在微生物多樣性研究中的應(yīng)用[J].河北大學(xué)學(xué)報(自然版),2003 12(23).[3]朱詩應(yīng)，戚中田.１６ＳｒＤＮＡ擴(kuò)增及測序在細(xì)菌鑒定與分類中的應(yīng)用[J].微生物與感染,2013 8(2):104-109.[4，7] 高小朋, 張欠欠, 任桂梅.分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用[J].延安大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2008 9(27)：27-45.[5] 路則寶，白現(xiàn)廣。分子生物學(xué)技術(shù)在微生物檢驗中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].紅河學(xué)院學(xué)報，2013 4（1）38-46.[6]雷正瑜.16RsDNA序列分析技術(shù)在微生物鑒定中的應(yīng)用[J].湖北生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2006 1（4）：35-45.

第五篇：分子生物學(xué)課件整理

注：根據(jù)課件內(nèi)容簡單整理，為了方便大家理解，內(nèi)容較多;如果僅僅為了考試，可以根據(jù)自己的需要進(jìn)行內(nèi)容的刪減。Lecture 1.Introduction

1.What is Molecular Biology? Molecular biology seeks to explain the relationships between the structure and function of biological molecules and how these relationships contribute to the operation and control of biochemical processes.Molecular biology is the study of genes and their activities at the molecular level, including transcription, translation, DNA

（一）基因的概念的產(chǎn)生和發(fā)展

2、Morgan 基因的物質(zhì)載體是染色體

3、G.Beadle & R.Tatum

基因是決定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的遺傳物質(zhì)單位

5、O.Avery

基因的化學(xué)本質(zhì)是DNA

6、Jacob & Monod

基因是在特定的遺傳調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)節(jié)下和控制下表達(dá)其功能的遺傳物質(zhì)單位

7、現(xiàn)代的基因概念

基因是核酸分子中儲存遺傳信息的遺傳單位，是指儲存有功能的蛋白replication, recombination and translocation.分子生物學(xué)的研究內(nèi)容

Major content of molecular biology ◆ Structure and Function of nucleic acid ★conformation and function of DNA ★conformation and function of RNA ◎mRNA ◎tRNA◎rRNA ◎ ribozyme ◎antisence RNA ◎ microRNA ◎ RNA interfrence 人們開發(fā)出：RNAi、RNAa、ncRNA、SiRNA、microRNA、Antisene RNA、SatellileRNA、TelomereRNA、lincRNA、InCRNA、PiRNA、qiRNA、endoSiRNA等等，其他還有RNA結(jié)合蛋白(RNPs)、RNA酶等成百上千種RNA相關(guān)的新成員，組成了一個龐大的RNA新世界

這些RNA不僅在基因-蛋白質(zhì)的合成中發(fā)揮重要作用，它更調(diào)節(jié)和管理著—基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、表型等幾乎所有的功能。

在細(xì)胞增殖、分化、生長、凋亡、生殖、發(fā)育、遺傳、損傷、修復(fù)、炎癥、感染、防治等一切生命活動中發(fā)揮著重要作用；

RNA還是生命起源的“先驅(qū)’’，近年來研究證明，RNA比DNA更古老，它是地球上最早出現(xiàn)的生命形式；它可以攜帶遺傳信息，能自我復(fù)制，自我進(jìn)化，自我編譯，又具有催化分子功能------,以后才有了DNA和蛋白質(zhì)，才有了今天的生物世界。

RNA更是人類生命健康的維護(hù)者，它不僅調(diào)節(jié)和管理著人類的一切生命活動，而且它還是防治許多重大的疾病和開發(fā)新藥物的靶分子和預(yù)警分子，并可直接和間接的發(fā)揮防治疾病的作用。

◆Functional Genomics ◎As the Human Genome Project has mostly determined the genetic sequence, the next step is functional genomics, which will reveal each gene's functions and controls ◎ Human Genome Diversity Project ◎ Environmental Genome Project ◎Pharmacogenomics ◎Comparative Genomics

Artificial life 人工生命是通過人工模擬生命系統(tǒng),來研究生命的領(lǐng)域。人工生命的概念，包括兩個方面內(nèi)容

1.屬于計算機(jī)科學(xué)領(lǐng)域的虛擬生命系統(tǒng)，涉及計算機(jī)軟件工程與人工智能技術(shù)，以及

2.基因工程技術(shù)人工改造生物的工程生物系統(tǒng)，涉及合成生物學(xué)技術(shù)。

分子生物學(xué)與醫(yī)學(xué)

◆人體發(fā)育調(diào)控和人體功能調(diào)控的分子生物學(xué)基礎(chǔ) ◎發(fā)育、分化與衰老的分子生物學(xué)基礎(chǔ) ◎細(xì)胞增殖調(diào)控的分子生物學(xué)基礎(chǔ)

◎神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫調(diào)控的分子生物學(xué)基礎(chǔ)

◆ 基因與疾病 ◎疾病的分子機(jī)理

致病基因的克隆

復(fù)雜疾病的分子基礎(chǔ) ◎基因診斷 ◎基因治療

Lecture 2 structure and function of gene 第一節(jié) 基因的概念及其發(fā)展 一 基因（gene）

質(zhì)多肽鏈或RNA序列信息所必需的全部核苷酸序列

二、基因組（genomic）The genome is the entirety of an organism's hereditary information.It is encoded either in DNA or, for many types of virus, in RNA.The genome includes both the genes and the non-coding sequences of the DNA

細(xì)胞或生物體中，一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和。

人類基因組包含24條染色體以及線粒體上的全部的遺傳物質(zhì)。

第二節(jié) 真核生物基因組

一、基因分類

1、結(jié)構(gòu)基因（strutual gene）可被轉(zhuǎn)錄形成mRNA并進(jìn)而翻譯位多肽鏈，構(gòu)成各種結(jié)構(gòu)蛋白的基因

2、調(diào)節(jié)基因（regulatory gene）可調(diào)節(jié)、控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的基因。其突變可能會影響一個或多個結(jié)構(gòu)基因的功能，導(dǎo)致一個（或多個）蛋白質(zhì)的改變。

3、rRNA基因和tRNA基因

二、基因的結(jié)構(gòu)

enhancer pr omoter e xon 5UTR, 3UTR intron

（一）編碼區(qū)、外顯子（exon）

2、內(nèi)含子（intron）★GT—AG規(guī)則：

內(nèi)含子多是以GT開始，并以AG結(jié)尾

★一個基因的內(nèi)含子可以是另一個基因的外顯子。★外顯子的數(shù)量是描述基因結(jié)構(gòu)特征的重要指標(biāo)。三、調(diào)控元件（acting elements）

（二）前導(dǎo)區(qū)：

位于編碼區(qū)的上游，相當(dāng)于mRNA5端的非編碼區(qū)

（三）調(diào)節(jié)區(qū)：

包括啟動子、增強(qiáng)子等基因編碼區(qū)的兩側(cè)，也稱側(cè)翼序列

◎順式調(diào)控元件（cis-acting elements）：與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)。能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識別和結(jié)合的DNA序列。◎反式調(diào)控元件（trans-acting elements）:一些可以通過結(jié)合順式元件而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白因子。

（一）啟動子（promoter）

啟動子是DNA分子可以與RNA聚合酶特異結(jié)合的部位，也就是使轉(zhuǎn)錄開始的部位。在基因表達(dá)的調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄的起始是個關(guān)鍵。常常某個基因是否應(yīng)當(dāng)表達(dá)決定于在特定的啟動子起始過程。2 啟動子的類型

(1)一類是RNA聚合酶可以直接識別的啟動子 這類啟動子應(yīng)當(dāng)總是能被轉(zhuǎn)錄。

但實際上也不都如此，外來蛋白質(zhì)可對其有影響，即該蛋白質(zhì)可直接阻斷啟動子，也可間接作用于鄰近的DNA結(jié)構(gòu)，使聚合酶不能和啟動子結(jié)合(2)另一類啟動子在和聚合酶結(jié)合時需要有蛋白質(zhì)輔助因子的存在。這種蛋白質(zhì)因子能夠識別與該啟動子順序相鄰或甚至重疊的DNA順序。3 啟動子的共同順序

⑴ 真核生物基因啟動子 位于RNA合成開始位點的上游大約10bp和35bp處有兩個共同的順序，稱為-10和-35序列。這兩個序列的共同順序如下，-35區(qū)“AATGTGTGGAAT”，-10區(qū)“TTGACATATATT”。

-10序列又稱為Pribnow盒(原核生物)。是RNA聚合酶所結(jié)合和作用必需的順序

⑵真核生物基因啟動子

▲TATA box（Goldberg-Hogness box）：

位于-35bp處，序列為TATA（A/T）A（T/A）是RNA聚合酶Ⅱ的結(jié)合部位

▲CAAT盒：在轉(zhuǎn)錄起始位點上游70-80bp處

保守的共同順序：GCCTCAATCT。RNA聚合酶Ⅱ可以識別這一順序。⑶啟動子中的－10和-35序列是RNA聚合酶所結(jié)合和作用必需的順序 [1]RNA聚合酶能和-35和-10序列中的堿基和DNA主 鏈中的磷酸基相接觸;[2]離開共同順序較遠(yuǎn)的啟動子的活性亦較弱;[3]最重要的是，破壞啟動子功能的突變中有75%都是改變了共同順序中的堿基，其余25%亦為離共同順序較近的。-35和-10序列相距約20bp，即大致是雙螺旋繞兩圈的長度。因為這兩個結(jié)合區(qū)是在DNA分子的同一側(cè)面，沉默子的作用機(jī)理

沉默子介導(dǎo)產(chǎn)生的沉默是一種狀態(tài)的變化,在此過程中,產(chǎn)生類似于異染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)阻止轉(zhuǎn)錄因子與DNA的相互作用,使轉(zhuǎn)錄被抑制,沉默子作為異染色質(zhì)形成中的失活中心參與沉默狀態(tài)的建立和擴(kuò)散

沉默子含阻遏蛋白結(jié)合序列，阻遏蛋白與其結(jié)合后阻遏基因的轉(zhuǎn)錄。直接阻遏(direct repression)沉默子結(jié)合蛋白與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中的成員結(jié)合后將其固定，使基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄復(fù)合物無法形成而喪失活性

競爭(competition)在一些基因中沉默子與增強(qiáng)子等正調(diào)控元件相鄰或相重疊，阻遏蛋白結(jié)合后阻止激活蛋白與鄰近正調(diào)控元件的結(jié)合從而阻遏轉(zhuǎn)錄

淬滅

沉默子與增強(qiáng)子相鄰，阻遏蛋白與沉默子結(jié)合后,雖不影響激活蛋白與DNA的結(jié)合能力,卻通過蛋白之間的相互作用阻止激活蛋白與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的正確接觸來抑制其活性 可見此酶是結(jié)合在雙螺旋的一面。可以想像，它能“感覺到每個結(jié)合區(qū)的溝底中堿基所產(chǎn)生的特異形狀。”

（三）增強(qiáng)子（enhancer)★位于結(jié)構(gòu)基因附近，能夠增強(qiáng)該基因轉(zhuǎn)錄活性的一段DNA順序稱為增強(qiáng)子(enhancer)。

★增強(qiáng)子是另一類順式作用的DNA片段，可使基因轉(zhuǎn)錄的速率大大提高。

增強(qiáng)子的類型

①組織和細(xì)胞專一性增強(qiáng)子

許多增強(qiáng)子的增強(qiáng)效應(yīng)有很高的組織細(xì)胞專一性，只有在特定的轉(zhuǎn)錄因子(蛋白質(zhì))參與下，才能發(fā)揮其功能。②誘導(dǎo)性增強(qiáng)子

這種增強(qiáng)子的活性通常要有特定的啟動子參與。

例如，金屬硫蛋白基因可以在多種組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，又可受類固醇激素、鋅、鎘和生長因子等的誘導(dǎo)而提高轉(zhuǎn)錄水平。

增強(qiáng)子的特點

①增強(qiáng)子可提高同一條DNA鏈上基因轉(zhuǎn)錄效率，可以遠(yuǎn)距離作用，通常距離l～4kb，個別情況下離開所調(diào)控的基因30kb仍能發(fā)揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。

②增強(qiáng)子作用與其序列的正反方向無關(guān)，將增強(qiáng)子方向倒置依然能起作用。而將啟動子倒置就不能起作用，可見增強(qiáng)子與啟動子是很不相同的。③增強(qiáng)子要有啟動子才能發(fā)揮作用，沒有啟動子存在，增強(qiáng)子不能表現(xiàn)其活性。但增強(qiáng)子對啟動子沒有嚴(yán)格的專一性，同一增強(qiáng)子可以影響不同類型啟動子的轉(zhuǎn)錄。

④增強(qiáng)子必須與特定的蛋白質(zhì)因子結(jié)合后才能發(fā)揮增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用。增強(qiáng)子一般具有組織或細(xì)胞特異性，許多增強(qiáng)子只在某些細(xì)胞或組織中表現(xiàn)活性，是由這些細(xì)胞或組織中具有的特異性蛋白質(zhì)因子所決定的。

例如，人類胰島素基因5’端上游約250個核苷酸處有一組織特異性增強(qiáng)子。在胰島素p細(xì)胞中有一種特異性蛋白因子，可以作用于這個區(qū)域，以增強(qiáng)胰島素基因的轉(zhuǎn)錄。在其他組織細(xì)胞中沒有這種蛋白因子，所以也就沒有此作用。

⑤大多為重復(fù)序列，一般長約50bp，適合與某些蛋白因子結(jié)合。其內(nèi)部常含有一個核心序列，即(G)TGGA／TA／TA／T(G)，是產(chǎn)生增強(qiáng)效應(yīng)時所必需的。

⑥許多增強(qiáng)子還受外部信號的調(diào)控，如金屬硫蛋白的基因啟動區(qū)上游所帶的增強(qiáng)子，就可以對環(huán)境中的鋅、鎘濃度做出反應(yīng)。

增強(qiáng)子的作用機(jī)理

①增強(qiáng)子中有Z-DNA結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的雙鏈間距離大于B-DNA，與蛋白質(zhì)的親和力更高一些，有利于轉(zhuǎn)錄。

②增強(qiáng)子中有DNA水解酶容易切斷的部位，可與一些轉(zhuǎn)錄因子蛋白形成復(fù)合物，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。

③增強(qiáng)子可與核基質(zhì)結(jié)合形成結(jié)構(gòu)體，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。

3．沉默子（Silencer）

Silencers are control regions of DNA that, like enhancers, may be located thousands of base pairs away from the gene they control.However, when transcription factors bind to them, expression of the gene they control is repressed.沉默子的特點

(1)可以在遠(yuǎn)距離作用于啟動子

(2)對基因的阻遏作用沒有方向的限制，即無論其位于啟動子的上游或下游均可阻遏啟動子的表達(dá)

某些沉默子中含有骨架結(jié)合位點保守序列

沉默子與蛋白結(jié)合,通過蛋白之間的相互作用形成DNA環(huán)后與啟動子作用，破壞起始復(fù)合物而抑制轉(zhuǎn)錄;

或者產(chǎn)生的DNA環(huán)發(fā)生了組蛋白的修飾和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的變化,這種變化使關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子不能正確結(jié)合從而阻止轉(zhuǎn)錄

也可能沉默子和核基質(zhì)相互作用將轉(zhuǎn)錄單元固定于缺乏轉(zhuǎn)錄因子的亞顯微結(jié)構(gòu)

4.絕緣子(insulator)

絕緣子(insulator)長約幾百個核苷酸對，是通常位于啟動子同正調(diào)控元件(增強(qiáng)子)或負(fù)調(diào)控因子(為異染色質(zhì))之間的一種調(diào)控序列。

絕緣子本身對基因的表達(dá)既沒有正效應(yīng)，也沒有負(fù)效應(yīng)，其作用只是不讓其他調(diào)控元件對基因的活化效應(yīng)或失活效應(yīng)發(fā)生作用。絕緣子的功能

①有序地裝置龐大的染色體DNA以及確保其中上萬種基因每一種都能在時空上正確無誤地表達(dá)。

絕緣子在這里起著關(guān)鍵的阻斷作用,保護(hù)啟動子的功能不受其它異常增強(qiáng)子或其它激發(fā)信號的有害影響

②防止基因免受鄰近沉默信號的作用。這類沉默信號系來自細(xì)胞核的內(nèi)環(huán)境中遍布的大量致密染色質(zhì)的“擴(kuò)張”或“溢出”。

絕緣子的這種功能可以維持染色質(zhì)區(qū)域的分界以及保護(hù)基因座位的獨立性。

絕緣子的作用原理

①結(jié)構(gòu)域邊界模型(Domain boundary model,)

絕緣子能使它所限定的染色質(zhì)區(qū)域發(fā)生折疊成環(huán),促使該區(qū)域內(nèi)各種調(diào)節(jié)元件彼此相互作用,同時也阻止了不同區(qū)域調(diào)節(jié)元件之間互相影響。染色質(zhì)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)域能對抗附近致密染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)展。這樣一來,絕緣子能防止位置效應(yīng)也能得到合理的解釋。②“跟蹤”模型(“Tracking” model):

結(jié)合在增強(qiáng)子元件上的轉(zhuǎn)錄因子沿DNA鏈向它的目標(biāo)啟動子追逐。此時絕緣子的特異結(jié)合蛋白在中途阻擋轉(zhuǎn)錄因子,使其不能抵達(dá)啟動子區(qū)域。③轉(zhuǎn)錄誘捕模型(Transcription decoy model)

在絕緣子與其特異結(jié)合蛋白結(jié)合所形成的復(fù)合物可成為捕捉增強(qiáng)子的籠子,將增強(qiáng)子復(fù)合物吸引到其中而使之失去功能。

四、基因家族（gene family）

（一）基因家族的概念

1、基因家族：核苷酸序列或編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有一定程度同源性的一組基因。由同一祖先基因進(jìn)化而來。

2、假基因（pseudogene）

在多基因家族中，某些成員并不能表達(dá)出有功能的產(chǎn)物，這些基因稱為假基因。

假基因與有功能的基因同源，原來可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或點突變等，使這一基因失去活性，成為無功能基因。

與相應(yīng)的正常基因相比，假基因往往缺少正常基因的內(nèi)含子，兩側(cè)有順向重復(fù)序列。

人們推測，假基因的來源之一，可能是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后生成的RNA前體通過剪接失去內(nèi)含子形成mRNA，如果mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)cDNA，再整合到染色體DNA中去，便有可能成為假基因，因此該假基因是沒有內(nèi)含子的，在這個過程中，可能同時會發(fā)生缺失，倒位或點突變等變化，從而使假基因不能表達(dá)。

（二）、基因家族大致可分為兩類

1、一類是基因家族成簇地分布在某一條染色體上，它們可同時發(fā)揮作

用，合成某些蛋白質(zhì)，如組蛋白基因家族就成簇地集中在第7號染色體長臂3區(qū)2帶到3區(qū)6帶區(qū)域內(nèi)；

2、另一類是一個基因家族的不同成員成簇地分布 在不同的染色體上，這些不同成員編碼一組功能上緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)，如珠蛋白基因家族

五、重復(fù)序列：高度重復(fù)序列 中度重復(fù)順序 單拷貝順序

（一）高度重復(fù)序列

高度重復(fù)序列在基因組中重復(fù)頻率高，可達(dá)百萬(106)以上，因此復(fù)性速度很快。

在基因組中所占比例隨種屬而異，約占10-60％，在人基因組中約占20％。

高度重復(fù)順序又按其結(jié)構(gòu)特點分為三種。

1、倒位（反向）重復(fù)序列（inverted repeats）

反向重復(fù)序列由兩個相同順序的互補拷貝在同一DNA鏈上反向排列而成。約占人基因組的5％。

2、衛(wèi)星DNA

衛(wèi)星DNA(satelliteDNA)是另一類高度重復(fù)序列，這類重復(fù)順序的重復(fù)單位一般由2-10bp組成，成串排列。由于這類序列的堿基組成不同于其他部份，可用等密度梯度離心法將其與主體DNA分開，因而稱為衛(wèi)星DNA或隨體DNA。在人細(xì)胞組中衛(wèi)星DNA約占5-6％。§大衛(wèi)星DNA（macrosatellite DNA）§小衛(wèi)星DNA（minisatellite DNA）

§微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）

3、較復(fù)雜的重復(fù)單位組成的重復(fù)順序

這種重復(fù)順序為靈長類所獨有。用限制性內(nèi)切酶HindⅢ消化非洲綠猴DNA，可以得到重復(fù)單位為172bp的高度重復(fù)順序，這種順序大部份由交替變化的嘌呤和嘧啶組成。有人把這類稱為α衛(wèi)星DNA。而人的α衛(wèi)星DNA更為復(fù)雜，含有多順序家族。

4、高度重復(fù)順序的功能

⑴參與復(fù)制水平的調(diào)節(jié)反向序列常存在于DNA復(fù)制起點區(qū)的附近。另外，許多反向重復(fù)序列是一些蛋白質(zhì)（包括酶）和DNA的結(jié)合位點。

⑵參與基因表達(dá)調(diào)控DNA的重復(fù)順序可以轉(zhuǎn)錄到核內(nèi)不均一RNA分子中，而有些反向重復(fù)順序可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這對穩(wěn)定RNA分子，免遭分解有重要作用

⑶參與轉(zhuǎn)位作用幾乎所有轉(zhuǎn)位因子的末端都包括反向重復(fù)順序，長度由幾個bp到1400bp。由于這種順序可以形成回文結(jié)構(gòu)，因此在轉(zhuǎn)位作用中即能連接非同源的基因，又可以被參與轉(zhuǎn)位的特異酶所識別。

⑷與進(jìn)化有關(guān) 不同種屬的高度重復(fù)順序的核苷酸序列不同，具有種屬特異性，但相近種屬又有相似性。如人的α衛(wèi)星DNA長度僅差1個堿基（前者為171bp，后者為172bp），而且堿基序列有65％是相同的，這表明它們來自共同的祖先。在進(jìn)化中某些特殊區(qū)段保守的，而其他區(qū)域的堿基序列則累積著變化。

⑸同一種屬中不同個體的高度重復(fù)順序的重復(fù)次數(shù)不一樣，這可以作為每一個體的特征，即DNA指紋。

（二）中度重復(fù)順序

中度重復(fù)序列大致指在真核基因組中重復(fù)數(shù)十至數(shù)萬（<105）次的重復(fù)順序。其復(fù)性速度快于單拷貝順序，但慢于高度重復(fù)順序。少數(shù)在基因組中成串排列在一個區(qū)域，大多數(shù)與單拷貝基因間隔排列。依據(jù)重復(fù)順序的長度，中度重復(fù)順序可分為兩種類型。（1）短分散片段

（short interspersed repeated segments, SINES）這類重復(fù)順序的平均長度約為300bp（〈500bp），它們與平均長度約為1000bp的單拷貝順序間隔排列。拷貝數(shù)可達(dá)10萬左右。如Alu家族，Hinf

家族等屬于這種類型的中度重復(fù)序列（2）長分散片段

（Long interspersed repeated segments, LINES）

這類重復(fù)順序的長度大于1000bp，平均長度為3500-5000bp，它們與平均長度為13000bp（個別長幾萬bp）的單拷貝順序間隔排列。

也有的實驗顯示人基因組中所有LINES之間的平均距離為2.2kb,拷貝數(shù)一般在1萬左右，如KpnⅠ家族等。

中度重復(fù)順序在基因組中所占比例在不同種屬之間差異很大，一般約占10-40％，在人約為12％。這些順序大多不編碼蛋白質(zhì)。這些非編碼的中度重復(fù)順序的功能可能類似于高度重復(fù)順序。

在結(jié)構(gòu)基因之間，基因簇中，以及內(nèi)含子內(nèi)都可以見到這些短的和長的中度重復(fù)順序。如HLA基因，rRNA基因，tRNA基因,組蛋白基因,免疫球蛋白基因等。

中度重復(fù)順序一般具有種屬特異性；在適當(dāng)?shù)那闆r下，可以應(yīng)用它們作為探針區(qū)分不同種哺乳動物細(xì)胞的DNA。下面介紹幾種典型的中度重復(fù)順序。

Alu家族是哺乳動物包括人基因組中含量最豐富的一種中度重復(fù)順序家族，在單倍體人基因組中重復(fù)達(dá)30萬-50萬次，約占人基因組的3-6％。Alu家族每個成員的長度約300bp，由于每個單位長度中有一個限制性內(nèi)切酶Alu的切點（AG↓CT）從而將其切成長130和170bp的兩段，因而定名為Alu序列（或Alu家族）。

Alu序列分散在整個人體或其他哺乳動物基因組中，在間隔DNA，內(nèi)含子中都發(fā)現(xiàn)有Alu序列，平均每5kbDNA就有一個Alu順序。

KpnⅠ家族是中度重復(fù)順序中僅次于Alu家族的第二大家族。用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ消化人類及其它靈長類動物的DNA，在電泳譜上可以看到4個不同長度的片段，分別為1.2,1.5,1.8和1.9kb，這就是所謂的KpnⅠ家族。

KpnⅠ家族成員順序比Alu家族更長（如人KpnⅠ順序長6.4kb），而且更加不均一，呈散在分布，屬于中度重復(fù)順序的長分散片段型。

盡管不同長度類型的KpnⅠ家族（稱為亞類，subfamily）之間同源性比較小，不能互相雜交，但它們的3'端有廣泛的同源性。KpnⅠ家族的拷貝數(shù)約為3000￣4800個，占人體基因組的1％,與散在分布的Alu家族相似，KpnⅠ家族中至少有一部份也是通過KpnⅠ順序的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的cDNA拷貝的重新插入到人基因組DNA中而產(chǎn)生的。

Hinf家族：

這一家族以319bp長度的串聯(lián)重復(fù)存在于人體基因組中。用限制性內(nèi)切酶HinfⅠ消化人體DNA，可以分離到這一片段。Hinf家族在單位基因組內(nèi)約有50 100個拷貝，分散在不同的區(qū)域。319bp單位可以再分成兩個亞單位，分別為172bp和147bp,它們之間有70%的同源性。

rRNA基因：在原核生物如大腸桿菌基因組中，rRNA基因一共是七套；在真核生物中rRNA基因的重復(fù)次數(shù)更多。在真核生物基因組中18S和28S,rRNA基因是在同一轉(zhuǎn)錄單位中，低等的真核生物如酵母中，5SrRNA也和18S,28SrRNA在同一轉(zhuǎn)錄單位中；

而在高等生物中，5SrRNA是單獨轉(zhuǎn)錄的，而且其在基因組中的重復(fù)次數(shù)高于18S和28S基因。和一般的中度重復(fù)順序不一樣，各重復(fù)單位中的rRNA基因都是相同的。

rRNA基因通常集中成簇存在，而不是分散于基因組中，這樣的區(qū)域稱為rDNA，如染色體的核仁組織區(qū)（nucleolus organizer region）即為rDNA區(qū)。

（三）單拷貝順序

單拷貝順序在單倍體基因組中只出現(xiàn)一次或數(shù)次，因而復(fù)性速度很慢。單拷貝順序在基因組中占50-80％，如人基因組中，大約有60-65％的順序?qū)儆谶@一類。單拷貝順序中儲存了巨大的遺傳信息，編碼各種不同功能的蛋白質(zhì)。

六、真核生物基因組的特點

1.真核生物基因組DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，儲存于細(xì)胞核內(nèi)，除配子細(xì)胞外，體細(xì)胞內(nèi)的基因的基因組是雙份的（即雙倍體,diploid），即有兩份同源的基因組。

2.真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。一個結(jié)構(gòu)基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯生成一個mRNA分子和一條多肽鏈。

3.存在重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)可達(dá)百萬次以上。4.基因組中不編碼的區(qū)域多于編碼區(qū)域。

5.大部分基因含有內(nèi)含子，因此，基因是不連續(xù)的。

6.基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核生物的基因組，具有許多復(fù)制起點，而每個復(fù)制子的長度較小

重疊基因有以下幾種情況

（1）一個基因完全在另一個基因里面。如基因Ａ和Ｂ是兩個不同基因，而Ｂ包含在基因Ａ內(nèi)。同樣，基因Ｅ在基因Ｄ內(nèi)。（2）部分重疊。（3）兩個基因只有一個堿基重疊。

八、原核生物基因組的結(jié)構(gòu)和功能

（1）基因組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈DNA 分子組成。

（2）具有操縱子結(jié)構(gòu)，即數(shù)個功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，受同一個調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)。數(shù)個操縱子還可以由一個共同的調(diào)節(jié)基因（regulatorygene）即調(diào)節(jié)子（regulon）所調(diào)控。

（3）在大多數(shù)情況下，結(jié)構(gòu)基因在細(xì)菌基因組中都是單拷貝，但是編碼rRNA的基因rDNA往往是多拷貝的,這樣可能有利于核糖體的快速組裝，便于在急需蛋白質(zhì)合成時細(xì)胞可以在短時間內(nèi)有大量核糖體生成。

（4）和病毒的基因組相似，不編碼的DNA部份所占比例比真核細(xì)胞基因組少得多。

（5）具有編碼同工酶的同基因（isogene）例如，在大腸桿菌基因組中有兩個編碼分支酸（chorismicacid）變位酶的基因，兩個編碼乙酰乳酸（acetolactate）合成酶的基因。

（6）和病毒基因組不同的是，在細(xì)菌基因組中編碼順序一般不會重疊，即不會出現(xiàn)基因重疊現(xiàn)象。

（7）在DNA分子中具有各種功能的識別區(qū)域如復(fù)制起始區(qū)OriC，復(fù)制終止區(qū)TerC,轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)和終止區(qū)等。這些區(qū)域往往具有特殊的順序，并且含有反向重復(fù)順序。

（8）在基因或操縱子的終末往往具有特殊的終止順序,它可使轉(zhuǎn)錄終止和RNA聚合酶從DNA鏈上脫落。

例如大腸桿菌色氨酸操縱子后尾含有40bp的GC豐富區(qū)，其后緊跟AT豐富區(qū)，這就是轉(zhuǎn)錄終止子的結(jié)構(gòu)。

終止子有強(qiáng)、弱之分，強(qiáng)終止子含有反向重復(fù)順序，可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其后面為polyT結(jié)構(gòu)，這樣的終止子無需終止蛋白參與即可以使轉(zhuǎn)錄終止。而弱終止子盡管也有反向重復(fù)序列，但無polyT結(jié)構(gòu)，需要有終止蛋白參與才能使轉(zhuǎn)錄終止。

Lecture 3 DNA replication 第一節(jié) DNA的復(fù)制

一、DNA復(fù)制的基本特點

（一）復(fù)制的起始點和方向

★復(fù)制起始點：復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復(fù)制起始點(origin of replication)常用ori或o表示

★復(fù)制子： replicon DNA復(fù)制從起始點開始直到終點為止，每個這樣的DNA單位稱為復(fù)制子或復(fù)制單元

★復(fù)制叉：在復(fù)制開始時，復(fù)制起始點出呈現(xiàn)一叉形結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)制叉（replication fork）

1、復(fù)制起始點：

DNA復(fù)制起始點有結(jié)構(gòu)上的特殊性。這些特殊的結(jié)構(gòu)對于在DNA復(fù)制起始過程中參與的酶和許多蛋白質(zhì)分子的識別和結(jié)合都是必須的。§大腸桿菌染色體DNA復(fù)制起始點Oric由422個核苷酸組成，是一系列對稱排列的反向重復(fù)序列，即回文結(jié)構(gòu)(palindrome)，其中有9個核苷酸或13個核苷酸組成的保守序列，這些部位是大腸桿菌中DnaA蛋白識別的位置

2、DNA復(fù)制的方向

(1)定點開始雙向復(fù)制：這是原核生物和真核生物DNA復(fù)制最主要的形式，從一個特定位點解鏈，沿著兩個相反的方向各生長出兩條鏈，形成一個復(fù)制泡。

(2)定點開始單向復(fù)制：質(zhì)粒colE1是個典型的例子，復(fù)制從一個起始點開始，以同一方向生長出兩條鏈，形成一個復(fù)制

(3)兩點開始單向復(fù)制：腺病毒DNA的復(fù)制是從兩個起點開始的，形成兩個復(fù)制叉，各以一個單一方向復(fù)制出一條新鏈。

二、復(fù)制的基本方式

(一)DNA的半保留復(fù)制(semiconservative replication)

（二）半不連續(xù)復(fù)制 前導(dǎo)鏈(leading strand)：在以3′→5′方向的母鏈為模板時，復(fù)制合成出一條5′→3′方向的前導(dǎo)鏈，前導(dǎo)鏈的前進(jìn)方向與復(fù)制叉打開方向是一致的，因此前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的 隨從鏈(lagging strand)：另一條母鏈DNA是5′→3′方向，它作為模板時，復(fù)制合成許多條5′→3′方向的短鏈，叫做隨從鏈，隨從鏈的前進(jìn)方向是與復(fù)制叉的打開方向相反的。

隨從鏈只能先以片段的形式合成，這些片段就叫做崗崎片段(Okazaki fragments)，原核生物崗崎片段含有1000-2000核苷酸，真核生物一般10000核苷酸。最后再將多個崗崎片段連接成一條完整的鏈。

由于前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的，而隨從鏈的合成是不連續(xù)進(jìn)行的，所以從總體上看DNA的復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制

三、復(fù)制過程

（一）DNA復(fù)制的起始階段

1、DNA復(fù)制起始引發(fā)體的形成及所參與的酶和蛋白質(zhì)

⑴解鏈酶(helicase)：解鏈酶的作用就是打開DNA雙鏈之間的氫鍵。

大腸桿菌中DnaB蛋白就有解鏈酶活性，與隨從鏈的模板DNA結(jié)合，沿5′→3′方向移動，還有一種叫做Rep蛋白和前導(dǎo)鏈的模板DNA結(jié)合沿3′→5′方向移動。

⑵.單鏈結(jié)合蛋白：(single strand binding proteins, SSBP)

它與解開的單鏈DNA結(jié)合，使其穩(wěn)定不會再度螺旋化并且避免核酸內(nèi)切酶對單鏈DNA的水解，保證了單鏈DNA做為模板時的伸展?fàn)顟B(tài)，SSBP可以重復(fù)利用。

⑶ 引發(fā)體的形成

DNA復(fù)制起始的關(guān)健步驟是前導(dǎo)鏈DNA的合成，一旦前導(dǎo)鏈DNA的聚合作用開始，隨從鏈DNA的合成也隨著開始。由于前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的，所以它的起始相對簡單，而隨從鏈的合成是不連續(xù)進(jìn)行的，所以引發(fā)階段比較復(fù)雜。大腸桿菌的引發(fā)前體由Dna B.Dna C和單鏈結(jié)合蛋白組成。★引物酶(primase)它是一種特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。這種短RNA片段一般十幾個至數(shù)十個核苷酸不等，它們在DNA復(fù)制起始處做為引物。RNA引物的3′OH末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一個磷酸二酯鍵的位置

★引發(fā)體(primosome)高度解鏈的模板DNA與多種蛋白質(zhì)因子形成的引發(fā)前體促進(jìn)引物酶結(jié)合上來，共同形成引發(fā)體，引發(fā)體主要在DNA隨從鏈上開始，它連續(xù)地與引物酶結(jié)合并解離，從而在不同部位引導(dǎo)引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3′OH末端接下去合成DNA片段，這就是隨從鏈不連續(xù)合成的開始。

（二）DNA復(fù)制的延長階段以及參與的酶和蛋白質(zhì)分子

1、DNA的聚合反應(yīng)和DNA聚合酶

★DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerse Ⅰ）：

DNA polⅠ是由一條多肽鏈組成，分子量為109KD。酶分子中含有一個Zn++，是聚合活性必須的。

(1)DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′聚合活性 這是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的核苷酸順序，將互補的dNTP逐個加到引物RNA3′-OH末端，并促進(jìn)3′-OH與dNTP的5′-OH形成磷酸二酯鍵，酶的專一性表現(xiàn)為新進(jìn)入的dNTP必須與模板DNA堿基配對時才有催化作用。

(2)DNA聚合酶Ⅰ的3′→5′外切核酸酶活性

這種酶活性的主要功能是從3′→5′方向識別并切除DNA生長鏈末端與模板DNA不配對而游離的核苷酸，這種功能稱為校對功能，這是保證其聚合作用的正確性不可缺少的，因此對于DNA復(fù)制中極高的保真性是至關(guān)重要的。

(3)DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′外切核酸酶活性

這種酶活性是從DNA鏈的5′端向3′末端水解已配對的核苷酸，本質(zhì)是切斷磷酸二酯鍵，每次能切除10個核苷酸。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起重要作用，對完成的DNA片段去除5′端的RNA引物也是必須的。

DNA polⅠ并不是DNA復(fù)制過程中的主要酶，它的作用主要與DNA損傷后的修復(fù)有關(guān)。

DNA聚合酶Ⅱ(DNA polⅡ）

分子量為120KD，每個細(xì)胞約有100個酶分子，但活性只有DNA polⅠ的5%，它具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，而沒有5′→3′外切活性，它的作用可能與DNA損傷修復(fù)有關(guān)。DNA聚合酶Ⅲ(DNA polⅢ）

這是在DNA復(fù)制過程中起主要作用的聚合酶，它是由一個多亞基組成的蛋白質(zhì)分子，其分子量＞600kDa整個酶分子形成一個不對稱的二聚體 DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是單獨起作用的，而是與引發(fā)體，解鏈酶等構(gòu)成一個復(fù)制體。由于復(fù)制體的存在，先導(dǎo)鏈和隨從鏈可以同時復(fù)制。DNA polⅢ是由多亞基組成的不對稱二聚體，它可能同時負(fù)責(zé)先導(dǎo)鏈和隨從鏈的復(fù)制

2、與超螺旋松馳有關(guān)的酶

拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)是一類改變DNA拓?fù)湫再|(zhì)的酶。

在體外可催化DNA的各種拓?fù)洚悩?gòu)化反應(yīng)，而在生物體內(nèi)它們可能參與了DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。

在DNA復(fù)制時，復(fù)制叉行進(jìn)的前方DNA分子部分產(chǎn)生有正超螺旋，拓?fù)涿缚伤神Y超螺旋，有利于復(fù)制叉的前進(jìn)及DNA的合成。

DNA復(fù)制完成后，拓?fù)涿赣挚蓪NA分子引入超螺旋，使DNA纏繞、折疊，壓縮以形成染色質(zhì)。

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶有Ⅰ型和Ⅱ型，它們廣泛存在于原核生物及真核生物中。

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(TopoⅠ)的主要作用

將環(huán)狀雙鏈DNA的一條鏈切開一個口，切口處鏈的末端繞螺旋軸按照松馳超螺旋的方向轉(zhuǎn)動，然后再將切口封起來。這就使DNA復(fù)制叉移動時所引起的前方DNA正超螺旋得到緩解，利于DNA復(fù)制叉繼續(xù)向前打開。

對環(huán)狀單鏈DNA還有打結(jié)或解結(jié)作用，對環(huán)狀雙鏈DNA的環(huán)連或解連以及使環(huán)狀單鏈DNA形成環(huán)狀雙鏈DNA都有作用

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ)的主要作用

是在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的，曾被稱為旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)，它們作用特點是切開環(huán)狀雙鏈DNA的兩條鏈，分子中的部分經(jīng)切口穿過而旋轉(zhuǎn)，然后封閉切口。還可使DNA分子從超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗神Y狀態(tài)，此反應(yīng)不需要ATP參與。DNA復(fù)制完成后，TopoⅡ在ATP參與下，DNA分子從松馳狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋。

催化的拓?fù)洚悩?gòu)化反應(yīng)還有環(huán)連或解環(huán)連，以及打結(jié)或解結(jié)。

DNA連接酶(DNA ligase)作用：消耗ATP，將隨從鏈中相鄰的兩個DNA片段連接起來

催化同一模板DNA鏈上的兩個相鄰DNA片段的3＇端與5＇端間形成磷酸二酯鍵，把相鄰的兩段DNA連成完整的鏈

（三）DNA復(fù)制的終止階段

DNA在復(fù)制過程中，合成出的前導(dǎo)鏈為一條連續(xù)的長鏈。隨從鏈則是由合成出許多相鄰的片段，在連接酶的催化下，連接成為一條長鏈。連接作用是在連接酶催化下進(jìn)行的。

DNA復(fù)制的過程 延長:

DNA-pol Ⅲ(DDDP-Ⅲ)的5? → 3?的聚合活性使核苷酸之間生成3?，5?磷酸二酯鍵

模板 以DNA單鏈為模板

底物 dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）

引物 以小片段RNA為引物，在 RNA引物的 3?-OH末端上開始逐個添加dNTP

按堿基配對原則（A = T G ≡ C）按5? → 3? 方向

第二節(jié) 真核生物DNA復(fù)制的特點 1.復(fù)制起始點及方向

與原核生物不同，真核生物DNA復(fù)制有許多起始點，例如酵母S.cerevisiae的17號染色體約有400個起始點，因此，雖然真核生物DNA復(fù)制的速度(60核苷酸/每秒鐘)比原核生物DNA復(fù)制的速度(E.coli 1700核苷酸/每秒鐘)慢得多，但復(fù)制完全部基因組DNA也只要幾分鐘的時間。2.在真核生物DNA復(fù)制叉處，需要兩種不同的酶。DNA聚合酶α(polα)和DNA聚合酶δ(polδ)

polα和引物酶緊密結(jié)合，在DNA模板上先合成RNA引物，再由polα延長DNA鏈，這種活性還要復(fù)制因子C參與。

同時結(jié)合在引物模板上的PCNA，此時釋放了polα，然后由polδ結(jié)合到生長鏈3′末端，并與PCNA結(jié)合，繼續(xù)合成前導(dǎo)鏈。

而隨從鏈的合成靠polα緊密與引物酶結(jié)合并在復(fù)制因子C幫助下，合成崗崎片段

3、末端復(fù)制與端粒酶 端區(qū)(telomeres)由于真核生物染色體是線性DNA，它的兩端叫做端區(qū)(telomeres)，端區(qū)是由重復(fù)的寡核苷酸序列構(gòu)成的。

由于隨從鏈?zhǔn)且砸环N不連續(xù)的形式合成崗崎片段，所以不能完成線性染色體末端的復(fù)制，如果這個問題不解決，真核生物在細(xì)胞分裂時DNA復(fù)制將產(chǎn)生5′末端隱縮，使DNA縮短。端粒酶(telomerase)由蛋白質(zhì)和RNA兩部分組成的，它以自身的RNA為模板，在隨從鏈模板DNA的3′OH末端延長DNA，再以這種延長的DNA為模板，繼續(xù)合成隨從鏈。第三節(jié) DNA損傷與修復(fù)

一、DNA的損傷

(一)DNA損傷的原因 1.DNA分子的自發(fā)性損傷

2.物理因素引起的DNA損傷

3.化學(xué)因素引起的DNA損傷 1.DNA分子的自發(fā)性損傷(1)DNA復(fù)制中的錯誤

堿基配對的錯誤頻率約為10-1－10-2 在DNA復(fù)制酶的作用下堿基錯誤配對頻率降到約10-5－10-6 DNA聚合酶還會暫停催化作用，以其3′－5′外切核酸酶的活性切除錯誤接上的核苷酸，然后再繼續(xù)正確的復(fù)制但校正后的錯配率仍約在10-10左右.(2)DNA的自發(fā)性化學(xué)變化

a.堿基的異構(gòu)互變

DNA中的4種堿基各自的異構(gòu)體間都可以自發(fā)地相互變化(例如烯醇式與酮式堿基間的互變)，這種變化就會使堿基配對間的氫鍵改變，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鳥嘌呤等，如果這些配對發(fā)生在DNA復(fù)制時，就會造成子代DNA序列與親代DNA不同的錯誤性損傷 b.堿基的脫氨基作用

堿基的環(huán)外氨基有時會自發(fā)脫落，從而胞嘧啶會變成尿嘧啶、腺嘌呤會變成次黃嘌呤(H)、鳥嘌呤會變成黃嘌呤(X)等，遇到復(fù)制時，U與A配對、H和X都與C配對就會導(dǎo)致子代DNA序列的錯誤變化。胞嘧啶自發(fā)脫氨基的頻率約為每個細(xì)胞每天190個。c.脫嘌呤與脫嘧啶

自發(fā)的水解可使嘌呤和嘧啶從DNA鏈的核糖磷酸骨架上脫落下來。一個哺乳類細(xì)胞在37℃條件下，20h內(nèi)DNA鏈上自發(fā)脫落的嘌呤約1000個、嘧啶約500個 估計一個長壽命不復(fù)制繁殖的哺乳類細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞)在整個生活期間自發(fā)脫嘌呤數(shù)約為108，約占細(xì)胞DNA中總嘌呤數(shù)的3%。d.堿基修飾與鏈斷裂

細(xì)胞呼吸的副產(chǎn)物O2、H2O2等會造成DNA損傷，能產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物，還可能引起DNA單鏈斷裂等損傷，每個哺乳類細(xì)胞每天DNA單鏈斷裂發(fā)生的頻率約為5萬次。此外，體內(nèi)還可以發(fā)生DNA的甲基化，結(jié)構(gòu)的其他變化等，這些損傷的積累可能導(dǎo)致老化。

2.物理因素引起的DNA損傷

(1)紫外線引起的DNA損傷

DNA分子損傷最早就是從研究紫外線的效應(yīng)開始的。當(dāng)DNA受到最易被其吸收波長(～260nm)的紫外線照射時，主要是使同一條DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價鍵連成二聚體，相鄰的兩個T、或兩個C、或C與T間都可以環(huán)丁基環(huán)(cyclobutane ring)連成二聚體，其中最容易形成的是TT二聚體

(2)電離輻射引起的DNA損傷

電離輻射損傷DNA有直接和間接的效應(yīng)，直接效應(yīng)是DNA直接吸收射線能量而遭損傷，間接效應(yīng)是指DNA周圍其他分子(主要是水分子)吸收射線能量產(chǎn)生具有很高反應(yīng)活性的自由基進(jìn)而損傷DNA。電離輻射可導(dǎo)致DNA分子的多種變化： a.堿基變化

主要是由OH－自由基引起，包括DNA鏈上的堿基氧化修飾、過氧化物的形成、堿基環(huán)的破壞和脫落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。b.脫氧核糖變化

脫氧核糖上的每個碳原子和羥基上的氫都能與OH－反應(yīng)，導(dǎo)致脫氧核糖分解，最后會引起DNA鏈斷裂。c.DNA鏈斷裂

單鏈斷裂:DNA雙鏈中一條鏈斷裂稱單鏈斷裂(single strand broken)雙鏈斷裂:DNA雙鏈在同一處或相近處斷裂稱為雙鏈斷裂(doublestrand broken)。

雖然單鏈斷裂發(fā)生頻率為雙鏈斷裂的10-20倍，但還比較容易修復(fù)；對單倍體細(xì)胞來說(如細(xì)菌)一次雙鏈斷裂就是致死事件。

d.交聯(lián) 同一條DNA鏈上或兩條DNA鏈上的堿基間可以共價鍵結(jié)合 DNA與蛋白質(zhì)之間也會以共價鍵相連，組蛋白、染色質(zhì)中的非組蛋白、調(diào)控蛋白、與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶都會與DNA共價鍵連接。這些交聯(lián)是細(xì)胞受電離輻射后在顯微鏡下看到的染色體畸變的分子基礎(chǔ)，會影響細(xì)胞的功能和DNA復(fù)制。

3.化學(xué)因素引起的DNA損傷(1)烷化劑對DNA的損傷

烷化劑是一類親電子的化合物，很容易與生物體中大分子的親核位點起反應(yīng)。烷化劑的作用可使DNA發(fā)生各種類型的損傷： a.堿基烷基化

烷化劑很容易將烷基加到DNA鏈中嘌呤或嘧啶的N或O上，其中鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻擊，烷基化的嘌呤堿基配對會發(fā)生變化，例如鳥嘌呤N7被烷化后就不再與胞嘧啶配對，而改與胸腺嘧啶配對，結(jié)果會使G－C轉(zhuǎn)變成A－T。b.堿基脫落

烷化鳥嘌呤的糖苷鍵不穩(wěn)定，容易脫落形成DNA上無堿基的位點，復(fù)制時可以插入任何核苷酸，造成序列的改變。c.斷鏈

DNA鏈的磷酸二酯鍵上的氧也容易被烷化，結(jié)果形成不穩(wěn)定的磷酸三酯鍵，易在糖與磷酸間發(fā)生水解，使DNA鏈斷裂。d.交聯(lián)

烷化劑有兩類

單功能基烷化劑，如甲基甲烷碘酸，只能使一個位點烷基化；

雙功能基烷化劑，化學(xué)武器如氮芥、硫芥等，一些抗癌藥物如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、絲裂霉素等，某些致癌物如二乙基亞硝胺等均屬此類，其兩個功能基可同時使兩處烷基化，結(jié)果就能造成DNA鏈內(nèi)、DNA鏈間，以及DNA與蛋白質(zhì)間的交聯(lián)。

(2)堿基類似物、修飾劑對DNA的損傷 人工可以合成一些堿基類似物用作促突變劑或抗癌藥物，如5－溴尿嘧啶(5－BU)、5－氟尿嘧啶(5－FU)、2－氨基腺嘌呤(2－AP)等。由于其結(jié)構(gòu)與正常的堿基相似，進(jìn)入細(xì)胞能替代正常的堿基參入到DNA鏈中而干擾DNA復(fù)制合成，例如5－BU結(jié)構(gòu)與胸腺嘧啶十分相近，在酮式結(jié)構(gòu)時與A配對，卻又更容易成為烯醇式結(jié)構(gòu)與G配對，在DNA復(fù)制時導(dǎo)致A－T轉(zhuǎn)換為G－C。(二)DNA損傷的后果

1.點突變(point mutation)

指DNA上單一堿基的變異。嘌呤替代嘌呤(A與G之間的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C與T之間的替代)稱為轉(zhuǎn)換(transition)；嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤則稱為顛換(transvertion)。2.缺失(deletion)

指DNA鏈上一個或一段核苷酸的消失。3.插入(insertion)

指一個或一段核苷酸插入到DNA鏈中。在為蛋白質(zhì)編碼的序列中如缺失及插入的核苷酸數(shù)不是3的整倍數(shù)，則發(fā)生讀框移動(reading frame shift)，使其后所譯讀的氨基酸序列全部混亂，稱為移碼突變 4.倒位或轉(zhuǎn)位(transposition)

指DNA鏈重組使其中一段核苷酸鏈方向倒置、或從一處遷移到另一處。 5.雙鏈斷裂

已如前述，對單倍體細(xì)胞一個雙鏈斷裂就是致死性事件。突變或誘變對生物可能產(chǎn)生4種后果 ①致死性；

②喪失某些功能；

③改變基因型而不改變表現(xiàn)型

④發(fā)生了有利于物種生存的結(jié)果，使生物進(jìn)化。

二、DNA修復(fù)(一)回復(fù)修復(fù)

1.光修復(fù)

這是最早發(fā)現(xiàn)的DNA修復(fù)方式。

修復(fù)是由細(xì)菌中的DNA光解酶(photolyase)完成，此酶能特異性識別紫外線造成的核酸鏈上相鄰嘧啶共價結(jié)合的二聚體，并與其結(jié)合，這步反應(yīng)不需要光；結(jié)合后如受300－600nm波長的光照射，則此酶就被激活，將二聚體分解為兩個正常的嘧啶單體，然后酶從DNA鏈上釋放，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。后來發(fā)現(xiàn)類似的修復(fù)酶廣泛存在于動植物中，人體細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)。2.單鏈斷裂的重接

DNA單鏈斷裂是常見的損傷，其中一部分可僅由DNA連接酶(ligase)參與而完全修復(fù)。此酶在各類生物各種細(xì)胞中都普遍存在，修復(fù)反應(yīng)容易進(jìn)行。但雙鏈斷裂幾乎不能修復(fù)。3.堿基的直接插入

DNA鏈上嘌呤的脫落造成無嘌呤位點，能被DNA嘌呤插入酶(insertase)識別結(jié)合，在K＋存在的條件下，催化游離嘌呤或脫氧嘌呤核苷插入生成糖苷鍵，且催化插入的堿基有高度專一性、與另一條鏈上的堿基嚴(yán)格配對，㈡ 轉(zhuǎn)錄模板

對于不同的基因來說，其轉(zhuǎn)錄信息可以存在于兩條不同的DNA鏈上。能夠轉(zhuǎn)錄RNA的那條DNA鏈稱為有意義鏈(模板鏈）而與之互補的另一條DNA鏈稱為反意義鏈（編碼鏈）。使DNA完全恢復(fù)。4.烷基的轉(zhuǎn)移

在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有一種O6甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶，能直接將甲基從DNA鏈鳥嘌呤O6位上的甲基移到蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基上而修復(fù)損傷的DNA。這個酶的修復(fù)能力并不很強(qiáng)，但在低劑量烷化劑作用下能誘導(dǎo)出此酶的修復(fù)活性。

(二)切除修復(fù)(excision repair)①首先由核酸酶識別DNA的損傷位點，在損傷部位的5′側(cè)切開磷酸二酯鍵。不同的DNA損傷需要不同的特殊核酸內(nèi)切酶來識別和切割。②由5′→3′核酸外切酶將有損傷的DNA片段切除。

③在DNA聚合酶的催化下，以完整的互補鏈為模板，按5′→3′方向DNA鏈，填補已切除的空隙

④由DNA連接酶將新合成的DNA片段與原來的DNA斷鏈連接起來。這樣完成的修復(fù)能使DNA恢復(fù)原來的結(jié)構(gòu)。

（三)重組修復(fù)(recombinational repair)受損傷的DNA鏈復(fù)制時，產(chǎn)生的子代DNA在損傷的對應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。另一條母鏈DNA與有缺口的子鏈DNA進(jìn)行重組交換，將母鏈DNA上相應(yīng)的片段填補子鏈缺口處，而母鏈DNA出現(xiàn)缺口 以另一條子鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填補母鏈DNA的缺口，最后由DNA連接酶連接，完成修補。

重組修復(fù)不能完全去除損傷，損傷的DNA段落仍然保留在親代DNA鏈上，只是重組修復(fù)后合成的DNA分子是不帶有損傷的，但經(jīng)多次復(fù)制后，損傷就被“沖淡”了，在子代細(xì)胞中只有一個細(xì)胞是帶有損傷DNA的。

(四)SOS修復(fù)

SOS修復(fù)是指DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷、細(xì)胞處于危急狀態(tài)時所誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式，修復(fù)結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細(xì)胞的生成率，但留下的錯誤較多，故又稱為易誤修復(fù)(error prone repair)，使細(xì)胞有較高的突變率。

Lecture 3 The expression of genetic information 轉(zhuǎn)錄（transcription): 在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA鏈為模板合成RNA，從而將DNA所攜帶的遺傳信息傳遞給RNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄。

經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成的RNA有多種，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA和HnRNA。

第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄

一、轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的比較

（一）轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的相同點

1、均以DNA為模板

2、合成方向是5--3 `

3、服從堿基配對原則

4、均需要依賴DNA的聚合酶

二、轉(zhuǎn)錄作用及其特點 ㈠不對稱轉(zhuǎn)錄

㈡真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都是各種RNA的前體，既無活性，亦物功能，必須在細(xì)胞核內(nèi)加工，形成由活性的RNA后，由核運至細(xì)胞質(zhì)中才能執(zhí)行翻譯功能

三、原核生物RNA的生物合成

㈠ RNA聚合酶（RNA polymerase）

這是一種不同于引物酶的依賴DNA的RNA聚合酶。

該酶在單鏈DNA模板以及四種核糖核苷酸存在的條件下，不需要引物，即可從5'→3'聚合RNA。

原核生物中的RNA聚合酶全酶由五個亞基構(gòu)成，即α2ββ‘σ。σ亞基與轉(zhuǎn)錄起始點的識別有關(guān)，而在轉(zhuǎn)錄合成開始后被釋放，余下的部分（α2ββ'）被稱為核心酶，與RNA鏈的聚合有關(guān)。

㈢轉(zhuǎn)錄過程 1.起始階段

⑴σ因子的識別作用

① RNA鏈的起始通常是在RNA聚合酶所結(jié)合DNA區(qū)域的一端，在解開的雙鏈部分，離-10開始

②處第一個核苷酸通常是pppA或pppG,較少為pppC，但偶而亦可為pppU。大約12或13個堿基處 ③σ因子的解離

RNA鏈的延伸階段開始后，σ因子即從核心酶-DNA-新生RNA復(fù)合體上解離下來，并可再用于和新的核心酶結(jié)合 延長階段

⑴ RNA聚合酶在延伸新生RNA鏈時繼續(xù)使DNA螺旋解鏈，以便暴露出模板鏈，RNA鏈的生長點是大約12bp長的RNA-DNA雜交區(qū) 在RNA鏈離開模板時，此雜交區(qū)即復(fù)原，同時兩條DNA鏈即又重復(fù)螺旋化。終止階段

細(xì)菌DNA中有轉(zhuǎn)錄終止信號，稱為終止子(terminator)終止子的作用是在DNA模板的特異位點處終止RNA的合成。

在終止子處，RNA聚合酶停止其聚合作用，將新生RNA鏈釋出，并離開模板DNA。在某些位點處，終止需要一種輔助蛋白質(zhì)，即ρ因子，但在其他位點處，核心酶本身即可終止轉(zhuǎn)錄。

不依賴ρ因子的終止子有兩個特征:

DNA順序有雙重對稱(dyad)，位于RNA3‘端之前15-20核苷酸處；

DNA模板鏈中有一串約6個A，轉(zhuǎn)錄為RNA3'端的U。雙重對稱的意義在于其轉(zhuǎn)錄本能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

依賴ρ的終止子沒有不依賴ρ的終止子特有的多聚dA序列，并且也不是都能形成穩(wěn)定的發(fā)夾。

ρ因子的作用機(jī)制，但有幾種可能性

ρ因子在RNA的存在下能水解ATP，說明它能與新生RNA鏈結(jié)合，并可能應(yīng)用ATP放出的能量將RNA鏈從酶和模板中釋出。ρ因子可能與RNA聚合酶結(jié)合。

編碼ρ因子的基因rho發(fā)生突變時產(chǎn)生的某些ρ蛋白質(zhì)僅能在RNA聚合酶的β亞基也發(fā)生相應(yīng)突變時才能有RNA合成的活性。

已知RNA聚合酶本身能識別DNA模板中依賴ρ的終止順序，而ρ因子是在以后才發(fā)揮作用而釋出RNA的。即使是在沒有ρ時，RNA聚合酶也在依賴ρ的終止子處暫停，不過以后仍繼續(xù)向前進(jìn)。

四、真核生物的轉(zhuǎn)錄作用 ㈠ 真核細(xì)胞中的RNA聚合酶

真核生物中的RNA聚合酶可按其對α-鵝膏蕈堿敏感性而分為三種，它們均由10～12個大小不同的亞基所組成，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，其功能也不同

㈡ RNA聚合酶Ⅰ

合成RNA的活性最顯著。它位于核仁中，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄編碼rRNA的基因(稱rRNA)，而細(xì)胞內(nèi)絕大部分RNA是rRNA。

聚合酶Ⅰ不被雙環(huán)八肽──α-鵝膏蕈堿抑制。RNA聚合酶Ⅱ

它位于核漿中，負(fù)責(zé)核內(nèi)不勻一RNA(hnRNA)的合成。而hnRNA是mRNA的前體。它是最直接和遺傳調(diào)節(jié)相關(guān)的酶。

RNA聚合酶Ⅱ的活性均可被低濃度的α-鵝膏蕈堿所迅速抑制 ㈢RNA聚合酶Ⅲ

負(fù)責(zé)合成tRNA和許多小的核內(nèi)RNAs。對α-鵝膏蕈堿的反應(yīng)則不盡相同

在動物細(xì)胞中聚合酶Ⅲ可被高濃度α-鵝膏蕈堿所抑制 在酵母和昆蟲細(xì)胞中則不會被抑制。㈣常用的轉(zhuǎn)錄抑制劑

★轉(zhuǎn)錄單位

真核生物的一個轉(zhuǎn)錄單位就是一個基因，由一個結(jié)構(gòu)基因和相應(yīng)的順式調(diào)控元件組成。

一個轉(zhuǎn)錄單位只有一個結(jié)構(gòu)基因。㈤轉(zhuǎn)錄因子

真核生物在轉(zhuǎn)錄時往往需要多種蛋白質(zhì)因子的協(xié)助。一般可將這些轉(zhuǎn)錄所需的蛋白質(zhì)分為三大類(1)RNA聚合酶的亞基，它們是轉(zhuǎn)錄必須的，但并不對某一啟動子有特異性。(2)某些轉(zhuǎn)錄因子能與RNA聚合酶結(jié)合形成起始復(fù)合物，但不組成游離聚合酶的成分。

這些因子可能是所有啟動子起始轉(zhuǎn)錄所必須的。亦可能僅是轉(zhuǎn)錄終止所必須的。

在這一類因子中，要嚴(yán)格區(qū)分開哪些是RNA聚合酶的亞基，哪些僅是輔助因子，是很困難的。

(3)某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異順序結(jié)合。

如果這些順序存在于啟動子中，則這些順序因子是一般轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)的一部分。如果這些順序僅存在于某些種類的啟動子中，則識別這些順序的因子也只是在這些特異啟動子上起始轉(zhuǎn)錄必須的。

起始階段

RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄起始

RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是hnRNA 真核生物的轉(zhuǎn)錄起始較為復(fù)雜。目前已知RNA聚合酶Ⅱ至少有六種不同的蛋白因子參與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成。這些蛋白因子被稱為轉(zhuǎn)錄因子（transcriptional factor, TF)。包括 TFⅡA，TFⅡB，TFⅡD，TFⅡE，TFⅡF，TFⅡ-I。終止階段

RNA轉(zhuǎn)錄合成的終止機(jī)制有兩種：

1．自動終止：模板DNA鏈在接近轉(zhuǎn)錄終止點處存在相連的富含GC和AT的區(qū)域，使RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成寡聚U及發(fā)夾形的二級結(jié)構(gòu)，引起RNA聚合酶變構(gòu)及移動停止，導(dǎo)致RNA轉(zhuǎn)錄的終止。2．依賴輔助因子的終止：由終止因子(ρ因子)識別特異的終止信號，并促使RNA的釋放。

真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后的加工修飾

一、mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 1．加帽(adding cap)：

即在mRNA的5'-端加上m7GTP的結(jié)構(gòu)。此過程發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，即HnRNA即可進(jìn)行加帽。加工過程首先是在磷酸酶的作用下，將5'-端的磷酸基水解，然后再加上鳥苷三磷酸，形成GpppN的結(jié)構(gòu)，再對G進(jìn)行甲基化。

2．加尾(adding tail)：

這一過程也是細(xì)胞核內(nèi)完成，首先由核酸外切酶切去3'-端一些過剩的核苷酸，然后再加入polyA。polyA結(jié)構(gòu)與mRNA的半壽期有關(guān)。3．剪接（splicing)：

真核生物中的結(jié)構(gòu)基因基本上都是斷裂基因。結(jié)構(gòu)基因中能夠指導(dǎo)多肽鏈合成的編碼順序被稱為外顯子，而不能指導(dǎo)多肽鏈合成的非編碼順序就被稱為內(nèi)含子。

第二節(jié) 翻譯

翻譯（translation）

蛋白質(zhì)的生物合成過程，就是將DNA傳遞給mRNA的遺傳信息，再具體的解譯為蛋白質(zhì)中氨基酸排列順序的過程，這一過程被稱為翻譯 蛋白質(zhì)合成體系

① mRNA：作為蛋白質(zhì)生物合成的模板，決定多肽鏈中氨基酸的排列順序； ② tRNA：搬運氨基酸的工具；

③ 核蛋白體：蛋白體生物合成的場所； ④ 酶及其他蛋白質(zhì)因子； ⑤ 供能物質(zhì)及無機(jī)離子。

一、mRNA

作為指導(dǎo)蛋白質(zhì)生物合成的模板。mRNA中每三個相鄰的核苷酸組成三聯(lián)體，代表一個氨基酸的信息，此三聯(lián)體就稱為密碼(coden)。共有64種不同的密碼。

遺傳密碼具有以下特點：

① 連續(xù)性； ② 簡并性； ③ 通用性；（但在線粒體或葉綠體中特殊）④ 方向性，即解讀方向為5′→ 3′； ⑤ 擺動性；

⑥ 起始密碼：AUG；終止密碼：UAA、UAG、UGA。

二、tRNA

在氨基酸t(yī)RNA合成酶催化下，特定的tRNA可與相應(yīng)的 氨基酸結(jié)合，生成氨基酸t(yī)RNA，從而攜帶氨基酸參與蛋白質(zhì)的生物合成。tRNA反密碼環(huán)中部的三個核苷酸構(gòu)成三聯(lián)體，可以識別mRNA上相應(yīng)的密碼，此三聯(lián)體就稱為反密碼(anticoden)。

反密碼對密碼的識別，通常也是根據(jù)堿基互補原則，即A—U，G—C配對。但反密碼的第一個核苷酸與第三核苷酸之間的配對，并不嚴(yán)格遵循堿基互補原則。如反密碼第一個核苷酸為Ⅰ，則可與A、U或C配對，如為U，則可與A或G配對，這種配對稱為不穩(wěn)定配對。

三、rRNA和核蛋白體

原核生物中的核蛋白體大小為70S，可分為30S小亞基和50S大亞基。小亞基：由16SrRNA和21種蛋白質(zhì)構(gòu)成。大亞基：由5SrRNA，23SRNA和35種蛋白質(zhì)構(gòu)成。

真核生物中的核蛋白體大小為80S，也分為40S小亞基和60S大亞基。小亞基：由18SrRNA和30多種蛋白質(zhì)構(gòu)成。大亞基：則由5S rRNA，28S rRNA和50多種蛋白質(zhì)構(gòu)成

蛋白質(zhì)生物合成過程包括三大步驟： ①氨基酸的活化與搬運；

②活化氨基酸在核蛋白體上的縮合； ③多肽鏈合成后的加工修飾。

一、氨基酸的活化與搬運

氨基酸的活化以及活化氨基酸與tRNA的結(jié)合，均由氨基酰tRNA合成酶催化完成。其反應(yīng)過程為：

（一）起動階段

1．40S起動復(fù)合物的形成：

在起動因子的促進(jìn)下，40S小亞基與mRNA的起動部位，起動tRNA

（fmet-tRNAfmet），和GTP結(jié)合，形成復(fù)合體。

原核mRNA的起動部位由一段富含嘌呤的特殊核苷酸順序組成，稱為SD序列（核蛋白體結(jié)合位點，RBS），可被核蛋白體小亞基辨認(rèn)結(jié)合。真核生物中的mRNA具有帽子結(jié)構(gòu)，已知需一種特殊的帽子結(jié)合蛋白（CBP）以識別此結(jié)構(gòu)。

2．80S起動前復(fù)合體的形成：IF3從40S起動復(fù)合體上脫落，60S大亞基與復(fù)合體結(jié)合，形成80S起動前復(fù)合

（二）肽鏈延長階段

1．進(jìn)位：與mRNA下一個密碼相對應(yīng)的氨基酰tRNA進(jìn)入核蛋白體的受位。此步驟需GTP，Mg2+，和EF參與。2．成肽：

在轉(zhuǎn)肽酶的催化下，將給位上的tRNA所攜帶的甲酰蛋氨酰基或肽酰基轉(zhuǎn)移到受位上的氨基酰tRNA上，與其α-氨基縮合形成肽鍵。此步驟需Mg2+，1973年S.Cohen 也成功的進(jìn)行了另一個體外重組實驗，他將編碼有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌R6-5質(zhì)粒DNA與編碼有四環(huán)素抗性基因的另一種大腸桿菌質(zhì)粒pSC101 DNA混合后加入內(nèi)切酶EcoRI對DNA進(jìn)行切割，再用T4連接酶將它們連接成重組分子，用這種連接后的重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，某些轉(zhuǎn)化菌落表現(xiàn)出了既抗卡那霉素又抗四環(huán)素的雙重抗性特征。

以上兩個實驗帶給人們的啟示：

DNA是可以在體外進(jìn)行切割和拼接的

利用細(xì)菌細(xì)胞可以快速的復(fù)制DNA并能夠合成蛋白質(zhì)。這兩個實驗也標(biāo)致著基因工程技術(shù)的誕生 K+。給位上已失去蛋氨酰基或肽酰基的tRNA 3．移位：

核蛋白體向mRNA的3'-端滑動相當(dāng)于一個密碼的距離，同時使肽酰基tRNA從受體移到給位。此步驟需EF（EFG）、GTP和Mg2+參與。此時，核蛋白體的受位留空，與下一個密碼相對應(yīng)的氨基酰tRNA即可再進(jìn)入，重復(fù)以上循環(huán)過程，使多肽鏈不斷延長。

（三）肽鏈終止階段

核蛋白體沿mRNA鏈滑動，不斷使多肽鏈延長，直到終止信號進(jìn)入受位。1．識別：RF識別終止密碼，進(jìn)入核蛋白體的受位。

2．水解：RF使轉(zhuǎn)肽酶變?yōu)樗饷福嚯逆溑ctRNA之間的酯鍵被水解，多肽鏈釋放。

3．解離：通過水解GTP，使核蛋白體與mRNA分離，tRNA、RF脫落，核蛋白體解離為大、小亞基。

分子生物學(xué)研究的對象 蛋白質(zhì)和核酸

對核酸、蛋白質(zhì)的研究積累為分子生物學(xué)技術(shù)的成熟打下了重要性的基礎(chǔ)。

70年代初是分子生物學(xué)成熟標(biāo)致的重要時期，因為誕生了分子生物學(xué)應(yīng)用的一個重要學(xué)科——基因工程。

80年代誕生的PCR技術(shù)將復(fù)雜的分子生物學(xué)技術(shù)簡單化了，便得更加容易推廣和應(yīng)用。使得分子生物學(xué)技術(shù)一下普及到了一般的實驗室。PCR技術(shù)，又稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它利用一對特異性的引物和耐高溫的DNA聚合酶，在短短的2-3小時內(nèi)將一段DNA擴(kuò)增到1000萬倍，對實驗室的條件的要求也降到最低點。

1990年開始的“人類基因組計劃”將分子生物學(xué)帶入到一個高通量的發(fā)展時代。生命科學(xué)進(jìn)入到了基因組和后基因組時代。

基因工程genetic engineering

1.基因工程誕生的理論基礎(chǔ)

基因工程的誕生依賴于在此之前生命科學(xué)基礎(chǔ)理論的發(fā)展成就，概括起來主要包括三個方面：

⑴ 40年代確定了遺傳物質(zhì)是DNA，它是遺傳信息的載體。

⑵ 50年代發(fā)現(xiàn)DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)并揭示了半保留復(fù)制的機(jī)理，揭示了基因的自我復(fù)制和表達(dá)的機(jī)理。

⑶ 50年代末至60年代初，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說，并成功破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問題。2．工具酶的發(fā)現(xiàn)為基因工程的誕生奠定了技術(shù)的基礎(chǔ)： 3．基因工程的誕生

1972年H.Boyer 和 P.Berg 第一次完成了DNA的體外重組實驗，用E.coRI在體外對SV40的DNA和λ噬菌體的DNA進(jìn)行了消化，然后用T4連接酶將消化后的DNA片段進(jìn)行了連接，結(jié)果獲得了重組的雜種DNA分子。

基因工程所使用的名稱：

重組DNA技術(shù)(recombinant DNA technique)遺傳工程(genetic engineering)基因工程(gene engineering)基因操作(gene manipulation)基因克隆(gene cloning)

分子克隆(molecular cloning)基因工程的基本內(nèi)容：

1．將兩種不同來源的DNA－－即目的DNA和載體DNA提取純化。2．用限制性內(nèi)切酶處理DNA。

3．用連接酶將切開的不同源的DNA連接到一起，構(gòu)成重組DNA。4．將重組DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。

5．通過大量的培養(yǎng)細(xì)菌，以達(dá)到擴(kuò)增目的基因或表達(dá)蛋白的目的。

基因工程的目的： 進(jìn)行分子克隆

表達(dá)重組基因所編碼的蛋白質(zhì)

工具酶

一、限制酶(restriction enzyme)

?

全稱限制性核酸內(nèi)切酶、簡稱限制酶或內(nèi)切酶。

1． 限制酶的分類

限制酶有三種：I型、II型、III型。2.限制酶的命名

一般的限制酶通常由四個拉丁文字母組成第1個字母代表產(chǎn)生該酶的細(xì)菌的屬名，第2、3個字母代表產(chǎn)生該酶的細(xì)菌種名

第4個字母代表產(chǎn)生該酶的菌株號。

3.限制酶的識別和切割位點

根據(jù)Ⅱ型酶種類割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口： ⑴產(chǎn)生平末端

⑵產(chǎn)生5’端突出的粘性末端 ⑶產(chǎn)生3’端突出的粘性末端 6.限制酶使用的條件 ⑴ 緩沖系統(tǒng)：

50mmol/L tris.Cl 10mmol/L Mg++ 1mmol/L DTT NaCl ⑵ 反應(yīng)體積

⑶ 反應(yīng)溫度和時間 ⑷ 限制酶的商業(yè)化 7.限制酶的商業(yè)化

試劑公司的名稱： Promaga公司 安瑪西亞公司

大連保生物公司 北京賽百勝公司 北京華美公司

購買酶時的注意事項：價格因素 供貨時間 運輸方式

酶的保存

修飾酶

⒈逆轉(zhuǎn)錄酶種類：

禽類成骨細(xì)胞性白血病病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶

小鼠白血病病毒(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶 ⒉ T4DNA連接酶

從噬菌體中提取，用于DNA的連接 ⒊ 堿性磷酸酶

可將DNA或RNA5’的磷酸去除，可用于制止不希望發(fā)生的連接反應(yīng)進(jìn)行。⒋末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶

用于將已標(biāo)記好的單核苷酸加到DAN的3’端上，起到標(biāo)記的作用；有時也可用于DNA片段的同聚尾的形成。

載體(vector)在基因工程中的作用: 將外源DNA插入其中，并一同轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，能夠穩(wěn)定的保存下來，完成外源DNA克隆和表達(dá)的功能。載體所必需的條件

1必須有自身的復(fù)制子，并能攜帶重組DNA一起復(fù)制。2載體分子上必須有限制性內(nèi)切酶位點即多克隆位點。3載體必須具有可供選擇的標(biāo)置，便于重組分子的篩選。

4載體分子盡量小，便于能插入較大的外源DNA，最好是高考貝。5表達(dá)載體必須具備能在宿主細(xì)胞中表達(dá)的能力。

一、常用的克隆載體

㈠質(zhì)粒plasmid 1．質(zhì)粒的一般特點

? 細(xì)菌質(zhì)粒是一些雙鏈閉環(huán)的DNA分子，這些質(zhì)粒都是獨立于染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的輔助性遺傳單位。通常，質(zhì)粒含編碼某些基因的酶，這些酶在一定環(huán)境下對宿主細(xì)胞有利。由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型對抗生素的抗性、產(chǎn)抗生素、降解復(fù)雜有機(jī)化合物，以及產(chǎn)生大腸桿菌素，及限制酶、修飾酶等。

? 質(zhì)粒都帶有獨立的復(fù)制子，能獨立的自我復(fù)制。但在復(fù)制時必須依賴宿細(xì)菌的酶。

?

質(zhì)粒的不親和性(不相容性)

質(zhì)粒的三種狀態(tài)

松馳型和嚴(yán)緊型 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性

多數(shù)質(zhì)粒在自然條件下可以通過細(xì)菌結(jié)合的作用轉(zhuǎn)移到新的宿細(xì)胞中。然而，由于質(zhì)粒缺少一種轉(zhuǎn)移所必須的mob基因，因此不能獨立的從一個細(xì)菌到另一個細(xì)菌的接合轉(zhuǎn)移。選擇標(biāo)記

質(zhì)粒載體的發(fā)展經(jīng)歷了三個階段：

第一階段：將選擇標(biāo)記引入含有復(fù)制子的質(zhì)粒中。

最早用作克隆載體的質(zhì)粒子有多種局限性：復(fù)制效率低；帶有不適合的選擇標(biāo)記；酶切位點少且不集中等，pBR322是早期最為成功的將所有理想的特性囊括于一身的質(zhì)粒載體。第二階段：高效型載體的發(fā)展

發(fā)展的趨勢是調(diào)整載體的結(jié)構(gòu)，提高載體的效率，減少載體的長度，擴(kuò)充載體的容納外源DNA的能力。這期間質(zhì)粒的代表是：pUC19等。第三階段：引入多種用途的輔助序列

這些用途包括通過組織化學(xué)檢測方法肉眼鑒定重組克隆，產(chǎn)生用于序列分析的單鏈DNA，外源蛋白的大量表達(dá)等用途的質(zhì)粒載體。

㈡λ噬菌體

1．λ噬菌體分子生物學(xué)

λ噬菌體的基因組是一長度50kb的雙鏈DNA，其末端為長12bp的天然互補單鏈（粘端）。當(dāng)它進(jìn)入宿細(xì)胞后其粘端會配對結(jié)合成環(huán)形，它在侵入宿細(xì)胞后可以兩種方式進(jìn)行復(fù)制：

裂解性生長 溶源性生長

2．λ噬菌體作為載體所具有的特征

不利因素：野生型λ噬菌體有一個龐大的基因組，其DNA可分為頭部、中央部分和尾部三個部分。其基因組由頭部（由7個基因組成）、尾部（由11個基因組成）、重組基因（5個基因和一個識別位點）、正調(diào)控基因（2個基因）、負(fù)調(diào)控基因（5個基因）、DNA合成基因（2個基因）、裂解基因（2個基因）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及識別位點組成。在沒有改造的情況下，λ噬菌體無法插入較大的外源DNA片段，無較集中的酶切位點和好的識別標(biāo)置。3．λ噬菌體載體的改造：

在λ噬菌體DNA的中央部分（約占30%）是其生長的非必須區(qū)，當(dāng)外源基因取代該區(qū)或該區(qū)缺失時，對噬菌體的生長不會造成影響。此外，外源基因不超過其本身的10倍數(shù)時，均可被包裝為成熟顆粒，具有噬菌體活性。

目前使用的λ噬菌體載體都經(jīng)過了改造，在其中加上了較集中的酶切位點、還加上了細(xì)菌的啟動子，這不僅使其具有擴(kuò)增外源DNA的能力，還使它能夠表達(dá)外源基因的產(chǎn)物。

λ噬菌體的用途： λ噬菌體主要用于cDNA文庫的構(gòu)建。㈢粘性質(zhì)粒

粘性質(zhì)粒是一種將λ噬菌體和質(zhì)粒兩種載體結(jié)合起來形成的一種人工載體。它具有如下特征：

⑴含有質(zhì)粒的抗藥性標(biāo)記，如Ampr基因。

⑵載體帶有噬菌體的cos區(qū)，所以對其進(jìn)行體包裝是必不可少的。

⑶具有多克隆位點。

⑷形體本身的體積很小，但容量大，可插入40kb大小的DNA片段。

⑸一般非重組的載體體積小，而無法進(jìn)行體外包裝，因而無法轉(zhuǎn)染細(xì)菌，只有包裝了的重組體才能進(jìn)入細(xì)菌，有利于篩選。㈣M13噬菌體

M13噬菌體是一種大腸桿菌的噬菌體它在轉(zhuǎn)染大腸桿菌后進(jìn)行一段時間的復(fù)制后開始進(jìn)行不對稱復(fù)制，而形成大量的單鏈DNA，而后將這些單鏈DNA進(jìn)行包裝病毒顆粒后釋放到細(xì)菌外，利用這一特點，可大量克隆單鏈的DNA分子用于制備核酸探針和DNA測序的材料。㈤大容量測序用載體

在基因組學(xué)的研究中，需要將基因組的DNA片段切割成較的片段進(jìn)行測序，以此來提高測序的速度。但我們前面提到的載體一般都無法滿足這一需要，為了達(dá)到這一目的，人們開發(fā)出了酵母人工染色體(YAC)和細(xì)菌人工染色體(BAC)，前者可容納100萬個堿基的DNA片段，后者可容納30萬個堿基的DNA片段。

載體的表達(dá)

用于目的基因的表達(dá)。可分為大腸桿菌表達(dá)載體和哺乳動物表達(dá)載體。㈠大腸桿菌表達(dá)載體

一般具備有細(xì)菌轉(zhuǎn)錄的啟動子，可人為的進(jìn)行操縱，如多數(shù)質(zhì)粒載

體中都帶有乳糖操縱子的啟動子，能在乳糖存在的情況進(jìn)行誘表達(dá)。㈡哺乳動物表達(dá)載體

多數(shù)是一些真核細(xì)胞病毒經(jīng)過改造而成形的。

重組DNA技術(shù)的基本過程

一、目的基因的制備 ㈠傳統(tǒng)的辦法 1.制備基因組DNA 將整個一個物種的基因組提取出來后用于基因工程的操作。常用于建立基因文庫。

2.制備cDNA文庫,并從中篩選目的基因

將一個物種或細(xì)胞中的全部RNA提取出來再從中提取mRNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶將其合成為cDNA，再將其重組于載體后，轉(zhuǎn)錄到大腸桿菌后形成cDNA文庫。

㈡制備用于表達(dá)的基因片段 ⒈直接用限制性酶切取

⒉用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增目的基因 ⒊化學(xué)合成

㈢利用生物信息學(xué)的技術(shù)和原理來選擇目的片段

是現(xiàn)在最普遍使用及最為方便的手段

二、載體的選擇和制備

載體均是商品，根據(jù)實驗的目的來選擇合適的載體，如分子克隆、表達(dá)、測序或長期保存目的基因等。即可以購買，也可以索求

三、DNA分子體外重組 基因工程的策略

?確定重組實驗的目的——是獲得目的基因，還是獲得表達(dá)產(chǎn)物。

?根據(jù)經(jīng)濟(jì)情況選擇合適的用品——包括質(zhì)粒（可以買成品，也可以向人索取質(zhì)粒自己提取）、酶的選擇等。

?制定周密的實驗計劃，基因工程的實驗周期都比較長，如計劃不周，將造成時間和經(jīng)濟(jì)上的損失。

?酶切位點的選擇 選擇合適的連接方式

四、將外源重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞

㈠轉(zhuǎn)化：主要指將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)菌的過程。通常是先將細(xì)菌細(xì)胞制備成感受態(tài)的菌，然后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

轉(zhuǎn)化常用的方法有兩種：化學(xué)轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)移

㈡轉(zhuǎn)染：主要指將噬菌體和病毒轉(zhuǎn)入細(xì)胞的過程。

五、目的基因的篩選和鑒定

篩選和鑒定的方式有許多種，要仿照最初的實驗方案來確定。常用的方式有：

用抗生素選擇培養(yǎng)基來篩選

用藍(lán)白斑選擇培養(yǎng)基來篩選

根據(jù)酶切方案來篩選

直接提取質(zhì)粒來篩選

提取質(zhì)粒和酶相結(jié)合來篩選

分子雜交 DNA測序

在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1.基因工程用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物

治療糖尿病的胰島素，是一種 51 個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)1982 年美國 EliLilly 公司推出基因工程制造的人胰島素，商品名為(Humulin)。干擾素用于治療肝炎等病毒感染性疾病，有良好療效。升發(fā)酵液中所得的干擾素相當(dāng)于過去從 1000 升人血中所得。生產(chǎn)成本也大為降低。

目前用基因工程生產(chǎn)的蛋白質(zhì)藥物已達(dá)數(shù)十種，許多以前本不可能大量生產(chǎn)的生長因子，凝血因子等蛋白質(zhì)藥物，現(xiàn)在用基因工程辦法便可能大量生產(chǎn)。

正在開發(fā)的350種生物技術(shù)藥物中，1/3以上用于腫瘤，其中有30種用于黑素瘤，20種用于結(jié)直腸癌，13種用于乳腺癌，13種用于前列腺癌。

正在開發(fā)的疫苗有77種，用于預(yù)防或治療HIV感染、AIDS、結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、多發(fā)性硬化、中風(fēng)。

正在開發(fā)的生物技術(shù)藥物中，有29種用于HIV感染、AIDS和AIDS相關(guān)疾病；19種用于自身免疫性疾病，其中11種用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、3種用于狼瘡；8種用于血液疾病，其中4種用于血友病，一種用于鐮形細(xì)胞性貧血。

2.基因工程用于疫苗生產(chǎn)

常用的制備疫苗的方法，一種是弱毒活疫苗，一種是死疫苗。兩種疫苗各有自身的弱點。活疫苗隱含著感染的危險性。死疫苗免疫活性不高，需加

大注射量或多次接種。

利用基因工程制備重組疫苗，可以克服上述缺點，亞基疫苗指只含有病原物的一個或幾個抗原成分，不含病原物遺傳信息。重組亞基疫苗就是用基因工程方法，把編碼抗原蛋白質(zhì)的基因重組到載體上去，再送入細(xì)菌細(xì)胞或其他細(xì)胞中區(qū)大量生產(chǎn)。這樣得到的重組疫苗往往效價很高，但決無感染毒性等危險。

在酵母中表達(dá)乙型肝炎表面抗原 HBsAg 產(chǎn)量可達(dá)每升 2.5mg，已于 1984 年問世。

基因工程生產(chǎn)疫苗有良好的發(fā)展前景。3.基因工程用于基因治療

人體基因的缺失，導(dǎo)致一些遺傳疾病，應(yīng)用基因工程技術(shù)使缺失的基因歸還人體，達(dá)到治療的目的，已成為基因工程在醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用的又一重要內(nèi)容。

分子生物學(xué)常用技術(shù)

核酸的分子雜交Nucleic acid hybridization 分子雜交的原理：

DNA具有變性的特點 變性的DNA還能復(fù)性

分子雜交的概念 用已知的DNA序列制成探針，來檢測末知的樣本DNA。

核酸分子雜交的基本過程:

首先要確定檢測的目標(biāo)，即檢測的目的核酸片段，這個片段的序列必須是已知的。

根據(jù)此設(shè)計一個探針（與檢測目的核酸互補的序列），并對其進(jìn)行合成和標(biāo)記。

再通過雜交實驗來完成探針對目的核酸的檢測。

分子雜交的形式：

液相雜交 固相雜交 固相雜交的一般過程

1.首先設(shè)計、合成探針。2.收集標(biāo)本，并提取核酸。

3.將提好的核酸樣本點到固相支持物上。4.封閉。

5.通過變性和復(fù)性完成雜交。6.漂洗

7.放射自顯影

核酸分子雜交技術(shù)的演變

斑點雜交 southern blot northern blot 原位雜交 芯片技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) Polymerase chain reaction(PCR)PCR技術(shù)的形成及發(fā)展

PCR的實現(xiàn) 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供一種合適的條件——摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時間, 合成DNA的原料。

PCR的改進(jìn)與完善

Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環(huán)都要重新加。②引物鏈延伸反應(yīng)在37℃下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術(shù)雖較傳統(tǒng)的基因擴(kuò)增具備許多突出的優(yōu)點，但由于Klenow酶不耐熱，在DNA模板進(jìn)行熱變性時，會導(dǎo)致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴(kuò)增反應(yīng)周期，給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時間內(nèi)沒能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視

1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%，在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%，在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③大大提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率，增加了擴(kuò)增長度(2.0Kb)。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區(qū)別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)為PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。PCR 技術(shù)的實驗原理

模擬細(xì)胞內(nèi)DNA合成的過程

利用了DNA變性、復(fù)性和能進(jìn)行雜交的特點，在引物存在的條件下DNA聚合酶開始對DNA進(jìn)行體外合成。

通過全自動的熱循環(huán)儀來完成 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點

PCR反應(yīng)的基本條件

模板的制備: 模板是進(jìn)行DNA體外擴(kuò)增的依據(jù)，它的來源于不同的材料。PCR對模板的質(zhì)量要求很高，但對它量的要求不高。

制備模板的材料：

新鮮材料：人或動物的血液及組織中提取；

從少量材料：痰、尿液、腹腔液等;法醫(yī)學(xué)的材料：血斑、精斑等；

考古材料

從以往保存的材料，如石蠟切片的蠟塊中。

提取的原理和方法：（略）

引物的設(shè)計：

引物的設(shè)計首先要依據(jù)你已知的序列來設(shè)計。即你要擴(kuò)增的目的DNA片段。這些資料可以從文獻(xiàn)上查找或從互聯(lián)網(wǎng)上來檢索。

實際做的過程中，引物也可借助于別人已經(jīng)發(fā)表的引物來。但從經(jīng)驗上說，別人公開發(fā)表的引物常常含有一定的錯誤。所以要進(jìn)行核查。

設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

⑤引物-3’端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物 量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。

PCR所用試劑： DNA聚合酶

buffer:包括兩種，一種是含Mg++，一種是不含Mg++。dNTPs 純凈水

自己要準(zhǔn)備的模板DNA的制備和引物的設(shè)計與合成。PCR的操作過程

設(shè)定一個加樣配方： 標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：

10×擴(kuò)增緩沖液 5ul

4種dNTP混合物

各200umol/L

引物

各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至 50ul

加樣：

單樣本加樣

多樣本加樣

加樣的順序 PCR反應(yīng)條件的設(shè)定：

預(yù)就性溫度： 94℃，5分

變性溫度： 94℃，30秒

退火溫度： 需要摸條件

延伸溫度： 72℃，30秒

總延伸溫度： 72℃，15分

PCR結(jié)果的鑒定

通過凝膠電泳的方式來進(jìn)行。

RT-PCR(reverse transcription-PCR)RT－PCR技術(shù)的應(yīng)用

用于制備基因工程的目的基因片段。

用于表達(dá)譜的檢測。PCR技術(shù)的應(yīng)用

PCR的初衷是為特異性的擴(kuò)增某段DNA

現(xiàn)在PCR在醫(yī)學(xué)研究中主要是用于基因診斷，常用于：

對遺傳病的突變基因進(jìn)行診斷

對病原體的基因診斷

通過PCR結(jié)合限制酶切的診斷 SSCP技術(shù)進(jìn)行點突變的診斷 RT-PCR進(jìn)行結(jié)構(gòu)基因的擴(kuò)增及定量表達(dá) 熒光定量PCR技術(shù)

PCR結(jié)合多態(tài)性分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析有2種情況：

限制片段多態(tài)性分析(A)、(B)重復(fù)序列多態(tài)性分析(A)、(C)SSCP技術(shù)進(jìn)行點突變的診斷 實時熒光定量PCR技術(shù)

電泳技術(shù)electrophoresis technology 核酸的凝膠電泳

一、基本原理

1．核酸分子在水溶液中呈多聚陰離子。加上電場，它們會向正電極的方向遷移。2．在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。

3．電泳環(huán)境的影響：緩沖液的組成和離子強(qiáng)度直接影響遷移速度。

當(dāng)電泳緩沖液中無離子時，溶液導(dǎo)電性極小，電泳速度慢。當(dāng)電泳緩沖液中離子濃度極強(qiáng)時，則導(dǎo)電性極高，并易產(chǎn)熱。

pH值也影響遷移率，溶液的pH遠(yuǎn)離樣品的等電點時，樣品顆粒的電離程度大，相應(yīng)的電泳速率就大。凝膠的濃度的不同對同樣大小顆粒的電泳速

率也不相同，因此，不同濃度的凝膠分辨DNA分子大小的能力也不同。

表：瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力

凝膠類型及結(jié)構(gòu) 分離DNA片段的大小范圍(bp)0.3%瓊脂糖 50 000-1 000 0.7%瓊脂糖 20 000-1 000 1.4%瓊脂糖 6 000-300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000-100 10.0%聚丙烯酰胺 500-25 20.0%聚丙烯酰 50-1

4．凝膠電泳的目的：

可將大小不等的DNA片段和蛋白分子進(jìn)行分離，并通過標(biāo)準(zhǔn)分子量基本原理：

maker鑒定其大小。

對所要的目的分子進(jìn)行純化提取。

二、瓊脂糖凝膠電泳 Agarose Gel Electrophoresis 瓊脂糖是從海藻中提取出的長鏈狀多聚糖，當(dāng)它被加熱到90℃時可被溶解成半透明的液體，這時便于澆板并在冷卻后固化成凝膠。其凝固點這40-45℃。

瓊脂糖電泳的優(yōu)點：操作方便，并可用來鑒定和純化特定的DNA分子。

用低溶點瓊脂糖來分離并純化DNA。

瓊脂糖電泳的不足之處：它的分辨范圍在0.3-50kb之間，對一些分辨更小DNA分子的實驗將無法進(jìn)行。

瓊脂糖電泳結(jié)果的顯示：

利用核酸與溴化乙錠吸附性強(qiáng)的特點，用溴化乙錠來顯色。

三、聚丙烯酰胺凝膠電泳

(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)電泳材料：

丙烯酰胺

CH2═CH─C—NH2 ║ O N,N?ˉ-亞甲雙丙烯酰胺

H H │ │ CH2═CH─C—N—CH2—N—CH═CH2 ║ O 兩種丙烯酰胺在促凝劑存在的條件下可以凝集成膠。

PAGE的優(yōu)點和不足：優(yōu)點是分辨率高，不足是操作復(fù)雜，成本高。PAGE的凝膠可用溴化乙錠染色，也可以銀染，后者的分辨率高。

四、SDS-變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

(SOS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)

SDS-PAGE專門用于蛋白質(zhì)電泳。

基本原理：在蛋白質(zhì)電泳前，先將其變性成線結(jié)構(gòu)，并使其表面都吸附上帶負(fù)電荷的活性分子-----SDS。

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)

Western blotWestern blot 技術(shù)是借鑒了Southern blot 技術(shù)的原理而設(shè)計。它也是在凝膠電泳后通過轉(zhuǎn)移電泳將電泳分離物移到固相支持物上再進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

與Southern blot不同的是，它用來雜交的不是探針，而是特異性的物體。

Western blot的基本過程

先通過SDS-PAGE將樣本中的蛋白質(zhì)分離

通過轉(zhuǎn)移電泳將凝膠上的樣本移到硝酸纖維膜上 封閉硝酸纖維膜

用一抗來特異性的識別目標(biāo)蛋白 用酶標(biāo)二抗來識別一抗 顯色

DNA序列分析

Sanger雙脫氧終止法(手工測序)基本原理：

DNA在復(fù)制時，需要兩個單核苷酸之間脫去一分子水后形成磷酸二酯鍵。如果在其中加入雙脫氧的單核苷酸，將中止DAN的復(fù)制。通過自動化的DNA測序儀來進(jìn)行測序

二、基因組的大規(guī)模的測序列 新一代測技術(shù)的出現(xiàn)

第二代測序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis)，即通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定DNA的序列，現(xiàn)有的技術(shù)平臺主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。

酶聯(lián)免疫吸附分析Enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA)

通過免疫學(xué)技術(shù)(抗原、抗體反應(yīng))對樣本中的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行特異性的定性或定量分析。被檢測的蛋白質(zhì)即可能是抗原，也可以是抗體。基本過程：

1.將抗體或抗原結(jié)合到固相支持物上

2.用特異性的抗原或抗體(被酶標(biāo)記)對其進(jìn)行免疫識別。3.通過酶標(biāo)儀來檢測結(jié)果

ELISA常用的方法有：

雙抗體夾心法

間接法

一、轉(zhuǎn)基因技術(shù) 1.轉(zhuǎn)基因技術(shù)的概念

轉(zhuǎn)基因技術(shù)指的是將一個物種的特定基因通過人工的方法轉(zhuǎn)入到另一種生物的細(xì)胞中，并使它獲得了轉(zhuǎn)入基因的特性。

2.轉(zhuǎn)基因技術(shù)的類型

轉(zhuǎn)基因技術(shù)可分多個層次：

廣義的講，最基本的轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是基因工程，即將高等生物的基因通過體外重組后，轉(zhuǎn)化入細(xì)菌或酵母細(xì)胞。

真正意義上的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因動物。它們多是將外源基因注入生殖細(xì)胞或受精卵子中，并讓外源基因整合到其基因組中，并使其在胚胎及發(fā)育成熟的個體中獲得表達(dá)，形成具有新特性的個體。

三、轉(zhuǎn)基因動物 transgenic animal

1．轉(zhuǎn)基因動物的簡史

1980年，J.W.Gordon等人首次報道用顯微注射的方法向小鼠胚胎注射純化的DNA，開辟了轉(zhuǎn)基因動物研究的先河。

1982年，R.D.Palmiter等又報道用轉(zhuǎn)移生長激素基因的方法，獲得了7只轉(zhuǎn)基因鼠，其中1只比一般小鼠大一倍，被稱為巨鼠，引起極大的轟動。相繼有轉(zhuǎn)基因豬、魚、兔和羊等問世。

2．轉(zhuǎn)基因動物研究概況

⑴轉(zhuǎn)基因動物在培育新品種中的應(yīng)用

在轉(zhuǎn)基因動物歷史上，培育高效益的家畜、家禽和水生動物新品種曾經(jīng)是研究工作的主流。受“巨鼠”的影響，人們期望能通過轉(zhuǎn)基因動物的研究，獲得快速生長、節(jié)約飼料、產(chǎn)毛多、產(chǎn)蛋多和抗病的動物新品種。

主要是將生長激素和類胰島激素的基因轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)，并且取得了良好的增長效果，但也表現(xiàn)出一系列病理性副作用，關(guān)節(jié)炎和胃病尤其明顯。但轉(zhuǎn)基因魚是一個例外。

⑵動物生物反應(yīng)器(animal bioreactor)用動物乳腺生產(chǎn)醫(yī)用蛋白質(zhì)的優(yōu)點：

動物乳腺是一個自我封閉的系統(tǒng)，它表達(dá)的蛋白質(zhì)絕大多數(shù)不會回到血液循環(huán)系統(tǒng)中去，可以避免大量表達(dá)的外源蛋白質(zhì)對動物的健康造成危害。

乳腺組織是一種有效的蛋白質(zhì)合成器，一頭奶牛一年可產(chǎn)乳蛋白250-300千克，一只羊一年可產(chǎn)乳蛋白25-30千克。如果把百分之一的乳蛋白代換為醫(yī)用蛋白質(zhì)，產(chǎn)量十分可觀。

乳腺組織可以對人體蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的修飾和后加工，產(chǎn)品活性接近天然產(chǎn)品。

在動物乳腺表達(dá)的外源基因可以遺傳，一旦獲得成功，可以用常規(guī)畜牧技術(shù)繁殖產(chǎn)生群體。

我國轉(zhuǎn)基因動物研究的領(lǐng)軍人物

——中國工程院院士曾溢滔教授

⑶抗病育種

將具有抗病能力的基因?qū)雱游铮蛊渚哂休^理想的抗病能力。目前已做的工作有：

抗豬瘟育種：

抗流感基因工程育種：1989年Young將INF基因質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠受精卵，獲得表達(dá)，獲得抗病轉(zhuǎn)基因小鼠。

抗腫瘤動物模型：美國首先培育出易發(fā)乳腺癌的轉(zhuǎn)基因小鼠，為研究癌誘發(fā)和抗腫瘤藥物的篩選提供了研究的模型。迄今已培育出許多與癌基因有關(guān)的轉(zhuǎn)基因小鼠。⑷基因治療

⑸組織器官移植：

將人的標(biāo)志基因移入豬，使其器官上具有了人的抗原標(biāo)志，減小了排異反應(yīng)。

3.轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)路線 ⑴經(jīng)典的技術(shù)路線

先從已交配的供體動物的輸卵管中采取受精卵；

顯微注射法向受精卵的雄性核導(dǎo)入人工構(gòu)建的藥物蛋白基因；

經(jīng)外科手術(shù)把已導(dǎo)入外源基因的受精卵移入同步發(fā)情的受體母羊輸卵管內(nèi)；

讓受精卵在“養(yǎng)母”體發(fā)育至分娩出生；

用分子生物學(xué)技術(shù)檢測出生小羊是否已整合了導(dǎo)入的外源基因。

該法的缺點：實驗周期長，注射的外源基因整合率低。

⑵整合胚胎移植技術(shù)路線

該技術(shù)是對前種方法的改進(jìn)。它利用了生殖技術(shù)中的體外受精技術(shù)，使精子和卵子在體外受精；然后找到一個最佳時機(jī)向體外受精的細(xì)胞顯微注射藥物蛋白基因。然后在體對胚胎體進(jìn)行整合的鑒定。從中挑選有目的基因整合的胚胎進(jìn)行移植。采用經(jīng)陰道的非手術(shù)胚胎移植法，減少了對受精卵的損傷。

⑶核移植（克隆）技術(shù)路線

利用克隆技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灐＜丛谶M(jìn)行克隆之前，先目的基因注射到將進(jìn)行移植的核中，在按克隆技術(shù)進(jìn)行操作。其成功率比經(jīng)典技術(shù)路線高2.5倍。

⑷整合卵受精技術(shù)路線

即在受精之前先將藥物蛋白基因注射進(jìn)入卵細(xì)胞，經(jīng)檢測已經(jīng)完成整合后，再進(jìn)行體外受精和胚胎移植。

基因組學(xué)(genomics)功能基因組學(xué)(functional genomics)蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)Genome這個述語是德國遺傳學(xué)家Winkler在1920年創(chuàng)造的。它的含義是指一個細(xì)胞中所含有的全套遺傳信息。也是泛指一個物種中所含的全部的遺傳信息。

基因組學(xué)(genomics)主要是研究一個物種的基因組的組成，包括DNA堿基的排列順序，基因的分布情況。

人類基因組計劃簡介(human genome project, HGP)HGP簡介

人類基因組計劃是由美國科學(xué)家于1985年率先提出、于1990年正式啟動的。美國、英國、法國、德國、日本和我國科學(xué)家共同參與了這一價值達(dá)30億美元的人類基因組計劃。這一計劃旨在為30多億個堿基對構(gòu)成的人類基因組精確測序，發(fā)現(xiàn)所有人類基因并搞清其在染色體上的位置，破譯人類全部遺傳信息。

基因組(Genome):基因組就是一個物種中所有基因的整體組成 人類基因組有兩層意義： ——遺傳物質(zhì) ——遺傳信息

從整體水平研究基因的存在、基因的結(jié)構(gòu)與功能、基因之間的相互關(guān)系

人類基因組計劃的目標(biāo)：

1.測定人類基因組中32億個單核苷酸（堿基）的排列順序。

2.確定各個基因和功能元件在序列中的位置，也就通常說的基因定位。3.確定出與疾病相關(guān)的基因及找出有治療和藥用價值的基因。4.繪制出一個完整的人類基因圖譜。

HGP是如何進(jìn)行的： 1.基因組測序概觀

基因組的測序的基本過程：

①選擇物種

②從細(xì)胞中提取DNA ③把經(jīng)純化的DNA隨機(jī)切割成大小合適的重疊片段

④指導(dǎo)DNA片段插入到載體中，并克隆

⑤測出第一DNA片段的堿基順序

⑥確定片段間的重疊，把序列組裝成最終的基因序列 敲碎基因組，分析研究內(nèi)容所處的染色體位置

2.DNA的測序方法

在發(fā)明自動測序技術(shù)之前，人們用手工進(jìn)行測序，最常用的方法是末端終止法（后面專門介紹）。

手工測序是通過凝膠電泳的手段將DNA片段進(jìn)行分離，然后在膠上“讀出”堿基的排列順序。這就決定了被測序的DNA片段不可能太大，而且效率很低，在20世紀(jì)80年代時，一天只能完成500bp片段的測序工作。

3.自動化測序

1985年Leroy Hood, Lioyd Smith, Mike Hunkapiller發(fā)明了第一臺自動測序儀，每天能測15 000個bp，1998年Hunkapiller領(lǐng)導(dǎo)的小組發(fā)明了一種新的測序列儀——ABI 3700G型DNA分析儀，每天可測多達(dá)400 000bp。測序的自動化推動了HGP的神速發(fā)展，研究人員僅用15個月的時間就完成了人類基因序列的90%。

技術(shù)的改進(jìn)促進(jìn)了測序的發(fā)展，每18個月全世界的測序總量翻一番，而測序成本則減少一半。從20世紀(jì)80年代末期到2001年，測序成本從10美元降到10美分。

4.測序用載體的改進(jìn)

在進(jìn)行基因組測序時，先要將提取的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶切成大小不等的片段，并使每個片段之間能夠出現(xiàn)部分的重疊，然后需將這些片段放入載體大量克隆后才能完成測序的需要。

分子生物學(xué)中常用的載體是質(zhì)粒，它一般能攜帶較小的DNA片段。但在HGP的測序中需要能攜帶更大片段的載體，人工染色體載體的出現(xiàn)解決了這一困難。現(xiàn)在用的人工染色體分為細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome BAC)或酵母人工染色體(yeast artificial chromosome YAC)。BAC能攜帶300 000bp的DNA，YAC能攜帶1 000 000bp 的DNA，但不夠穩(wěn)定。

5.組裝基因組的拼圖游戲

基因測序后，要將一個個小的DNA片段拼裝起來就象一個游戲，但是一個十困難的工作。一個原因是人的基因組過于龐大，32億個堿基對被切成小片段也要有上千萬個片段，把它們從頭到尾找到一起本身就是很困難的工作。加上人的基因組中存在著大量的重復(fù)順序，約占人基因組的一半以上，這樣在拼接時很容易把一個區(qū)誤認(rèn)為另一個區(qū)域，因此在基因組測序和拼圖中常常會出現(xiàn)空洞和錯誤。要彌補這些空洞和錯誤，基因組的工作草圖的每一個堿基至少被測4-5次，人類基因組的最終目標(biāo)是產(chǎn)生完全的序列，沒有空隙，準(zhǔn)確率要達(dá)到99.99%。

6.目前進(jìn)行基因組計劃的兩種策略： 霰彈法測序：

先將人的基因組制備成各級小片段，并且小片段間有重疊的關(guān)系 然后對每個小片段進(jìn)行測序 通過重疊的關(guān)系將相互聯(lián)系著的小片段拼接成較大片段 當(dāng)拼到比較大的片段時，就可用于構(gòu)建圖譜 最終全部基因的序列。

全基因組霰彈法測序：

將基因組分割成小片段 然后對小片段進(jìn)行隨機(jī)的測序

通過計算機(jī)的程序?qū)⑺羞@些小片段組裝成連續(xù)的大片段，最終得到全基因組序列。

模式生物體的研究

通過對進(jìn)化不同階段的生物體基因組序列的比較，發(fā)現(xiàn)基因組結(jié)構(gòu)組成和功能調(diào)節(jié)的規(guī)律。

人類基因組計劃的完成示標(biāo)志著生命基礎(chǔ)科學(xué)的研究進(jìn)入到后基因組時代。

HGP對人類的重要意義

1、HGP對人類疾病基因研究的貢獻(xiàn)

人類疾病相關(guān)的基因是人類基因組中結(jié)構(gòu)和功能完整性至關(guān)重要的信息。對于單基因病，采用“定位克隆”和“定位候選克隆”的全新思路，導(dǎo)致了亨廷頓舞蹈病、遺傳性結(jié)腸癌和乳腺癌等一大批單基因遺傳病致病基因的發(fā)現(xiàn)，為這些疾病的基因診斷和基因治療奠定了基礎(chǔ)。對于心血管疾病、腫瘤、糖尿病、神經(jīng)精神類疾病（老年性癡呆、精神分裂癥）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重點。健康相關(guān)研究是HGP的重要組成部分，1997年相繼提出：“腫瘤基因組解剖計劃”“環(huán)境基因組學(xué)計劃”。

2、HGP對醫(yī)學(xué)的貢獻(xiàn)

基因診斷、基因治療和基于基因組知識的治療、基于基因組信息的疾病預(yù)防、疾病易感基因的識別、風(fēng)險人群生活方式、環(huán)境因子的干預(yù)

3、HGP對生物技術(shù)的貢獻(xiàn)

（1）基因工程藥物：分泌蛋白（多肽激素，生長因子，趨化因子，凝血和抗凝血因子等）及其受體。

（2）診斷和研究試劑產(chǎn)業(yè)：基因和抗體試劑盒、診斷和研究用生物芯片、疾病和篩藥模型。

（3）對細(xì)胞、胚胎、組織工程的推動：胚胎和成年期干細(xì)胞、克隆技術(shù)、器官再造。

4、HGP對制藥工業(yè)的貢獻(xiàn)

篩選藥物的靶點：與組合化學(xué)和天然化合物分離技術(shù)結(jié)合，建立高通量的受體、酶結(jié)合試驗為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計：基因蛋白產(chǎn)物的高級結(jié)構(gòu)分析、預(yù)測、模擬—藥物作用“口袋”

個體化的藥物治療：藥物基因組學(xué)。

5、HGP對社會經(jīng)濟(jì)的重要影響

生物產(chǎn)業(yè)與信息產(chǎn)業(yè)是一個國家的兩大經(jīng)濟(jì)支柱；發(fā)現(xiàn)新功能基因的社會和經(jīng)濟(jì)效益；轉(zhuǎn)基因食品；轉(zhuǎn)基因藥物（如減肥藥，增高藥）

6、HGP對生物進(jìn)化研究的影響

生物的進(jìn)化史，都刻寫在各基因組的“天書”上；草履蟲是人的親戚發(fā)現(xiàn)了大約一百四十萬個單核苷酸多態(tài)性，并進(jìn)行了精確的定位，初步確定了30多種致病基因。隨著進(jìn)一步分析，我們不僅可以確定遺傳病、腫瘤、心血管病、糖尿病等危害人類生命健康最嚴(yán)重疾病的致病基因，尋找出個體化的防治藥物和方法，同時對進(jìn)一步了解人類的進(jìn)化產(chǎn)生重大的作用。

9、蛋白組的復(fù)雜性

人類基因組編碼的全套蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)組）比無脊椎動物編碼的蛋白質(zhì)組更復(fù)雜。人類和其他脊椎動物重排了已有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，形成了新的結(jié)構(gòu)。也就是說人類的進(jìn)化和特征不僅靠產(chǎn)生全新的蛋白質(zhì)，更重要的是要靠重排和擴(kuò)展已有的蛋白質(zhì)，以實現(xiàn)蛋白質(zhì)種類和功能的多樣性。有人推測一個基因平均可以編碼2-10種蛋白質(zhì)，以適應(yīng)人類復(fù)雜的功能 ——13億年；人是由300～400萬年前的一種猴子進(jìn)化來的；人類第一次“走出非洲”——200萬年的古猿；人類的“夏娃”來自于非洲，距今20萬年——第二次“走出非洲”？

7、HGP帶來的負(fù)面作用 侏羅紀(jì)公園不只是科幻故事 種族選擇性滅絕性生物武器 基因?qū)＠麘?zhàn)

基因資源的掠奪戰(zhàn) 基因與個人隱私。

人類基因組帶給我們的新發(fā)現(xiàn)

1、基礎(chǔ)數(shù)據(jù)

全部人類基因組約有2.91Gbp，約有39000多個基因；平均的基因大小有27kbp；其中G+C含量偏低，僅占38%，而2號染色體中G+C的含量最多；到目前仍有9%的堿基對序列未被確定，19號染色體是含基因最豐富的染色體，而13號染色體含基因量最少等等（具體信息可參見cmbi 特別報道：生命科學(xué)的重大進(jìn)展）。

2、基因的分布情況

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和定位了26000多個功能基因，其中尚有42%的基因尚不知道功能，在已知基因中酶占10.28%，核酸酶占7.5%，信號傳導(dǎo)占12.2%，轉(zhuǎn)錄因子占6.0%，信號分子占1.2%，受體分子占5.3%，選擇性調(diào)節(jié)分子占3.2%，等。發(fā)現(xiàn)并了解這些功能基因的作用對于基因功能和新藥的篩選都具有重要的意義。

3、基因數(shù)量少得驚人：

一些研究人員曾經(jīng)預(yù)測人類約有14萬個基因，但Celera公司將人類基因總數(shù)定在2.6383萬到3.9114萬個之間，不超過40,000，只是線蟲或果蠅基因數(shù)量的兩倍，人有而鼠沒有的基因只有300個。如此少的基因數(shù)目，而能產(chǎn)生如此復(fù)雜的功能，說明基因組的大小和基因的數(shù)量在生命進(jìn)化上可能不具有特別重大的意義，也說明人類的基因較其他生物體更'有效'，人類某些基因的功能和控制蛋白質(zhì)產(chǎn)生的能力與其他生物的不同。這將對我們目前的許多觀念產(chǎn)生重大的挑戰(zhàn)，它為后基因組時代中生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供新的非凡的機(jī)遇。但由于基因剪切，EST數(shù)據(jù)庫的重復(fù)以及一些技術(shù)和方法上的誤差，將來亦可能人類的基因數(shù)會多于4萬。

4、不同各族間DNA的差異

人類單核苷酸多態(tài)性的比例約為1/1250bp，不同人群僅有140萬個核苷酸差異，人與人之間99.99％的基因密碼是相同的。并且發(fā)現(xiàn)，來自不同人種的人比來自同一人種的人在基因上更為相似。在整個基因組序列中，人與人之間的變異僅為萬分之一，從而說明人類不同“種屬”之間并沒有本質(zhì)上的區(qū)別。

5、人類基因組中存在大片“荒漠”。

在染色體上有基因成簇密集分布的區(qū)域，有大片的區(qū)域只有“無用DNA” ——不包含或含有極少基因的成分。基因組上大約有1／4的區(qū)域沒有基因的片段。在所有的DNA中，只有1%-1.5%DNA能編碼蛋白，在人類基因組中98%以上序列都是所謂的“無用DNA”，分布著300多萬個長片斷重復(fù)序列。這些重復(fù)的“無用”序列，決不是無用的，它一定蘊含著人類基因的新功能和奧秘，包含著人類演化和差異的信息。經(jīng)典分子生物學(xué)認(rèn)為一個基因只能表達(dá)一種蛋白質(zhì)，而人體中存在著非常復(fù)雜繁多的蛋白質(zhì)，提示一個基因可以編碼多種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)比基因具有更為重要的意義

6、男女性別間基因的差異

男性的基因突變率是女性的兩倍，而且大部分人類遺傳疾病是在Y染色體上進(jìn)行的。所以，可能男性在人類的遺傳中起著更重要的作用。

7、外來基因

人類基因組中大約有200多個基因是來自于插入人類祖先基因組的細(xì)菌基因。這種插入基因在無脊椎動物是很罕見的，說明是在人類進(jìn)化晚期才插入我們基因組的。可能是在我們?nèi)祟惖拿庖叻烙到y(tǒng)建立起來前，寄生于機(jī)體中的細(xì)菌在共生過程中發(fā)生了與人類基因組的基因交換。

8、新的遺傳標(biāo)記

蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)

proteome一詞于1994年提出，源于proteins和genome,意思是proteins expressed by a genome。研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學(xué)

蛋白質(zhì)組的廣義含義：

指某種細(xì)胞或組織中基因組所表達(dá)的所有的蛋白質(zhì)。但與基因組不同的是，蛋白質(zhì)組是一個動態(tài)的概念，因此有人用功能蛋白質(zhì)組的概念，指的是細(xì)胞在一定階段或與某一生理現(xiàn)象相關(guān)的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組的狹義含義：

可以指不同類型細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變化，如正常細(xì)胞和異常細(xì)胞之間、細(xì)胞用藥或不用藥之間的蛋白質(zhì)水平差異、不同組織細(xì)胞間的蛋白質(zhì)類型的差異。

蛋白質(zhì)組研究的意義和背景

蛋白組學(xué)可從另一方面來進(jìn)行探索。即找到蛋白再來找其基因。

蛋白研究的困難性

蛋白質(zhì)與核酸相比，結(jié)構(gòu)更復(fù)雜

前者與后者殘基的比為20:4；后者能在體外進(jìn)行合成、前者則不能；后者結(jié)構(gòu)和組成的差異不大、前者有著復(fù)雜的翻譯后修飾如磷酸化、甲基化等內(nèi)容。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)易被破壞

核酸在變性后能夠復(fù)性，并且結(jié)構(gòu)不被破壞(這一點正是人們所利用的)。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)一旦變性則很難恢復(fù)。

蛋白質(zhì)組研究主要分兩個步驟

蛋白質(zhì)組分離技術(shù) 蛋白質(zhì)組分析技術(shù) 蛋白質(zhì)的分離

將各種蛋白進(jìn)行分離是進(jìn)行后續(xù)分析的基礎(chǔ)。分離的越細(xì)、分辨率越高將會為分析創(chuàng)造更好的條件。常用的蛋白質(zhì)分離手段有：

親和層析 分子篩 離子交換

毛細(xì)管電泳 一向電泳 雙向電泳

雙向電泳技術(shù) 樣品的制備

等電聚焦電泳(1向)SDS-PAGE電泳(2向)掃描保留圖象

強(qiáng)大的分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 選定目標(biāo)蛋白 切膠 后續(xù)分析 對膠的染色 圖象的采集 圖象分析和處理

切膠收集目標(biāo)蛋白

基因診斷

(Gene Diagnosis)基因診斷是以DNA或RNA為實驗材料，通過對某種特異堿基序列的檢出來確定某種疾病的發(fā)生或某種病原體的存在。

基因診斷要達(dá)到的目的 對已知突變基因的檢出

臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究

對一些未知基因突變的篩選和分析。

對一些基因表達(dá)水平高低與某些疾病相關(guān)性的研究 對病原體基因的檢出。基因診斷早期的方法

分子雜交(hybridization)限制片段長度多態(tài)性的研究

(restriction fragment length polymorphism RFLP)分子雜交應(yīng)用于基因診斷的基本原理

根據(jù)被檢測目標(biāo)設(shè)計一個核酸探針，再用探針對來檢測具體的樣本，從而達(dá)到診斷的目的。

在實際應(yīng)用中，常用southern blot的方法來進(jìn)行突變基因的篩查。

PCR技術(shù)進(jìn)行基因診斷的幾種基本設(shè)計：

1.根據(jù)突變位點來設(shè)計特異性的引物。通過有無擴(kuò)增片段來進(jìn)行定性的。

2.通過基因片段長度的多態(tài)性來進(jìn)行鑒定。3.PCR結(jié)合限制片段長度多態(tài)性來進(jìn)行鑒定。

4.通過PCR-SSCP來進(jìn)行鑒定。

5.通過設(shè)計特異性的引物來診斷病原體的特異性基因。

基因診斷的應(yīng)用 多態(tài)性分析

對遺傳病突變基因的診斷

已知突變位點的診斷

未知突變位點的篩查和定位 基因異常表達(dá)的診斷（定量表達(dá)）外源DNA的檢測

腫瘤標(biāo)記物的確定和診斷 在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

DNA多態(tài)性

序列多態(tài)性(SNPs – 單堿基多態(tài)性)同源染色體 5-GGTTTACACCTAA-同源染色體 5-GTTTTAAACCGAA-

長度多態(tài)性(VNTR-可變的串聯(lián)重復(fù)順序)同源染色體 5-AATCAATCAATC-

同源染色體 5-AATCAATCAATCAATCAATC-

核心序列較長者（如大于8bp）常稱為小衛(wèi)星DNA，或稱可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR）核心序列較短者（如2-5bp）常稱為微衛(wèi)星DNA，或稱短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）

微衛(wèi)星多態(tài)性 單堿基多態(tài)性

遺傳信息變異是所有基因組的共同特征。不同個體、群體在疾病易感性、對環(huán)境理、化、生、致病因子反應(yīng)性和其他性狀上的差別，都與基因組序列中的變異有關(guān)，這些變異最常見的形式是單核苷酸多態(tài)性（SNP）。

人類基因組中SNP的數(shù)目約為3百萬－1千萬。人類遺傳多態(tài)性的意義 與性狀相關(guān)；

與疾病相關(guān)，可用于預(yù)測發(fā)病風(fēng)險； 個體醫(yī)學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)；

可作為遺傳標(biāo)志，用于疾病連鎖診斷； 作為個人身份識別標(biāo)識用于法醫(yī)學(xué)。

遺傳性狀

遺傳多態(tài)性在身份識別方面的應(yīng)用

公安司法系統(tǒng)——罪犯及受害人的身份識別及親子鑒定； 部隊 —— 傷亡士兵的身份識別；

保安 —— 個人DNA身份證，用于人員識別；

何為RFLP? 限制性片段長度多態(tài)性

(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)

何為DNA指紋？用一種或幾種限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA，用探針雜交并放射自顯影。

中國人群的遺傳學(xué)關(guān)系

主要成果：證實中國人群可分為南、北兩大組，兩者之間有明顯的基因融匯；提出了東亞人群可能起源于東南亞、而東亞現(xiàn)代智人與其他各大洲現(xiàn)代人群都起源于10－20萬年前“走出非洲”的群體的觀點。

基因治療Gene Therapy

依靠遺傳物質(zhì)來治療疾病，包括糾正人自身基因的結(jié)構(gòu)或功能上錯亂、阻止病變的進(jìn)展，殺滅病變的細(xì)胞，或抑制外源原體遺傳物質(zhì)的復(fù)制，從而達(dá)到治病的目的。這就是基因治療的含義。基因工程與基因治療有相似的一面：

二者都需將“目的基因”（基因治療也可稱為治療基因）分離和純化；都需要將選擇合適的載體，并將“目的基因”與載體在體進(jìn)行重組；都需要將重組體導(dǎo)入受體（靶）細(xì)胞。基因工程與基因治療有不同的一面：

基因工程的主要目的是將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并使得外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)、純化，最終獲得重組蛋白。

基因治療的主要目的是將具有治療價值的基因形成的重組體導(dǎo)入體細(xì)胞直接表達(dá)，并無需對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化。

基因工程的全部過程都在體外操作；而基因治療需將外源基因?qū)塍w細(xì)胞中，因此技術(shù)上具有很大難度，而且對其有效性和安全性方面提出了

苛刻的要求

基因治療有兩種途徑：

ex vivo in vivo ex vivo ：

將含有外源基因的載體在體外導(dǎo)入人體細(xì)胞或異體細(xì)胞（也稱基因工程化細(xì)胞），經(jīng)體外細(xì)胞擴(kuò)增后，輸回人體。這種方法易于操作，并易于解決安全性的問題，但不易于工程化生產(chǎn)。in vivo途徑

將外源的治療基因裝配于合適的真核細(xì)胞表達(dá)載體，直接導(dǎo)入人體內(nèi)，這種方式的導(dǎo)入有利于在規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。但是，這種方式導(dǎo)入治療基因及其載體必須證明其安全性，而且導(dǎo)入體內(nèi)后需能進(jìn)入靶細(xì)胞，有效地表達(dá)并達(dá)到治療的目的。因此，在技術(shù)上要求很高，其難度明顯高于前者。

致病基因的確定(定位)近日，來自國際上六個國家的科學(xué)家展開合作，通過分析全球不同人群之間的遺傳基因信息，初步繪制出首張人類DNA序列中變異基因片段的遺傳圖譜“HapMap”。這張圖譜對于基因治療來講，意義非凡。

所謂“HapMap計劃”，是由加拿大、中國、日本、尼日利亞、英國和美國共同資助并聯(lián)合展開的基因研究項目，全名為“國際人類基因組單體型圖計劃”(簡稱“HapMap計劃”)，項目旨在建立一個幫助研究者發(fā)現(xiàn)人類疾病及其對藥物反應(yīng)相關(guān)基因的公眾資源。

反義技術(shù) 又稱反義寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides）技術(shù)，是指利用人工合成的反義RNA和反義DNA來阻斷基因的轉(zhuǎn)錄或復(fù)制，控制細(xì)胞生長在中間階段,使編碼蛋白質(zhì)的基因能轉(zhuǎn)錄為mRNA，因而不能翻譯成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，以達(dá)治療某一疾病的目的、用反義RNA已對某些癌癥進(jìn)行臨床試驗。這類反義技術(shù)只能認(rèn)為是一種從基因水平進(jìn)行治療的技術(shù)，它們以不同方式，在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平發(fā)揮作用。由于它們的分子量低，故而有潛力進(jìn)入靶細(xì)胞，但其臨床穩(wěn)定性、毒性、細(xì)胞通透性等各方面都需要進(jìn)一步研究。

藥物靶向治療（drugs targeting）此法機(jī)理可概括為病毒導(dǎo)向酶的藥物前體治療（virus directed enzyeme prodrug therapy,vdept），即用反轉(zhuǎn)錄病毒載體的外源基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi).該基因編碼一種酶，此酶可將一種無害的藥物前體轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒素復(fù)合物。帶有這一基因的病毒載體只在特殊組織或腫瘤細(xì)胞中而不在正常細(xì)胞中表達(dá)