第一篇：《微生物的培養與應用》學案

生物選修一第二章微生物的培養與應用教案 ★課題目標

（一）知識與技能

了解有關培養基的基礎知識；掌握培養基的制備、高壓蒸汽滅菌和平板劃線法等基本操作技術

（二）過程與方法

分析實驗思路的確定和形成的原因，分析實驗流程，對比前面的實驗設計，歸納共性，分析差異，增加印象

（三）情感、態度與價值觀

形成勇于實踐、嚴謹求實的科學態度和科學精神 ★課題重點 無菌技術的操作 ★課題難點

無菌技術的操作 ★教學方法

啟發式教學 ★教學工具

多媒體課件 ★教學過程

（一）引入新課

在傳統發酵技術的應用中，都利用了微生物的發酵作用，其中的微生物來自于制作過程中的自然感染。而在工業化生產中，為了提高發酵的質量，需要獲得優良菌種，并保持發酵菌種的純度。這就要涉及到微生物的培養、分離、鑒別等基本技術。現在我們開始學習微生物的培養和應用專題。

（二）進行新課 1．基礎知識

1．1 培養基的種類包括 固體 培養基和 液體 培養基等。

〖思考1〗瓊脂是從紅藻中提取的 多糖，在配制培養基中用作為 凝固劑。【補充】培養基的類型及其應用：

〖思考2〗從細胞的化學元素組成來看，培養基中為什么都含有這些營養成分？ 1．3 培養基除滿足微生物生長的 ph、特殊營養物質 和 氧氣 等要求。【補充】生長因子：某些微生物正常生長代謝過程中必須從培養基中吸收的微量有機小分子，如某些氨基酸、堿基、維生素等。

〖思考3〗牛肉膏和蛋白胨主要為微生物提供 糖、維生素 和 有機氮 等營養物質。

〖思考4〗培養乳酸桿菌時需要添加 維生素，培養霉菌時需要將培養基ph調節為 酸性，培養細菌時需要將ph調節為 中性或微堿性。活動2：閱讀“無菌技術”，討論回答下列問題：

1．4 獲得純凈培養物的關鍵是 防止外來雜菌的入侵。1．5 無菌技術包括：

（1）對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行 清潔和消毒 ；（2）將培養器皿、接種用具和培養基等器具進行 滅菌 ；

（3）為避免周圍微生物污染，實驗操作應在 酒精燈火焰附近旁進行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與 周圍物品 相接觸。1．6 比較消毒和滅菌（填表）

〖思考5〗無菌技術除了防止培養物被污染外，還具有的目的是 防止感染實驗操作者。1．7 消毒方法：

（1）日常生活經常用到的是 煮沸 消毒法；

（2）對一些不耐高溫的液體，則使用 巴氏 消毒法（作簡要介紹）；

（3）對接種室、接種箱或超凈工作臺首先噴灑 石炭酸或煤酚皂 等溶液以增強消毒效果，然后使用 紫外線 進行物理消毒。

（4）實驗操作者的雙手使用 酒精 進行消毒； 1．8滅菌方法：

（1）接種環、接種針、試管口等使用 灼燒 滅菌法；

（2）玻璃器皿、金屬用具等使用 干熱 滅菌法，所用器械是 干熱滅菌箱 ；（3）培養基、無菌水等使用 高壓蒸汽 滅菌法，所用器械是 高壓蒸汽滅菌鍋。（4）表面滅菌和空氣滅菌等使用 紫外線 滅菌法，所用器械是 紫外燈。

〖思考6〗對接種環滅菌時要用酒精燈的 充分燃燒 層火焰灼燒可能伸入試管或培養皿的部位。

〖思考7〗利用干熱滅菌箱對玻璃器皿滅菌時物品不能擺得太擠，目的是避免妨礙熱空氣流通。

【補充】培養基的配制原則：

①目的要明確：根據培養的微生物種類、培養的目的等確定培養基的類型和配制量。

②營養要協調：培養基中各種營養物質的濃度和比例要適宜。例如：碳氮比4∶1時，谷氨酸棒狀桿菌大量繁殖而產生谷氨酸少；碳氮比為3∶1時，菌體繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。③ph要適宜：細菌培養基ph中性或偏堿性，霉菌培養基呈酸性。2．實驗操作

2．1 計算：根據配方比例，計算100ml培養基各成分用量。

2．2 稱量：準確稱取各成分。稱取牛肉膏和蛋白胨時動作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收空氣中水分。

2．3 溶化：①加水加熱熔化牛肉膏；②加入蛋白胨和氯化鈉繼續加熱；③加入瓊脂；④用蒸餾水定容到100ml。整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂。2．4 調ph：用1mol/lnaoh溶液調節ph至偏堿性。

2．5 滅菌：將配制好的培養基轉移到錐形瓶中，加塞包扎后用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌；所用培養皿用報紙包扎后用干熱滅菌箱滅菌。

2．6 倒平板：待培養基冷卻至50℃左右時在酒精燈火焰附近操作進行。其過程是：

①在火焰旁右手拿錐形瓶，左手拔出棉塞；

②右手拿錐形瓶，使錐形瓶的瓶口迅速通過火焰；

③左手將培養皿打開一條縫隙，右手將培養基倒入培養皿，立刻蓋上皿蓋。④待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。

〖思考1〗錐形瓶的瓶口通過火焰的目的是消滅瓶口的雜菌，防止雜菌感染培養基。〖思考2〗倒平板的目的是防止培養基冷卻過程中形成的水滴落到培養基表面。〖思考3〗若皿蓋和皿底之間粘有培養基，則該平板能否培養微生物？為什么？ 不能。空氣中雜菌會在這些粘附培養基上繁殖，并污染皿內培養基。

〖思考4〗配制斜面培養基中，試管要加塞棉塞的目的是保持通氣并防止雜菌感染。〖思考5〗試管培養基形成斜面的作用是增大接種面積。2．7 接種

2．7．1微生物接種的最常用方法是平板劃線法和稀釋涂布法，另外還有穿刺接種和斜面接種等。

2．7．2平板劃線法：通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。其操作步驟是： ①將接種環在酒精燈火焰上灼燒直至燒紅。

②在酒精燈火焰旁冷卻接種環，并打開大腸桿菌的菌種試管的棉塞。③將菌種試管口通過火焰達到消滅試管口雜菌的目的。④將冷卻的接種環伸入到菌液中取出一環菌種。⑤將菌種試管口再次通過火焰后塞上棉塞。⑥將皿蓋打開一條縫隙，把接種環伸入平板內劃3～5條平行線，蓋上皿蓋，不要劃破培養基。⑦灼燒接種環，冷卻后從第一區劃線末端開始向第二區域內劃線。重復上述過程，完成三、四、五區域內劃線。注意不要將第五區的劃線與第一區劃線相連。⑧將平板倒置放在培養箱中培養。

〖思考6〗取菌種前灼燒接種環的目的是消滅接種環上的微生物；除第一次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環的目的是消滅接種環上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環冷卻后進行，其目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環的目的是防止細菌污染環境和操作者。〖思考7〗在第1次劃線后都從上次劃線末端開始的目的是獲得由單個細菌形成的標準菌落。2．7．3 稀釋涂布平板法：將菌液進行一系列梯度稀釋，并將不同稀釋度菌液分別涂布到瓊脂固體培養基上進行培養。當稀釋倍數足夠高時，即可獲得單個細菌形成的標準菌落。2．7．4 系列稀釋操作：

①取盛有9ml水的無菌試管6支，編號101、102、103、104、105、106。

②用灼燒冷卻的移液管吸取1ml菌液注入編號為101試管中，并吹打3次，使之混勻。③從101倍液中吸取1ml菌液注入到編號為102試管內吹打均勻，獲得102倍液。依此類推。3．結果分析與評價

3．1 培養未接種培養基的作用是對照，若有菌落形成，說明培養基滅菌不徹底。3．2 在肉湯培養基上，大腸桿菌菌落呈白色，為圓形，光滑有光澤，邊緣整齊。3．3 培養12h和24h后的菌落大小不同（相同、不同）；菌落分布位置相同（相同、不同）。原因是時間越長，菌落中細菌繁殖越多，菌落體積越大；菌落的位置不動，但菌落數增多。〖思考9〗在某培養基上出現了3種特征不同的菌落，原因有培養基滅菌不徹底或雜菌感染等。

〖思考10〗頻繁使用的菌種利用臨時保藏法保存，長期保存菌種的方法是甘油管藏法。前者利用固體斜面培養基培養后，保存在4℃冰箱中，每3～6個月轉種培養一次，缺點是保存時間較短，容易發生污染和變異；后者將菌種與無菌體積等量混合后保存在－20℃冷凍箱中。

（三）課堂總結、點評

（四）實例探究

例1．關微生物營養物質的敘述中，正確的是 答案：d 例2．下面對發酵工程中滅菌的理解不正確的是 a.防止雜菌污染 b.消滅雜菌 答案：b ☆綜合應用

例3．右表是某微生物培養基成分，請據此回答： 編號成分含量 ①粉狀硫10g ②（nh4）2so40.4g ③k2hpo44.0g ④mgso49.25g ⑤feso40.5g ⑦h2o100ml（1）右表培養基可培養的微生物類型 是。

如不想浪費此培養基，可再加入，用于培養。

養基可用于培養。

（4）表中營養成分共有 類。

（5）不論何種培養基，在各種成分都溶化 后分裝前，要進行的是。

（6）右表中各成分重量確定的原則是。

（7）若右表培養基用于菌種鑒定，應該增加的成分是。

答案：⑴自養型微生物 ⑵含碳有機物 金黃色葡萄球菌 ⑶固氮微生物 ⑷3 ⑸調整ph ⑹依微生物的生長需要確定 ⑺瓊脂（或凝固劑）

（五）鞏固練習

2．根瘤菌能利用的營養物質的組別是 3．配制培養基的敘述中正確的是

a．制作固體培養基必須加入瓊脂 b．加入青霉素可得到放線菌 4．自養型微生物與異養型微生物的培養基的主要差別是 生 物硝化細菌根瘤菌酵母菌谷氨酸棒狀桿菌

代謝類型自養需氧型異養需氧型異養兼性厭氧型自養需氧型 a．根瘤菌、谷氨酸棒狀桿菌 b．硝化細菌、酵母菌

6．甲、乙、丙是三種微生物，下表ⅰ、ⅱ、ⅲ是用來培養微生物的三種培養基。甲、乙、丙都能在ⅲ種正常生長繁殖；甲能在ⅰ中正常生長繁殖，而乙和丙都不能；乙能在ⅱ中正常生長繁殖，甲、丙都不能。下列說法正確的是（）粉狀硫 10gk2hpo4 4gfeso4 0.5g蔗糖

10g（nh4）2so4 0.4gh2o 100mlmgso4 0.5g ⅰ++++-+++ ⅱ+++-++++ ⅲ++++++++ a、甲、乙、丙都是異養微生物

b、甲、乙、丙都是自養微生物、丙是異養微生物

d、甲是異養微生物、乙是固氮微生物、丙是自養微生物

7．微生物（除病毒外）需要從外界吸收營養物質并通過代謝來維持正常的生長和繁殖。下列有關微生物營養的說法正確的是

b．微生物生長中不可缺少的一些微量的無機物稱為生長因子

d．生長因子一般是酶或核酸的組成成分，微生物本身合成這些生長因子的能力往往不足。8．某一種細菌株要從環境中提取現成的亮氨酸（20種氨基酸中的一種）才能生長，此菌株對鏈霉素敏感。實驗者用誘變劑處理此菌株，想篩選出表中細菌菌株類型。根據實驗年目的，選用的培養基類型是（）

注：ｌ—亮氨酸

ｓ—鏈霉素

“＋”—加入

“—”—不加入

如：ｌ—：不加亮氨酸

ｓ＋：加入鏈霉素

選項篩選出不需要亮氨酸的菌株篩選出抗鏈霉素的菌株篩選出不需要亮氨酸的抗鏈霉素的菌株

ａｌ＋

ｓ＋ｌ—

ｓ—ｌ＋

ｓ－ ｂｌ－

ｓ—ｌ＋

ｓ＋ｌ—

ｓ＋ ｃｌ—

ｓ＋ｌ＋

ｓ＋ｌ—

ｓ— ｄｌ＋

ｓ—ｌ—

ｓ—ｌ＋

ｓ＋

9．要將從土壤中提取的自生固氮菌與其他的細菌分離出來，應將它們接種在

10．酵母菌培養液中常含有一定濃度的葡萄糖，但當葡萄糖濃度過高時，反而抑制微生物的生長，原因是 ★課余作業

１、收集生活中與微生物有關的實例，并通過所學知識對其進行解釋 ２、我們打針輸液時，首先要用酒精擦拭針刺處，為什么？ ★教學體會

本節課可以通過生產實例導入，使學生認識在微生物的培養過程中，保持培養物純凈的重要性。在課堂上可以跳出教材，充分發揮學生的主動性，讓學生收集列舉更多的生產生活中的實例，從中體會培養物純凈的重要性。當時由于微生物的微觀性和危害性，一定要教育學生培養良好的衛生習慣。★資料袋 微生物的特點

1.個體微小，結構簡單

在形態上，個體微小，肉眼看不見，需用顯微鏡觀察，細胞大小以微米和納米計量。2.繁殖快

生長繁殖快，在實驗室培養條件下細菌幾十分鐘至幾小時可以繁殖一代。3.代謝類型多，活性強。4.分布廣泛

有高等生物的地方均有微生物生活，動植物不能生活的極端環境也有微生物存在。5.數量多

在局部環境中數量眾多，如每克土壤含微生物幾千萬至幾億個。6.易變異

相對于高等生物而言，較容易發生變異。在所有生物類群中，已知微生物種類的數量僅次于被子植物和昆蟲。微生物種內的遺傳多樣性非常豐富。所以微生物是很好的研究對象，具有廣泛的用途。

第二篇：微生物的分離與培養

病原物的分離與培養

病原物的分離與培養在植物病害的研究中具有重要意義，分離、培養病原菌的方法是植物病理學研究工作中最常應用的實驗技術。一方面，在一個新的病害研究中，通過分離與培養獲得病原物的純培養，完成柯氏法則，以明確該病病原；研究病原物的生物學特性和病害循環（侵染、病程等等）。所謂病原物的分離，即把該病原菌從發病組織上與其他微生物分開；所謂病原物的培養，即將分離的病原菌移到可以讓這種病原菌正常生長的營養基質即培養基上，從而獲得其純培養。病原物的分離與培養，需經以以幾個步驟: 1.有關器皿的滅菌和消毒； 2.制作培養基； 3.病原菌的分離 4.病原菌的培養。－、滅菌與消毒

滅菌與消毒是兩個不同的概念。滅菌則是指殺死一切微生物的營養體和孢子。消毒一般是指消滅病原菌和有害微生物的營養體，在植物病理學實驗中，需要進行純培養，不能有任何雜菌污染，因此對所用器材、培養基和工作場所都要進行嚴格的消毒和滅菌。消毒與滅菌的方法很多，一般可分為加熱、過濾、輻射和使用化學藥品等方法。

(一)熱力滅菌

熱力滅菌分干熱滅菌和濕熱滅菌兩類。

1．干熱滅菌

干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內的蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。細胞內的蛋白質疑固性與其本身的含水量有關。在菌體受熱時，當環境和細胞內含水量越大，則蛋白質凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高(160～170℃)，時間長1～2 h。但干熱滅菌溫度不能超過180 ℃，否則包器皿的紙或棉塞就會燒焦，甚至引起燃燒。干熱滅菌使用的儀器是烘箱。

干熱滅菌有火焰燒灼滅菌和熱空氣滅菌兩種。火焰燒灼滅菌適用于接種環、接種針和金屬用具如鑷子等，無菌操作時酌試管口和瓶口也在火焰上作短暫燒灼滅菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后進行灼燒滅菌。通常所說的干熱滅菌是在烘箱內利用高溫干燥空氣(160～170℃)進行滅菌。此法適用于玻璃器皿如吸管和培養皿等的滅菌。

進行干熱滅菌要注意以下問題：物品不要擺得太擠，以免妨礙空氣流通；滅菌物品不要接觸烘箱內壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火；在升溫過程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示箱內停止加溫；電烘箱內溫度未降到70℃以前，切勿自行打開箱門以免驟然降溫導致玻璃器皿炸裂。濕熱滅菌

(1)高壓蒸汽滅菌 此法是將物品放在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內，0.1MPa，121℃保持15～30 min進行滅菌。時間的長短可根據滅菌物品種類和數量的不同而有所變化，以達到徹底滅菌。這種滅菌適用于培養基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的滅菌。

(2)常壓蒸汽滅菌 在不具備高壓蒸汽滅菌的情況下：常壓蒸汽滅菌是一種常用的滅菌法。對于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養基如明膠培養基、牛乳培養基、含糖培養基等可采用常壓蒸汽滅菌。這種滅菌方法可用阿諾氏流動蒸汽滅菌器進行，也可用普通蒸籠進行滅菌。由于常壓，其溫度不超過100℃，僅能使大多數微生物被殺死，而芽孢細菌卻不能在短時間內殺死，因此可采用間歇滅菌以殺死芽孢細菌，達到徹底滅菌的目的。

常壓間歇滅菌是將滅菌培養基放人滅菌器內，每天加熱100℃，30 min，連續3 d，第一天加熱后，其中的營養體被殺死，將培養物取出放室溫下18～24 h，使其中的芽孢發育成營養體，第二天再加熱100℃，30 min，發育的營養體又被殺死，但可能仍留有芽孢，故再重復一次，使徹底滅菌。

(二)過濾除菌

許多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加熱消毒滅菌方法，—均會被熱破壞，因此采用過濾除菌的方法。應用最廣泛的過濾器有：

(1)蔡氏過濾器 該過濾器是由石棉制成的圓形濾板和一個特制的金屬（銀或鋁）漏斗組成，分上、下兩節。過濾時，用螺旋把石棉板緊緊夾在上、下兩節濾器之間，然后將溶液臵于濾器中抽濾。每次過濾必須用一張新濾板。根據其孔徑大小，濾板分為3種型號：K型最大，作一般澄清用；EK濾孔較小，用來除去一般細菌；EK-S濾孔最小，可阻止大病毒通過。使用時可根據需要選用。

(2)微孔濾膜過濾器 這是一種新型濾器，其濾膜是用醋酸纖維酯和硝酸纖維酯的混合物制成的薄膜。微孔濾膜過濾器是由上下二個分別具有出口和入口連接裝臵的塑料蓋盒組成。出口處可連接針頭，入口處可連接針筒。使用時將濾膜裝入兩塑料蓋盒之間，旋緊蓋盒，當溶液從針筒注入濾器時，此濾器將各種微生物阻留在微孔濾膜上面，從而達到除菌的目的。根據待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾器。此法除菌的最大優點是可以不破壞溶液中各種物質的化學成分。但由于濾量有限，所以一般只適用于實驗室中小量溶液的過濾除菌。實驗室中用于除菌的微孔濾膜孔徑一般為0.22μm，但若要將病毒除掉，則需更小孔徑的微孔濾膜。微孔濾膜過濾除菌的主要操作步驟為：

① 組裝、滅菌 將0.22μm孔徑的濾膜裝入清洗干凈的塑料濾器中，旋緊。壓平，包裝滅菌后待用(0.1MPa、121.5℃滅菌：20 min)。連接。將滅菌濾器的入口在無菌條件下，以無菌操作方式連接于裝有待濾溶液注射器上，將針頭與出口處連接并插入帶橡皮塞的無菌試管中。

② 壓濾 將注射器中的待濾溶液加壓緩緩擠壓過濾到無菌試管中。濾畢，將針頭撥出。壓濾時，用力要適當，不可太猛太快，以免細菌被擠壓通過濾膜。

提示: 整個過程應在無菌條件下嚴格無菌操作以防污染，過濾時應避免各連接處出現滲透現象。

(三)輻射滅菌 紫外線滅菌是用紫外線燈進行的。波長為200～300 nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260 nm的殺菌力最強。在波長一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強度和時間的乘積成正比。紫外線殺菌機理主要是因為它誘導了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA的交聯，從而抑制了DNA的復制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成[O]，再使O2氧化生成臭氧(O3)，或使水氧化生成過氧化氫(H2O2)。O3和H2O2有殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以只適用于無菌室、接種箱的空氣及物體表面的滅菌。

注意事項: 紫外線對眼結膜及視神經有損傷作用，對皮膚有刺激作用，故不能直視紫外線燈光，更不能在紫外線燈光下工作。紫外線燈距照射物以不超過1.2 m為宜。

此外，采用60Co-γ射線滅菌，也已廣泛用于不能進行加熱滅菌的紙、塑料薄膜，各種積層材料制作的容器以及醫用生物敷料皮等的滅菌。γ射線滅菌的最大優點是穿透力強，可在厚包裝完好條件下滅菌。

(四)化學藥品滅菌

化學藥品消毒滅菌法是應用能抑制或殺死微生物的化學制劑進行消毒滅菌的方法。能破壞細菌代謝機能并有致死作用的化學藥劑為殺菌劑，如重金屬離子等；只是阻抑細菌代謝機能，使細菌不能增殖的化學藥劑為抑菌劑，如磺胺類及大多數抗生素等。化學藥品對微生物的作用是抑菌還是殺菌以及作用效果還與化學藥品濃度的高低、處理微生物的時間長短、微生物的種類以及微生物所處的環境等有關。

植物病理學實驗室中常用的化學藥品有2％煤酚皂溶液(來蘇爾)、0.25％新潔爾滅、0.1％升汞、3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等。

消毒與滅菌不僅是從事植物病理學和整個生命科學研究必不可少的重要環節和實用技術，而且在醫療衛生、環境保護、食品、生物制品等各方面均具有重要的應用價值。根據不同的使用要求和條件選用合適的消毒滅菌的方法。

二、培養基的制作

1、目的要求

了解培養基的配制原理，掌握培養基的制備方法。

2、基本原理

在植物病理學研究工作中經常要使用各種不同的培養基。培養基是按照生物生長繁殖所需要的各種營養，用人工方法配制而成的營養基質。其中含有碳源、氮源、無機鹽、維生素以及水分等。微生物在培養基上生長繁殖還必須在最適pH范圍內才能生長得更好，因此，對不同種類的微生物應將培養基調節到一定的pH范圍。－般而言，真菌調節到微酸，細菌調節到微堿。

培養基的種類很多，不同的微生物所需要的培養基不同。依物理性狀可分為液體的、固體的和半固體的三種。固體培養基是在液體培養基中加入1.5 %～2 %的瓊脂，半固體培養基是加入0.2 %～0.5 %的瓊脂。瓊脂(agar)起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。

根據營養物質來源的不同，培養基可分為天然、半合成和合成培養基三類。天然培養基是以自然界原有的有機物為材料經滅菌后制成，如馬鈴薯、胡蘿卜、水果、大麥粒、高粱粒等。半合成培養基中既有一些天然的有機物質，又有一些成分簡單或明確的化合物。如常用的馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)、肉汁胨培養基(NA)等。合成培養基是由一些成分明確的化合物配制而成的，無任何成分不明確的物質，常用于研究微生物的生理生化性狀，如查氏(Czapek)培養基等。

根據培養基用途不同，可分為生長繁殖培養基、富集培養基、貯存培養基、選擇性培養基和鑒別培養基等。在植物病理學研究中，最常用培養基有馬鈴薯葡萄糖培養基，主要用于分離培養病原真菌。

在培養基配制完之后，必須經過滅菌，以便徹底殺死其中原有的一切微生物。

3、材料、試劑與儀器 材料 馬鈴薯。

試劑 葡萄糖、瓊脂等。

儀器與用品 高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙(或酸度計)、試管、鋁鍋、攪拌棒、三角瓶、燒杯、漏斗、量筒、紗布、棉花、天平等。

4、操作步驟

PDA培養基(馬鈴薯葡萄糖培養基)馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20g、蒸餾水1000 ml，自然pH。

在PDA培養基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，這樣配制的培養基也稱為PSA培養基。(1)稱量 稱量去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g。提示：瓊脂加入的量取決于瓊脂的質量，質量好的15 g就夠了，質量差的應適當增加。另外，在夏天氣溫較高時，適當增加用量。

(2)將馬鈴薯切成小塊，放入鍋中，加水1000 ml，煮沸30 min。用紗布濾去馬鈴薯殘渣。

(3)將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂，加熱熔化。

提示：在瓊脂熔化的過程中，需要用玻璃棒不斷攪拌，并控制火力不要使培養基溢出或燒焦。

(4)加入葡萄糖 葡萄糖溶解后，加入適量的水以補充加熱過程中損失的水分，定容至1000 ml。

提示：通常在制作培養基的鍋內用紅藍鉛筆標記出不同體積的刻度，如1 000 ml、2000 ml等，在定容時直接將水加至已標記的刻度即可。

(5)分裝 根據不同的實驗目的，可將配制的培養基分裝于試管內或三角瓶內。分裝試管，其量為管高的1／5，滅菌后制成斜面。分裝三角瓶的容量以不超過三角瓶容積之一半為宜。

(6)加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脫脂的經彈松的棉花，棉塞可過濾空氣，防止雜菌侵入并可減緩培養基水分的蒸發，故在植物病理學研究工作中普遍使用。

正確的棉塞是形狀、劃、、松緊與管口或瓶口完全適合，過緊時妨礙空氣流通，操作不便；過松則達不到濾菌的目的，且棉塞過小往往容易掉進試管內。正確的棉塞頭較大，約有1／3在外，2／3在試管內。分裝過程中注意不要使培養基沾染在管(瓶)口上以免浸濕棉塞，引起污染。

(7)包扎 加塞后，將試管用線繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道線繩扎好。用記號筆注明培養基名稱、配制日期、組別、制作人等。

(8)滅菌 將上述培養基以0.1MPa，121℃，高壓蒸氣滅菌20 min。

(9)擱臵斜面 將滅菌的試管培養基豎臵冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱臵的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。

培養基經滅菌后，必須放在37℃溫箱培養24h，無菌生長者方可使用。

PDA培養基一般不需要調pH。對于要調節pH的培養基，一般用pH試紙測定其pH。如果培養基偏酸或偏堿時，可用l mol／L NaOH或l mol／L HCl溶液進行調節。調節時應逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過酸或過堿破壞培養基成分。

三、病原菌的分離培養和純化

1、目的要求

(1)了解分離與純化微生物的基本原理及方法。

(2)掌握倒平板的方法和組織分離、稀釋分離、平板劃線分離的基本操作技術。

(3)掌握在平板、斜面及液體培養基上培養病原菌及觀察其培養性狀的方法。

2、基本方法

植物病原真菌的分離方法主要有組織分離法和稀釋分離法兩種。最常用的方法是組織分離法，而稀釋分離法主要用于病組織上產生大量孢子的病原真菌的分離。病原細菌的分離方法以劃線分離法為最常用，在有些情況下也采用稀釋分離法。

為了獲得分離菌的純培養，必須要進行分離菌的純化，純化的方法類似于分離工作中采用的稀釋分離法或劃線分離法。

3、材料、儀器與用具 3.1 材料

(1)稻瘟病（葉、病節、病穗頸）(Pyricularia oryzae)。(2)柑桔炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）。(3)黃瓜灰霉病（Botrytis cineria）。(4)番茄灰霉病（果）(Botrytis cinerea)。

(5)黃瓜菌核病（果）(Sclerotinia sclerotiorum)。(6)黃瓜細菌性角斑病（葉）(Pseudomonas syringae pv．1achryrnans)。

(7)水稻白葉枯病（葉）(Xanthomonas campestris pv．oryzae)。(8)白菜軟腐病（葉）(Erwinia carotovora subspp．carotovora)。

3.2．培養基 PDA培養基；肉膏蛋白脈培養基；加寄主組織煎汁的培養基等。

3.3．儀器與用品 超凈工作臺、培養箱、培養皿、吸管、吸水紙、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、鑷子、接種鏟(針)、接種環(鉺)、70％酒精、0.1％升汞、酒精燈、火柴、記號筆、橡皮筋套、可調式電爐、不銹鋼鍋等。

4、實驗操作

(一)病原真菌的分離

1．組織分離法 其步驟為：

(1)取滅菌培養皿一個，臵于濕紗布上，在皿蓋上用玻璃鉛筆注明分離日期、材料和分離人的姓名。提示：無菌操作應注意下面幾點：工作前將所需的物品都放在超凈工作臺內；操作前用肥皂洗手，操作時還需用70 ％酒精擦拭雙手；無菌操作時，呼吸要輕，不要說話。

（2）用無菌操作法向培養皿中加入25％乳酸1～2滴(可減少細菌污染)，然后將融化而冷至60℃左右的PDA培養基倒人培養皿中，每皿倒10～15 ml，輕輕搖動使之成平面。凝固后即成平板培養基。

提示：加入25％乳酸1～2滴，可減少平板上出現污染細菌菌落。除乳酸外，在培養基中加入適當的抗菌素抑制細菌的生長，也是常用的方法。加青霉素(20μg／m1)可以抑制G+ 細菌生長；加多黏霉素B(5.0μg／ml。)可以抑制G-細菌生長；加鏈霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／m1)可以抑制大部分細菌的生長。除了氯霉素可在滅菌前加入外，其他抗菌素都應在滅菌后并冷卻到45℃左右(以手背觸三角瓶感到燙，但尚可以忍耐為宜)時加入。倒平板過程中只要遵循“穩、輕、快”要領，不必在火焰上方，一般很少污染。(3)取真菌葉斑病的新鮮病葉(或其他分離材料)，選擇典型的單個病斑，用剪刀或解剖刀從病斑邊緣(病健交界處，)切取小塊(每邊長3～4 mm)病組織數塊。

提示：選擇新患病的組織作為分離的材料，可以減少腐生菌混入的機會。腐生菌一般在發病很久而已經枯死或腐敗的部分滋生，因此，一般斑點病害應在臨近健組織的部分分離。

（4）將病組織放入70％酒精中浸3～5s后，按無菌操作法將病組織移入0.1％升汞液中分別表面消毒0．5、1、2、3、5 min(也可使用其他表面消毒劑)，如植物組織柔嫩，則表面消毒時間宜短；反之則可長些。然后放入滅菌水中連續漂洗三次，除去殘留的消毒劑。

提示：先用70％的酒精浸2～3 s是為了消除寄主表面的氣泡，減少表面張力，70％的酒精亦用于表面消毒，處理的時間較短(一般數秒至l min)升汞溶液消毒的時間因材料而異，可自30s至30min不等，一般情況下，需時間3～5 min。

(5)用無菌操作法將病組織移至平板培養基上，每皿內放4～6塊。

提示：在將病組織小塊移放到平板表面之前，應將其在無菌吸水紙上吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現細菌污染。

(6)將培養皿倒臵放入25℃左右恒溫箱內培養。一般3～4 d后觀察待分離菌生長結果。

(7)若病組織小塊上均長出較為一致的菌落，則多半為要分離的病原菌。在無菌條件下，用接種針(鏟)自菌落邊緣挑取小塊移入斜面培養基上，在25 ℃左右恒溫箱內培養，數日后，觀察菌落生長情況，如無雜菌生長即得該分離病菌純菌種，便可臵于冰箱中保存。

提示：除根據菌落的一致性初步確定長出的菌落是否目標菌外，還要在顯微鏡下檢查，進一步確定。如果是對未知病原菌的組織分離，則要將長出的菌落分別轉出，通過進一步的接種實驗明確哪一種為其病原菌。

在組織分離工作中，如果植物材料體積較大且較軟(如患灰霉病的番茄果實)，在分離過程中可直接挖取內部患病組織移入平板培養基上，完成分離工作。

2.稀釋分離法

(1)取滅菌培養皿三個，平放在濕紗布上，編號，并注明日期、分離材料及分離人姓名。

(2)用滅菌吸管吸取滅菌水，在每一皿中分別注入0.5～1.0 ml。(3)用移植環蘸一滴孢子懸浮液，與第一個培養皿中的滅菌水混合，再從第一個培養皿移三環到第二個培養皿中，混合后再移三環到第三個培養皿中。

(4)將熔化并冷卻到45～50℃的培養基，分別倒在三個培養皿中(為防止細菌污染，也可以向每個培養皿中事先加入1～2滴25％乳酸)，搖勻，凝固，要使培養基與稀釋的菌液充分混勻。

提示： 倒平板時的培養基溫度一定要掌握好，過熱易將病原菌燙死而使分離失敗，過冷則倒入培養皿中后難以形成平板，不利于分離。

(5)將培養皿翻轉后臵恒溫箱(25℃)中培養，數日后觀察菌落生長情況。

(6)挑菌 將培養后長出較為整齊一致的單個菌落分別挑取，接種到斜面培養基上，臵25℃左右培養。待菌長出后，檢查菌是否單純，若有其他菌混雜，就要再一次進行分離純化，直到獲得純培養。

(二)病原細菌的分離

病原細菌的分離方法以稀釋分離法和劃線分離法為最常用。在進行分離之前，首先應對病組織材料進行細菌學初步診斷，即經過鏡檢確認有噴菌現象以后，才對該病組織作分離工作。稀釋分離法是最經典的標準分離法，方法同上述真菌分離。

除去上述稀釋分離法以外，較為方便的是劃線分離法：(1)預先把熔化好的肉膏蛋白胨培養基倒入培養皿中，凝成平板后，翻轉放在30℃恒溫箱中2～4 h，使表面無水滴凝結。也可凝成平板后直接使用。(2)將病組織先用0.1％升汞表面消毒0.5～2 min，再用無菌水換洗3次后，放在滅菌培養皿中的滅菌水中，用滅菌玻棒研碎，并讓組織碎塊在水中浸泡20～60 min，讓細菌釋放到滅菌水中。

(3)用滅菌的接種鉺，(接種環)；蘸取浸泡液在干燥的培養基平板表面劃線，盡量不要把平板表面劃破。劃過第一批線后的接種環應放在火焰上燒灼，冷卻后直接在第一批劃線的末端向另一方向劃線。滅菌后再劃第三次線。

提示：劃過第一批線后接種鉺放在火焰上燒過這一步驟非常重要，這樣做可以使第一批線和第二批線上的細菌數量相差很大。

(4)用玻璃鉛筆在培養皿上寫上分離材料、日期和分離者姓名后，翻轉培養皿，放在26～28℃恒溫箱中培養。1～3 d后觀察有無細菌生長，在哪些地方有單菌落生長出來?其中的優勢單菌落應為待分離菌形成的。

(5)仔細挑取病原菌的單菌落，并移植到斜面培養基上。同時，再把單菌落用滅菌水稀釋成懸浮液作第二次劃線分離，經培養后出現的菌落在形態特征都趨于一致，并與典型描述的特征相一致時，即表明已獲得純培養。最好要經過連續三次單菌落的分離，才能確保純化。

(三)真菌、細菌培養性狀

1．真菌培養性狀觀察 取已分離，純化的某種真菌菌種；按前述稀釋分離法中(1)～(5)步驟進行，待某培養皿中形成單個菌落后觀察。記載以下內容：菌落顏色、菌叢密集及繁茂程度、是否有色素分泌出來而滲透到培養基中、菌落生長速度快慢等。同時要記載培養基種類(成分及pH)和培養溫度、光照條件。

2．細菌培養性狀觀察

(1)仿照上述真菌菌落形成步驟，觀察記載以下內容：菌落顏色、菌落邊緣形狀、菌落表面是光亮還是粗糙或有皺折、、菌落隆起情況、是否有色素分泌到培養基中，菌落生長速度快慢，是否有特殊氣味形成等。同時要記載培養基種類(成分及pH)和培養溫度、光照條件。

(2)用接種鉺(環)蘸細菌菌種后，通過無菌操作在牛肉膏蛋白胨等斜面培養基表面從下向上劃一直線，過2～3 d后長出的細菌群體稱為菌苔，可仿照觀察記載細菌菌落的記載內容，記載菌苔顏色、邊緣形狀、表面是光亮還是粗糙有皺折、隆起情況、是否有色素分泌到培養基中，是否有特殊氣味生成，生長速度快慢等。也要記載培養基種類(成分及pH)和培養溫度、光照條件。

(3)用接種鉺(環)蘸取細菌菌種后，通過無菌操作，將其接種在某種液體培養基中，數日后觀察記載培養基中是否變混濁、是否有色素、氣體、沉淀生成，培養液表面是否可生成菌膜等。也要記載培養基種類(成分及pH)和培養溫度、光照條件。

第三篇：微生物實驗室培養

平陸中學高二生物

課題一：微生物的實驗室培養第二課時

車柳順2.24學習目標：

1、明確配制培養基的步驟

2、說出純化微生物的方法和步驟

目標一：制備牛肉膏蛋白胨固體培養基

1、步驟：計算→稱量→溶化→→滅菌→倒平板。

2、演示倒平板操作

導思：（完成倒平板操作的討論題1——4）

目標二：純化大腸桿菌

1、微生物接種最常用的方法是劃線法和涂布平板法。

2、平板劃線法通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續分散到培養基的表面。稀釋涂布平板法則是將菌液進行一系列的梯度，然后將不同稀釋度的菌液分別到瓊脂固體培養基的表面，進行培養。

3、總結平板劃線法和稀釋涂布平板法的操作步驟并演示

（1）平板劃線操作：

導思：（完成平板劃線法的討論題）

（2）稀釋涂布平板法：

導思：（完成稀釋涂布平板法操作的討論題）

4、平板劃線法和稀釋涂布平板法的異同點是

目標三：菌種的保存

（1）對于頻繁使用的菌種，可以采用的方法

（2）對于需要長期保存的菌種，可以采用的方法。

自我反思

1、以下關于制備牛肉膏蛋白胨固體培養基的敘述錯誤的是（）

A.操作順序為計算、稱量、溶化、倒平板、滅菌

B.將稱量好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯

C.將培養皿冷卻至50C左右時進行倒平板

D.待平板冷卻凝固約5—10min后將平板倒過來放置

2、有關倒平板的操作錯誤的是（）

A.將滅過菌的培養皿放在火焰旁的桌面上

B.將打開的錐形瓶瓶口迅速通過火焰

C.將培養皿打開，培養皿蓋倒放在桌面上

D.等待平板冷卻凝固后需要倒過來放置

3、有關稀釋涂布平板法，敘述錯誤的是（）

A.先將菌液進行一系列的稀釋

B.然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到固體培養基的表面

C.適宜條件下培養

D.結果都可在培養基表面形成單個的菌落

4、產生標準形態菌落的細菌的最初數目和培養基分別是（）

A.一個細菌、液體培養基B.許多細菌、液體培養基

C.一個細菌、固體培養基D.許多細菌、固體培養基

第四篇：微生物的培養與生長

第四章

微生物的培養與生長

所有生物為了生存都必須不斷地從外界環境中吸收所需的各種物質從中獲得 原料和能量以便合成新的細胞物質，生物所需的這些物質稱之為營養物質。生物吸收利用營養物質的過程一般稱為營養。營養物質是生物進行一切生命活動的物質基礎，失去這個基礎，一切生物都無法生存，微生物也不例外。可見，營養對微生物的重要性。

第一節 微生物的營養

一、微生物細胞的化學組成

分析微生物細胞化學組成是了解微生物營養物質的基礎。主要成分：C、H、N、O和無機成分。其中主要是水分、蛋白質、碳水化合物、脂肪、核酸和無機鹽。水分占90-97，其余占3-10%。

二、營養物質及其生理功能

微生物所需的營養物質，主要包括碳素化合物、氮素化合物、水分、無機鹽類和生長素。這些物質對微生物的生命活動主要有三方面的作用：

（1）、供給微生物合成細胞物質的原料；（2）、合成代謝和生命活動所需的能量；（3）、調節新陳代謝。

（一）、碳源

碳源主要用來供給菌體生命活動所需的能量，構成軍菌體細胞及代謝產物。常用的碳源有：糖類、脂肪和某些有機酸、部分醇類。

在某些特殊情況（如碳源貧乏），蛋白質水解產物或氨基酸等也可以被某些菌種作為碳源使用。由于菌種所含煤系統并不完全相同，所以，各種菌能利用的碳源亦不相同。

葡萄糖、麥芽糖、乳糖等單糖和雙糖是絕大部分細菌、酵母菌、放線菌及霉菌可利用的碳源，大多數霉菌、放線菌和部分細菌可直接利用糊精和淀粉作為碳源。

（二）、氮源

氮源主要用來構成菌體細胞物質（如氨基酸、核酸、蛋白質）和含氮代謝產物。常用的氮源可分為兩類：有機氮源和無機氮源。黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、魚粉等屬于有機氮源；氨水、硫酸銨、尿素、硝酸鈉、硝酸銨和磷酸氫二銨等為無機氮源。

（三）、水

水是微生物體內外的溶媒，只有通過水，微生物所需要的營養物質才能進入細胞，也只有通過水其代謝產物才能排出體外。另外，水也可以直接參加代謝作用，如蛋白質、碳水化合物和脂肪的水解作用都是在水參與下才能進行的。

（四）、無機鹽

無機鹽也是微生物生長所必不可少的營養物，其中又可分為主要元素和微量元素兩大類。主要元素微生物需要量大，有P、S、Mg、K、Ca、Na等，它們參與細胞結構物質的組成，有調節細胞質pH值和氧化還原電位的作用，有能量轉移、控制原生質膠體和細胞透性的作用。微量元素有Fe、Cu、Zn、Mn、Co等，它們的需要量 雖然極微，但往往強烈地刺激微生物的生命活動。它們或是酶活性基的組成成分或酶的激活劑。

（五）、生長因子

有些微生物在含有碳源、氮源、無機鹽的培養基中仍不能正常生長，如在培養基中加入某種組織（或細胞）提取液時，則微生物生長良好，說明這種組織中含有某些微生物生長所需的生長因子。凡是微生物生長所不可缺少的微量有機物都稱為生長因子。包括維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶及其衍生物。

這些物質之所以稱之為生長因子，是由于某些微生物自己不能合成之，必須由外界提供。它不是一切微生物所必需的。

第一類是不需要外源供給的微生物，像自養型細菌和廣泛分布的一些腐生性細菌和霉菌，它們自己可以合成這些物質，以滿足自身 的需要。

第二類是缺乏自制一種或兩種能力的微生物，如金黃色葡萄球菌需要硫胺素，根瘤菌需要生物素。這類微生物中有些種類，當外界供給所需要的前體物質，亦能滿足需要。

第三類為對多種維生素、氨基酸、堿基都缺乏合成能力的微生物，在培養基中提供水解蛋白質和織物組織液才能生長（如麥芽汁、酵母汁）。

維生素作為酶的活性基團起催化作用。氨基酸是組成蛋白質的結構物質，嘌呤、嘧啶是合成核苷酸的主要物質。

三、微生物的營養類型

由于各種微生物的生活環境和對物質的利用能力不同，它們對營養的需要和代謝方式也不盡相同，根據微生物所需要的營養和能量的不同，尤其是碳素營養來源的不同，可把它們分成自養微生物和異養微生物兩大類。

自養型微生物：能利用簡單的無機物作為營養物質進行生長繁殖，能以CO2或碳酸鹽為碳源，以氨或硝酸鹽為氮源，在體內合成有機物，不需要外界供給有機物。

異養型微生物：只能用現成的有機物作為碳源，如單糖、雙糖、淀粉、纖維素、有機酸等，另外，根據能量來源不同，又可分為兩種類型。即光能營養型和化能營養型。光能營養型能利用光能。化能營養型是來自物質氧化過程釋放的能量。

根據碳素來源和能量來源可分四種類型。

（1）、光能自養型：這類微生物利用日光作為其生活所需的能源，利用CO2作為碳源，以無機物為供氫體來還原CO2,合成細胞有機物質。如藍細菌（光合細菌）。

（2）、光能異養型：有少數微生物種類具有光合色素，能利用光能把CO2還原為碳水化合物，但必須以某種有機物為CO2同化中的供氫體。如紅螺菌屬利用丙醇作為供氫體，積累丙酮。

（3）、化能自養型：能利用氧化無機物時產生的能量，把CO2還原成有機碳水化合物。如硝化細菌、鐵細菌等。

（4）、化能異養型： 能源來自有機物 的氧化或發酵產生的化學能，以有機物為碳源，以有機或無機氮為氮源。這類微生物的種類最多。

四、微生物對營養物質的吸收方式

微生物對營養物質的吸收取決于細胞膜的結構和生物功能。細胞膜是一層具有高度選擇性的半透膜，控制營養物質及 代謝產物的進出細胞。細胞膜上有豐富的酶，這些酶與物質的吸收和排泄有關。微生物對營養物質吸收的機制有四種：

1、被動擴散：由高濃度向低濃度擴散。

2、助長擴散：有載體蛋白參加。

3、主動運輸：從低濃度向高濃度擴散，需要能量和載體蛋白。

4、基因轉移：通過磷酸化轉移。

五、培養基

微生物的生長和繁殖需要一定的營養物質，根據微生物對營養物質的需要，經過人工配制適合比同微生物生長、繁殖或積累代謝產物的營養基質就成為培養基。培養基的主要用途為：促使微生物生長與繁殖，用于微生物純種分離、鑒定 和制造微生物制品等。

（一）、培養基的類型

由于各種微生物所需要的營養物不同，所以培養基的種類也有很多種，估計可有數千種之多，但大致可以分為以下幾類。

1、根據營養物質來分

（1）、合成培養基：是由已知化學成分及數量的化學藥品配制而成的。這種培養基成分精確，重復性強。但價格高，一般多用于實驗室內供研究有關微生物的營養、代謝、分離和鑒定生物制品及選育菌種用。

（2）、天然培養基：采用化學成分還不十分清楚或化學成分不恒定的天然有機物，可用組織提取液等。如牛肉膏、酵母膏、麥芽汁、蛋白胨、牛奶、血清等。玉米粉、馬鈴薯配制方便、經濟，運用于實驗室和生產。

（3）、半合成培養基：在天然有機物的基礎上，加入一些化學藥品，以補充無機鹽成分，使其更能充分滿足生長需要。該培養基是使用最多的培養基。

2、根據培養基物理性狀分

（1）、固體培養基：在液體培養基中加入2%瓊脂，成為固體狀，用于菌種保藏、分離、菌落特征觀察、計數等。

（2）、液體培養基：一般用于生產。

（3）、半固體培養基：加入0.35%-0.40%瓊脂。

3、根據培養基的用途來分

（1）、基礎培養基：滿足一般微生物生長需要的營養物質。

（2）、加富培養基：在培養基中加入額外的營養物質，使某些微生物在其中生長，而不適合其它微生物生長。通常加入血、血清、動植物提取液。

（3）、選擇培養基：在培養基中加入某些化學藥品以抑制不需要的微生物生長，而促進需要的微生物生長，往往加入一些抑菌劑或殺菌劑。

（4）、鑒別培養基；根據微生物能否利用培養基中的某種成分，依靠指示劑的顏色反應，借以鑒別不同種類的微生物。

（二）、培養基配制的原則

1、根據微生物的營養要求配制；

2、注意營養成分的比例；

3、培養基的pH值；

4、氧化還原電位。

第二節

微生物的生長

一、微生物的生長

微生物在適宜的環境中，按照自己的代謝方式，不斷地吸收營養物質，進行新陳代謝，即進行同化作用和異化作用。如果同化作用大于異化作用，細胞會增大，細胞的體積逐漸增加，這就是生長。細胞的生長有一定限度的，當增到一定限度時，細胞就開始分裂，形成兩個基本相似的子細胞，子細胞又可重復進行生長和分裂。細胞分裂形成子細胞，使個體數目增加，這就是分裂。從生長到繁殖的過程也就是由量變到質變的 發展過程，這一質變過程叫發育。微生物在比較合適的條件下，能正常生長和繁殖。當環境發生某些變化，此變化超過了微生物能適應忍受的程度時，微生物的生命活動就會受到抑制而發生變異，甚至死亡。

細菌的生長的標志：以群體數目的增加作為生長標志。因為很難將生長與繁殖分開。

放線菌和霉菌：是以菌絲的伸長和分枝表現為生長的。

對于微生物的應用，不論是在食品和其他方面的應用，主要是利用它的菌體，及其產生的代謝產物和酶類，而這與微生物的生長是密切相關的。所以了解和掌握微生物的生長特性是很有必要的。

二、微生物的純培養

目的是從混雜狀態中純化分離細菌，是研究利用微生物的基礎，通常采用以下方法：

1、稀釋平板法；

2、劃線法；

3、單細胞分離法；

4、選擇培養基分離法。

此部分試驗指導中也有，在此簡單介紹。

三、微生物生長的測定

（一）、單細胞的微生物是指細菌和酵母菌等，它們的生長量不是測定細胞大小，而是測定群體增長量。方法如下：

1、全數測定

所謂全數測定，即是培養一定時間后測定細胞的總數。其數量既包括活的細胞，也包括死的細胞。

（1）、計數器法：采用血球計數板。

（2）、染色涂片計數法：取定量菌液將其涂布于1cm2的面積內，染色、鏡檢、計數。

（3）、比濁法：是測定菌液中細胞數的快速方法，原理是菌液中細胞量越多，濁度越大。用未知細胞數的菌液和已知細胞數的菌液相比，來求出未知細胞數菌液中的細胞數。

2、活菌計數法：測定活菌數。（1）稀釋平板法：取待測的細胞懸液作一系列的稀釋，稀釋級數越高，稀釋液中含細胞數愈少，也就越易在培養皿上顯出單個菌落。

（2）、液體稀釋培養法：采用統計學原理進行測定，如大腸菌群的測定，采用此方法。

（二）、多細胞微生物生長的測定

以菌絲生長的長度或菌絲增加的重量作為生長指標。最簡單的方法是將酶菌接種在培養皿內固體培養基中央，在一定時間內測定菌落的直徑或面積。對生長速度快的霉菌，可每24h測量一次。可求出菌絲的平均生長速度。

（三）、細胞物質的測定

測量活菌或死菌。

1、干重法：過濾或離心，烘干稱重。

2、含氮量法：細胞的蛋白質含量比較穩定。而氮又是蛋白質的重要組成。因此，測定微生物細胞的含氮量來表示其生長情況。

四、生長曲線

是指細菌等單細胞微生物，以細胞增長數的對數值為縱坐標，以培養時間為橫坐標作圖時，可以繪出一個曲線，此曲線稱為生長曲線。

細菌純培養的生長曲線：由于細菌各個時期生長繁殖速度不同，所以，生長曲線又可分為延遲期、對數期、穩定期和衰亡期。

（一）、延遲期

少量的細菌接種到新鮮培養基后，開始時，細胞一般不立即進行繁殖。因此，它們的細菌數幾乎不增加，甚至還有減少。生長曲線中的這一段時間稱為延遲期。

處于延遲期的細菌體積增長較快，特別是在此期的末期。

延遲期的出現可能是因為細胞在新的環境中，需要合成新的必需的酶、輔酶或某些中間代謝產物，或者為了適應新環境而出現的調整代謝的時間。延遲期的長短與菌種的遺傳性、菌齡及移種到新鮮培養基前后所處的環境條件是否相同等因素有關。

繁殖速度較快的菌種接種時，其延遲期也較短，甚至檢查不到延遲期；接種到同樣組成的培養基比接種到組成不同的培養基中，其延遲期要短些；增大接種量可縮短甚至消除延遲期。

由于延遲期的長短能影響微生物的正常生長周期，在發酵工業生產中延長生產周期，會降低設備的利用率。所以，生產實踐中總是設法縮短延遲期。為此，采取的措施有：

（1）、增加接種量；（2）、用對數生長期的菌種；（3）、用健壯的菌種；

（4）、在種子培養基中加入發酵培養基中的某些成分；（5）、采用最適種齡等。

（二）、對數期

在延遲期末，細胞開始出現較大量的分裂，培養基中的菌數急劇增加，進入了對數期。在此期內，如用菌數的對數與培養時間作圖時，則該線呈一條直線，此期為對數期。

對數期的菌數按幾何級數增加。即1個細菌繁殖幾代，產生2n個細胞。對數生長期的菌體代謝活躍，消耗營養多，生長速率高，個體數目顯著增多。另外，群體中的細胞化學組成與形態、生理特征等比較 一致，這一時期的菌種 很健壯，因此，在生產上常用它作為接種的種子。

實驗室也多用對數期的細胞作為試驗材料。通常對數期維持的時間較長，但它也受營養及環境條件所左右。

（三）、穩定期

在一定的培養液中，細菌不可能按對數期的高速率無限地生長繁殖，這是由于對數期中細菌的活躍生長已經消耗了大量的營養物質，所以，在對數期末，細菌生長速率逐漸下降，死亡率大量增加，以致使新增值的細胞數與死亡的細胞數趨于平衡，因此活菌數保持相對的穩定，成為穩定期。

處于這個期的細胞生活力逐漸減弱，開始大量儲存代謝產物。同時，也積累了許多不利于微生物活動的代謝產物。由于微生物的生長改變了它自己的生活條件，出現了不利于細菌生長的因素，如pH值、氧化還原電位等，致使大都數芽孢桿菌在這個生長階段形成芽孢。

由于穩定期有大量代謝產物積累，人們要獲得其代謝物質，可在這一時期提取。在此穩定期內，活菌數達到最高水平。如要得到大量菌體，也應在此期開始收獲。穩定期持續時間長短取決于菌種的繁殖與衰亡的數量之比。環境條件對穩定期的長短也有影響。

（四）、衰亡期

穩定期后，如再繼續培養，細菌死亡率逐漸增加，以致使死亡數大大超過新生數，總的活菌數明顯下降，即死亡期。其中，有一階段活菌數以幾何數下降。因此，也稱為對數衰亡期。

這個時期，細菌菌體常出現多種形態，包括畸形和衰退型，因此，此期的菌種不宜作種子。

微生物中單細胞生長曲線，反映了一種微生物在某種生活環境中（試管、搖瓶、發酵罐）的生長、繁殖和死亡的規律。研究生長曲線既可為研究營養和環境條件提供理論依據，又可用來調控微生物的生長發育。

霉菌的生長也有延遲期、穩定期和衰亡期。由于它們不是單細胞微生物，所以它們的繁殖不按幾何級數增加，故而沒有對數生長階段。

五、連續培養

1、分批培養：在培養微生物時。將微生物置于一定容積的定量培養基中培養，稱為定量培養。

2、連續培養：是在微生物的培養過程中，不斷地供給營養物質，并排除老菌液，讓培養的微生物相對地維持較長時間的對數生長期，以利于提供較多的對數生長細胞。在發酵工業上，可提高發酵率和自動化水平，減少動力消耗并提高產品質量。有三種方法：

（1）、恒濁連續培養法；（2）、恒化連續培養法。

連續培養法在工業生產上稱為連續發酵。我國在丙酮、丁醇、酒精的生產以及檸檬酸的發酵上已采取了連續發酵法，縮短了發酵周期，效果良好。連續發酵的最大優點是取消了分批發酵中各批之間的間斷時間，縮短發酵周期，提高設備利用率。再者，連續發酵便于工業生產，自動化控制，產物均一，產量高。但是在工業化生產中連續發酵容易發生雜菌污染及菌種退化等問題。

第三節

環境條件對微生物的影響

外界環境對微生物的作用有三種情況：

（1）、外界環境條件適宜時，微生物生長旺盛，代謝作用加速；（2）、外界環境條件不太適宜時，微生物生長緩慢，代謝作用受到一定程度的抑制；

（3）、外界環境不適宜的情況達到微生物難以忍受的程度，這時，微生物生命活動受到嚴重的影響，可能發生變異或死亡。

人們控制和調節微生物所處的環境條件的目的是要促進某些有益微生物的生長，發揮它們的有益作用；抑制和殺死那些不利于人類的微生物，并清除它們的有害作用，如防止食品的腐敗變質等。

了解以下常用的幾個概念；

（1）、防腐（Antisepsis）：又叫抑菌，是防止或抑制微生物的生長繁殖。（2）、消毒（Disinfection）：是指殺死病原微生物的措施。

（3）、滅菌（Sterilization）：殺滅物體上所有的微生物，包括病原微生物及非病原微生物。

（4）、商業滅菌：是從商品的需要出發對食品進行的滅菌，指食品經過殺菌處理后，按一定的檢驗方法檢不出活的微生物或者僅能檢出極少數的非病原微生物，而且，它們在一定的保存期內不至于引起食品變質腐敗。

（5）、無菌（Asepsis）：即無活的微生物存在。如無菌操作。

（6）、死亡（dead）：是指微生物不可逆的喪失了生長繁殖的能力，即使再放到合適的環境中也不再繁殖。

環境因素包括：物理條件、化學條件和生物條件

一、溫度

溫度是影響生物機體的最重要的因素之一。溫度的變化影響著微生物的細胞中生化反應速度。

熱力致死時間（Thermal Death Time TDT）：是指在特定的條件和特定的溫度下，殺死一定數量微生物所需要的時間。

D值（Decimal reduction time）在一定溫度下加熱，活菌數減少一個對數周期（即90％的活菌被殺死）時，所需要的時間（min）。

Z值：如果在加熱至死曲線中，時間降低一個對數周期（即縮短90％的加熱時間）所需要升高的溫度（oC）。

F值：在一定的基質中，其溫度為121.1 oC，加熱殺死一定數量微生物所需要的時間（min）。

高溫滅菌分為干熱滅菌和濕熱滅菌。

（一）、干熱滅菌（diy heat sterilization）

主要用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。

1、火焰滅菌：直接利用火焰燃燒殺滅微生物。該方法滅菌迅速、徹底。

2、加熱空氣滅菌：將空氣加熱達140-160oC，保持1-2h。

（二）、濕熱滅菌（moist heat sterilization）

1、煮沸滅菌：煮沸溫度接近100 oC，保持15-30min，可殺死微生物的營養體，若要殺死芽孢，則需要2-3h，此法適用于可以浸泡在水中的物品，如食品、器材、衣物等。

2、間歇滅菌（vfractional sterillization或tyndallization）：用蒸汽加熱滅菌溫度不超過100 oC，每日一次，每次加熱30min，連續三次。

3、巴氏消毒（pasteurization）：有些食品或物品在高溫下會受到不同程度的損害，不宜用過高的溫度滅菌，可采用較低的溫度進行滅菌，條件是62-63 oC，30min；或72 oC，15s。適用于殺死食品中的病原菌。

4、高壓蒸汽滅菌（normal autoclaving）：1kg/cm2，121.5 oC，15-30min。

5、超高溫瞬時殺菌法（Ultra high temperature short time，UHT）：滅菌溫度132-150 oC，3-5s，可殺死微生物的營養細胞和耐熱性強的芽孢細菌，但污染嚴重的鮮乳在142 oC以上殺菌效果才好。

二、濕度

干燥能引起微生物細胞內蛋白質變性和鹽濃度增高，這是抑制微生物生長或促進其死亡的主要原因。

三、滲透壓

嗜鹽微生物、嗜糖微生物的概念。

除以上耐高滲微生物之外，一般來說，18%-25%的鹽濃度能完全阻止微生物的生長。

由于高滲透壓對微生物有抑制作用，所以，在食品工業上，廣泛地利用腌制和糖漬方法來保存食品。

四、氧化還原電位

不同的微生物需要的氧化還原電位不同。

五、輻射

1、紫外線：細胞中的核酸具有吸收紫外線的性能，紫外線的輻射能量作用于核酸時，能引起核酸的變化。妨礙蛋白質和酶的合成。紫外線殺菌作用常用于空氣消毒和器材物體表面消毒。

2、x、γ射線：x射線不如γ射線，γ射線被空氣吸收較少，射程遠，穿透力強，可用于食品殺菌。

由于各種射線照射殺菌時不需要高溫，所以這類殺菌又稱為冷殺菌。

六、超聲波與微波

超聲波對微生物細胞內含物有強烈的震蕩作用，可破壞細胞，另外，水溶液經處理后能產生過氧化氫，因而有殺菌能力，可以用來保藏食品。

微波是利用熱效應對微生物有殺滅作用。微波產生熱效應的特點是加熱均勻，熱能利用效率高，加熱時間短。目前微波用于食品滅菌。

七、氫離子濃度

pH值對微生物生長影響較大，主要影響菌體細胞膜上的電荷，影響物質的吸收、代謝。每種微生物都有自己適宜的pH值范圍。超過此一定范圍后，生長就會停止。由于pH值不同會影響微生物的代謝活動，改變物質合成方向。

高濃度氫離子可引起菌體表面蛋白質和核酸的水解，破壞酶的活性。另外，某些有機酸可引起氧化作用，具有殺菌作用。如食品防腐劑苯甲酸和水楊酸等。高濃度的堿具有殺菌作用，如石灰水、氫氧化鈉、碳酸鈉等作為機器、工具以及冷庫等的消毒劑。

八、化學物質

（一）、氧化劑：氧化劑殺菌的效果與作用和濃度成正比關系，殺菌的機理是氧化劑放出游離氧作用于微生物蛋白質的活性基團（氨基、羥基和其他化學基團），造成代謝障礙而死亡。主要有高錳酸鉀、過氧化氫、漂白粉、過氧乙酸、碘等。

（二）、甲醛：殺菌機理是與蛋白質的氨基結合而使蛋白質變性至死。

（三）、酚類：機理是蛋白質變性。石炭酸（苯酚）、來蘇兒。

（四）、醇類：脫水劑，乙醇：70%的乙醇殺菌能力最強。

（五）、新潔爾滅

（六）、毒性物質：SO2、H2S、CO、CN-。

（七）、染料：結晶紫、孔雀綠、復紅、次甲基藍、孟加拉紅對微生物有抑制作用。

（八）、重金屬鹽類：重金屬鹽類對微生物都有毒害作用，其機理是金屬離子容易和微生物的蛋白質結合而發生變形或沉淀。

第五篇：應用微生物生產實習報告

本次實習以生產實習為主，生產實習是學習應用微生物專業的一項重要的實踐性教學環節，旨在開拓我們的視野，增強專業意識，鞏固和理解專業課程。實習方式主要是請企業技術人才和老師在以講解形式介紹有關內容 的前提下，帶領同學們參觀生產車間，向企業技術生產工作人員學習請教相關知識;由帶隊老師組織同學們分組討論、發言，通過交流實習體會方式，加深和鞏固實習內容。通過本次實習，我們學到了很多課本上學不到的東西，并對微生物在生產實踐上的應用有了更深的認識。釀酒基本原理和過程主要包括:酒精發酵、淀粉糖化、制曲、原料處理、蒸餾取酒、老熟陳釀、勾兌調味等。

（1）酒精發酵

酒精發酵是釀酒的主要階段,糖質原料如水果、糖蜜等,其本身含有豐富的葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等成分,經酵母或細菌等微生物的作用可直接轉變為酒精。

酒精發酵過程是一個非常復雜的生化過程,有一系列連續反應并隨之產生許多中間產物,其中大約有30多種化學反應,需要一系列酶的參加。酒精是發酵過程的主要產物。除酒精之外,被酵母菌等微生物合成的其他物質及糖質原料中的固有成分如芳香化合物、有機酸、單寧、維生素、礦物質、鹽、酯類等往往決定了酒的品質和風格。酒精發酵過程中會產生的二氧化碳會增加發酵溫度,因此必須合理控制發酵的溫度,當發酵溫度高于30～34℃,酵母菌就會被殺死而停止發酵。除糖質原料本身含有的酵母之外,還可以使用人工培養的酵母發酵,因此酒的品質因使用酵母等微生物的不同而各具風味和特色。

（2）淀粉糖化

糖質原料只需使用含酵母等微生物的發酵劑便可進行發酵；而含淀粉質的谷物原料等,由于酵母本身不含糖化酶，淀粉是由許多葡萄糖分子組成，所以采用含淀粉質的谷物釀酒時,還需將淀粉糊化,使之變為糊精、低聚糖和可發酵性糖的糖化劑。糖化劑中不僅含有能分解淀粉的酶類,而且含有一些能分解原料中脂肪、蛋白質、果膠等的其他酶類。曲和麥芽是釀酒常用的糖化劑，麥芽是大麥浸泡后發芽而成的制品,西方釀酒糖化劑慣用麥芽；曲是由谷類、麩皮等培養霉菌、乳酸菌等組成的制品。一些不是利用人工分離選育的微生物而自然培養的大曲和小曲等，往往具有糖化劑和發酵劑的雙重功能。將糖化和酒化這兩個步驟合并起來同時進行，稱之為復式發酵法。

（3）制曲

酒曲亦稱酒母,多以含淀粉的谷類(大麥、小麥、麩皮)、豆類、薯類和含葡萄糖的果類為原料和培養基,經粉碎加水成塊或餅狀,在一定溫度下培育而成。酒曲中含有豐富的微生物和培養基成分,如霉菌、細菌、酵母菌、乳酸菌等,霉菌中有曲霉菌、根霉菌、毛霉菌等有益的菌種,“曲為酒之母,曲為酒之骨,曲為酒之魂”。曲是提供釀酒用各種酶的載體。中國是曲蘗的故鄉,遠在3000多年前,中國人不僅發明了曲蘗,而且運用曲蘗進行釀酒。釀酒質量的高低取決于制曲的工藝水平,歷史久遠的中國制曲工藝給世界釀酒業帶來了極其廣闊和深遠的影響。

中國制曲的工藝各具傳統和特色,即使在釀酒科技高度發展的今天,傳統作坊式的制曲工藝仍保持著原先的本色,尤其是對于名酒,傳統的制曲工藝奠定了酒的卓越品質。

（4）原料處理

無論是釀造酒,還是蒸餾酒,以及兩者的派生酒品,制酒用的主要原料均為糖質原料或淀粉質原料。為了充分利用原料,提高糖化能力和出酒率,并形成特有的酒品風格,釀酒的原料都必須經過一系列特定工藝的處理,主要包括原料的選擇配比及其狀態的改變等。環境因素的控制也是關鍵的環節。

糖質原料以水果為主,原料處理主要包括根據成酒的特點選擇品種、采摘分類、除去腐爛果品和雜質、破碎果實、榨汁去梗、澄清抗氧、殺菌等。

淀粉質原料以麥芽、米類、薯類、雜糧等為主，采用復式發酵法，先糖化、后發酵或糖化發酵同時進行。原料品種及發酵方式的不同,原料處理的過程和工藝也有差異性。中國廣泛使用酒曲釀酒，其原料處理的基本工藝和程序是精碾或粉碎，潤料(浸米)，蒸煮(蒸飯)，攤涼(淋水冷卻)，翻料，入缸或入窖發酵等。

（5）蒸餾取酒

所謂蒸餾取酒就是通過加熱,利用沸點的差異使酒精從原有的酒液中濃縮分離，冷卻后獲得高酒精含量酒品的工藝。在正常的大氣壓下,水的沸點是100℃，酒精的沸點是78.3℃,將酒液加熱至兩種溫度之間時,就會產生大量的含酒精的蒸汽，將這種蒸汽收人管道并進行冷凝,就會與原[FS:PAGE]來的科液分開，從而形成高酒精含量的酒品。在蒸餾的過程中，原汁酒液中的酒精被蒸餾出來予以收集，并控制酒精的濃度。原汁酒中的味素也將一起被蒸餾，從而使蒸餾的酒品中帶有獨特的芳香和口味。蒸餾過程中乙醇蒸汽的逃逸，會嚴重影響測定結果的準確性。因此蒸餾前必須仔細檢查儀器各連接處是否嚴密。若蒸餾中出現漏氣，必須重新測定。

蒸餾時，應先小火加熱，待溶液沸騰后再慢慢用大火焰。對于易產生泡沫的酒樣加少量消泡劑。但是加過消泡劑的試樣蒸餾殘液，不能用來作浸出物的測定。

（6）酒的老熟和陳釀

酒是具有生命力的，糖化、發酵、蒸餾等一系列工藝的完成并不能說明釀酒全過程就已終結，新釀制成的酒品并沒有完全完成體現酒品風格的物質轉化，酒質粗劣淡寡，酒體欠缺豐滿，固以新酒必須經過特定環境的窖藏。經過一段時間的貯存后，醇香和美的酒質才最終形成并得以深化。通常將這一新釀制成的酒品窖香貯存的過程稱為老熟和陳釀。

（7）勾兌調味

勾兌調味工藝，是將不同種類、陳年和產地的原酒液半成品(白蘭地、威士忌等)或選取不同檔次的原酒液半成品(中國白酒、黃酒等)按照一定的比例，參照成品酒的酒質標準進行混合、調整和校對的工藝。勾兌調校能不斷獲得均衡協調、質量穩定、風格傳統地道的酒品。

酒品的勾兌調味被視為釀酒的最高工藝，創造出釀酒活動中的一種精神境界。從工藝的角度來看，釀酒原料的種類、質量和配比存在著差異性，釀酒過程中包含著諸多工序，中間發生許多復雜的物理、化學變化，轉化產生幾十種甚至幾百種有機成分，其中有些機理至今還未研究清楚，而勾兌師的工作便是富有技巧地將不同酒質的酒品按照一定的比例進行混合調校，在確保酒品總體風格的前提下，以得到整體均勻一致的市場品種標準。

以大曲酒的釀造為例，其具體流程可用圖表解析如下：

┌—→出窖堆放———┐

│↓

│ 大曲發酵酒醅高粱谷糠 水

│ ↓│↓│

│ 打碎│破碎│

│ ↓│↓

│ 碾細│潤料清蒸

│ ↓│↓│

│ 過篩│預蒸│

│ ↓│↓│

│ 大曲粉└———→配料←——————┘

│ │↓

│ │裝甑┌——→ 酒頭（作調味酒等）

│ │↓│

│ │蒸糧、蒸酒———┼——→ 蒸餾酒（入庫）

│ │││↓

│ └———————┐↓│貯存

││出甑│↓

││││勾兌

│↓↓↓↓

└————入窖發酵←加曲 ← 加水尾酒包裝

↑│↓

一、釀酒用水

酒的釀制與水有密切的聯系，古人云：水為酒之血，曲為酒之骨，名酒產地必有名泉。

國酒茅臺：用赤河水，“集靈泉于一身，匯秀水而東下”。

湘西酒鬼：用“三眼泉”水，此三泉為“龍”“鳳”和“壽”泉。

洋河大曲：用當地“美人泉”水，有人稱贊：洋河美人泉，佳釀醉神州。

郎酒：用四川古藺縣的郎泉水，“冬季蒸騰，暖如春水，夏季水寒徹骨，涼爽宜人，遇雨不濁，遇旱不涸。”“明如鏡，碧如玉，甘如露”之說。

杜 康 酒：用河南伊縣皇得地村的“黑虎泉”和“白虎泉”。曹操贊稱：何以解憂，惟有杜康。

二、酒窖： 窖址的選擇，窖區走向，空間高度，透氣性能，窖泥的培養等等都具有科學性，俗話說：窖泥培養人人都知，也人人都不知，其中奧妙無窮。

三、酒曲： 釀酒與酒曲的選擇有密切關系，釀制不同的酒，選擇酒曲的種類也不同。

（1）、大曲：用含淀粉質的糧食為培養基，微生物為霉菌和醇母菌混合。

特點：大曲酒味醇厚，曲香濃郁，但生產周期長，用曲量多，出酒率低和耗糧高。

（2）、小曲：用大米或米糠為培養基，微生物有霉菌和醇母。

特點：小曲酒口味較醇厚，香氣較清淡，出酒率高，耗糧低。

（3）、紅曲：用大米、秈米、糯米為培養基，微生物是紅曲霉菌，同時產生紅色素，兼有糖化和發醇作用。

特點：酒色鮮艷，香氣濃郁，出酒率高。

（4）、變曲：用麥作培養基，有糖化和生香作用。用于黃酒生產。

特點：產黃酒，味鮮較淡。

（5）、麩曲：用麩皮作培養基，糖化劑，原料價廉，但香味不足，糖化功能

└—

——————————————┘成品酒

生產工藝

①原料配比及處理

甘薯或碎米、高粱等100kg，細谷糠80kg，麩皮120kg，水400kg，麩皮50kg，礱糠50kg，醋酸菌種子40kg，食鹽3.75~7.5kg(夏多冬少)。

將薯干或碎米等粉碎，加麩皮和細谷糠拌合，加水潤料后以常壓蒸煮1h或在0.15MPa壓力下蒸煮40min，出鍋冷卻至30~40℃。

②發酵

原料冷卻后，拌入麩曲和酒母，并適當補水，使醅料水分達60%~66%。入缸品溫以24~28℃為宜，室溫在25~28℃左右。入缸第二天后，品溫升至38~40℃時，應進行第一次倒缸翻醅，然后蓋嚴維持醅溫30~34℃進行糖化和酒精發酵。入缸后5~7d酒精發酵基本結束，醅中可含酒精7%~8%，此時拌入礱糠和醋酸菌種子，同時倒缸翻醅，此后每天翻醅一次，溫度維持37~39℃。約經12d醋酸發酵，醅溫開始下降，醋酸含量達7.0%~7.5%時，醋酸發酵基本結束。此時應在醅料表面加食鹽。一般每缸醋醅夏季加鹽3kg，冬季加鹽1.5kg。拌勻后再放兩天，再經2d后醋醅成熟即可淋醋。

③淋醋

淋醋工藝采用三套循環法。先用二醋浸泡成熟醋醅20~24h，淋出來的是頭醋，剩下的頭渣用三醋浸泡，淋出來的是二醋，缸內的二渣再用清水浸泡，淋出三醋。如以頭淋醋套頭淋醋為老醋；二淋醋套二淋醋3次為雙醋，較一般單淋醋質量為佳。

④陳釀及熏醋

陳釀是醋酸發酵后為改善食醋風味進行的儲存、后熟過程。陳釀有兩種方法，一種是醋醅陳釀，即將成熟醋醅壓實蓋嚴，封存數月后直接淋醋。或用此法貯存醋醅，待銷售旺季淋醋出廠。另一種是醋液陳釀，即在醋醅成熟后就淋醋，然后將醋液貯入缸或罐中，封存1~2個月，可得到香味醇厚、色澤鮮艷的陳醋。有時為了提高產品質量，改善風味，則將部分醋醅用文火加熱至70~80℃，24h后再淋醋，此過程稱熏醋。

⑤配兌和滅菌

陳釀醋或新淋出的頭醋都還是半成品，頭醋進入澄清池沉淀，調整其濃度、成分、使其符合質量標準。除現銷產品及高檔醋外，一般要加入0.1%苯甲酸鈉防腐劑后進行包裝。陳醋或新淋的醋液應于85~90℃維持50min殺菌，但滅菌后應迅速降溫后方可出廠。一般一級食醋的含酸量5.0%，二級食醋含酸量3.5%。