第一篇：病理技術員培訓[定稿]

病理技術員培訓 概述

?病理學是研究疾病的病因、發生機制、病理變化、結局和轉歸的一門學科。

?病理學是一門基礎學科，但又是聯系基礎醫學和臨床醫學的橋梁。包括病理解剖學和病理生理學。

?病理學常用研究方法：

1.尸體解剖

2.活體組織學檢查

3.脫落細胞學檢查

4.動物實驗

5.組織和細胞培養

1.尸體解剖：

遺體→病理解剖、觀察→正確診斷、查明死因、解釋臨床癥狀和體征等臨床現象及時發現和確診新疾病，特別是傳染病提供第一手科研材料

2.活體組織學檢查：

局部手術、嵌取、穿刺針吸→肉眼和鏡下病理觀察→良惡性腫瘤診斷和疑難病例確診 乳腺癌：對乳房腫塊診斷不清，懷疑非實質病變者可采取穿刺針吸小塊組織做病理檢查，方法簡單診斷可靠率高，尤其對鑒別診斷有重要價值。如通過各種方法均未取得結果而仍診斷不清，直接切取活體組織檢查。

前列腺癌：直腸指診DRE，在前列腺癌的篩選檢查中必不可少且簡單、經濟、方便和穿刺活檢以早期發現前列腺癌。前列腺癌的確診必須通過病理活檢證實,經直腸超聲引導下前列腺穿刺活檢術操作簡單、準確性高、安全、并發癥少。胃癌：

3.脫落細胞學檢查：腫瘤的普查和早期發現、早治療（1）宮頸癌：陰道脫落細胞檢查為早期最有效的檢查

（2）乳腺癌：乳頭溢液者，可收集液體涂片送病理查找癌細胞。（3）肺癌：反復痰中查癌細胞，獲陽性結果，有確診價值

（4）食道癌：食管拉網細胞學，初篩，承受度和敏感性較低，約束了其廣泛使用

（5）膀胱癌：尿脫落細胞檢查：是一種簡單易行又無創傷的膀胱癌檢查方法，對膀胱癌的診斷有重要價值，膀胱癌病人約85%尿脫落細胞檢查可呈陽性。

?5.動物實驗:

?6.組織和細胞培養：

第一節 標本制作的常規工作 ?1.清潔工作：

工作實驗室要干凈整潔，固體廢棄物要存放于醫用垃圾袋內，防止污染，保持水管通暢。

?2.接受標本工作：

核對檢查申請單、送檢標本及標志，對于送檢的微小標本必須認真核對容器內或濾紙上是否有組織及數量，容器無名字的應立即寫上名字；檢查標本固定液是否充足，按順序存放。?3.標本登記工作：

將檢查后的標本登記在登記卡，包括驗收日期和病理編號，編號寫在申請送檢單右上角，按順序排放，為取材做準備。?4.標本取材工作：

先核對再取材，取材后在按編號放置，脫水盒背面詳細記錄取材情況，并寫上日期和簽上取材人姓名。

第一節 標本制作的常規工作

?5.取材后標本進行固定、脫水、包埋、切片、染色。

6、染色后貼標簽送診斷室觀察，診斷發出后及時登記診斷結果，切片蠟塊及時歸檔。?7.存放溶液試劑及染料的容器必須及時貼標簽，注明名稱和配制日期。?8.配制強酸試劑、揮發易燃試劑注意安全。?9.室內不用的電器、燈火須及時關閉。

?10.染色液、脫水液如有沉渣，應過濾后備用。第二章

組織切片程序

? 冰凍切片

石蠟切片

火棉膠切片

︳

↓

︳

——————————→先取 材←—————————— ↓

再固 定

↓

冰 凍 ←————————-------沖 水 ∣

↓

∣

脫 水——————————— ∣

↓

↓ ∣

透 明

乙醚酒精 ∣

↓

↓

∣

浸 蠟

膠液滲透

∣

↓

↓

∣

石蠟包埋

火棉膠包埋 ↓

↓

↓

冰凍切片

切 片

切 片 ↓

↓

↓ 染 色

染 色

染 色 ↓

↓

↓ 封 固

封 固

封 固

一、標本取材

?切取病變組織或擬研究的組織

?應選擇病變或可疑病變的組織。必要時選取病變與正常組織交界處。

?切取標本的原則是求準而不是求量多，所以切取組織宜小不宜大，以不超過24x24mm2為佳，厚度以3—5mm為度，過大過厚會影響對標本的固定，另方面也影響切片的制作。

病理科標本檢查和取材制度

1、標本的檢查和取材由病理醫師承擔。

2、病理醫師通過肉眼仔細觀察標本，判斷病變的部位、大小、浸潤深度及與切緣和周圍組織的關系，然后挑選有代表性的部位取材，做病理切片。取材必須遵從規范要求，以保證診斷的準確性，提供準確的TNM分期信息和其他與治療、估計預后相關的信息。

3、取材前應核對申請單編號與標本的編號、標本的份數是否相符，申請單與標本應有雙標記和雙核對，并仔細閱讀申請單中的內容，初步判斷病變的性質，做到對病變心中有數。

4、標本檢查和取材應按照有關的操作規范進行；應當對大體標本進行細致的觀察，并有相應的文字記錄。

5、取材結束后必須核對組織塊，并在取材記錄單上標示；隨后將記錄單交病理技術人員，供切片染色后核對使用。

6、組織塊應該每塊分別編號，并做到一一對應。

7、取材后剩余的標本應妥善保存，保存至病理報告發出后2周時間。

8、剩余的病理標本和標本容器屬于醫療廢棄物，應按照“醫療廢物”的規定處理，不可隨意丟棄。

9、科室質量與安全管理小組定期對取材質量進行自查，及時總結和發現問題，制定措施，持續改進取材質量。標本取材原則：

?1.應詳細描述標本的數量、大小（mm、cm、多量時聚堆測量)、形狀、色澤、和質地等

?2.小量小標本，應全部取材

?3.多量小標本，取材后剩余者應保管好備用

?4.粘膜和皮膚應“立埋”以便觀察各層結構 大標本取材：

?記錄標本的手術類型

?描述和記錄標本大小（三維長度、形狀、色澤、表面、質地等）球形標本可測直徑

?切面：沿大面切開，描述和記錄其特點，如實性或囊性，各占比例，色澤、質地、出血壞死，囊壁厚度，內容物顏色等

?前列腺、甲狀腺、胰腺等臟器應間隔一定距離做多個平行破面，以免漏掉微小腫瘤.?取代表性區域，并與正常組織交界處取材 ?完整瘤體要帶包膜，如甲狀腺、乳腺 ?取材塊的大小2cmx1.5cmx0.3cm ?編號：數量、剩余組織記錄“留”，全部取材時記錄（全包）一包等，微小組織試做 ?重取材要記錄

活體小組織(小標本)取材：

組織標本體積小,在取材時應特別小心,用伊紅讓標本著色,并用插鏡紙包裹,以防丟失,應標明粒數.多瓶組織應將附號標清楚.標本的來源與收集(一)

1、臨床活檢

2、尸體解剖

3、實驗動物

（二）1、檢查申請單的姓名，標本的件數是否與之相符合。

2、標本是否符合要求。取材注意事項

1.及時、盡可能新鮮 2.迅速固定、冷藏

3.刀要快，不要擠壓組織

4.注意研究目的

培養

定量

對比觀察

臨床診斷

臨床病理取材注意事項

1、檢查申請單的姓名是否與標本標注的姓名相符

2、檢查申請單所列標本是否與實際標本吻合。

3、檢查申請單所列標本件數是否與實際標本件數吻合。

二

組織固定

概念：用化學試劑保持尸體、器官、組織和細胞固有形態

結構的過程謂固定

所用的化學試劑謂固定劑或固定液。目的：防止自溶、腐敗，保持良好結構 原理：使組織及細胞內蛋白凝固；

使有關成分沉淀、變性，成為不溶性物質 方法：浸泡

灌注：局部灌注、全身灌注

蒸汽熏蒸

固定的作用

固定的作用不僅是使細胞內蛋白質凝固，終止或減少外源性酶和內源性酶的反應，防止細胞自溶，以保持組織的固有形態和結構，更重要的是保存組織或細胞的抗原性，不但使抗原不致失活，還要使抗原不發生彌散，以免在免疫組化染色時產生過深的背景。固定的目的

1、能防止細菌的腐蝕和抑制組織的自溶

2、能凝固或沉淀細胞內或組織液的蛋白等

3、使組織硬化，便于切塊

4、對某些具有傳染性的標本，能防止其擴散

5、保存組織細胞中固有的物質

6、保存好大體標本

7、可增強染色

固定時間:

常規組織病理學: 可長時間固定

細胞病理學：可長時間固定

細胞化學：不宜過長，約1小時為宜

固定后處理：

充分洗滌

固定時間越長，洗滌時間也應相應增加 固定的注意事項

①一般應在離體30分鐘內固定,越及時越好,并將組織上的血液,分泌物沖洗干凈

②固定劑的量一般不少于組織塊總體積的4倍以上，一般為10--15倍，容器勿過小。

③固定的時間應視組織的種類和大小決定,一般小組織4-6小時,大組織18-24小時或更長。

④有特殊要求的須用特殊的固定劑;超微結構觀察：低溫固定

⑤不同組織在固定時應注意特殊的處理方法

⑤不同組織在固定時應注意特殊的處理方法

?為防止組織因固定劑作用而發生變形，對軟薄組織如神經、肌腱、腸系膜等應先平攤魚吸水紙上，在投入固定劑中，可防止蛋白質凝固而引起的扭曲變形；

?對含氣體而浮于液體表面的組織如肺，可連以重物使其下沉，或在組織上覆蓋脫脂棉，以防止組織表面干燥。固定液的選擇

1、盡量選擇對組織收縮少，滲透快的固定液

2、選擇較通用的固定液，既能做好HE的染色，又能做免疫組化標記

3、特殊的病例選擇特殊的固定液 如：

狂犬病——丙酮 磷酸酶——丙酮 糖原——無水酒精 ?。

固定液的分類

Ⅰ.醛類：甲醛、戊二醛、多聚乙醛、丙稀醛等 Ⅱ.氧化劑類：四氧化餓（奧酸）、高錳酸鉀、重鉻酸鉀等 Ⅲ.蛋白變性類：醋酸、甲醇、乙醇等 Ⅳ.其它：氯化汞，苦味酸等。固定液

甲醛溶液：福爾馬林，Formeldehyde

4％甲醛，或 10％福爾馬林

40％甲醛

用于無特要求的組織常規固定

乙醇（Ethyl Alcohol）: 95%

用于細胞涂片常規固定，糖原固定 乙醇乙醚混合固定液: 95% ：

95%乙醇+ 95%乙醚（1:1）

用于細胞涂片巴氏染色

固定液的使用

（一）甲醛（formaldehyde）

一般市售的含37-40%，平時使用都把它看為100%。它由甲醛氣體飽和于水而成。比重為1.12，有一股刺鼻的氣味。甲醛與組織蛋白質類的反應是多樣而復雜的，因為它能和多種不同的功能基團結合。如近來的抗原修復就是認為組織中的蛋白與醛產生交聯蛋白后，要將它們顯示出來，就必須應用溫度高達92℃以上的抗原修復液，才能將其交聯的醛鍵打開，與后來的抗體結合，將其表達出來。甲醛的優點：

1、收縮較小

2、固定較為均勻，穿透力強

3、能使組織硬化并富有彈性

4、能保存脂肪及脂類物質

5、成本較低

甲醛的缺點：

1、成分不純，含少量的甲醇，影響酶反應

2、含少量的甲酸，易產生色素

3、不能固定尿酸和糖類物質

4、易揮發、污染環境

5、易產生醛基、封閉抗原

應用甲醛配成的固定液有：

1、緩沖福爾馬林固定液（neutral buffered formaaldehyde）

NaH2PO4·H2O

4g

Na2HPO4（無水）

65g

蒸餾水

900ml

甲醛

100ml 2、10%福爾馬林固定液

甲醛

10ml

自來水

90ml 3、10%福爾馬林鹽固定液

甲醛

10ml

自來水

90ml

NaCl

0.9g

4、Bouin氏固定液

苦味酸飽和水溶液

75ml

甲醛

25ml

冰醋酸

5ml

5、Zonker氏液

氯化汞

5g

重鉻酸鉀

2.5g

硫酸鈉

1g

水

100ml 注：該固定液固定時間為16-24h，染色前應用碘酒除去汞鹽的沉淀，否則會影響染色后切片的觀察。

（二）酒精（alcohol）

有無水酒精（99.8%）和工業酒精（95%）在病理技術方面，酒精是一種重要的試劑，它可配成不同的濃度來進行脫水，如：60%、70%、80%、90%、95%等，在切片染色前，用酒精來除去二甲苯，在染完色后則用其來脫水。

應當注意的是，組織脫水時應根據組織的大小、器官或部位、取材的大小來確定脫水時間，一般認為濃度越低，脫水時間可以相對延長，如70%可用來長期保存標本，但如果在100%的酒精里時間就不能太長，否則組織易脆不利于切片。酒精可以與其它試劑混合，配成混合固定液，如AAF固定液。

酒精的優點：

1、可以保存糖原和尿酸結晶。

2、能在任何比例的情況下與水混合。

3、能溶解苯類物質，為染色法中的橋梁試劑。

4、能脫去切片上的水份。

5、可配成混合固定液。、可作為保存標本的固定液。7、可用來消毒。

灑精的缺點：

1、可溶解脂類及脂肪物質。

2、可沉淀白蛋白，球和核蛋白。

3、滲透力不強。

4、可脫去某些已著染切片的顏色。

5、不作為單獨的固定液。

6、價格昂貴。

三、石蠟包埋制樣 組織塊脫水：

逐級乙醇脫水

透明：二甲苯

浸蠟：65°C

包埋：溶解蠟

（一）脫水 ? 脫水就是利用脫水劑將組織內的水分置換出來，以利于有機溶劑石蠟的滲入，這一過程稱為脫水。

?脫水劑：乙醇

?一般情況下,應將大小標本分別脫水.標本脫水從低濃度開始,一般人標本從70%或75%乙醇,動物標本從50%乙醇開始。脫水后組織收縮、變脆。

人工脫水程序

(適應于3mm厚的組織塊)1、30%酒精 24h 2、50%酒精 24h 3、70%酒精 24h 4、80%酒精 24h 5、90%酒精 12h 6、95%酒精 4h 7、95%酒精 4h

細小組織脫水程序

（適合于胃、腸鏡活檢，肝、肺、腎穿刺活檢的組織）1、80%酒精10-15min 2、90%酒精10-15min 3、95%酒精10-15min 4、100%酒精10-15min

5、二甲苯5-10min

6、石蠟15-20min

1、人工脫水法優點：

（1）可根椐不同的組織選擇最佳時間。

（2）可避免細小的組織經受不必要的脫水時間,防止組織的硬脆．（３）可靈活掌握，隨時進行觀察和調整．

2、人工脫水法的不是之處：（1）需耗人力；

（2）必須在白天完成，晚上無法進行換液；

（3）如機器發生故障，組織塊被擱置在外邊，致使組織干涸，影響了制片的質量。

Shandan全封閉電腦控制全自動組織脫水機

該機由電腦、反應缸和試劑儲存缸三部分構成。

電腦屏幕可顯示時間、溫度、所需時間、是否用真空負壓等，可根據不同的時間要求，編制9套不同的組織脫水程序。

1、正常室溫脫水程序 A、10%福爾馬林

2h B、90%酒精

1.5h C、95%酒精

1.5h D、95%酒精

1h E、95%酒精

1h F、100%酒精

1h

2、加溫脫水程序

應用正常室溫的脫水時間，再編入加溫程序，加溫的溫度一般在37-40℃

3、真空負壓脫水程序

應用正常室溫的脫水時間，再編入真空負壓脫水程序

4、周末程序

A、10%福爾馬林10h B、90%酒精10h C、95%酒精10h D、95%酒精10h E、95%酒精10h F、100%酒精2h

G、100%酒精2h H、100%酒精2h I、二甲苯1h J、二甲苯1h K、石蠟65℃真空負壓1h L、石蠟65℃真空負壓1h

該機的特點：

1、容量大，一次可處理250-300個包埋盒。

2、全部密閉，試劑不易揮發，保護了環境。

3、帶有定期的攪動裝置，使組織固定均勻，脫水徹底，浸蠟充分。

4、脫水過程可使用真空負壓和加熱。

5、該機占地量小。脫水方法及注意事項:

1.常用試劑為乙醇。

2.快速石蠟切片常用丙酮為脫水劑，尸體解剖標本一般在無水乙醇后加丙酮。

3.因為脫水劑的新舊影響脫水時間,必須靈活掌握,根據本實驗室情況,定時更換脫水劑.?

可用作固定液,也是一種比較好的脫水劑。脫水能力強、速度快,可配制不同濃度進行脫水。但一般情況下,多用在無水酒精的補充脫水。

丙酮脫水性比酒精強,但容易使組織過度硬化,所以應適當掌握脫水時間。

（二）脫鈣

?骨和其他鈣化組織制片時應先脫鈣再切片。將組織置于脫鈣劑中，每日更換新鮮液、直至組織軟化為止。

?常用脫鈣劑是5%---10%硝酸溶液。硝酸 5－10ml 和蒸餾水 加至 100ml。作用迅速，對組織不膨脹，但每日需要更換新鮮溶液，最好早晚各一次，一般1－3天完成。

?脫鈣時間視組織大小和含鈣多少而定，以大頭針可輕松刺入為準。

1．取材：骨組織固定于10%福爾馬林24小時后再鋸

取厚度約0.5厘米骨片。

2．固定：再以10%福爾馬林固定2天。

3．將組織置于脫鈣劑5%---10%硝酸溶液中，每日更換新鮮液、直至組織軟化為止。

4．流水沖洗24小時（除酸）。

5．進行常規脫水，透明，浸蠟，切片。

（三）透明 ?透明的目的:

因為大多數脫水劑不能和石蠟相混合,組織內的水份脫干凈后,必須通過透明劑的作用,才能便于浸蠟包埋.↓

↓

既能溶于乙醇又能溶于石蠟

↓

因在此過程中，組織中的乙醇被透明劑取代，使其折光率接近組織蛋白的折光率，組織呈不同程度的透明狀光線可以透過，故稱透明。

常用透明劑種類及注意事項:

1.二甲苯是最為常用的一種透明劑，還有很多種，如三氯甲烷（氯仿），香柏油，苯酚，松節油等。

2.透明要注意的關鍵是時間：

透明時間不夠，石蠟不能完全進入組織，影響到包埋切片 ；但是如果透明過度，組織發硬發脆影響切片質，故組織在二甲苯中不能久留.特別是肝脾等組織.3.制片過程有兩次透明：

第一次組織脫水后透明；

第二次切片染色透明。

（四）浸蠟

1.組織經透明后，在熔化的石蠟內浸漬的過程，稱浸蠟。

2.組織經過透明后要浸入石蠟內,目的是去除組織中的透明劑(二甲苯)而代之以石蠟,并滲入組織內部,把軟組織變為有適當的硬度的蠟塊以便切片.3.一般浸蠟須經過2到3次,石蠟的溶點為54-60度左右,目前常用的脫水機上是兩個蠟缸.浸蠟時要注意掌握好石蠟的溫度和浸蠟的時間

浸蠟作用

1、可起到填充、支撐的作用。

組織經酒精、二甲苯的作用后，其中有許多物質被溶解去，如脂肪及脂類物質、糖原等。因而遺留下許多腔隙，妨礙了切片。在切片時由于誘導劑的作用下石蠟可以浸入到物質的各個角落，當石蠟冷卻時，浸入到各處的石蠟就填充在各處的空隙，包括血管和器官等。使組織保持原有的形狀，也使包埋后蠟塊保持平整，便于切片。

2、使切片能完整的切除并保持切片的美觀

浸蠟的方法 ①傳統浸蠟法

將透明好的組織放入熔化的石蠟中浸漬一定的時間。②真空負壓浸蠟法

將透明好的組織放入浸蠟缸中，然后移入真空負壓箱內，或者脫水機自身配有的真空負壓裝置進行浸蠟。

浸蠟時間，真空負壓數見表。

注意

為了盡可能排除透明劑，浸蠟可以分兩級或三級進行。以熔點較低（54度以下）的軟石蠟作為第一步，然后再換為熔點較高（60-62度）的石蠟作為第二步，第三步。浸蠟時間1－4小時，或更長，并使之過夜則較易切割。但過長會使組織脆硬，切片時易破碎，過短，浸蠟不夠，難以制成高質量切片。

（五）包埋

?包埋，就是將已經經過固定，脫水，透明，浸蠟的組織塊從最后的蠟浴取出置入充滿熔融石蠟的包埋框內，包埋成塊，使組織和包埋劑相熔一體并迅速冷卻，這個程序稱為包埋。?包埋劑凝固后，進一步加強了組織的硬度和韌度而便于進行切片。

包埋時的注意事項：

1、所使用的鑷子，包埋框，最好放于37的恒溫箱內，以免這些物質過冷（在冬天時）而過早冷卻包埋的石蠟，影響包埋的質量，這種現象在沒有石蠟包埋機的單位較為明顯。

2、打開脫水盒，取出組織塊，將一平整的大的一面朝下，并用鑷子壓平，使其保持在一水平面上。

3、每包埋完一塊，應附上標簽，以免出差錯或張冠李戴。如為塑料包埋盒，則可少去這一步，極為方便。

4、對于管腔的組織如血管、腸、氣管等應豎起來包埋對于皮膚及胃、腸、等組織應辯認好方向。仔細包埋。

5、細小多塊的組織，可包埋在一個蠟塊，但應保持在同一平面上，以免影響切片。

6、包埋完后，蠟面凝固，便可放入水中加速硬化，如帶有冷凍設備的包埋機，則可少去這一步。

7、包埋時組織塊不能使其冷卻凝固，應保持組織塊上的蠟處于熔化狀態，這樣包埋時才能和包埋蠟溶為一體。如果組織塊自身的蠟先凝固，包埋后的蠟塊切片時組織與邊蠟分離切不成佳片嚴重的會崩掉，影響切片。

修切蠟塊

應用包埋框包埋的組織塊，切片前一定要將其切好，組織塊與邊蠟應保持有0.5cm的厚度，才有利于切片。

1、有利于切片，使切片能連續切出。

2、減少損傷刀口延長刀口的壽命，以利多切蠟塊。

3、有利于切片的裱貼。例如一張載片要裱兩塊組織時，修切好的蠟塊，就能使它們擺得整齊。

?1.組織取材2毫米厚度，固定于福爾馬林數小時

后再換以新鮮福爾馬林固定數小時。2.組織流水沖洗6－12小時。3.70％酒精2－4小時。4.85％酒精2－4小時。

5.95％酒精（Ⅰ）2－4小時。6.95％酒精（Ⅱ）2－4小時。7.100％酒精（Ⅰ）2－4小時。8.100％酒精（Ⅱ）2小時。9.二甲苯（Ⅰ）0.5－1小時。10.二甲苯（Ⅱ）0.5小時。11.浸蠟（Ⅰ）2小時。12.浸蠟（Ⅱ）2小時。13.組織包埋。

快速切片診斷是在數十分中或半小時左右制成切片并作出診斷的一種手段，主要用于手術中決定手術的切除范圍和手術方式。快速切片的方法包括冰凍切片和快速石蠟切片。

?制作快速石蠟切片時，切取組織應該薄小，從固定、脫水到浸蠟的全過程都要加溫，一般是先將各種試劑在超聲波快速石蠟脫水儀中預熱，恒溫下操作，整個過程大約在10－15分鐘即可完成

?快速石蠟包埋法操作過程

（1）先取病變組織于AAF中固定3－5分鐘。（2）95％酒精1分鐘。（3）無水酒精1分鐘

（4）正丁醇1/3丙酮2/3混合液1分鐘（5）二甲苯1分鐘（6）浸蠟1－2分鐘（7）包埋

（六）組織切片 切片機類型：

旋轉式切片機

滑動式切片機

（六）組織切片

?石蠟切片的步驟：

1.切片前先把切片刀磨鋒利，將修好蠟塊置冰箱冷凍后放在切片機上 2.將蠟塊固定于切片機頭上的夾座內，調整到稍離開切片能夠切到的位置上，注意蠟塊組織切面與切片刀口成5-10度夾角。

3.再調整蠟塊組織切面恰好與刀口接觸，旋緊刀架，固定好機頭。

4.根據需要調整切片厚度，一般3--5μm為宜。

切片的步驟：

5、搖動切片機手輪先進行修整切片，直到切出完整的最大組織切面后，再進行切制。

6、實踐中可用右手轉動切片機手輪，左手用毛筆托起蠟片，協調地進行切片操作。

7、切下的切片帶，一端用鑷子輕輕拉起，應盡可能將切片帶拉直展開，用毛筆將切片帶從刀口向上挑起，拉下切片帶，然后輕拖鋪于水箱內展平，水溫45--55℃為宜。

石蠟切片的步驟：

8、切片附貼前，可先涂蛋白甘油，防止切片在染色時脫片；附貼后放溫箱內（65℃左右）烘烤10--30min，也可置于微波爐內溫火一分鐘后切片上石蠟完全融化，然后染色。

冰凍切片法：

?常用低溫冷凍切片機

?快速將新鮮組織固定在冷凍切片機中，冷凍數分鐘即可切片，數分鐘即可完成，稍后進行快速染色。

?常用于手術中快速診斷或組織化學染色和保存脂肪做特殊染色

組織切片 注意事項:

1、持蠟器一定要將蠟塊挾緊挾牢，以免使其跳動而影響切片。

2、刀一定要保持無口、鋒利，一次性刀片做到這一點較容易，大刀片要做到上述要求就比較困難。因此就要認真地磨好刀才能保證切片的質量。

3、裱片的水溫不能過高或偏低，高者可溶化所切出的切片，低者則展不開切片，使切片留有皺紋，最適的水溫應是比石蠟的溶點低2-5℃，如石蠟的溶點為60-62℃，裱片的水溫則可達55-57℃，余者類推。

4、對于細小的組織，應特別小心修切，防止一刀切下，全部皆休的情況。

5、對于多塊細小的組織，原則上是每一細小的組織都應有一個切面。修切的時候更應特別小心。

6、每切完一塊，裱于載片后應隨時刻上編號，以防止差錯或混亂的現象發生，減少差錯的苗頭。

7、挑切片的毛筆，應選用細小柔軟的毛筆為佳，用時向上挑，決不能往下，以免刀口傷及毛筆。

石蠟切片常可出現的問題

1、石蠟切片不能形成帶狀的原因是室溫低，蠟塊周邊不整齊。

2、石蠟切片，切片卷起的原因是刀的傾斜角度過大或刀不快。

3、石蠟切片出現的皺折的原因是石蠟溶點低，純度不足。

4、石蠟切片出現厚薄不均勻的主要原因是組織塊挾不牢固或組織堅硬如肌瘤等。

5、石蠟切片出現波浪狀的原因是組織塊太硬或骨組織末完全脫鈣。

6、石蠟切片，當切片放入水中裱片時，切片周圍的蠟迅即向四邊散開，其主要原因是組織脫水不徹底，浸蠟浸不進去。包埋蠟中含有二甲苯。

7、石蠟切片，當切片切出后蠟塊向上時，把已切出的切片帶走并損壞的原因是切片刀背面留有殘余石蠟。

8、組織切片常見的人為性色素沉著物是福爾馬林色素，常見的器官是肝、脾。

9、組織切片常見的外源性色素是碳末，常見的器官是肺。

10、石蠟切片時切片刀的最宜角度是

5℃-30℃

11、一般所稱呼的標準室溫是20℃

12、組織浸蠟的溫度最好為

13、石蠟溶點的最高度高2-3℃即65℃。冰凍切片

一、種類：

1、低溫恒冷箱切片法

2、二氧化碳冰凍切片法

3、甲醇循環制冷冰凍切片法

4、半導體冰凍切片法

5、氯乙烷冰凍切片法

二、冰凍切片的目的

1、在手術進行中。突然發現病人的病變與原診斷不相符合或者懷疑時需要病理給予確定。

2、了解淋巴結內是否有轉移的腫瘤細胞或者轉移的程度，以利于確定以后的治療措施。

3、對于已確定惡性腫瘤的病人則需要了解其手術范圍是否足夠，上下切緣是否有殘存的腫瘤細胞。

4、在剖腹探查所發現的腫塊。

5、顯示組織中的脂肪類物質。

6、某些酶的顯示如ATP酶琥珀酸脫氫酶等。

7、神經病理學中的某些染色法。

8、對某些物質所進行的免疫熒光的研究。

三、冰凍切片的操作

（1）本室現有Shandon-AS620E型冷凍切片機的主要性能。左邊的切片臺可達到-60左右，冷凍箱內在0～-30間可任意調節，箱面上有電子控制板，裝有急速冷凍，即放上標本啟動該鍵機器馬上進行冷凍工作并持續10分鐘；有冷凍臺溫度顯示冷凍箱內溫度顯示；有即時除霜內溫度顯示；

有即時除霜鍵，啟動該鍵機器可持續工作15分鐘，將工作間頂部后面的制冷柵上的霜除掉；有照明鍵，啟動該鍵可照明工作間；有消毒鍵當進行一星期的工作后，啟動該鍵可對工作間進行消毒；有工作間面的密鎖鍵啟動鍵可將工作間鎖住，除此之外該機的左邊有四個按鍵兩個為快速自動進退、兩個為微小進退、另有一個手動旋鈕，調節修塊時的進退。（2）切片取末經固定的組織不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整。最好24×24 × 4mm。

（3）取出組織支承器，放平擺好組織周邊滴上包埋劑，速放入冷凍臺上冰凍，小組織應先取一組織支承器滴上包埋劑讓其凍成一個小臺再放上細小組織，滴上包埋劑。（4）將冷凍好的組織塊夾緊于切片機上修平切面。

（5）調好厚度，根椐不同的組織而定，一般在5-10um.（6）調好防卷板，制作冰凍切片的調節，關建在于防卷板的調節，這就要求要細心，準確，將其調校，調校至適當的位置，此時切片。冰凍切片在第一時間順利地在刀與防卷板之間通過，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時便可掀起防卷板，取一載片，將其附貼上即可。

（7）用于附貼切片的載片，不能存放入冷凍的地方，于室溫存放即可。因為當附貼切片時，從室溫中取出的溫差，當溫度較高的載片附貼上溫度低的切片時，由于兩種物質溫度的差別，當它們碰撞在一起時，分子間的彼此轉移而產生了一種吸附力。使切片與載片牢固地附貼在一起。如果用冷藏的載片附貼切片，就沒有這種現象發生。

（8）應視不同的組織選擇不同冰凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根椐不同的組織而定，不能一概而論，例如：切未經固定的腦組織，肝臟組織和淋巴結組織等，冷凍箱的溫度可調在-10℃～-15℃左右。切甲狀腺，脾、腎、肌肉等組織,則應調在-15℃ ～-20℃左右。切帶有脂肪的組織如乳腺組織，應調在-25℃左右，如為大量的脂肪組織時，應調至-30℃。

四、冰凍切片時的注意事項

1、防卷板和切片及持刀架上的地方應保持干凈經常用毛筆挑除切片殘余及用柔軟的紙張擦。因為包埋劑常常貼在上述的地方。如果不把它們去除掉，就會影響切片。使切片不能完整切出。

2、應用于冰凍切片的組織不能過大過厚，過大難以切出好片過厚冰凍費時，最好的取材應在24 × 24 × 2cm。

3、冰凍組織前組織放于組織支承器上應視組織的走勢來給予放置，然后四周加上包埋劑，保持周邊的整齊，如出現凹凸不平的地方，可用刀子將其修平，才不致于影響切片。

4、組織塊不須經各種固定液固定，尤其是含水的固定液在未能達到固定前更不能使用。臨床快速冰凍切片不須要預先固定，一是為了爭取時間，二是固定了的組織反而增加了切片的難度。如果使用了未完全固定的組織做冰凍切片，就會出現冰晶，這是因為含水溶液的固定液在組織未經固定前，其中的水份也會滲入到組織當中去，當冰凍發生時，這些水份就存留于組織中形成了冰晶。

5、當切片時，如果發現組織冰凍過度時，可將冰凍的組織取出來，于室溫中停留片刻，以利于軟化組織，使其不致于過度冰凍。

五、冰凍切片的快速染色

1、用普通染色進行染色（HE染色）

（1）固定、切片用電吹風吹干后于10%的福爾馬林鹽或純丙酮中固定2分鐘后自來水沖洗。（2）滴少許蘇木素染液于切片上于酒精燈上加熱染色，當見有蒸汽時即可中止染色，快速水洗、分化、用熱水促其藍化、伊紅對比染色、酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。

2、超聲波快速染色法

（1）固定：切片的固定與上同。

（2）把水洗后的切片插入裝有蘇木素的玻璃瓶中超聲波處理30sec或1min,水洗、分化、放于裝有熱水的玻璃瓶中、超聲波處理30sec,酒精脫水，二甲苯透明封固。

結果：經上述各種方法處理后所制作的切片。細胞核呈藍色，軟骨基質鈣鹽深藍色，胞漿呈深度不同的粉紅色，嗜酸性顆粒為鮮紅色，膠原纖維量粉紅色，肌纖維呈鮮紅色，彈力纖維呈亮紅色，切片完整，未見有冰晶出現。第六章 切片染色與封固

一、染色：

利用染料在組織切片上給與顏色，使其與組織或細胞內的某種成分發生作用，經過透明后通過光譜吸收和折射，使其各種微細結構能顯現不同顏色，這樣在顯微鏡下就可顯示出組織細胞的各種成分。

一、染色 ?目的:

將組織切片浸入染色劑內,使組織或細胞等成分染上不同的顏色 產生不同的折射 ,以便在光學顯微鏡下觀察.?方法:

蘇木素-伊紅染色稱常規染色,又稱HE染色.其他染色方法稱特殊染色(特染).染色原理

1、化學反應：

利用組織細胞內酸堿性的不同，其與陰陽離子結合力的不同，染色也不同。如：細胞核呈酸性＋堿性染料(氧化蘇木素)→深藍色

細胞漿呈堿性﹢酸性染料(伊紅染料)→不同深淺的紅色

2、物理作用：

①毛細管作用及滲透作用

②吸收和溶液作用：如復紅溶液為紅色，所染

組織也為紅色，但干燥復紅為綠色

③吸附作用 染色術語

?⒈媒染劑：與染料或組織發生結合作用，促進染色能力的物質，如鐵明礬、鉀明礬等。

?⒉促染劑：能使組織易于著色的物質，它與媒染劑不同，不直接參與染色反應，如醋酸、碳酸等。

?⒊分化劑：如酸堿類分化劑，又稱退色劑；氧化退色劑，主要用于漂白作用。染色步驟: 脫蠟

（1）二甲苯I

5分鐘（2）二甲苯II（應完全透明）

5分鐘

逐級降濃度酒精水化脫二甲苯

（3）無水酒精I（變為不透明）

1－2分鐘（4）無水酒精II

1－2分鐘（5）95% 酒精

1－2分鐘

（6）80% 酒精

1－2分鐘（7）自來水洗

片刻

染色步驟

（8）

蒸餾水

片刻

（9）

蘇木素液染核

10—15分鐘（10）自來水沖洗

片刻

（11）1%鹽酸酒精分化

0.5—1分鐘（12）流水沖洗

片刻（13）碳酸鋰飽和水溶液反藍

1分鐘

（14）流水沖洗

5--10分鐘（15）復染 0．5％伊紅水溶液（對比染色）

2—5分鐘 染色步驟: ?逐級升濃度酒精脫水（若為醇溶伊紅可直接人90％酒精）

（16）自來水洗（分化伊紅）

片刻（17）95％酒精I

1－2分鐘（18）95%酒精 II

I—2分鐘（I9）無水酒精 I

1—2分鐘（20）無水酒精II

l－2分鐘 ?透明

（21）二甲苯I

5—10分鐘

（22）二甲苯II

5—10分鐘

（23）蓋玻片下封固

?染色結果: 細胞核：藍色，軟骨基質鈣鹽等深藍色；細胞漿深淺不同的粉紅色，嗜酸性顆粒鮮紅色；膠原纖維呈粉紅色，肌纖維呈鮮紅色，彈力纖維呈亮紅色，紅血球為桔紅色，蛋白基質為粉紅色。

? HE（Hematoxin Eosin,HE〕染色 ?1〕蘇木素染色配方： ?

蘇木素

1g ?

純酒精

10ml ?

鉀明礬

20g ?

蒸餾水

200ml ?

氯化汞

0.5g ?2〕伊紅染色配方：

伊紅

0.5-1g ?

蒸餾水

99ml 伊紅染液 ?

配方：伊紅Y（水溶）

0.5—lg

蒸餾水

99ml

若取用伊紅Y（醇溶性）應溶于99ml75％或95％的乙醇中。若在伊紅液中加人0.5毫升冰醋酸，可加速其染色過程，并使胞漿的色澤更為艷麗 HE染色過程中的要點： ?切片脫蠟務必干凈徹底

?脫苯和酒精要徹底

?蘇木素染色液配制及鹽酸酒精分化較為重要

?各級水洗應充分及伊紅染色要適當

?切片固封樹膠要適當

染色時的注意事項

（1）切片烘烤以切片附貼牢固為原則，否則容易掉片。（2）切片脫蠟一定要徹底，不然會導致染色深淺不一。

（3）切片染蘇木素前可令其無水化，這樣可延長蘇木素的壽命。因為每次染色前，切片水洗，然后進入染液雖然每次帶入的水分很少，但隨著次數的增加，所帶入的水分足可以稀釋染液影響染色的質量。

（4）切片在蘇木素的染色時間應充分寧過勿不足。對于初學者來說更應過染，否則分化會過度導致染色過淺。

（5）切片分化時，要根椐不同的組織來確定分化時間，并不斷積累經驗。

（6）伊紅染色時間也要充分，經低濃度灑精時應仔細觀察，必要時快速通過，以免過于褪色。

（7）切片致無水酒精后，不要在控干無水酒精時讓切片干涸，可以不經控干直接地進入碳酸二甲苯（也可以進入二甲苯酒精混合1：1）碳酸有較強的吸水性透明也好很適合南方地區。（8）切片從二甲苯中取出封固時，切不能讓其干涸，因南方地區空氣潮濕干涸的切片與空氣接觸，可吸收其水份。這樣的切片很容易裉色。切片不干涸，表面被著二甲苯，由于它不溶于水起到與水隔絕的作用。

（9）滴中性樹膠封蓋切片，膠不能太濃，太濃膠難以均勻鋪開，且易產生氣泡，又不能太稀過稀的膠由于二甲苯含量較多，當切片干燥時，二甲苯揮發掉，膠封的切片收縮，即可導致一半切片沒有被膠封固的結果。最合適的膠應是滴下成珠。

（10）封固切片時，盛膠的瓶子及瓶蓋四周不要留有余膠，否則瓶蓋難以打開。因此每次用完后都必須將其擦干凈。當打不開瓶蓋時應放入烤箱中烘烤，即可打開。

（11）標簽附貼要認真，不要貼得歪歪斜斜，影響切片的外觀.1、切片機的使用，應如何注意保養？

切片機座應注意平穩，切片時應注意搖轉速度的快慢要盡量保持均勻一致。滑動面要經常滴上機油，以利于滑動及旋轉自如和防銹，切片完后除去殘蠟，取下切片刀，先用濕布擦去余蠟，繼用干布擦干，再用油布擦一遍，最后用罩蓋好切片機，以防灰塵落于機上，影響機器的運轉。

2、化學試劑使用時的注意事項

（1）已打開的藥品或染色時的玻璃瓶染色液，每次用后即隨手蓋緊，以免揮發，易揮發易吸潮的藥品用后蠟封。

（2）易燃的試劑要遠離火種，謹防火災，因病理科有較多的易燃化學試劑。

（3）強酸，強堿試劑或有腐蝕性的廢染液，不要直接倒入下水道，以免腐蝕下水道，造成不必要的損失。

（4）易變質或易氧化失效的試劑，應標明配制日期，妥為保存，有的只能一次性用完，因此,應本著節約的原則，用多少，配多少，切勿造成浪費。

3、石蠟切片刀應怎樣保養好？

切片刀要經常磨，保持鋒利無刀口，每次用完后用布擦干凈，再用油布擦，以防刀口生銹影響切片。

4、如何使樹膠處于中性狀態？

取少量無水碳酸鈉，加入到封固用的樹膠中攪拌后放置數日取其上清液，即為中性樹膠。

5、切片染完蘇木素后的分化，應該如何控制和注意什么問題？

（1）分化液中鹽酸不能高于1%，否則會因分化過強而將已著色的顏色大部分脫水，造成染色過淺。

（2）對各種組織應視情況而定，如淋巴結的切片，應分化較長時間等。

（3）分化完后，應在顯微鏡下觀察，如發現核中的物質不清楚，則應繼續分化至清晰為止。（4）要認真操作，細心觀察，不斷總結。

6、切片欠佳表現在哪些方面？

切片欠佳的主要表現有：切片見有刀痕皺折、橫裂、折疊、不全、破碎、組織松散。厚薄不勻或呈波浪狀等現象。二

封固

蓋玻片下封固

結果：胞核呈藍色，胞漿呈紅色，紅細胞呈桔紅色，其它成分呈深淺不同紅色

國產中性樹膠 封片,注意樹膠量適中,掌握封片手法, 防止氣泡.二

封固 注意事項：

?1.配制封固膠時濃淡要適宜，以恰能滴下成珠為宜，用前攪拌均勻。?2.使用時要適量。

?3.封固切片時，切片上剩余二甲苯不要過多也不要過干，如遇少量氣泡可用鑷子輕壓蓋片，切勿放烤箱內，如氣泡不易壓出需將切片置二甲苯后重新封固。第七章 特殊染色

HE染色雖是一種快速、經濟、且易掌握的方法，但它不能回答病因學、Z組織發生及發病機制等方面的許多問題。而特殊染色可以協助解決病理診斷問題。

特殊染色法是為了達到某些特殊的要求，或是為了觀察特殊的組織結構。

一、脂肪染色

主要用于心、肝、腎的脂肪變性，動脈粥樣硬化，以及因脂肪栓塞導致的死亡病例鑒定等。

試劑配制：蘇丹染液

蘇丹III或蘇丹IV0.5g，70%乙醇250ml，丙酮250ml 染色方法：

1.標本常規甲醛固定后流水沖洗12h；

2.用濾紙吸干標本表面的水分，把標本放入蘇丹III染液中浸泡30min； 3.用70％乙醇分化，以脂肪組織呈橙黃色，其它組織不著色為佳； 4.水洗后浸存在5％甲醛液中，為了防腐可加入適量的防腐劑。

二 彈力纖維染色法

病理診斷應用彈力纖維染色，目的是觀察組織內彈力纖維是否增生或破壞、斷裂和崩解，從而幫助診斷。?試劑配制：

地衣紅酒精液

1g ?

70%酒精

100ml ?

濃鹽酸

1ml ?結果：Taner-Unna法，彈力纖維呈深棕紅色。

Verhoeff鐵蘇木素染色法，彈力纖維呈黑色。

Verhoeff鐵蘇木素染色法 三、六胺銀（PASM〕染色

? 在腎臟活體組織檢查和一些真菌感染的組織選用此方法 PASM染液的配方：

2％硝酸銀水溶液3ml； ?

3％六次甲基四胺液25ml； ?

5％硼砂2ml。

?注：2％硝酸銀配制胺溶液，染色時間40分鐘，溫度 ?

55~60℃，隨時鏡下觀察便于控制。PASM染色法：

?（1〕1％過碘酸水溶液內染10分鐘； ?（2〕自來水沖洗，蒸餾水沖洗；

?（3〕入5％鉻酸水溶液40分鐘，出此溶液后用1％亞硫酸鈉除掉鉻酸； ?（4〕自來水洗數次，蒸餾水洗3－4次；

?（5〕入六胺銀染液（50－60℃〕40分鐘，20分鐘后，每5分鐘鏡下觀察一次，蒸餾水洗四次； ?（6〕入0.2%氯化金水溶液1－2分鐘，蒸餾水洗三次； ?（7〕入5％硫代硫酸鈉水溶液1－2分鐘，蒸餾水洗數次； ?（8〕復染HE，脫水、透明、封片

?結果：底膜呈黑色，網狀纖維呈黑色，細胞核呈藍色，背景呈粉紅色

四、淀粉樣物質染色（介紹剛果紅染色）

?.淀粉樣物質是一種嗜伊紅性物質，性質屬于糖蛋白成分。組織出現此物質稱為淀粉樣變性。

?1〕試劑配制： ?（1〕剛果紅染色液。剛果紅1g，蒸餾水100ml； ?（2〕Harris蘇木素染色液。

淀粉樣物質染色（介紹剛果紅染色）?2〕染色步驟：

?（1〕蘇木素染色液浸染2分鐘； ?（2〕0.5%鹽酸乙醇分化數秒鐘； ?（3〕流水洗，蒸餾水洗2次； ?（4〕剛果紅染色液中25分鐘； ?（5〕無水乙醇迅速脫水2次； ?（6〕二甲苯透明，中性樹膠封固。

?結果：淀粉樣物質呈紅色，細胞核呈藍色。

第八章

細胞學檢查技術

?細胞學檢查是腫瘤病理診斷和普查較常用方法。

?特點：簡便、快速、無創傷，可反復多次檢查。

?對于腫瘤，只做初步診斷，確診依據活體組織學檢查。常規細胞病理學技術

一、取材、涂片制備

痰涂片、胸水、腹水及尿液制片

二、固定

三、染色(巴氏染色)

常用固定液

（1）等量95%乙醇和乙醚混合液（2）氯仿酒精固定液（3）95%酒精固定液（4）福爾馬林固定液

細胞學研究，固定液選擇要根據實驗要求條件而定，如用細胞涂片作原位PCR，固定液要選用多聚甲醛。

巴氏染色步驟

1．標本95％酒精固定3-5分鐘 2．Harris蘇木素液5-10分鐘

3．水（蒸餾水或自來水）漂洗2-3次 4．1％鹽酸水溶液（或1％鹽酸酒精液）

浸1-3次

5．自來水浸洗1-2次

6．自來水或稀碳酸鋰（100ml蒸餾水中加碳酸鋰飽

和液1滴），涂片返藍為止

7．依次置入70％→80％→95％酒精，各2分鐘

8．桔黃G6液，1分鐘

9．95％酒精Ⅰ、Ⅱ缸，各1分鐘 10．EA36液，5分鐘

11．95％酒精Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 各1分鐘 12．無水酒精Ⅰ、Ⅱ，各1分鐘 13．二甲苯Ⅰ、Ⅱ，各2分鐘 14．中性樹膠蓋片封固

涂片制備 ?注意要點：

1.涂片動作要輕柔；

2.涂片要均勻，不易太厚或太薄； 3.涂片時要避免來回摩擦損壞細胞。

?適宜的涂片是涂片的細胞占玻片的2/3，在鏡下每個視野內都布滿細胞，間隙很小。涂片固定 ?1.濕固定法:

即趁標本新鮮而濕潤時即投入固定液內，這種標本染色后，染色鮮艷，結構清楚。

常用于痰液涂片、陰道涂片、宮頸涂片、穿刺涂片、食管拉網術涂片等。?2.干燥固定法：

即等待涂片自然或吹風機吹干后在固定。?固定液：95%酒精

?固定時間：10--20分鐘 ?染色方法：常規HE染色

第九章 大體標本制作有關知識 ?1.大體標本的收集

通過尸體解剖和活體組織（包括外科手術切除標本和活體組織穿刺標本〕檢查時發現并收集。

?2.大體標本的取材：

越新鮮越好

3.大體標本的固定

?1〕固定的目的：

將受檢組織盡快地侵入固定液內，使組織和細胞的固有成分迅速凝固，防治自溶和腐敗，使其保持與生活狀態有相似的結構，以利于切片和觀察。

?2〕固定液的選擇：

A.甲醛（Fomaldehyde〕，又稱福爾馬林，其濃度在4％，它是一種還原劑，極易揮發，散發出強烈的刺激性氣體，使人流鼻涕、流眼淚，呼吸道有異物感。B.95％酒精（乙醇〕，除具有固定組織的作用外，尚有脫水作用 3.大體標本的固定 ?固定要求：

1.固定后達到防腐的目的；

2.能長期保存組織原有的體積和特色；

3.標本自然顏色長期保存后再做組織切片也不影響染色效果 ?一般用10%甲醛溶液固定，不易用有色的混合固定液。

2.動物標本取材:

①動物致死法

麻醉法,空氣栓塞法,斷頭法,擊頭法,股動脈放血法等,要求動作迅速,及時解剖,取材與固定

②動物取材注意事項:

準備好鋒利的刀剪,固定液,取材應新鮮,最好是心臟還在跳動時取材,并立即投入固定液.組織塊厚度不超過3mm(應將組織上的血液,滲物,粘液糞便等用生理鹽水沖洗干凈,選好組織塊的切面,切除不需要的部分,再固定),應盡可能維持組織原形,對神經肌肉皮膚組織,可將其兩端固定在木板或硬紙板上,然后再固定.用化學反應原理，在切片上滴加某種化學試劑，使之與組織或細胞中的生物化學物質結合，再用顯色劑使之顯色，達到定位、定性地顯示組織或細胞中的某種物質成分，這種技術稱為組織化學和細胞化學技術。其結果可用顯微鏡和電鏡觀察。結合定量病理學技術，還可對有關成分定量。

? 糖類 ? 脂類

? 核酸

? 酶類

? 膠原纖維 ? 彈力纖維 ? 神經纖維

? 細胞膜、核膜結構

概念：免疫組織化學技術是指利用已知的抗

體與組織中相應的抗原結合，并利用

顯色劑在原位將抗原物質顯示出來 原理：抗原＋抗體＋顯色劑

特點：在組織中原位顯示某種特異性抗原 常用顯色劑種類：酶、金屬粒子、同位素

生物素、化學顯色劑（DAB）結果觀察：顯微鏡、透射電鏡

抗 原

←

組織中

+

抗 體

←

試劑

↓

抗原抗體復合物

+

第二抗體

← 標記有顯色底物

↓

顯色反應

← 顯色劑(DAB)

第二篇：病理-病理科技術員職責

病理科技術員職責

主任技師職責

(1)負責制訂病理技術室的建設及發展規劃。

(2)負責病理新技術的開發及應用。

(3)精通各項技術室工作并指導各項技術工作，解決各種疑難技術問題。

(4)組織技術室人員學習，提高業務能力。

(5)負責制訂進修技術人員的培訓計劃，具體落實安排及指導。

(6)組織技術室開展科研工作及參加科內外科研工作。

(7)在科主任領導下負責儀器、設備、試劑等的選購工作。

(副主任技師按分工履行主任技師崗位職責的相應部分)主管技師職責

(1)獨立承擔合格的常規切片、冷凍切片及涂片制作。(2)獨立承擔20項以上組織化學染色工作。(3)獨立開展免疫組化技術工作。

(4)協助上級技師承擔輔導進修技術人員的教學工作。(5)在上級技師指導下，獨立開展或參加有關科研工作。

(6)參加巨檢及尸檢記錄工作，協助醫師做好臨床病理討論會前的準備工作。(7)在主治醫師指導下，承擔或參加大體標本攝影及大體標本制作工作。(8)承擔儀器的維修、保養工作。

(9)在沒有主任技師的科室，力所能及地承擔主任技師的相應工作。技師職責

(1)獨立承擔合格的常規切片、冷凍切片及涂片制作。(2)在上級技師指導下，參加或承擔部分主管技師的工作。

(3)在沒有專職檔案管理員、文秘相應編制的科室，應根據實際需要分別承擔下述任務： 收費、資料歸檔、各項登記工作、診斷報告書的打印及發送等。

第三篇：病理技術員崗位工作職責

技術員崗位工作職責

一、病理技術員必須具備良好的職業道德、高度的責任感和嫻熟的操作技能。

二、每位技術員要認真學習各種儀器設備的使用與維護，要以主人翁精神愛惜各類儀器設備，杜絕任何損害儀器設備的操作和行為。

三、技術員要謹慎細致地處理好制片過程中每一環節。不允許粗心大意，以免張冠李戴，貽誤病人。

四、技術員要及時更換和配制好各類有關：工作液，確保標本處理質量。

五、技術員要與診斷醫師密切協作，共同處理標本制作過程中出現的各種問題。不允許單方面一味推卸責任，以免損害病人利益。

六、技術員要嚴格把好切片質量關，進修及實習人員未經考核合格者，不得單獨制片和擅自操作各種貴重儀器。

第四篇：病理技術員在分子病理領域作用淺談范文

病理技術員在分子病理領域的作用 浙江大學附屬第一醫院病理科 丁偉

分子病理目前可以分二大類：一類是建立在形態學基礎上的（比如her2熒光原位雜交、顯色原位雜交等）檢測；另一類是建立在PCR平臺上的（比如測序、熒光定量PCR等）數據檢測；報告有二種：一種僅僅是對檢測數據進行分析（比如EGFR、K-ras等）。另一種是檢測數據用于病理診斷（比如軟組織腫瘤、淋巴瘤等腫瘤的熒光原位雜交技術或PCR技術）。

分子基因檢測的歸屬爭議很大:是在病理科做？還是在檢驗科做？藥劑科以及各種實驗室做？大家都在搶，為什么？因為大家看到了利益，看到了學科的發展。那么，病理與其他學科相比優勢在那里：

1、樣本的評估？

2、有執業醫生資格？很多病理醫生都這么認為，其實這些其他學科都可能做到，他們可以通過學習培訓，識別腫瘤細胞，懂得初級的病理診斷并不是難事，由于病理一直在強調樣本的質量控制，檢驗人員也開始學習腫瘤診斷。而且我院檢驗的分子實驗室連病理醫師都有，很多檢驗、臨床藥理都有醫師。那么我們病理如何才能把分子檢測爭回來？

我們病理的真正優勢是什么？我個人認為是風險控制！由于血液檢查每次送檢的樣本不一樣，那怕某次的結果是錯誤的，也沒有辦法溯源，檢驗人員可以告訴患者基因發生了改變：上次檢查血內還沒有出現或現在血液內不存在了，所以檢驗的檢查風險很小。而病理樣本和血液樣本不一樣，病理樣本具有朔源性：患者因為治療效果不好或者其他原因到其他醫院治療時，往往會拿原來的組織到別的醫院重新進行基因檢測，如果兩次檢測結果不一致，如果兩次檢測結果不一致，患者就可以告你耽誤他的了治療。分子基因檢測任何一次的操作失誤，以及試劑種類不同、品牌不同、實驗方法不同，設備的誤差，都可能導致結果的不同。而檢驗與病理唯一的不同是樣本的選擇和樣本的制備（切白片）：因為病理樣本在病理科，這個工作只有在病理科才能完成。患者和檢測單位根本不清楚你給的是那塊，就是給錯了你也不知道。切白片還會引發污染：我們往往給外單位切白片時，都是在切常規切片時切的，切片臺上、毛筆都是蠟屑，展片水也不會很干凈，還有切片刀、鑷子，這些都不可能不存在污染。在常規病理切片時也經常會有污染，大多在顯微鏡下能夠分辨出來；當與病史不符合時會重切，才避免了誤診，但也有少量的污染因為天衣無縫，也會產生誤診。如果病理科不開展基因檢測（只是外送），不可能有專人負責這個工作，也不會有人去參加過專業培訓，更不要說為別人考慮風險意識。現在基因檢測有敏感度大多在1-2%以上，很小的污染就可能影響結果。那規范的分子取樣應該怎么做？專人負責，專人操作，專用機器：

1、切片之前（每操作一個蠟塊），必須使用消毒酒精擦拭切片機，清除殘余蠟屑。

2、用一次性棉簽代替毛筆，一次性刀片一個蠟塊一個刀口。

3、用一次性藥盒作展片工具，每個蠟塊一只。鑷子用完后也要用消毒酒精擦拭。除了試劑質量和操作流程以外，仍會有很多無法估量的因素造成分子病理的假陽性或假陰性。隨著患者法律意識和各種醫學知識的增強，分子檢測遲早會變成燙手的山芋，回歸到病理科。這種風險只有病理科才能控制，也是病理科的真正優勢。作為一個病理技術員，必須要做好室內質控和室間質控。應該參加衛計委病理質控中心PQCC和歐盟EMQN、CAP等測評機構的室間質評。室間質控可以證明你用的方法是合理的、使用的試劑的合格的，操作流程是正確的。同時還應該搞好室內質控：

1、建立科學的SOP文件。

2、嚴格按規范操作。

3、認真做好陽性、陰性對照。只有這樣，才能做出穩定、正確的結果。但這幾句話做起來不難，難的是堅持。堅持靠什么？嚴格的監督機制和責任心。責任心是指一個人必須勇于承擔風險，主動負責的敬業精神。但我們有關分子病理檢測規范在制定時存在一定程度上的不合理性。我們規定必須是病理執業醫生才有資格簽發報告，如果是建立在形態學基礎上需要對疾病進行診斷的，是正確的。如果是建立在PCR平臺基礎上僅僅是對數據的報告那就有很大的問題了：做的人、判讀的人和最終簽發報告的人常常不是同一個人。試想一下，如果一個病理科：所有的病理醫生都沒有權力發報告，只有科主任才能簽字，結果會是什么樣子？醫生們可能會有長期的責任心嗎？簽發報告給予了報告人的榮譽感、責任心，更重要的是必須承擔風險。事實上,分子病理檢測無論是基于組織學基礎的（FISH）還是建立在PCR平臺上的，大多數單位都是由技術員操作，有的甚至連選擇樣本也是技術員完成的。那如果都是由技術員操作、判讀，醫生簽字，醫生其實存在很大的風險，出了問題，由誰負責？根據PQCC測評資料，2012年EGFR檢測，通過率為68%；2013年通過率為79%。而且，這個數字存在很大的水份。由于所有參評單位的樣本都是一樣的，在一些試劑公司的操作下，有不少單位在對答案，同時還有不少單位沒有參加測評，可以這樣說，就這一個檢測項目，全國至少可能有一半以上的單位檢測結果是錯的，也就是說有很多醫生在簽發錯誤的結果，我們的患者也有不少在接受了錯誤的治療，這是一個非常嚴重的問題。誰來負責？醫生還是技術員？在中國，病理界認為病理醫生嚴重缺少，個人認為并不十分準確。在發達國家，病理醫生與技術員的比例是1：3左右，而中國連1：1還不到，如果說中國的病理醫生缺少的話，那中國的技術員更缺少，我們的病理醫生可以把一部分工作分擔出去。比如取材：中國病理規范規定取材必須由有執業醫生資格的病理醫生取。但美國、加拿大等發達國家，只要有醫學背景的經過嚴格培訓獲得資格的人員，就可以取材。比如助理醫生、專職取材員。也許有醫生會說，醫生不取材，診斷有困難。但是實際上很多會診的疑難病理切片，沒有一例是專家親自取材的，怎么就可以診斷？自己不取就不能診斷了？我們不否認取材和看大體標本對病理診斷的重要性，但如果樣本都按規范取，描寫的詳詳細細，診斷會有困難么？有困難時還可以再去看標本，可以重取。目前，在一個規范的切片質量穩定的病理科，切片質量問題絕大多數都是由于取材質量差導致標本固定、脫水不佳引起。我相信，專職取材員一定比現在的很多病理醫生取得更好！而診斷醫生，每個人都應該配備專業秘書，從事資料查詢、整理、報告錄入等等輔助性工作，從而把醫生從雜事中解放出來。這就要求大家都有服務意識：中國人骨子里具有“奴性”，不尊重為你服務的人，也不愿意為別人服務。其實我們生活在人人為我我為人人的世界里，我們都在為別人服務，別人也在為自己服務。中國病理事業的發展需要病理人解放思想，更換理念。一直以來，我們一直在說病理如何如何不好，待遇如何如何差，錢如何如何少。病理非常缺人，沒人愿意來，惡性循環。這難道我們自己沒有責任嗎？如果連病理界精英階層都整天說病理工作不好，那新生怎么敢來，為什么要來？而且，這種聲音就象傳染病，傳遍整個病理界，新的不愿來，來的不安心，工作充滿了怨氣。病理真的那么差嗎？病理專家們賺的錢真的那么少嗎？我們除了沒有紅包，比臨床能少多少？根據不完全統計（根據對不少經常參加等級醫院評審專家的了解），一般的病理科在醫院內的收入為中上水平。而且，隨著公民法律意識的健全，各學科的發展，病理的地位正在逐漸提高，病理科條件也在不段改善，我們應該多在領導決策階層呼吁提高病理的待遇，但在學科內部需要更多的正面宣傳（其實病理科還是有很多優勢，病理診斷工作可以長壽，可以防止老年癡呆，可以青春常在，沒看到我們的醫生七、八十歲了還基本上都在上班賺錢，這是其他學科沒法比的,病理醫生一輩子賺的錢也不會少。都說病理風險大，其實全國病理醫生賠錢的真不多，根據浙江省衛生廳統計，病理比檢驗、放射要低得多，形態學這東西有時很難說誰對誰錯。回扣也好，紅包也好，都是違法的錢，都有風險，你要愿意冒這個風險，晚上不怕睡不著，想貪那里都有辦法），增加病理的凝聚力和吸引力，這樣，這個學科發展才有希望。

對于不用于診斷的分子病理檢測，其性質是檢測而不是診斷，我們只是對數據進行分析，其報告只能叫分子檢測報告而不能叫分子診斷報告。從法律上講，技術員有權簽發這類檢測報告。因此，我們任何人、任何機構都無權剝奪法律給予的權力。有的醫生認為：技術員沒有能力對檢測結果進行判讀和分析，更不可能對樣本進行樣本評估，其實是對技術員的歧視，我們只是分工不同，培養和培訓的方向不同，智商相差并不多。而且我們從事分子檢測技術員大多是碩士生或博士生，他們對分子檢測結果的判讀和分析比醫生還要精通，比醫生還要準確，憑什么要剝奪他們的權力？如果他們經過診斷的培訓，對樣本的評估并不是難事。

那么是不是所有的從事分子工作的技術員都能簽發報告？不是的！分子基因檢測是一個高風險的行業，需要較強的專業知識和有一定的診斷基礎，并經過專業技術培訓，獲得培訓證書或上崗證書的才能判讀并簽發報告。如果我們的技術員是從常規技術轉過來，沒有進行系統化的分子生物學學習和培訓，沒有病理學診斷基礎，沒有臨床個體化診斷治療的知識，不能分析檢測過程中出現的問題，那么，不僅不能判讀，就是從事檢測操作，都很危險。同樣，如果我們的醫生沒有這方面的知識和培訓，也不能簽發報告。

一個行業要想有生命力，必須賦予其使命感、自豪感和責任心。如果我們在制訂政策時，只考慮醫生的利益，而不顧技術員的利益，不懂得尊重技術員，不考慮技術員的前途和發展，那么，這個行業就不會有生命力，技術人員不會安心工作，也就沒有可靠的結果，這對中國病理事業是致命的。也許有醫生會說，只有病理醫生才能簽字是為了從檢驗科把基因檢測項目搶回來，那是一廂情愿的事，別人根本不認可。而且，如果用犧牲技術員權益去換取所謂的檢測權，那么我們不需要，因為這不利于病理學科的健康發展。個人認為：用于靶向藥物治療的基因檢測，在病理科最終只是過客，過不了多久，血液就可能完全代替組織，到那時，也不用爭了，全部都是檢驗科做的。因此，分子病理的出路還是在用于病理診斷的基因檢測上。

我們必須按法律辦事，如果分子病理檢測如果其數據是用于診斷的，那么診斷報告必須由醫生簽發。但如果僅僅只是對數據的分析和判讀，應該誰判讀，誰負責，誰簽發，有責任才會有正確的結果。分子病理技術員除了做好本職工作外，還能做什么？

1、科研：與臨床結合、申報課題，書寫論文。

2、研發：研發新的探針、發現新的基因、新的技術新的方法等。

就目前而言，分子病理檢測的主要問題在病理科，而不在其他學科，其他學科和我們爭是我們自己不作為，我們不可能自己不做，也不讓別人做。要想讓病理立于不敗之地，必須做好自己的工作，同時與各學科進行合作。我相信，在病理醫生和技術員的共同努力下，中國的分子病理一定會規范地、迅速地發展。

第五篇：病理技術員在分子病理領域的作用

病理技術員在分子病理領域的作用

浙江大學附屬第一醫院病理科丁偉

分子病理目前可以分三類：

1、建立在形態學基礎上的（比如her2熒光原位雜交、顯色原位雜交等）檢測；

2、建立在PCR平臺上的（比如測序、熒光定量PCR等）數據檢測；

3、檢測數據用于病理診斷的（比如軟組織腫瘤、淋巴瘤等腫瘤的熒光原位雜交技術或PCR技術）。

分子基因檢測的歸屬爭議很大:，是在病理科做？還是在檢驗科做？藥劑科以及各種實驗室做？大家都在搶，為什么？因為大家看到了利益，看到了學科的發展。那么，病理與其他學科相比優勢在那里：

1、樣本的評估？

2、有執業醫生資格？很多病理醫生都這么認為，其實這些其他學科都可能做到，檢驗有醫師、臨床藥理也有醫師，他們可以通過學習培訓，識別腫瘤細胞，懂得初級的病理診斷并不是難事，而且我們的檢驗分子實驗室連病理醫師都有。如何爭回來？

我們病理的真正優勢是什么？風險意識和風險控制！由于血液檢查每次送檢的樣本不一樣，那怕某次的結果是錯誤的，也沒有辦法溯源，檢驗人員可以告訴患者基因發生了改變：上次檢查血內還沒有出現或現在血液內不存在了。所以檢驗的檢查風險很小，風險意識不強。這種習慣性思維和工作方法運用到組織分子病理檢測時，就會出現危機：病理樣本和血液樣本不一樣，病理樣本具有朔源性：患者因為治療效果不好或者其他原因到其他醫院治療時，往往會拿原來的組

織到別的醫院重新進行基因檢測，如果兩次檢測結果不一致，如果兩次檢測結果不一致，患者就可以告你耽誤他的了治療。任何一次操作的失誤，設備的誤差，以及試劑種類不同、品牌不同、實驗方法不同，都可能導致結果的不同。這種風險還存于樣本采取的過程（切白片）：這個過程充滿了陷阱。由于病理樣本是在病理科的，這個工作只有在病理科完成。這就有了檢測前樣本評估，我可以給你腫瘤細胞多的組織，也可以給你只有少數腫瘤大片壞死的組織。作為患者和檢測單位根本不清楚你給的是那塊，就是給錯了你也不知道。切白片還會引發污染：我們往往給外單位切白片時，都是在切常規切片時切的，切片臺上、毛筆都是蠟屑，展片水也不會很干凈，還有切片刀、鑷子，這些都不可能不存在污染。在常規病理切片時也經常會有污染，大多在顯微鏡下能夠分辨出來；當與病史不符合時會重切，才避免了誤診，但也有少量的污染因為天衣無縫，也會產生誤診。如果病理科不開展基因檢測（只是外送），不可能有專人負責這個工作，也不會有人去參加過專業培訓，更不要說為別人考慮風險意識。現在基因檢測有敏感度大多在1-2%以上，很小的污染就可能影響結果。那規范的分子取樣應該怎么做？專人負責，專人操作，專用機器：

1、切片之前（每操作一個蠟塊），必須使用消毒酒精擦拭切片機，清除殘余蠟屑。

2、用一次性棉簽代替毛筆，一次性刀片一個蠟塊一個刀口。

3、用一次性藥盒作展片工具，每個蠟塊一只。鑷子用完后也要用消毒酒精擦拭。除了試劑質量和操作流程以外，仍會有很多無法估量的因素造成分子病理的假陽性或假陰性。隨著患者法律意識和各種醫學知識的增強，分子檢測遲早會變成燙手的山芋，回歸到病理科。

作為一個病理技術員，必須要做好室內質控和室間質控。應該參加歐盟EMQN、CAP和衛計委病理質控中心PQCC的室間質評。室間質控可以證明你用的方法是合理的、使用的試劑的合格的，操作流程是正確的。室內質控：

1、建立科學的SOP文件。

2、嚴格按規范操作。

3、認真做好陽性對照。只有這樣，才能做出穩定、正確的結果。但這幾句話做起來不難，難的是堅持。堅持靠什么？嚴格的監督機制和責任心。現實的問題：我們以前有關分子病理檢測規范在制定時存在一定程度上的不合理性。我們規定必須是病理執業醫生才有資格簽發報告，如果是建立在形態學基礎上需要對疾病進行診斷的，是正確的。如果是建立在PCR平臺基礎上僅僅是對數據的報告那就有很大的問題了：做的人、判讀的人和最終簽發報告的人常常不是同一個人。試想一下，如果一個病理科：所有的病理醫生都沒有權力發報告，只有科主任才能簽字，結果會是什么樣子？簽發報告給予了報告人的榮譽感、責任心，更重要的是必須承擔風險。事實上分子病理檢測無論是基于組織學基礎的（FISH）還是建立在PCR平臺上的，大多數單位都是由技術員操作，有的甚至連選擇樣本也是技術員完成的。那如果都是由技術員操作、判讀，醫生簽字，醫生其實存在很大的風險，出了問題，由誰負責？

在中國，病理界認為病理醫生嚴重缺少，個人認為并不十分準確。在發達國家，病理醫生與技術員的比例是1：3左右，而中國連1：1還不到，如果說中國的病理醫生缺少的話，那中國的技術員更缺少，我們的病理醫生可以把一部分工作分擔出去。比如取材：中國病理規范規定取材必須由有執業醫生資格的病理醫生取。但美國、加拿大等發達國家，只要有醫學背景的經過嚴格培訓獲得資格的人員，就可以取材。比如助理醫生、專職取材員。也許有醫生會說，醫生不取材，診斷有困難。但是實際上很多會診的疑難病理切片，沒有一例是專家親自取材的，怎么就可以診斷？自己不取就不能診斷了？我們不否認取材和看大體標本對病理診斷的重要性，但如果樣本都按規范取，描寫的詳詳細細，診斷會有困難么？有困難時還可以再去看標本，可以重取。目前，在一個規范的切片質量穩定的病理科，切片質量問題絕大多數都是由于取材質量差導致標本固定、脫水不佳引起。我相信，專職取材員一定比現在的很多病理醫生取得更好！而診斷醫生，每個人都應該配備專業秘書，從事資料查詢、整理、報告錄入等等輔助性工作，從而把醫生從雜事中解放出來。這就要求大家都有服務意識：中國人骨子里具有“奴性”，不尊重為你服務的人，也不愿意為別人服務。其實我們生活在人人為我我為人人的世界里，我們都在為別人服務，別人也在為自己服務。中國病理事業的發展需要病理人解放思想，更換理念。一直以來，我們一直在說病理如何如何不好，待遇如何如何差，錢如何如何少。病理非常缺人，剛畢業的不愿意來。惡性循環。這難道我們自己沒有責任嗎？如果連病理界精英階層都說病理工作不好，那新生怎么敢來，為什么要來？而且，這種聲音就象傳染病，傳遍整個病理界，新的不愿來，來的不安心，工作充滿了怨氣。病理真的那么差嗎？病理專家們賺的錢真的那么少嗎？我們除了沒有紅

包，比臨床能少多少？根據不完全統計，一般的病理科在醫院內的收入為中上水平。而且，隨著公民法律意識的健全，各學科的發展，病理的地位正在逐漸提高，病理科條件也在不段改善，我們應該多在領導決策階層呼吁提高病理的待遇，但在學科內部需要更多的正面宣傳，增加病理的凝聚力和吸引力，這樣，這個學科發展才有活力。

對于不用于診斷的分子病理檢測，其性質是檢測而不是診斷，我們只是對數據進行分析，其報告只能叫分子檢測報告而不能叫分子診斷報告。從法律上講，技術員有權簽發這類檢測報告。因此，我們任何人、任何機構都無權剝奪法律給予的權力。有的醫生認為：技術員沒有能力對檢測結果進行判讀和分析，更不可能對樣本進行樣本評估，其實是對技術員的歧視，我們只是分工不同，培養和培訓的方向不同，智商相差并不多。而且我們從事分子檢測技術員大多是碩士生或博士生，他們對分子檢測結果的判讀和分析比醫生還要精通，比醫生還要準確，憑什么要剝奪他們的權力？如果他們經過診斷的培訓，對樣本的評估、FISH判讀都不是難事。

那么是不是所有的從事分子工作的技術員都能簽發報告？不是的！分子基因檢測是一個高風險的行業，需要較強的專業知識和有一定的診斷基礎，并經過專業技術培訓，獲得培訓證書或上崗證書的才能判讀并簽發報告。如果我們的技術員是從常規技術轉過來，沒有進行系統化的分子生物學學習和培訓，沒有病理學診斷基礎，沒有臨床個體化診斷治療的知識，不能分析檢測過程中出現的問題，那么，不僅不能判讀，就是從事檢測操作，都很危險。同樣，如果我們的醫生

沒有這方面的知識和培訓，也不能簽發報告。

一個行業要想有生命力，必須賦予其使命感、自豪感和責任心。如果我們在制訂政策時，只考慮醫生的利益，而不顧技術員的利益，不懂得尊重技術員，不考慮技術員的前途和發展，那么，這個行業就不會有生命力，也就不會安心工作，這對中國病理事業是致命的。因此，分子病理檢測如果其數據是用于診斷的，提供檢測數據可以由操作者簽發，但診斷報告必須由醫生簽發。但如果僅僅只是對數據的分析和判讀，應該誰判讀，誰負責，誰簽發。

分子病理技術員除了做好本職工作外，還能做什么？

1、科研：與臨床結合、申報課題，書寫論文。

2、研發：研發新的探針、發現新的基因、新的技術新的方法等。

我相信，在病理醫生和技術員的共同努力下，中國的分子病理一定會規范地、迅速地發展，分子病理檢測也遲早會回規病理。我的想法只代表我個人的觀點和意見。請謹慎引用。