第一篇：土壤微生物的分離培養技術實驗報告

重慶大學研究生專業實驗教學

實驗報告書

實驗課程名稱： 實驗指導教師： 學

院： 專業及類別： 學

號： 姓

名： 實驗日期： 成績：

重慶大學研究生院制

一、實驗目的

1、了解分離與純化微生物的基本原理及方法；

2、了解倒平板配制土豆培養基的方法與平板劃線分離的基本操作技術；；

3、學習習近平板菌落計數的基本原理和方法，并掌握其基本技能；

4、初步觀察來自土壤中的幾類微生物的菌落形態特征，并能判斷菌的類型。

二、實驗原理

1、培養基的種類

培養基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養基質，用以培養、分離、鑒別、保存各種微生物或積累代謝產物。一般的培養基應包含適合微生物生長的6大營養素即水分、碳源、氮源、能源、無機鹽和生長因子。培養基的種類很多，根據培養成分的不同可分為天然培養基、合成培養基與半合成培養基；根據物理狀態的不同又可分為液體培養基和固體培養基。微生物的分離、純化、記數等方面的研究常常使用的就是固體培養基。本實驗就是使用的固體培養基。

已配制好的培養基必須立即滅菌，如來不及滅菌，應暫存冰箱，以防止其中微生物生長繁殖而消耗養分和改變培養基酸堿度所帶來不利影響。

培養基的原材料來源十分廣泛，本實驗采用的原材料為土豆。

2、接種方法與無菌接種

將微生物的培養物或含有微生物的樣品移植到培養基上的操作技術稱之為接種。接種是微生物實驗及科學研究中的一項最基本的操作技術。接種的關鍵是要嚴格的進行無菌操作。微生物的接種方法很多，劃線接種、三點接種、穿刺接種、混澆接種與涂布接種是幾種常用的接種方法。

劃線接種是最常用的接種方法，即在固體培養基表面作來回直線形的移動，就可以達到接種的目的。常用的接種工具為接種環、針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。三點接種是把少量的微生物接種在平板表面，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落后，來觀察研究它們的形態。研究霉菌形態時就常用此法。

穿刺接種是用針蘸取少量的菌種，沿半固體培養基中心向管底作直線穿刺。該法常用于厭氧菌種的保藏或微生物的動力研究。

混澆接種是先將待接的微生物放入培養皿中再倒入冷卻至45℃左右的固體培養基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就被稀釋了。待平板凝固后，置于適宜溫度下培養，就可以長出單個菌落的微生物。

涂布接種是將菌液倒入平板上，再用涂布棒在表面迅速的作來回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可以長出單個菌落的微生物。

本實驗采用的是劃線接種。為了防止接種時引入其它微生物，整個操作過程均需在無菌操作臺上進行，還需對操作員的雙手進行酒精消毒，每次劃線前都需灼燒接種環，接種時才打開培養皿且不能全部打開，接種完馬上關上。

三、實驗器材

1、儀器

培養皿、量筒、滴管、吸水紙、燒杯、三角瓶、酒精燈、玻璃棒、接種環、15ml離心管、試管架、鑷子、電磁爐、鍋、恒溫培養箱、高溫滅菌鍋、無菌操作臺、酒精燈、天平、濾紙等。

2、材料

土豆、瓊脂、蒸餾水、酒精、土壤樣品

四、實驗步驟

1、土壤稀釋液的配制

① 在菜地用九點取樣法取適量土壤樣品，具體操作為：在菜地選取九個取樣點，在每個取樣點取相同量的表層土壤（10cm左右），然后將其混合均勻；

② 稱取1g土壤樣品與99ml蒸餾水，將其配制成100ml的土壤溶液； ③ 用移液管取9ml蒸餾水于15ml離心管中，再用移液槍取1ml前一步已配制的土壤溶液于離心管中，搖勻，即為10-3的土壤溶液；

④ 重復前一步，將土壤溶液稀釋為10-

4、10-

5、10-

6、10-

7、10-8一系列稀釋液。

2、土豆培養基的制備

① 用天平稱取200g土豆，清洗干凈后去皮切丁；

② 用量筒量取1000ml蒸餾水與電磁爐鍋中，再加入已準備好的土豆，將其煮爛；

③ 從鍋中取出已煮爛的土豆，用紗布過濾，濾液待用； ④ 稱取20g瓊脂與濾液中，再用蒸餾水定容至1000ml；

⑤ 在制備好的濾液中加入0.1ml菌液，然后放入高溫滅菌鍋中，在121℃下滅菌20min；

⑥ 取出已滅菌的土豆培養基，待其熔化后冷卻至60℃，倒入每付平板約15-20ml，待其凝固后便可使用。

3、微生物的接種與分離

① 將接種需要的所有器材均放置于無菌操作臺上；

② 用浸泡在酒精里棉花給雙手滅菌，點燃酒精燈，右手拿接種環，左手拿培養基；

③ 將接種環放在火焰上燒灼，待其冷卻后在10-6土壤稀釋液中蘸取少量液體，打開培養基的一部分，采用劃線接種，使之形成單菌落，一共劃線3-4次，每劃線一次就需在火焰上燒灼一次；

④ 重復上步，接種10-

7、10-8的土壤稀釋液的微生物；

⑤ 接種完的培養基放在恒溫培養箱中倒置培養48h，取出觀察。

五、結果與思考

1、實驗結果

圖1 實驗結果如圖1所示。由圖1可知，采用劃線接種土壤微生物的培養皿里有單菌落出現，這說明劃線接種能達到分離培養的目的。

學習過微生物這門課程的同學都知道，真菌的菌落較大且疏松，菌絲細長，呈絨毛狀、蜘蛛網狀、棉絮狀，無固定大小，多有光澤，不易挑，孢子會呈現紅色、褐色、綠色、黑色、黃色等不同的顏色；細菌的菌落較小，形狀表面或光滑黏稠，或粗糙干燥，易挑起，多為白色。由此可知土壤里既含有真菌又含有細菌。

2、思考題

⑴在平板劃線法中，為什么每次都需要將接種環上的剩余物燒掉？

答：這么做的主要目的是殺死上次劃線后接種環上殘留的菌種，以使下次劃線的菌種直接來自于上次劃線的末端，使每次劃線菌種數目減少，從而達到分離菌株的目的。

⑵為什么要把培養皿倒置培養？

答：①操作時培養皿蓋上可能粘有水珠或者細菌，倒著培養可以避免培養皿蓋上的水珠或者微生物落在培養皿上；

②培養過程中，細菌在代謝繁殖過程中會產生一些有害于細菌生長繁殖的代謝物，釋放熱量及有水排出，如果不倒著培養會有水珠滴落到培養基中，影響菌落的生長;③如果培養目標是收集細菌代謝物，而且代謝物易溶于水，倒著培養可能會方便收集。

六、實驗總結 我本科所學專業是材料科學與工程，本次實驗是我高中后第一次接觸微生物方面的知識。在本次實驗課里，段老師先給我們詳細講解了微生物分離培養方面的許多理論知識，然后才進入了理論環節。在實驗操作過程中段老師一直在我們旁邊觀察我們的實驗操作過程，一旦出現錯誤，會立即指出并耐心的給我們講解應該怎么做，我擔心自己從來沒做過微生物培養方面的實驗會做不好，段老師還一直在旁邊鼓勵我，并給我講解了許多微生物分離培養方面的知識，最后我獨立完成了本次實驗。此次實驗課，我真的是受益匪淺，學到了許多微生物分離培養方面的知識，十分感謝段老師。

圖2 如圖2所示，本次微生物分離培養實驗中，有些培養皿里菌落很少，只有一個，有的甚至沒有。我認為出現這種情況原因可能是：劃線接種時，未等接種環冷卻就開始接種，微生物可能被高溫殺死；在接種時，酒精燈火焰太大，進行接種操作的全過程又離酒精燈火焰很近，這也可能將微生物殺死。

第二篇：微生物分離實驗報告（定稿）

微生物分離實驗報告

實驗儀器及材料

土樣：18號土樣 試劑及培養基

培養基：果膠酶篩選培養基；幾丁質酶真菌篩選培養基；果膠酶劃線分

離培養基；幾丁質酶劃線培養基；細菌半固體培養基；淀粉培養基；葡萄糖酵解培養基；乳糖酵解培養基；蛋白胨水培養基

a)試劑：草酸銨結晶紫染液、番紅復染液等各種染料以及盧戈氏碘液、95%

乙醇、5%孔雀綠水溶液、無菌水等

儀器

錐形瓶（500mL×2；300mL×2；100mL×3）、培養皿（20套）、試管（20支）、移液管（3支）、燒杯、玻璃棒、載玻片、蓋玻片、光學顯微鏡、涂布棒、U型管、德漢氏小管、酒精燈、漏斗、接種環、濾紙、棉塞、牛皮紙、無菌操作臺、滅菌鍋、紗布等

細菌的篩選，分離純化及鑒定 細菌的篩選

土樣處理

配制生理鹽水：在燒杯中配置200ml0.85％的生理鹽水，用移液管各移取9ml于五支潔凈試管，再移取90ml配置好的生理鹽水于三角燒瓶，并放入少許玻璃珠，包好滅菌；

加土樣：冷卻后準確稱取10g土樣放入盛有90ml無菌生理鹽水并帶有少許玻璃珠的三角燒瓶中，充分震蕩搖勻，然后放在30℃恒溫培養箱中靜置15min。

果膠酶菌種篩選

梯度稀釋：用一支無菌吸管吸取1ml土壤懸液加入到盛有9ml無菌水的試管中充分混勻，此為10-1稀釋液，以此類推制成10-

2、10-3兩種稀釋度的土壤溶液（如下圖）；

涂布：配制果膠酶篩選培養基，110度滅菌20-30分鐘，冷卻后倒平板在培養皿蓋周邊用記號筆做好標記，分別寫上10-

1、10-3兩種稀釋度字樣，每稀釋度標記三皿，然后用無菌吸管分別由10-

3、10-1兩管土壤稀釋液中吸取適量對好放入已寫好稀釋度的平板中央位置，每皿準確放入0.2ml，用無菌玻璃棒在培養基表面輕輕地涂布均勻，其方法是將菌液先沿一條直線輕輕地來回推動，使之均勻分布，然后改變方向90度沿另一垂直線來回推動，平板內邊緣處改變方向用涂布棒再涂布幾次；

培養：將平板倒置于30℃恒溫箱中培養1-2天；

果膠酶透明圈平板檢測：取10-1涂布平皿，用0.5％的剛果紅染色15-20min后，倒掉剛果紅，用1mol/L的NaCl脫色幾分鐘至觀察到透明圈，則說明水解圈內的菌有水解果膠的能力；

菌落描述：取此菌進行菌落形態描述，就菌落的大小（大、中，小），顏色（白，黃，粉紅等），干濕（干、濕），邊緣（整齊，不整齊），表面（光滑，粗糙，有無突起等）分別進行闡述并詳細記錄； 細菌的分離純化

劃線分離：制備果膠酶劃線培養基，滅菌后倒平板，挑取具有水解圈的菌種，第一次劃線分離培養1-2天后取分離所得單菌落再進行第二次劃線分離，劃線分離的具體方法是：先在平皿上劃定區域，然后將接種針在火焰上進行滅菌操作，取含菌種的培養皿，在火焰上方（注意：不

圖 細菌的劃線分離示意圖

能離火焰太近）打開培養皿蓋，先拿接種針在上蓋處劃線以降溫，然后用接種針輕挑所選菌落一到兩下，將平皿蓋上放好，再取剛剛冷卻了的干凈平皿在1區進行劃線接種操作。操作完畢后對接種針進行滅菌操作，完成后在火焰上方打開平皿蓋，將接種針冷卻后從1區引線到2區，再如圖所示劃線，劃完后引線到3區，同上進行劃線，劃線完畢后蓋蓋平放；

純種保藏：再配制一份普通細菌培養基，分裝試管后滅菌，制得斜面，將純種劃線接種在斜面上培養保存并進行下一步的鑒定。

a)純種果膠酶水解能力的測定

配制果膠酶篩選培養基，110度滅菌20-30分鐘，冷卻后倒平板在培養皿蓋周邊用記號筆做好標記，將分離純化的細菌點種于平板上（注意：點種的量不宜過多，以3～4個為宜），在30℃培養箱中培養1～2天，取培養后的平皿用0.5％的剛果紅染色15-20min后，倒掉剛果紅，用1mol/L的NaCl脫色幾分鐘至觀察到透明圈，測量并記錄透明圈的大小

b)簡單染色步驟 i.涂片 取一塊載玻片，在上邊用膠頭滴管加半滴無菌水，用接種環無菌操作將沾有菌的接種環置于載玻片上的無菌水種涂抹，待看到微弱的渾濁即可；（注意取菌不要太多）

ii.干燥與固定

涂菌面朝上，通過火焰以干燥并固定菌物，固定過程應使載玻片通過火焰2-3次，注意溫度的控制，過熱的溫度會將細菌殺死，溫度以手背感覺微微發燙為標準；

iii.染色

將載玻片平放于載波片支架上，滴加結晶紫染液覆蓋涂菌部位即可，染色1.5min iv.水洗

傾去染液，將載玻片的涂菌面朝下，自來水沖洗，水流不宜太急、太大，至洗出水無色為止；

v.干燥

用吸水紙吸去多余水分后自然干燥； vi.鏡檢

將制備好的樣片置于顯微鏡下進行觀察，先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當的視野后，將高倍鏡轉出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀察細菌的形態。

c)革蘭氏染色步驟 i.涂片

先在載玻片一側用記號筆標記間隔的四個區域，在另一側四個區域的位置分別滴加半滴無菌水。分別取四種活躍生長期菌種（大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草桿菌和一種自選菌）按常規方法涂片（不宜過厚），用酒精燈按照簡單染色中所述干燥和固定的方法對四種菌進行干燥和固定。

ii.初染

滴加草酸銨結晶紫染液使之覆蓋涂菌部位，染色1.5min后水洗； iii.媒染

先用盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋1min后水洗； iv.脫色

先用乙醇沖去水跡，然后用95%乙醇覆蓋脫去色素，脫色約30s，立即用水沖洗；

v.復染

先用番紅洗去水跡，然后滴加番紅復染1.5min后水洗； vi.鏡檢

將制備好的樣片置于顯微鏡下進行觀察，先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當的視野后，將高倍鏡轉出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀察細菌。分別以大腸桿菌與金黃色葡萄球菌所染顏色作為對照，來判斷枯草桿菌以及另一種自選菌的染色結果。

d)芽孢染色步驟 i.涂片，加熱干燥及固定

在潔凈蓋玻片接近中部兩處分別滴一滴無菌水，分別接種枯草芽孢桿菌及梭狀芽孢桿菌。然后按照常規方法加熱干燥及固定；

ii.孔雀綠加熱染色

用木夾夾住載玻片，向載玻片上滴加5%孔雀綠水溶液使之完全覆蓋涂菌部位，然后在酒精燈上微微加熱（孔雀綠著色能力強，加熱可使較難染色的芽孢染成綠色，且再難洗脫）至染液冒蒸汽開始計時并維持5min，注意加熱時應以有蒸汽微微冒出為宜，過熱或加熱不足均會影響觀察效果，且加熱時在載玻片上隨時補加染液，切勿讓涂片干涸；

iii.水洗

水洗一定要等載玻片冷卻后進行，否則可能導致載玻片的破裂。具體水洗按常規方法進行； iv.復染

用0.5%番紅水溶液復染2min； v.水洗并干燥

按常規方法水洗后自然干燥； vi.鏡檢

先在低倍鏡下尋找視野范圍，然后換用高倍鏡調焦，最后加香柏油在油鏡下仔細尋找兩種細菌以及其周圍或內部染成綠色的芽孢。

e)半固體穿刺法觀察細菌運動性 i.配制培養基

配制半固體牛肉膏蛋白胨培養基，分裝于4支試管內，110度滅菌20-30分鐘，正立于燒杯中冷卻至室溫；

ii.在無菌操作臺上右手握接種針,以針挑取菌苔.垂直刺入半固體瓊脂培養的中心直至接近(但勿觸及)試管底,然后循原路退出。如圖所示：

iii.接種完成后在30℃條件下培養兩天觀察并判斷其運動性。

第三篇：微生物的分離與培養

病原物的分離與培養

病原物的分離與培養在植物病害的研究中具有重要意義，分離、培養病原菌的方法是植物病理學研究工作中最常應用的實驗技術。一方面，在一個新的病害研究中，通過分離與培養獲得病原物的純培養，完成柯氏法則，以明確該病病原；研究病原物的生物學特性和病害循環（侵染、病程等等）。所謂病原物的分離，即把該病原菌從發病組織上與其他微生物分開；所謂病原物的培養，即將分離的病原菌移到可以讓這種病原菌正常生長的營養基質即培養基上，從而獲得其純培養。病原物的分離與培養，需經以以幾個步驟: 1.有關器皿的滅菌和消毒； 2.制作培養基； 3.病原菌的分離 4.病原菌的培養。－、滅菌與消毒

滅菌與消毒是兩個不同的概念。滅菌則是指殺死一切微生物的營養體和孢子。消毒一般是指消滅病原菌和有害微生物的營養體，在植物病理學實驗中，需要進行純培養，不能有任何雜菌污染，因此對所用器材、培養基和工作場所都要進行嚴格的消毒和滅菌。消毒與滅菌的方法很多，一般可分為加熱、過濾、輻射和使用化學藥品等方法。

(一)熱力滅菌

熱力滅菌分干熱滅菌和濕熱滅菌兩類。

1．干熱滅菌

干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內的蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。細胞內的蛋白質疑固性與其本身的含水量有關。在菌體受熱時，當環境和細胞內含水量越大，則蛋白質凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高(160～170℃)，時間長1～2 h。但干熱滅菌溫度不能超過180 ℃，否則包器皿的紙或棉塞就會燒焦，甚至引起燃燒。干熱滅菌使用的儀器是烘箱。

干熱滅菌有火焰燒灼滅菌和熱空氣滅菌兩種。火焰燒灼滅菌適用于接種環、接種針和金屬用具如鑷子等，無菌操作時酌試管口和瓶口也在火焰上作短暫燒灼滅菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后進行灼燒滅菌。通常所說的干熱滅菌是在烘箱內利用高溫干燥空氣(160～170℃)進行滅菌。此法適用于玻璃器皿如吸管和培養皿等的滅菌。

進行干熱滅菌要注意以下問題：物品不要擺得太擠，以免妨礙空氣流通；滅菌物品不要接觸烘箱內壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火；在升溫過程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示箱內停止加溫；電烘箱內溫度未降到70℃以前，切勿自行打開箱門以免驟然降溫導致玻璃器皿炸裂。濕熱滅菌

(1)高壓蒸汽滅菌 此法是將物品放在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內，0.1MPa，121℃保持15～30 min進行滅菌。時間的長短可根據滅菌物品種類和數量的不同而有所變化，以達到徹底滅菌。這種滅菌適用于培養基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的滅菌。

(2)常壓蒸汽滅菌 在不具備高壓蒸汽滅菌的情況下：常壓蒸汽滅菌是一種常用的滅菌法。對于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養基如明膠培養基、牛乳培養基、含糖培養基等可采用常壓蒸汽滅菌。這種滅菌方法可用阿諾氏流動蒸汽滅菌器進行，也可用普通蒸籠進行滅菌。由于常壓，其溫度不超過100℃，僅能使大多數微生物被殺死，而芽孢細菌卻不能在短時間內殺死，因此可采用間歇滅菌以殺死芽孢細菌，達到徹底滅菌的目的。

常壓間歇滅菌是將滅菌培養基放人滅菌器內，每天加熱100℃，30 min，連續3 d，第一天加熱后，其中的營養體被殺死，將培養物取出放室溫下18～24 h，使其中的芽孢發育成營養體，第二天再加熱100℃，30 min，發育的營養體又被殺死，但可能仍留有芽孢，故再重復一次，使徹底滅菌。

(二)過濾除菌

許多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加熱消毒滅菌方法，—均會被熱破壞，因此采用過濾除菌的方法。應用最廣泛的過濾器有：

(1)蔡氏過濾器 該過濾器是由石棉制成的圓形濾板和一個特制的金屬（銀或鋁）漏斗組成，分上、下兩節。過濾時，用螺旋把石棉板緊緊夾在上、下兩節濾器之間，然后將溶液臵于濾器中抽濾。每次過濾必須用一張新濾板。根據其孔徑大小，濾板分為3種型號：K型最大，作一般澄清用；EK濾孔較小，用來除去一般細菌；EK-S濾孔最小，可阻止大病毒通過。使用時可根據需要選用。

(2)微孔濾膜過濾器 這是一種新型濾器，其濾膜是用醋酸纖維酯和硝酸纖維酯的混合物制成的薄膜。微孔濾膜過濾器是由上下二個分別具有出口和入口連接裝臵的塑料蓋盒組成。出口處可連接針頭，入口處可連接針筒。使用時將濾膜裝入兩塑料蓋盒之間，旋緊蓋盒，當溶液從針筒注入濾器時，此濾器將各種微生物阻留在微孔濾膜上面，從而達到除菌的目的。根據待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾器。此法除菌的最大優點是可以不破壞溶液中各種物質的化學成分。但由于濾量有限，所以一般只適用于實驗室中小量溶液的過濾除菌。實驗室中用于除菌的微孔濾膜孔徑一般為0.22μm，但若要將病毒除掉，則需更小孔徑的微孔濾膜。微孔濾膜過濾除菌的主要操作步驟為：

① 組裝、滅菌 將0.22μm孔徑的濾膜裝入清洗干凈的塑料濾器中，旋緊。壓平，包裝滅菌后待用(0.1MPa、121.5℃滅菌：20 min)。連接。將滅菌濾器的入口在無菌條件下，以無菌操作方式連接于裝有待濾溶液注射器上，將針頭與出口處連接并插入帶橡皮塞的無菌試管中。

② 壓濾 將注射器中的待濾溶液加壓緩緩擠壓過濾到無菌試管中。濾畢，將針頭撥出。壓濾時，用力要適當，不可太猛太快，以免細菌被擠壓通過濾膜。

提示: 整個過程應在無菌條件下嚴格無菌操作以防污染，過濾時應避免各連接處出現滲透現象。

(三)輻射滅菌 紫外線滅菌是用紫外線燈進行的。波長為200～300 nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260 nm的殺菌力最強。在波長一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強度和時間的乘積成正比。紫外線殺菌機理主要是因為它誘導了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA的交聯，從而抑制了DNA的復制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成[O]，再使O2氧化生成臭氧(O3)，或使水氧化生成過氧化氫(H2O2)。O3和H2O2有殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以只適用于無菌室、接種箱的空氣及物體表面的滅菌。

注意事項: 紫外線對眼結膜及視神經有損傷作用，對皮膚有刺激作用，故不能直視紫外線燈光，更不能在紫外線燈光下工作。紫外線燈距照射物以不超過1.2 m為宜。

此外，采用60Co-γ射線滅菌，也已廣泛用于不能進行加熱滅菌的紙、塑料薄膜，各種積層材料制作的容器以及醫用生物敷料皮等的滅菌。γ射線滅菌的最大優點是穿透力強，可在厚包裝完好條件下滅菌。

(四)化學藥品滅菌

化學藥品消毒滅菌法是應用能抑制或殺死微生物的化學制劑進行消毒滅菌的方法。能破壞細菌代謝機能并有致死作用的化學藥劑為殺菌劑，如重金屬離子等；只是阻抑細菌代謝機能，使細菌不能增殖的化學藥劑為抑菌劑，如磺胺類及大多數抗生素等。化學藥品對微生物的作用是抑菌還是殺菌以及作用效果還與化學藥品濃度的高低、處理微生物的時間長短、微生物的種類以及微生物所處的環境等有關。

植物病理學實驗室中常用的化學藥品有2％煤酚皂溶液(來蘇爾)、0.25％新潔爾滅、0.1％升汞、3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等。

消毒與滅菌不僅是從事植物病理學和整個生命科學研究必不可少的重要環節和實用技術，而且在醫療衛生、環境保護、食品、生物制品等各方面均具有重要的應用價值。根據不同的使用要求和條件選用合適的消毒滅菌的方法。

二、培養基的制作

1、目的要求

了解培養基的配制原理，掌握培養基的制備方法。

2、基本原理

在植物病理學研究工作中經常要使用各種不同的培養基。培養基是按照生物生長繁殖所需要的各種營養，用人工方法配制而成的營養基質。其中含有碳源、氮源、無機鹽、維生素以及水分等。微生物在培養基上生長繁殖還必須在最適pH范圍內才能生長得更好，因此，對不同種類的微生物應將培養基調節到一定的pH范圍。－般而言，真菌調節到微酸，細菌調節到微堿。

培養基的種類很多，不同的微生物所需要的培養基不同。依物理性狀可分為液體的、固體的和半固體的三種。固體培養基是在液體培養基中加入1.5 %～2 %的瓊脂，半固體培養基是加入0.2 %～0.5 %的瓊脂。瓊脂(agar)起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。

根據營養物質來源的不同，培養基可分為天然、半合成和合成培養基三類。天然培養基是以自然界原有的有機物為材料經滅菌后制成，如馬鈴薯、胡蘿卜、水果、大麥粒、高粱粒等。半合成培養基中既有一些天然的有機物質，又有一些成分簡單或明確的化合物。如常用的馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)、肉汁胨培養基(NA)等。合成培養基是由一些成分明確的化合物配制而成的，無任何成分不明確的物質，常用于研究微生物的生理生化性狀，如查氏(Czapek)培養基等。

根據培養基用途不同，可分為生長繁殖培養基、富集培養基、貯存培養基、選擇性培養基和鑒別培養基等。在植物病理學研究中，最常用培養基有馬鈴薯葡萄糖培養基，主要用于分離培養病原真菌。

在培養基配制完之后，必須經過滅菌，以便徹底殺死其中原有的一切微生物。

3、材料、試劑與儀器 材料 馬鈴薯。

試劑 葡萄糖、瓊脂等。

儀器與用品 高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙(或酸度計)、試管、鋁鍋、攪拌棒、三角瓶、燒杯、漏斗、量筒、紗布、棉花、天平等。

4、操作步驟

PDA培養基(馬鈴薯葡萄糖培養基)馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20g、蒸餾水1000 ml，自然pH。

在PDA培養基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，這樣配制的培養基也稱為PSA培養基。(1)稱量 稱量去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g。提示：瓊脂加入的量取決于瓊脂的質量，質量好的15 g就夠了，質量差的應適當增加。另外，在夏天氣溫較高時，適當增加用量。

(2)將馬鈴薯切成小塊，放入鍋中，加水1000 ml，煮沸30 min。用紗布濾去馬鈴薯殘渣。

(3)將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂，加熱熔化。

提示：在瓊脂熔化的過程中，需要用玻璃棒不斷攪拌，并控制火力不要使培養基溢出或燒焦。

(4)加入葡萄糖 葡萄糖溶解后，加入適量的水以補充加熱過程中損失的水分，定容至1000 ml。

提示：通常在制作培養基的鍋內用紅藍鉛筆標記出不同體積的刻度，如1 000 ml、2000 ml等，在定容時直接將水加至已標記的刻度即可。

(5)分裝 根據不同的實驗目的，可將配制的培養基分裝于試管內或三角瓶內。分裝試管，其量為管高的1／5，滅菌后制成斜面。分裝三角瓶的容量以不超過三角瓶容積之一半為宜。

(6)加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脫脂的經彈松的棉花，棉塞可過濾空氣，防止雜菌侵入并可減緩培養基水分的蒸發，故在植物病理學研究工作中普遍使用。

正確的棉塞是形狀、劃、、松緊與管口或瓶口完全適合，過緊時妨礙空氣流通，操作不便；過松則達不到濾菌的目的，且棉塞過小往往容易掉進試管內。正確的棉塞頭較大，約有1／3在外，2／3在試管內。分裝過程中注意不要使培養基沾染在管(瓶)口上以免浸濕棉塞，引起污染。

(7)包扎 加塞后，將試管用線繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道線繩扎好。用記號筆注明培養基名稱、配制日期、組別、制作人等。

(8)滅菌 將上述培養基以0.1MPa，121℃，高壓蒸氣滅菌20 min。

(9)擱臵斜面 將滅菌的試管培養基豎臵冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱臵的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。

培養基經滅菌后，必須放在37℃溫箱培養24h，無菌生長者方可使用。

PDA培養基一般不需要調pH。對于要調節pH的培養基，一般用pH試紙測定其pH。如果培養基偏酸或偏堿時，可用l mol／L NaOH或l mol／L HCl溶液進行調節。調節時應逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過酸或過堿破壞培養基成分。

三、病原菌的分離培養和純化

1、目的要求

(1)了解分離與純化微生物的基本原理及方法。

(2)掌握倒平板的方法和組織分離、稀釋分離、平板劃線分離的基本操作技術。

(3)掌握在平板、斜面及液體培養基上培養病原菌及觀察其培養性狀的方法。

2、基本方法

植物病原真菌的分離方法主要有組織分離法和稀釋分離法兩種。最常用的方法是組織分離法，而稀釋分離法主要用于病組織上產生大量孢子的病原真菌的分離。病原細菌的分離方法以劃線分離法為最常用，在有些情況下也采用稀釋分離法。

為了獲得分離菌的純培養，必須要進行分離菌的純化，純化的方法類似于分離工作中采用的稀釋分離法或劃線分離法。

3、材料、儀器與用具 3.1 材料

(1)稻瘟病（葉、病節、病穗頸）(Pyricularia oryzae)。(2)柑桔炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）。(3)黃瓜灰霉病（Botrytis cineria）。(4)番茄灰霉病（果）(Botrytis cinerea)。

(5)黃瓜菌核病（果）(Sclerotinia sclerotiorum)。(6)黃瓜細菌性角斑病（葉）(Pseudomonas syringae pv．1achryrnans)。

(7)水稻白葉枯病（葉）(Xanthomonas campestris pv．oryzae)。(8)白菜軟腐病（葉）(Erwinia carotovora subspp．carotovora)。

3.2．培養基 PDA培養基；肉膏蛋白脈培養基；加寄主組織煎汁的培養基等。

3.3．儀器與用品 超凈工作臺、培養箱、培養皿、吸管、吸水紙、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、鑷子、接種鏟(針)、接種環(鉺)、70％酒精、0.1％升汞、酒精燈、火柴、記號筆、橡皮筋套、可調式電爐、不銹鋼鍋等。

4、實驗操作

(一)病原真菌的分離

1．組織分離法 其步驟為：

(1)取滅菌培養皿一個，臵于濕紗布上，在皿蓋上用玻璃鉛筆注明分離日期、材料和分離人的姓名。提示：無菌操作應注意下面幾點：工作前將所需的物品都放在超凈工作臺內；操作前用肥皂洗手，操作時還需用70 ％酒精擦拭雙手；無菌操作時，呼吸要輕，不要說話。

（2）用無菌操作法向培養皿中加入25％乳酸1～2滴(可減少細菌污染)，然后將融化而冷至60℃左右的PDA培養基倒人培養皿中，每皿倒10～15 ml，輕輕搖動使之成平面。凝固后即成平板培養基。

提示：加入25％乳酸1～2滴，可減少平板上出現污染細菌菌落。除乳酸外，在培養基中加入適當的抗菌素抑制細菌的生長，也是常用的方法。加青霉素(20μg／m1)可以抑制G+ 細菌生長；加多黏霉素B(5.0μg／ml。)可以抑制G-細菌生長；加鏈霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／m1)可以抑制大部分細菌的生長。除了氯霉素可在滅菌前加入外，其他抗菌素都應在滅菌后并冷卻到45℃左右(以手背觸三角瓶感到燙，但尚可以忍耐為宜)時加入。倒平板過程中只要遵循“穩、輕、快”要領，不必在火焰上方，一般很少污染。(3)取真菌葉斑病的新鮮病葉(或其他分離材料)，選擇典型的單個病斑，用剪刀或解剖刀從病斑邊緣(病健交界處，)切取小塊(每邊長3～4 mm)病組織數塊。

提示：選擇新患病的組織作為分離的材料，可以減少腐生菌混入的機會。腐生菌一般在發病很久而已經枯死或腐敗的部分滋生，因此，一般斑點病害應在臨近健組織的部分分離。

（4）將病組織放入70％酒精中浸3～5s后，按無菌操作法將病組織移入0.1％升汞液中分別表面消毒0．5、1、2、3、5 min(也可使用其他表面消毒劑)，如植物組織柔嫩，則表面消毒時間宜短；反之則可長些。然后放入滅菌水中連續漂洗三次，除去殘留的消毒劑。

提示：先用70％的酒精浸2～3 s是為了消除寄主表面的氣泡，減少表面張力，70％的酒精亦用于表面消毒，處理的時間較短(一般數秒至l min)升汞溶液消毒的時間因材料而異，可自30s至30min不等，一般情況下，需時間3～5 min。

(5)用無菌操作法將病組織移至平板培養基上，每皿內放4～6塊。

提示：在將病組織小塊移放到平板表面之前，應將其在無菌吸水紙上吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現細菌污染。

(6)將培養皿倒臵放入25℃左右恒溫箱內培養。一般3～4 d后觀察待分離菌生長結果。

(7)若病組織小塊上均長出較為一致的菌落，則多半為要分離的病原菌。在無菌條件下，用接種針(鏟)自菌落邊緣挑取小塊移入斜面培養基上，在25 ℃左右恒溫箱內培養，數日后，觀察菌落生長情況，如無雜菌生長即得該分離病菌純菌種，便可臵于冰箱中保存。

提示：除根據菌落的一致性初步確定長出的菌落是否目標菌外，還要在顯微鏡下檢查，進一步確定。如果是對未知病原菌的組織分離，則要將長出的菌落分別轉出，通過進一步的接種實驗明確哪一種為其病原菌。

在組織分離工作中，如果植物材料體積較大且較軟(如患灰霉病的番茄果實)，在分離過程中可直接挖取內部患病組織移入平板培養基上，完成分離工作。

2.稀釋分離法

(1)取滅菌培養皿三個，平放在濕紗布上，編號，并注明日期、分離材料及分離人姓名。

(2)用滅菌吸管吸取滅菌水，在每一皿中分別注入0.5～1.0 ml。(3)用移植環蘸一滴孢子懸浮液，與第一個培養皿中的滅菌水混合，再從第一個培養皿移三環到第二個培養皿中，混合后再移三環到第三個培養皿中。

(4)將熔化并冷卻到45～50℃的培養基，分別倒在三個培養皿中(為防止細菌污染，也可以向每個培養皿中事先加入1～2滴25％乳酸)，搖勻，凝固，要使培養基與稀釋的菌液充分混勻。

提示： 倒平板時的培養基溫度一定要掌握好，過熱易將病原菌燙死而使分離失敗，過冷則倒入培養皿中后難以形成平板，不利于分離。

(5)將培養皿翻轉后臵恒溫箱(25℃)中培養，數日后觀察菌落生長情況。

(6)挑菌 將培養后長出較為整齊一致的單個菌落分別挑取，接種到斜面培養基上，臵25℃左右培養。待菌長出后，檢查菌是否單純，若有其他菌混雜，就要再一次進行分離純化，直到獲得純培養。

(二)病原細菌的分離

病原細菌的分離方法以稀釋分離法和劃線分離法為最常用。在進行分離之前，首先應對病組織材料進行細菌學初步診斷，即經過鏡檢確認有噴菌現象以后，才對該病組織作分離工作。稀釋分離法是最經典的標準分離法，方法同上述真菌分離。

除去上述稀釋分離法以外，較為方便的是劃線分離法：(1)預先把熔化好的肉膏蛋白胨培養基倒入培養皿中，凝成平板后，翻轉放在30℃恒溫箱中2～4 h，使表面無水滴凝結。也可凝成平板后直接使用。(2)將病組織先用0.1％升汞表面消毒0.5～2 min，再用無菌水換洗3次后，放在滅菌培養皿中的滅菌水中，用滅菌玻棒研碎，并讓組織碎塊在水中浸泡20～60 min，讓細菌釋放到滅菌水中。

(3)用滅菌的接種鉺，(接種環)；蘸取浸泡液在干燥的培養基平板表面劃線，盡量不要把平板表面劃破。劃過第一批線后的接種環應放在火焰上燒灼，冷卻后直接在第一批劃線的末端向另一方向劃線。滅菌后再劃第三次線。

提示：劃過第一批線后接種鉺放在火焰上燒過這一步驟非常重要，這樣做可以使第一批線和第二批線上的細菌數量相差很大。

(4)用玻璃鉛筆在培養皿上寫上分離材料、日期和分離者姓名后，翻轉培養皿，放在26～28℃恒溫箱中培養。1～3 d后觀察有無細菌生長，在哪些地方有單菌落生長出來?其中的優勢單菌落應為待分離菌形成的。

(5)仔細挑取病原菌的單菌落，并移植到斜面培養基上。同時，再把單菌落用滅菌水稀釋成懸浮液作第二次劃線分離，經培養后出現的菌落在形態特征都趨于一致，并與典型描述的特征相一致時，即表明已獲得純培養。最好要經過連續三次單菌落的分離，才能確保純化。

(三)真菌、細菌培養性狀

1．真菌培養性狀觀察 取已分離，純化的某種真菌菌種；按前述稀釋分離法中(1)～(5)步驟進行，待某培養皿中形成單個菌落后觀察。記載以下內容：菌落顏色、菌叢密集及繁茂程度、是否有色素分泌出來而滲透到培養基中、菌落生長速度快慢等。同時要記載培養基種類(成分及pH)和培養溫度、光照條件。

2．細菌培養性狀觀察

(1)仿照上述真菌菌落形成步驟，觀察記載以下內容：菌落顏色、菌落邊緣形狀、菌落表面是光亮還是粗糙或有皺折、、菌落隆起情況、是否有色素分泌到培養基中，菌落生長速度快慢，是否有特殊氣味形成等。同時要記載培養基種類(成分及pH)和培養溫度、光照條件。

(2)用接種鉺(環)蘸細菌菌種后，通過無菌操作在牛肉膏蛋白胨等斜面培養基表面從下向上劃一直線，過2～3 d后長出的細菌群體稱為菌苔，可仿照觀察記載細菌菌落的記載內容，記載菌苔顏色、邊緣形狀、表面是光亮還是粗糙有皺折、隆起情況、是否有色素分泌到培養基中，是否有特殊氣味生成，生長速度快慢等。也要記載培養基種類(成分及pH)和培養溫度、光照條件。

(3)用接種鉺(環)蘸取細菌菌種后，通過無菌操作，將其接種在某種液體培養基中，數日后觀察記載培養基中是否變混濁、是否有色素、氣體、沉淀生成，培養液表面是否可生成菌膜等。也要記載培養基種類(成分及pH)和培養溫度、光照條件。

第四篇：土壤中放線菌的采集、分離、培養、發酵及提取實驗報告

土壤中放線菌的采集、分離、培養、發酵及提取

實驗目的：

1、從土壤中分離產抗生素的放線菌

2、放線菌的培養

3、放線菌的發酵產生活性物質

4、放線菌產生的活性物質提取。實驗原理：

放線菌是一類呈菌絲狀生長，主要以孢子繁殖。放線菌與人類的生產和生活關系極為密切，目前廣泛應用的抗生素約80%是各種放線菌所產生的。

許多臨床應用的抗生素均由土壤中分離的放線菌產生。采用選擇培養基可分離土壤中的放線菌。產抗生素的放線菌經液體培養后，其分泌的抗生素存在于離心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌試驗進行檢測，從而篩選到所需的抗生素產生菌，并對其進一步培養，繁殖，發酵，最終提取我們所需的抗生素。實驗器材：

1、土壤

2、培養基：高氏一號培養基、種子培養基、發酵培養基

3、其他：重鉻酸鉀、培養皿、牛津杯、接種環、酒精燈，無菌涂棒、三角錐瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、試管、牛皮紙、線繩等。實驗步驟：

一、土壤放線菌株的采集

采集樣品：選定取樣點（最好是有機質含量高的菜地），按對角交叉（五點法）取樣。先除去表層約2cm的土壤，將鏟子插入土中數次，然后取2～10cm處的土壤。將5點樣品約1kg充分混勻，除去碎石、植物殘根等。

樣品（土壤）處理：室溫風干

二、土壤中放線菌的分離、培養

1、配制淀粉培養基

淀粉瓊脂培養基（高氏培養基）

可溶性淀粉2g；硝酸鉀0.1g；磷酸氫二鉀0.05g；氯化鈉0.05g；硫酸鎂0.05g；硫酸亞鐵0.001g；瓊脂2g；水100ml.先把淀粉放在燒杯里，用5ml水調成糊狀后，倒入95ml水，攪勻后加入其他藥品，使它溶解。加熱到煮沸時加入瓊脂，不停攪拌，待瓊脂完全溶解后，補足失水。調整PH到7.2-7.4，分裝后滅菌，備用。

2、土壤懸液梯度稀釋

① 將5.0g土壤加入到50ml滅菌的生理鹽水中，震蕩10min制備土壤懸液。

② 用無菌吸管吸取1ml土壤懸液，加入到9ml滅菌的生理鹽水中10倍稀釋。

③ 按1：:1稀釋至10-

3、10-

4、10-5，將3塊滅菌平板分別標記10-

3、10-

4、10-5，稀釋過程應在無菌條件下進行。

3、將高氏一號培養基加熱溶化，待冷至55-60℃時，加入3%的重鉻酸鉀數滴（大約100ml加0.3ml），混合均勻。分別吸取0.1ml稀釋液于滅菌平皿中，再加入10-15ml恒溫于55℃的含有重鉻酸鉀的淀粉瓊脂培養基中，輕輕旋轉混合均勻。

4、平皿倒置于培養箱28℃恒溫培養一周左右。

5、將平皿上的放線菌菌落跳去在淀粉瓊脂平皿上四區劃線進行分離純化，28℃恒溫培養一周左右，觀察放線菌菌落特征。

6、將純化好的菌落轉入到斜面，4℃條件下進行保存。

三、抗菌譜的測定

1、挑取一個放線菌的菌落接種到含有250ml淀粉液體培養基的三角瓶，28℃恒溫培養一周左右。

2、將2ml培養8h的大腸桿菌分別加到200ml滅菌的牛肉膏蛋白胨培養基中混合均勻，每培養皿中倒入20ml，凝固后待用。

3、在上面培養皿中均勻放入4個牛津杯，每個牛津杯中加入1ml放線菌發酵培養液。培養皿放入37℃培養箱恒溫培養12h。

4、測量抑菌圈的大小。

四、發酵

1、配制種子培養基

蔗糖22.5g，黃豆粉12.5g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉1g，硫酸鈉0.1g，硫酸亞鐵0.01g，碳酸鈣2g，蒸餾水1000ml，PH值7.2,121℃滅菌20min。

2、配制發酵培養基

蔗糖45g，黃豆粉25g，磷酸氫二鉀0.2g，氯化鈉1g，硫酸鈉0.1g，硫酸亞鐵0.01g，碳酸鈣3g，蒸餾水1000ml，PH7.2。121℃滅菌20min。

3、種子液的制備

將試管斜面菌種轉管活化，28℃培養7天后，以接種取一環孢子轉入裝有50ml種子培養基的250ml三角搖瓶中，于28℃200r/min-1 培養4天。

4、發酵培養

以6%的接種量將種子液轉接入裝有50ml初始發酵培養基的250ml三角搖瓶中，于28℃200r/min-

1培養4天。

5、活性檢測

發酵液經4000r/ min-1 離心15min，取上清，杯碟法測定抗菌活性（同三）。

五、提取

1、發酵液經4000r/ min-1 離心15min，取上清，用乙酸乙酯以1:1的比例進行萃取。

2、活性檢測

將萃取液濃縮，杯碟法測定抗菌活性（同三）。

第五篇：微生物實驗報告

微生物實驗報告

姓名：阿曼古麗

學號：09070401042

班級：生物科學08-班

微生物實驗課程已經接近尾聲，同時訓練我們實際動手能力的實驗課程也已經全部結束，通過自己切身動手設計，操作實驗，感到收獲頗多。

我覺得最重要的就是實驗過程中操作實驗的重要性。實驗操作可以說是實驗成功與否的關鍵部分，可是馬虎不得。對于需要團隊合作的實驗，個人認為要有強勢的人員搭檔，不說是精通實驗操作規程，最少也得知道實驗的基本操作，掌握要做實驗的基本放法，這對于后續的實驗無疑是有決定性作用的。對于個人的實驗能力，關鍵還是要看平時的實驗積累，有些實驗操作繁瑣復雜，需要極大的耐心，這些都應該是逐漸培養起來的。

在這里我以學過的幾個實驗為例，簡單談一下自己的心得體會。

（一）環境因素對微生物生長的影響

溫度對微生物學報的大分子（蛋白質、核酸等）穩定性、酶的活性、細胞膜的流動性和完整性等方面有重要的影響。過高溫度會導致蛋白質（酶）及核酸變性失活，細胞膜破壞等，而過低溫度會使酶活性受抑制，細胞新陳代謝活動減弱

pH值過高或過低會使蛋白質、核酸等生物大分子所帶電荷發生變化，影響其生物活性，甚至導致變性失活，還可以引起細胞膜電荷變化，影響學報對營養物質的吸收，同時還會改變環境中物質的可給性及有害物質的毒性。紫外線誘導形成胸腺嘧啶二聚體和DNA交聯，從而抑制DNA的復制。此外，細菌具有光復合效應。紫外線穿透力弱，加一張蠟光紙即可阻止其穿過。

在自然界中普遍存在微生物間的拮抗現象，許多微生物可以產生抗生素，能選擇性地抑制或殺死其他微生物。

常用化學消毒劑包括有機溶劑（酚、醇、醛等）、重金屬、鹵素元素及其化合物、染料和表面活性劑。有機溶劑使蛋白質（酶）和核酸變性失活，破壞細胞膜；重金屬鹽也可使使蛋白質（酶）和核酸變性失活，或與細胞代謝產物螯合使之變成無效化合物；碘與蛋白質酪氨酸殘基不可逆結合而使蛋白質失活；低濃度染料可抑制細菌生長，革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌對染料更加敏感。

影響微生物生長的外界因素很多，其一是前面討論過的營養物質，其二是許多物理、化學因素。當環境條件的改變，在一定限度內，可引起微生物形態、生理、生長、繁殖等特征的改變；當環境條件的變化超過一定極限時，則導致微生物的死亡。研究環境條件與微生物之間的相互關系，有助于了解微生物在自然界的分布與作用，也可指導人們在食品加工中有效地控制微生物的生命活動，保證食品的安全性，延長食品的貨架期。

（二）革

蘭

氏

染

色

通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現縫隙，因此能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經沙黃等紅色染料復染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

革蘭氏陰性菌，以[大腸桿菌]為代表。大腸桿菌為兼氣性菌種，一般生存於腸道中及厭氧的還境中。革蘭氏陰性菌細胞壁的特徵為有一層out member 與陽性菌種不同。目前對大腸桿菌的研究很多，除了它是一般食物中是否有被污染的指標外，很多分子生物學方面的研究皆需要使用到大腸桿菌當作實驗宿主。

臨床應用：用于革蘭氏細菌分類形態觀察前的染色。主要應用于細菌分類和鑒定，革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法。

適用范圍：適宜石蠟切片、涂片等染色。

（三）活菌計數

菌計數法

此法又稱活菌計數法，其原理是每個活細菌在適宜的培養基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落。將待測樣品經一系列 10 倍稀釋，然后選擇三個稀釋度的菌液，分別取 0.2ml 放入無菌平皿，再倒入適量的已熔化并冷至 45 ℃ 左右的培養基，與菌液混勻，冷卻、待凝固后，放入適宜溫度的培養箱或溫室培養，長出菌落后，計數，按下面公式計算出原菌液的含菌數：

每毫升原菌液活菌數＝同一稀釋度三個以上重復平皿

菌落平均數×稀釋倍數× 5

此法還可以將稀釋的菌液取 0.2m 1 加到已制備好的平板上，然后用無菌涂棒將菌液涂布整個平板表面，放入適宜溫度下培養，計算菌落數，再按上公式計算出每毫升原菌液的所含活菌總數。此法可因操作不熟練造成污染，或因培養基溫度過高損傷細胞等原因造成結果不穩定。盡管如此，由于該方法能測出樣品中微量的菌數，仍是教學、科研和生產上常用的一種測定細菌數的有效方法。土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細菌、酵母、芽抱與抱子等的數量均可用此法測定。但不適于測定樣品中絲狀體微生物，例如放線菌或絲狀真菌或絲狀藍細菌等的營養體等。

隨著微生態學的發展，微生態療法通過調整腸道菌群作為部分疾病的輔助治療已應用于臨床。糞便標本腸道菌群的定量檢測方法——平板活菌計數法能夠較好地判定其療效以及腸道菌群是否存在失調和失調的程度。此種方法計數的線性范圍大，能較好的反映菌落的疏密程度。重復性、平行性好，但操作較繁瑣，且測定值常受各種因素的影響，需要操作者有熟練的技術。

在同學們的相互配合和老師的耐心指導下，這門實驗課也接近了尾聲，在這一學的這門實驗課中我也學到了很多的實驗室知識。為了保證實驗過程高質高量完成，除了實驗準備及實驗過程外，還要求實驗技術人員必須具備相應的素質，實驗操作人員必須具備較扎實的專業基礎、熟練的實驗技能及高度的責任心，在工作中要善于總結，同時一定要和老師積極溝通，不懂得地方及時向他請教，在以后的學習和工作中，我會繼續保持這種態度，認真完成老師交給的各項任務。