第一篇：瘦肉精檢測原理及操作步驟

瘦肉精檢測原理及操作步驟？

時間：2011-03-22 來源： 作者：

一、測定原理

“瘦肉精”克侖特羅競爭酶標(biāo)免疫檢測方法快速測定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。酶聯(lián)板的微孔包被有針對兔抗克侖特羅特異性抗體的羊抗體（第二抗體）。加入兔抗克侖特羅特異性抗體（第一抗體）與第二抗體結(jié)合而被固定，洗滌后加入標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液與酶結(jié)合物（酶標(biāo)記抗原），標(biāo)準(zhǔn)液或樣品中的游離抗原與酶標(biāo)抗原競爭兔抗克侖特羅特異性抗體上有限的結(jié)合位點。通過洗滌除去沒有與特異性抗體結(jié)合的酶標(biāo)抗原，加入酶基質(zhì)（過氧化脲）和發(fā)色劑（四甲基聯(lián)苯胺）并孵育，結(jié)合到板上的酶標(biāo)記物將無色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的底物。加酸終止反應(yīng)后，顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在單波長450 nm處測吸光度，吸收光強度與樣品中的克侖特羅濃度成反比。

二、試劑盒的組成

每個盒中（包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔）材料如下：

（1）1×96孔板（12排×8孔），包被有第二抗體（兔IgG抗體）；（2）6個標(biāo)準(zhǔn)液（300ul/瓶）為克侖特羅水溶液。濃度分別為0 ng/kg、100 ng/kg、300 ng/kg、900 ng/kg、2700 ng/kg、8100 ng/kg；（3）1個克侖特羅過氧物酶標(biāo)記物濃縮液12 ml（紅色帽）；（4）1個克侖特羅抗體濃縮液12 ml（黑色帽）；（5）1個酶基質(zhì)/發(fā)色劑11 ml（藍(lán)色帽）；（6）1個反應(yīng)停止液，1 mol/L硫酸14 ml（黃色帽）；（7）1個緩沖液25 ml，酶標(biāo)記物及抗體濃縮液稀釋用。

三、試驗材料

1、設(shè)備

微孔板酶標(biāo)儀（450 nm）、均質(zhì)器、冷凍離心機、離心管（50 ml）、微量可調(diào)移液器（單道、八道）、RIDAC18柱、濾紙（0.45μm）。

2、試劑

甲醇（分析純、100%）、50 mmol/LHCL、10 mmol/LHCL、50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.0）、500 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.0）、1 mol/LNaOH。

四、儲存條件

試劑盒保存于2-8℃，不要冷凍。不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與干燥劑一起重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，避免直接暴露在光線下。

五、試劑變質(zhì)的跡象

發(fā)色劑有任何顏色表明已變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光值小于0.6時，表示試劑可能變質(zhì)。

六、樣品處理

1、尿樣

尿樣一般不用處理，取20清亮尿樣直接測定。如果尿樣混濁要過濾或離心至得到清亮尿樣。

2、肝臟、肉樣

粉碎的5g樣品與25ml50 mmol/L HCL混合，振蕩1.5 h，以達(dá)到均質(zhì)的目的。稱6g均質(zhì)物（相當(dāng)于1 g肝臟），加入離心管中。10-15℃條件下（非常重要）4000轉(zhuǎn)/min或更高的轉(zhuǎn)速離心15 min。轉(zhuǎn)移上清液到另一個離心管中，加300μl 1mol/L NaOH混合15 min。加入4 ml 500 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 3.0），簡單混合并在4℃保存至少1.5 h或過夜（非常重要）。10-15℃條件下（非常重要）4000轉(zhuǎn)/min或更高的轉(zhuǎn)速離心15 min。分離全部上清液（應(yīng)是清亮的，非常重要），使其升至室溫（20-24℃），然后用RIDAC18柱純化。

RIDAC18柱純化樣品必須在室溫條件下（20-24℃），并嚴(yán)格控制過柱時流速。用3 ml甲醇洗滌柱子，控制流速為1滴/s。用2ml洗滌液（50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液pH 3.0），洗滌柱子。肝臟、肉樣的全部上清液進(jìn)柱，控制流速為1滴/4s。用2 ml洗滌液（50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液pH 3.0），洗滌柱子，流速為1滴/s。用正壓除去殘留的流體并用空氣或氮氣吹2 min，干燥柱子。用1 ml甲醇洗脫樣品，控制流速1滴/4s。在50-60℃并在弱空氣或氮氣流下完全蒸發(fā)甲醇溶劑。用1 ml蒸餾水溶解干燥的殘留物，取20μl進(jìn)行分析。

3、飼料

取10ｇ飼料樣品，用10 mmol/LHCL溶解，連續(xù)震蕩10 min，用濾紙過濾，在濾液中加入120μl 1mol/L NaOH進(jìn)行中和，檢查pH，用NaOH控制PH值在6.5-7.5之間，取上清液20μl進(jìn)行分析。稀釋倍數(shù)為25（即含有0.04 g飼料樣品/ml）。

七、測定步驟

第一步：所有試劑及樣品在開始檢測前必須回升至室溫（20-24℃），測定操作在20-24℃下進(jìn)行。

第二步：用盒中緩沖液以體積1﹕10的比例稀釋實際用量的克侖特羅抗體濃縮液（黑色蓋），稀釋前輕輕混均抗體，不要猛烈振蕩。

第三步：取出實驗需要數(shù)量的微孔板條，足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用的數(shù)量，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個平行試驗，記錄標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。剩余的微孔板條放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，置于2-8℃冷藏。

第四步：每個微孔中底部加100μl稀釋后的抗體溶液，室溫（20-24℃）孵育微孔板15 min，避免光線照射。

第五步：孵育的同時進(jìn)行酶標(biāo)記物的稀釋，用盒中緩沖液以體積1﹕10的比例稀釋實際用量的克侖特羅酶標(biāo)記物濃縮液（紅色蓋），稀釋前輕輕混均抗體，不要猛烈振蕩，避光放置。

第六步：洗板，甩出孔中液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍打，直到紙上無明顯水跡（拍打3次），以保證完全除去孔中的液體。用250μl蒸餾水充入孔中，再次甩掉微孔中液體，并在吸水紙上拍打，重復(fù)操作兩次。加洗滌水的移液器管尖必須置于微孔上方約0.5 cm處打出洗滌水，避免將板孔中的游離抗體帶入洗滌水中。洗板后立即進(jìn)行下一步操作，不要讓板孔干燥。

第七步：加入20μl標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔底部，標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個平行實驗。

第八步：加入100μl稀釋了的酶標(biāo)記物至微孔底部，輕輕震蕩微孔析并在桌面上作圓周運動以混勻。移液器管尖不要接觸到孔中的混合物，避免交叉污染。

第九步：室溫孵育微孔板30 min，避免放置，盡可能每隔10 min輕輕振蕩1次，準(zhǔn)備好酶基質(zhì)/發(fā)色劑，并注意避光放置。

第十步：洗板，同第六步。在洗板過程中加洗滌水的移液器置于微孔板上方0.5 cm處打出洗滌水，避免將板孔中的游離酶標(biāo)記物帶入洗滌水中。

第十一步：不要讓板孔干燥，迅速加入100μl酶基質(zhì)/發(fā)色劑到每個孔中，步驟操作要迅速，避免頭尾反應(yīng)時間相差過長，輕輕振蕩板并在桌面上作圓周運動以混勻。移液器管尖不要接觸微孔中的混合物，避免交叉污染。

第十二步：室溫暗處孵育微孔板15 min，暗處避光放置，同時準(zhǔn)備好反應(yīng)停止液。

第十三步：每孔加入100μl反應(yīng)停止液，混勻，60 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測量450 nm處波長吸光度值。

八、結(jié)果

所獲得的標(biāo)準(zhǔn)和樣品吸光度值的平均值除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值再乘以100，并且以百分比的形式給出吸光度值。

吸光度值（％）＝ ×100

計算的標(biāo)準(zhǔn)值（吸光度值）繪成一個對應(yīng)克侖特羅濃度（mg/kg）的半對數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，校正曲線在200-2000 ng/kg范圍內(nèi)應(yīng)當(dāng)成為線性。相對應(yīng)每一個樣品的濃度（ng/kg）可以從校正曲線上讀出

第二篇：瘦肉精的檢測步驟

瘦肉精快速檢測卡操作步驟

一、【檢測原理】

本試紙采用競爭抑制免疫層析技術(shù)的原理來測定動物尿液、組織和飼料中的鹽酸克侖特羅。試劑含有被預(yù)先固定于膜上檢測帶（T）的鹽酸克侖特羅偶聯(lián)物和被膠體金標(biāo)記的抗鹽酸克侖特羅單克隆抗體。檢測時樣品和標(biāo)記抗體競爭結(jié)合偶聯(lián)物。檢測限為3ng/ml（3ppb）。

二、【樣品制備】

肉：裝入大約4克碎的肉樣本（肉泥）于離心管中（醬豬牛肉加2ml水或PBS），蓋緊管蓋，在80℃左右的水浴鍋中水浴10 分鐘；吸取煮出的溶液到1.5ml的離心管中。如有明顯黃色渾濁請離心（3000rpm,5min），取上清檢測。如果檢測牛肉請吸出肉湯離心(3000rpm,5min)，取上清檢測。

三、【操作步驟】

1.在進(jìn)行測試前先仔細(xì)閱讀使用說明書，使用前將本品和待檢樣本溶液恢復(fù)至室溫。

2.從原包裝中取出試劑，打開后平放在桌面上，請在1小時內(nèi)盡快使用。

3.吸取待檢樣品溶液，緩慢滴加80~100μl(約2~3滴）于加樣孔中，加樣后開始計時。

4.在5分鐘內(nèi)讀取結(jié)果，超過5分鐘的結(jié)果判讀無效。

四、【結(jié)果判定】

陽性：位置C顯示出紅色條帶，位置T無條帶或顏色非常模糊時判為陽性。陰性：位置C顯示出紅色條帶，位置T同時出現(xiàn)紅色條帶時，判為陰性。無效：位置C不顯示出紅色條帶，則無論位置T顯示出紅色條帶與否，該試紙卡均判為無效。

【貯存及有效期】

冷藏，忌冷凍，有效期12個月。

【注意事項】

1.請按照操作步驟進(jìn)行測試，操作時請勿觸摸試紙顯示區(qū)。

2.如購買時發(fā)現(xiàn)過期，破損，污染，無效的產(chǎn)品，請到購買處更換。

3.本品為一次性產(chǎn)品，請勿重復(fù)使用。

4.出現(xiàn)陽性結(jié)果，建議用本卡復(fù)查一次。

5.自來水、蒸餾水或去離子水不能作為陰性對照。

6.由于樣品（尿和飼料）的差異，有的檢測線可能偏淡或偏暗，但只要出現(xiàn)條帶，就可判定為陰性結(jié)果。

7.若需直接檢測標(biāo)準(zhǔn)品，請用PBS或陰性樣品配制。

第三篇：瘦肉精檢測

通許縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所關(guān)于

外銷生豬“瘦肉精”檢測的報告

開封市動物衛(wèi)生監(jiān)督所：

為了保證畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，保障人民身體健康，全面推進(jìn)和諧社會的創(chuàng)建，2010年6月21日，通許縣畜牧局下發(fā)文件開展世博會期間整頓生豬經(jīng)營處等檢疫秩序活動，特別是重點開展 “瘦肉精”的檢測工作，堅決杜絕在飼料中使用萊克多巴胺及克倫特羅等違禁藥物，整頓和規(guī)范飼料、獸藥市場，嚴(yán)厲打擊假冒偽劣產(chǎn)品，實現(xiàn)全縣生豬生產(chǎn)的安全無污染，確保外銷到市場的是“放心豬”。

通許縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所認(rèn)真學(xué)習(xí)貫徹了縣局文件精神，開展以“瘦肉精”和重大動物疫病為主的檢測檢驗；加大對使用“瘦肉精”的打擊力度，建立生豬疫病防治體系，確保生豬及其加工產(chǎn)品的質(zhì)量安全。對檢測出“瘦肉精”的生豬產(chǎn)地在3個月內(nèi)禁止外銷，經(jīng)檢測合格后重新申請進(jìn)入市場。逐步推行生豬產(chǎn)品市場準(zhǔn)入制度、“一豬一標(biāo)一碼”標(biāo)識管理制度。對生豬“瘦肉精”進(jìn)行重點抽檢，檢驗中凡發(fā)現(xiàn)有“瘦肉精”的生豬均進(jìn)行銷毀，并向產(chǎn)地通報和封停該地生豬進(jìn)入市場。

據(jù)匯總統(tǒng)計，2010年6月至8月份我縣共外銷生豬8603頭。分批次發(fā)往浙江省慈溪市、江蘇省無錫市、安徽省和縣、浙江省寧波市、江蘇省常州市、廣東省湛江市、安徽省合肥市、安徽省淮南市、安徽蒙城縣等九個城市和地區(qū)。“瘦肉精”檢測全部呈現(xiàn)陰性。其中6月份外銷生豬2053頭，抽檢生豬尿樣110多個，檢測結(jié)果全部呈現(xiàn)陰性，合格率達(dá)到100%。7月份外銷生豬3190頭，抽檢生豬尿樣160多個，檢測結(jié)果全部呈現(xiàn)陰性，合格率達(dá)到100%。8月份外銷生豬3360頭，抽檢生豬尿樣170多個，檢測結(jié)果全部呈現(xiàn)陰性，合格率達(dá)到100%。

二○一○年九月八日

主題詞：瘦肉精 抽檢 報告

通許縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所二○一○年九月八日印

第四篇：(瘦肉精)檢測制度

第十節(jié)

屠宰企業(yè)違禁藥物（瘦肉精）檢測制度

（適用實行瘦肉精企業(yè)自檢的地區(qū)）

一、為規(guī)范生豬定點屠宰廠（場）待宰生豬尿樣違禁藥物“瘦肉精”的日常檢驗工作，制定本制度。

二、定點屠宰廠（場）必須有滿足日常檢測需要的工作場所及實驗室，并應(yīng)保持光線充足，通風(fēng)良好，室內(nèi)環(huán)境整潔，基本設(shè)施齊全。

實驗室必須配備能滿足檢測工作需要的檢測人員和審核人員。

三、檢測人員必須經(jīng)過有關(guān)單位的培訓(xùn)，能獨立操作，包括樣本的采取和檢測。

四、定點屠宰廠（場）必須建立瘦肉精檢測臺帳，并建立人員崗位責(zé)任制，所有檢測設(shè)施、器材、記錄等都要專人妥善保管。

五、嚴(yán)格執(zhí)行省政府的有關(guān)要求，生豬宰前必須進(jìn)行瘦肉精檢測，并實行每批必檢制度（一個檢疫證號為一批）。

六、檢測結(jié)果應(yīng)在屠宰廠（場）內(nèi)固定場所以醒目方式對外公示。

七、若檢測出現(xiàn)陽性結(jié)果，屠宰廠（場）必須將檢測結(jié)果立即報送當(dāng)?shù)貏游锓酪弑O(jiān)督機構(gòu)處理。

八、檢測方法按照《動物組織中鹽酸克倫特羅的測定 氣相色譜/質(zhì)譜法》NY/T 468-2006的規(guī)定執(zhí)行。

九、屠宰廠（場）應(yīng)自覺接受屠宰管理機構(gòu)和動物防疫監(jiān)督機構(gòu)對檢測工作開展監(jiān)督檢查、指導(dǎo)。

第五篇：瘦肉精檢測方法

目前，檢測瘦肉精的方法主要有四種，即高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜一質(zhì)譜法（GC－MS）、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法（CE）和免疫分析技術(shù)（IA）。而我國結(jié)合自己的實際情況，2001年農(nóng)業(yè)部首先組織制定了飼料中鹽酸克倫特羅的測定標(biāo)淮。該標(biāo)準(zhǔn)選擇確定了兩種：即高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜一質(zhì)譜法（GC－MS）。其中將HPLC法作為檢測瘦肉精的半確證性方法，其最低檢測限為 0．05μg/kg，優(yōu)點是檢測精確度高，而且假陽性率低；缺點是檢測過程煩瑣、檢測時間長，需貴重儀器、難于操作、價格昂貴。而GC一MS法優(yōu)點是能在多種殘留物同時存在的情況下對某種特定的殘留物進(jìn)行定性、定量分析。GC－MS法與HPLC法相比，檢測靈敏度更高，假陽性率更低，已將GC－MS法定為檢測瘦肉精的確證性方法。GC－MS法的缺點同HPLC相似。

(1)試劑和材料 以下所有試劑，除特別注明外，均為分析純試劑；水為符合GB／T6682規(guī)定的二級水。

①鹽酸克倫特羅對照品：含鹽酸克倫特羅不得少于98．5％

②鹽酸

③無水甲醇

④氫氧化鈉

⑤磷酸二氫鉀

⑥磷酸

⑦鹽酸溶液 取鹽酸4．2ml，加水至1000ml，即得。

⑧o．5mol／L磷酸二氫鉀溶液 取磷酸二氫鉀68g，加水800ml溶解并用磷酸調(diào)pH值至3．O，用水稀釋至1000ml，即得。

⑨0．05mol幾磷酸二氫鉀溶液 取磷酸二氫鉀6．88，加水800ml溶解并用磷酸調(diào)pH值至3．0，用水稀釋至1000mi，即得。

a．氫氧化鈉溶液 取氫氧化鈉48，加水使溶解成100mi，即得。

b．鹽酸克倫特羅對照品儲備液(1mg／mi)準(zhǔn)確稱取28．3mg鹽酸克倫特羅對照晶至25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至25ml，一20~C以下保存，有效期1年。

⑩鹽酸克倫特羅對照品工作液(10ttg／mi)取lmg／mi儲備液o．5ml到50mi量瓶中，加水至50mi，2～8~C保存，有效期1個月。

⑾鹽酸克倫特羅對照溶液(100ng／m1)取1(ug／m1工作液o．5ml到：50mi量瓶中水至50mi，2～8~C保存，有效期1個月。

⑿鹽酸克倫特羅檢測試劑盒(2～8~C冰箱中保存)

⒀固相萃取柱C，s：100mglml含碳量≥17％

(2)儀器和設(shè)備

①酶聯(lián)免疫反應(yīng)讀數(shù)儀

②分析天平精度0．00001g

③天平精度0．01g

④冷凍離心機

⑤50mi具塞離心管

⑥勻漿機

⑦微型振蕩器

⑧回旋振蕩器

⑨微量移液器 單道20uL，50ul，100uL；多道50～250uL，⑩干熱濃縮器

①空氣壓縮機

(3)測定步驟

①試料的制備(尿)

取供試尿lml，于3000r／min離心l0min，上清液作為供試試料，直接供酶聯(lián)免疫測定法測定。

取空白尿lml，于3000r／min離心l0min，上清液作為空白試料，直接供酶聯(lián)免疫測定法測定。

取空白尿2ml，于3000r／min離心l0min，上清液1.0ml添加l00ug／L的克倫特羅對照溶液20／H。作為2ug/l空白添加試料，直接供酶聯(lián)免疫測定法測定。

②試料的制備(肝)

取約l00g新鮮或冷凍后融化的空白或供試豬肝,用勻漿機以10000r／rain勻漿1-2min，使均勻呈糊狀，一20~C以下冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

取均漿后的供試肝樣，作為供試試料。

取均漿后的空白肝樣，作為空白試料。

取均漿后的空白肝樣(1土0．05)e添加l00ng／m1的克倫特羅對照溶液20tzL作為2ng／g空白添加試料。

a：提取(肝)取(1士o．05)z試料，置50ml離心管中；加鹽酸溶液5.0mi，旋渦混勻，中速振蕩1．5h；在10—15~C下以4000r／mill以上速度離心15min；上清液移人另一50ml離心管中，加入氫氧化鈉溶液300gL，混勻，振蕩15min；加0.5mol／l磷酸二氫鉀溶液4。0ml，混勻，2—8~C放置過夜；取上述溶液于10～15~C以4000r／111113以上的速度離心15min，上清液備用。

b．凈化(肝)C，固相萃取柱依次用無水甲醇3mi、0.05mol／L磷酸二氫鉀溶液2mi預(yù)洗，不使柱床干涸；將備用上清液全部過柱；用0.05mol／L磷酸二氫鉀溶液2ml淋洗，擠干，棄去所有淋洗液；用無水甲醇2mi洗脫，流速控制在0.5ml／mm以下，擠干，收集洗脫液；于50～60~C下用氮氣或空氣緩緩吹干洗脫液；殘余物用水1.0ml溶解，以4000r／mill以上的速度離心15rain，清液作為試樣溶液供酶聯(lián)免疫測定法測定。

③測定

a．室溫應(yīng)控制在19～30~C。

b．取在19—30~C放置1—2h的試劑盒，按每個標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液至少兩孔計算所需酶聯(lián)板條的數(shù)量，插入框架。每個微孔加入用緩沖溶液100倍稀釋的抗體100~tL，封口膜封板，室溫孵育30min。

c倒出孔內(nèi)液體，將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打，使孔內(nèi)沒有殘余液體。用多道移液器加水250pL到酶聯(lián)板的微?L內(nèi)，稍后倒出孔內(nèi)液體，再將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打，如此重復(fù)操作洗板3次。

d．分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白試料、空白添加試料和供試試料各20uL，分別放入不同微孔底中央，并在每孔內(nèi)加入用緩沖溶液100倍稀釋的酶結(jié)合物100~I。，在微型振蕩器上混勻，用封口膜封好，室溫孵育30min。

e．倒出孔內(nèi)液體，將酶聯(lián)板倒置在吸水紙上拍打，使孔內(nèi)沒有殘余液體，重復(fù)洗板3次。

f．用多道移液器加入用底物緩沖溶液10倍稀釋的底物100uL，室溫避光孵育15min。

g．用多道移液器每孔加終止液100uL。

h．在1h內(nèi)將酶聯(lián)板放于酶標(biāo)儀內(nèi)，于450nm波長處測定吸光度值。

(4)計算 用數(shù)據(jù)分析軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出試料中克倫特羅的含量。

(5)靈敏度和回收率

本方法的平均檢測下限為0.1mg／Kg。

本方法在1ug／kg添加濃度水平上豬尿回收率范圍為60％一120％，豬肝回收率范圍為40％～120％。