第一篇：園藝植物生物技術(shù)

園藝專業(yè)推廣碩士《園藝植物生物技術(shù)》試題

一．名詞解釋

1．基因組：某一生物包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNA分子。2．RT-PCR：一是反轉(zhuǎn)錄PCR的縮寫，即通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，將RNA鏈逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。二是實(shí)時(shí)PCR的縮寫，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。3．Northern blot：是一種通過檢測RNA的表達(dá)水平來檢測基因表達(dá)的方法，通過Northern blot可以檢測到細(xì)胞在生長發(fā)育特定階段或者脅迫或病理環(huán)境下特定基因表達(dá)情況。

4．AFLP：擴(kuò)增片段長度多態(tài)性。是基于PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點(diǎn)序列，作為引物結(jié)合位點(diǎn)。

5．藍(lán)白斑篩選：藍(lán)白斑篩選是一種基因工程常用的重組菌篩選方法。野生型大腸桿菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal切割成半乳糖和深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍(lán)。有色物質(zhì)可以使整個(gè)培養(yǎng)菌落產(chǎn)生顏色變化，可用于菌落鑒定和篩選。

二．選擇題

1.B 2.ABD 3.B 4.BD 5.A 6.BC 7.D 8.ABCD 9.ABC 10.BCD

三．簡答題

1.簡述植物農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化過程。

答：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化是以農(nóng)桿菌為媒介，將目的基因通過載體上的特定區(qū)域?qū)爰?xì)胞，并整合到染色體中。主要過程為：①分離目的基因片段；②將目的片段鏈接到克隆載體上，形成重組DNA分子；③將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞進(jìn)行增殖；④從細(xì)胞中篩選重組子；⑤提取已經(jīng)擴(kuò)增的基因，進(jìn)一步分析研究；⑥將目的基因克隆到表達(dá)載體，一般采用雙元載體；⑦利用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌；⑧利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植株，常用的方法有原生質(zhì)體法、真空滲入法和蘸花法3種。

2.列舉基因工程中常用的工具酶。答：基因工程中常用的工具酶有：

①限制性核酸內(nèi)切酶：是細(xì)菌產(chǎn)生的一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特定的堿基順序的核酸水解酶。

②DNA連接酶：將兩段DNA分子拼接起來的酶。③DNA聚合酶：催化單核苷酸鏈延伸。

④逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴于RNA的DNA聚合酶，這是一種有效的轉(zhuǎn)錄RNA成為DNA的酶，產(chǎn)物DNA又稱互補(bǔ)DNA。

⑤末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶：將脫氧核糖核酸加到DNA的3末端。⑥堿性磷酸酶：催化去除DNA、RNA等的5磷酸基團(tuán)。⑦依賴DNA的RNA聚合酶：識(shí)別特異性啟動(dòng)子，RNA轉(zhuǎn)錄。3.簡述SSR標(biāo)記原理和主要過程。

答：SSR即微衛(wèi)星DNA又叫簡單重復(fù)序列，指的是基因組中由1～6個(gè)核苷酸組成的基本單位重復(fù)多次構(gòu)成的一段DNA。微衛(wèi)星的突變率在不同物種、同一物種的不同位點(diǎn)和同一位點(diǎn)的不同等位基因間存在很大差異，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因而可以根據(jù)這兩端的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特意引物，通過PCR技術(shù)將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴(kuò)增出來，利用電泳分析技術(shù)就可獲得其長度多態(tài)性。

主要過程：①反應(yīng)體系，包括模板DNA、SSR引物、10×PCR緩沖液、dNTP、Tap 酶和ddH2O；②反應(yīng)過程包括預(yù)變性、變性、退火、延伸，在PCR儀上進(jìn)行；③將PCR產(chǎn)物在測序電泳儀上用5%聚丙烯酰胺凝膠分離，DNA染色采用銀染法。④數(shù)據(jù)分析，可用Quantity One軟件統(tǒng)計(jì)，再用NTSYS軟件計(jì)算出遺傳相似性系數(shù)，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析構(gòu)建聚類圖。4.簡述改良CTAB法提取園藝植物DNA的原理及主要過程。

答：CTAB是一種陽離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，但不能沉淀核酸，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。主要過程：

① 稱取植物組織約100-200mg，加適量液氮，研磨至組織破碎成粉末狀，迅速轉(zhuǎn)入2mL離心管。

② 在離心管中加入1mL 65℃預(yù)熱的1.5×CTAB提取液(100mmol/L的Tris-HCl，pH8.0，20mmol/L的EDTA，pH8.0，1.4mol/L的NaCl，4%的β-巰基乙醇)，放至65℃水浴30min，其間輕搖3次以混勻反應(yīng)液。

③ 水浴后取出離心管冷卻至室溫，加入等體積的氯仿：異戊醇(24﹕1)混合液，輕輕上下顛倒混勻，室溫下靜置15min后，于10000 r/min離心3min，取上清液。

④ 將上清液移至新的離心管，加入0.7倍體積的冷凍異丙醇，顛倒混勻后放置15min，10000 r/min離心5min，棄上清液。

⑤ 用75%的乙醇清洗 3次，沉淀為白色透明狀，用濾紙條吸干殘留乙醇，在超凈工作臺(tái)上無菌風(fēng)干后，將DNA溶于 50μL 超純水中。5.簡述PCR反應(yīng)中引物設(shè)計(jì)原理。答：PCR反應(yīng)中引物設(shè)計(jì)原理為：

①選擇合適的靶序列：設(shè)計(jì)引物之前，必須分析待測靶序列的性質(zhì)，選擇高度保守、堿基分布均勻的區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

②長度：一般來說，寡核苷酸引物長度為15-25bp。

③Tm值：引物的Tm值一般控制在55-65℃，盡可能保證上下游引物的Tm值一致。若G+C含量相對(duì)偏低，則可以使引物長度稍長，而保證一定的退貨溫度。④G+C含量：有效引物中的G+C含量一般為40%-60%。

⑤堿基的隨機(jī)分布：引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3’端不應(yīng)超過3個(gè)連續(xù)的G或C。

⑥引物末端：只有引物的3’端與模板結(jié)合，PCR才能進(jìn)行，所以3’端最好是G或C。

⑦引物自身：引物自身不存在連續(xù)4個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列，否則會(huì)影響到引物與模板之間的結(jié)合，尤其避免3’端的互補(bǔ)。

⑧引物之間：上下游引物之間盡量少的存在互補(bǔ)序列，否則上下游引物退火結(jié)合，將影響到PCR的擴(kuò)增效率。6.簡述同源序列法克隆目的基因的主要過程。

答：利用同源序列法快速克隆基因的基本思路是依據(jù)基因序列的高度保守區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性的簡并引物，通過PCR擴(kuò)增基因組DNA或cDNA，獲得所要分離的基因序列，多用于抗病基因的分離、克隆。主要過程為：①提取基因組DNA；②根據(jù)已知基因保守區(qū)域的核酸序列特征，運(yùn)用軟件設(shè)計(jì)引物并合成；③以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；④回收PCR擴(kuò)增的目的片段；⑤將目的片段鏈接載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌；⑥測序并進(jìn)行序列分析。四． 綜合題

根據(jù)你所學(xué)，談?wù)勀銓?duì)轉(zhuǎn)基因植物的看法。

答：自1983年美國在世界上首次獲得轉(zhuǎn)基因煙草以來，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了迅速發(fā)展，在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成熟，轉(zhuǎn)基因作物已進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化階段，而且種植面積逐年擴(kuò)大，呈直線上升趨勢。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，進(jìn)行植物品種的改良、新品種的培育以及作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)生物藥物和疫苗等。世界上已通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出許多產(chǎn)量高、品質(zhì)好、抗性強(qiáng)的農(nóng)作物新品種，生物技術(shù)藥品已應(yīng)用到醫(yī)藥、保健食品和日化產(chǎn)品等各個(gè)方面，生物制藥產(chǎn)業(yè)已成為最活躍、進(jìn)展最快的產(chǎn)業(yè)之一。因此，人們將以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為核心的生物技術(shù)上的巨大飛躍譽(yù)為第二次“綠色革命”。

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用十分廣泛：（1）植物品質(zhì)改良、新品種的培育，以滿足人類不斷增長的物質(zhì)生活需要：植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)可高效、快速提高糧食作物、蔬菜、林木樹種和花卉草種的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗耐性，為培育高產(chǎn)、高抗、多抗、優(yōu)質(zhì)的新品種提供了科學(xué)的手段。（2）醫(yī)藥研究，為人類健康服務(wù)：轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以把植物作為“生物反應(yīng)器”，進(jìn)行藥物蛋白、工業(yè)用酶、糖類、脂類等一些有益次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，具有成本低、周期短、效益高和安全性好的特點(diǎn)。（3）能源開發(fā)，促進(jìn)世界經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展：隨著世界經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，加速了對(duì)石油等有限的不可再生礦質(zhì)能源的消耗，世界各國均面臨著能源枯竭的嚴(yán)重問題。（4）減少環(huán)境污染，保護(hù)人類賴以生存的自然環(huán)境：轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以生產(chǎn)許多抗性強(qiáng)、適應(yīng)性廣的植物，最大限度地利用土地資源，增加全球植被的覆蓋率，減少水土流失和土地沙漠化，減少因CO2增加引起的溫室效應(yīng)?？共?、抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的廣泛種植，可以減少農(nóng)藥的使用量。轉(zhuǎn)基因植物可對(duì)土壤中的有毒污染物進(jìn)行高效吸收或生物降解，通過植物修復(fù)系統(tǒng)使受污染的環(huán)境得到修復(fù)。

總之，轉(zhuǎn)基因植物的廣泛種植可以顯著降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率；可以有效緩解人類的糧食問題、能源問題；可以大大提高人類的生活質(zhì)量和健康水平；可以有效增加可利用的土地資源，擴(kuò)大綠地植被面積，減少土地的沙漠化和鹽堿化，減少環(huán)境污染，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其轉(zhuǎn)基因植物已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品工業(yè)、畜牧業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域，其經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會(huì)效益都是巨大的。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是一種技術(shù)創(chuàng)新，是現(xiàn)代科技革命的一個(gè)重要方面，在農(nóng)業(yè)、生物、醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)保和能源領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。

第二篇：《園藝植物生物技術(shù)》實(shí)驗(yàn)教案

實(shí)驗(yàn)一 現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室與實(shí)驗(yàn)儀器

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)儀器是開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)平臺(tái)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室布局和儀器配置的掌握程度是學(xué)生知識(shí)結(jié)構(gòu)完整性的重要體現(xiàn)。通過現(xiàn)場參觀和老師講解加深同學(xué)們對(duì)現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)劃與布局及常用儀器設(shè)備的主要功能的認(rèn)識(shí)，掌握高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等關(guān)鍵儀器的使用方法。

二、實(shí)驗(yàn)場所選擇及實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

園藝學(xué)院植物分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室與開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究直接相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室分工與布局和主要相關(guān)儀器：如與組織培養(yǎng)有關(guān)的超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、接種至、培養(yǎng)室等；與分子生物學(xué)有關(guān)的高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。

三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1、相關(guān)背景知識(shí)回顧：對(duì)課堂講述的各種生物技術(shù)如分子標(biāo)記、細(xì)胞和組織培養(yǎng)等操作過程進(jìn)行回顧，重要指出每個(gè)環(huán)節(jié)要用到的必備儀器的作用、性能指標(biāo)、操作注意事項(xiàng)及儀器選購中應(yīng)注意的問題等。

2、每班分為兩小組簡要介紹現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室的布局及功能分區(qū)情況；針對(duì)每個(gè)分區(qū)的重要儀器進(jìn)行講述，結(jié)束時(shí)對(duì)所有參觀內(nèi)容進(jìn)行簡要總結(jié)，并回答同學(xué)們的提問。

四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)有很多易損儀器或有毒試劑，參觀時(shí)要求同學(xué)們認(rèn)真記錄，不要隨意動(dòng)手，以保證儀器和人身安全。

五、思考題

1、根據(jù)參觀內(nèi)容，描述本次參觀有了解到的主要儀器的名稱、用途及使用中的注意事項(xiàng)。

2、一個(gè)現(xiàn)代化生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備的基本功能的必備儀器有哪些？實(shí)驗(yàn)二 質(zhì)粒DNA的提取、純化及檢測

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取時(shí)最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個(gè)主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNA的分離和純化。本實(shí)驗(yàn)以堿裂解法為例介紹質(zhì)粒的抽提過程，應(yīng)掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。

二、實(shí)驗(yàn)原理 在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。

三、主要儀器及試材

含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液及離心機(jī)、移液槍、離心管及質(zhì)粒DNA提取有關(guān)試劑。

液氮、及DNA提取有關(guān)試劑。

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

（一）試劑配制:

1、LB培養(yǎng)基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，瓊脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分裝至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高壓滅菌15min，室溫貯存。

2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。

3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，過濾滅菌后-20℃保存。

4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去離子滅菌雙蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。

5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前臨時(shí)配制。

7、溶液III:醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（視冰醋酸情況，也可按6:3:1配制），貯存于4℃。

8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

9、苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）。

10、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

12、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝貯存于-20℃。14、6×loading buffer（上樣緩沖液）:0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%瓊脂糖凝膠:稱取1g瓊脂糖與三角燒瓶中，加100ml 1×TBE，微波爐加熱至完全熔化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5ug/ml（注意：EB為強(qiáng)誘變劑，操作時(shí)帶手套），輕輕搖勻，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液1×TBE），即可上樣。

（二）實(shí)驗(yàn)步驟

1、取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養(yǎng)基上劃線37℃過夜培養(yǎng)。

2、用無菌牙簽或槍頭挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于20ml含有Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床-250r/min過夜培養(yǎng)。

3、吸取1.5ml菌液，12000g離心1min，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈。

4、加入200ul預(yù)冷的溶液I，重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)徹底混勻沉淀或碎塊）。

5、加入400ul新配置的溶液II，輕柔顛倒混勻（不可劇烈震蕩），并將離心管置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解（溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

6、加入300ul預(yù)冷的溶液III，溫和顛倒混勻，見白色絮狀沉淀，置于冰上3-5min，使雜質(zhì)充分沉淀（溶液III為中和液，此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時(shí)K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀）。

7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇或2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混勻，室溫放置5min，4℃離心12000g ×15min。

8、倒盡上清，加75%乙醇浸洗沉淀除鹽1-2次，4℃離心 10000g×10min，棄上清，將沉淀在室溫或超凈工作臺(tái)上風(fēng)干。

9、將沉淀溶于40ul 滅菌超純水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10、取制備的質(zhì)粒DNA 1-2ul，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣，1%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳1h進(jìn)行檢測。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、實(shí)驗(yàn)中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物質(zhì)，操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù)，盡量減少臺(tái)面污染。

2、DAN電泳時(shí)只能由負(fù)極到正極，電泳時(shí)要注意電極是否正確。

3、質(zhì)粒電泳檢測一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型。

六、思考題

簡述質(zhì)粒DAN提取的步驟。

實(shí)驗(yàn)三 PCR技術(shù)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，是分子克隆技術(shù)中常用技術(shù)之一。PCR具有反應(yīng)快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。通過本實(shí)驗(yàn)應(yīng)掌握PCR原理，學(xué)習(xí)PCR操作過程。

二、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在環(huán)境下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)分為變性、退火、延伸三步，經(jīng)過一定的循環(huán)，介于兩個(gè)引物之間的特異DNA片段得到大量擴(kuò)增。

三、主要儀器及試材

含有外源cDNA片段的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)基因蘋果、番茄葉片總DNA；外源基因的特異引物及PCR儀與相關(guān)試劑。

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1、調(diào)整模板濃度至5ng/ul。

2、按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻，離心5秒（注意加1滴礦物油覆蓋PCR管）。

Template DNA

2ul（20ng）10×buffer

2.0ul MgCl2（25mM）

1.5ul Primer F（10uM）

0.2ul Primer R（10uM）

0.2ul dNTPs（2mM）

2.0ul Taq（5U/ul）

0.2ul Add ddH2O to

20ul

3、PCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置：

95℃

3min

1cycle 94℃

1min

55℃

1min 72℃

90s

35cycles 72℃

10min

1cycle 4℃

forever

4、檢測：加2ul溴酚藍(lán)，混勻，短暫離心，取15ul反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)樣電泳

5、在1%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣電泳；EB染色，紫外觀察。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、引物設(shè)計(jì)應(yīng)具有特異性，依靠引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；引物分裝成多管，不宜反復(fù)凍融多次；

2、PCR反應(yīng)的各種成分不能遺漏，操作應(yīng)戴手套，冰上操作；

3、根據(jù)引物的Tm值和擴(kuò)增片段長度以及PCR儀的特性來設(shè)定PCR循環(huán)條件；

4、注意分析電泳檢測PCR產(chǎn)物時(shí)出現(xiàn)拖帶或非特異性擴(kuò)增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。

六、思考題

簡述PCR技術(shù)的原理和步驟。

第三篇：園藝植物生物技術(shù) 試卷（模版）

一、將下面詞組相對(duì)應(yīng)的中文譯成拉丁文或拉丁文譯成中文。

1.Propagation

2.liquid medium

3.antibody

4.vitrification

5.SSH

6.克隆

7.接種

8.非對(duì)稱融合 9.RT-PCR

10.轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默

二、判斷下列各題正確與否，正確的填“Y”錯(cuò)誤的填“N”。

1.培養(yǎng)基滅菌后其Ph值會(huì)略微降低。

2.胚狀體是植物組織培養(yǎng)中的專門術(shù)語，是指由體細(xì)胞形成的、類似于生殖細(xì)胞形成的配子胚發(fā)育過程的胚胎發(fā)生途徑。

3.組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基多采用濕熱滅菌。

4.DNA電泳操作時(shí)要戴手套，是因?yàn)槠渲械腅B是一種強(qiáng)致癌物和誘變劑。

5.DNA復(fù)制時(shí)，新合成鏈的延伸方向是從5’到3’方向。

6.可用作病毒鑒定的草本指示植物種類很多，常用的有藜科、茄科、豆科、十字花科、葫蘆科等植物。

7.花藥培養(yǎng)屬于小孢子培養(yǎng)，而花粉培養(yǎng)則屬于器官培養(yǎng)的范疇。

8.胚搶救主要是對(duì)由于營養(yǎng)和或生理原因，造成難以播種成苗或要發(fā)育中期階段就敗育或退化的胚進(jìn)行中期離體培養(yǎng)。

9.理論上，從同一植物的根、莖、葉等不同器官中分離的DNA樣品它們之間不存在多態(tài)性；但分離Mrna再合成Cdna后可能存在豐富的多態(tài)性。

10.引起病毒類病害的病原包括病毒、類病毒、植原體、螺原體和韌皮部及木質(zhì)部限制性細(xì)菌等。

11.常用的報(bào)告基因吸c(diǎn)at、GUS、Ant、Luc、AFLP等。

12.植物生物技術(shù)的外植體材料以離體操作為主。

13.載體的條件是：能在宿主細(xì)胞中能自我自制并能穩(wěn)定保存，要有多個(gè)酶切位點(diǎn)，每種酶切位點(diǎn)最好只有一個(gè)，酶切后不損壞其自制能力及選擇標(biāo)記基因并能嵌于外源DNA具有可作為選擇。

14.在DNA電泳中，分子量大的片段比分子量小的片段距負(fù)極更近。

15.DNA雙鏈中AT間形成的氫鍵比CG間少。

三、填空題：將下列各題空缺部分的答案填在后面的方框內(nèi)，兩者用“，”隔開。

1.常見的啟動(dòng)子有＿、＿、＿等。

2.進(jìn)行胚搶時(shí)，就最終對(duì)胚搶救成活及成苗率影響大小而言，所利用的組織優(yōu)劣順序是：＿、＿、＿、＿。

3.日前世界上有200多種植物成功地再生出單倍體植株，其中我國首先報(bào)道的有40多種。獲得單倍體的方法有三種＿、＿、＿。

4.可用于病毒及類病毒檢測的方法很多，主要有＿、＿、＿。

5.要判斷哪一個(gè)克隆中具有我們所需要的基因就需要對(duì)所得到的重組克隆進(jìn)行篩選，篩選的方法主要有：＿、＿、＿等。

6.分子標(biāo)記研究中應(yīng)用最廣泛的DNA鑒定技術(shù)有＿、＿、＿等四種。

7.常用于植物組織培養(yǎng)的植物激素種類有＿、＿、＿等

8.目前尚無防治病毒病的有效藥劑，在園藝植物病毒病的防治中常用的策略主要有＿、＿、＿、＿。

9.轉(zhuǎn)基因在沉默的原因是多方面的，根據(jù)外源基因失活或沉默的分子機(jī)制，可將其分為三類：＿、＿、＿等。

10.園藝植物組織培養(yǎng)一般要經(jīng)歷五個(gè)階級(jí)，即＿、＿、＿、＿、＿等。

11.在遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體中通常構(gòu)建有一些篩選基因或報(bào)告基因，如果實(shí)驗(yàn)很成功，且檢測方法正確，則下列基因的作用效果應(yīng)呈現(xiàn)的顏色分別是：LacZ基因重組子_____色菌斑；GUS呈______色；GFP呈_______色。

12.狹義的植物生物技術(shù)是指：在離體的條件下，對(duì)植物（細(xì)胞）進(jìn)行遺傳改良或使其增殖的各種技術(shù)的總稱，包括＿＿和＿＿兩個(gè)大的層面。

13.迄今為止，已在獼猴桃、馬鈴薯、苜蓿、萵苣、甘藍(lán)、蕃茄、柑橘等植物的原生質(zhì)體再生植株中觀察到變異，再生植株產(chǎn)生的變異主要有＿、＿、＿、＿。

14.生命活動(dòng)的各個(gè)進(jìn)程都伴隨著不同基因的選擇開啟和關(guān)閉，基于這一基本的分子生物原理，現(xiàn)在已開發(fā)出許多克隆基因的方法，主要有＿、＿、＿、＿等。

15.常用的遺傳標(biāo)記有______標(biāo)記;______標(biāo)記;_______標(biāo)記和_______標(biāo)記等四種不同水平的標(biāo)記。

四、選擇題：從備選答案中選出正確的結(jié)果，正確答案是唯一的。

1.如果DNA一條鏈?zhǔn)?’-ATCG TACG GGTT-3’，則能與其互補(bǔ)配對(duì)的另一條鏈可能是：（）

A：5’-ATCG TACG GGTT-3’ B：5’-AACC CGTA CGAT-3’ C：3’-TAGC ATGC CCAA-5’ D：3’-UAGC AUGC CCAA-5’

2.植物病毒檢測可以用的方法有:（）

A：血清學(xué)檢測 B：PCR檢測 C：同工酶檢測 D：指示植物鑒定

3.可用于外植體消毒的方法有：()

A：酒精消毒 B：HgCl2消毒 C：NaClO消毒 D：NaCl消毒

4.原生質(zhì)體融合的方式有：（）

A：對(duì)稱融合 B：非對(duì)稱融合 C：配子—體細(xì)胞融合 D：供受體融合5.常用的選擇標(biāo)記基因有：（）

A：抗生素基因 B：NPTⅡ基因 C：花青素基因 D：熒光素酶基因

6.基本的PCR所需的試劑主要有：（）

A：兩側(cè)的引物 B：DNA模板 C：TaqDNA聚合酶 D：Mg+ 7.赤霉素的生理作用主要包括：（）

Ａ：誘導(dǎo)莖細(xì)胞的伸長 Ｂ：對(duì)形成層的細(xì)胞分化有影響 Ｃ：可以解除種子、塊莖、鱗莖等休眠 Ｄ：抑制衰老

8.基于現(xiàn)代生命科學(xué)的研究進(jìn)展，下列可能是遺傳物質(zhì)的有：()A：DNA B：RNA C：Protein D：多糖

9.園藝植物外植體脫除病毒的方法有：()A：熱處理脫除病毒 B：莖尖培養(yǎng)脫除病毒 C：微芽嫁接脫除病毒 D：高壓滅菌脫除病毒

10.影響原生質(zhì)體分離的因素主要有：（）

Ａ：植物的類型 Ｂ：基因型 Ｃ：外植體類型 Ｄ：生理狀態(tài)

11.The most important contribution of Watson and Crick is:()

A：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型 B：RNA結(jié)構(gòu)模型 C：DNA是遺傳物質(zhì) D：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)

12.體細(xì)胞雜種的鑒定方法主要有：（）

A：形態(tài)學(xué) B：細(xì)胞學(xué) C：電子顯微鏡觀察法 D：遺傳標(biāo)記

13.可以用于基因分離的方法有：（）

A：同源序列法 B：圖位克隆法 C：功能克隆法 D：差減雜交法

14.下列屬于現(xiàn)代生物技術(shù)研究的內(nèi)容有:()

A：有性雜交 B：體細(xì)胞雜交 C：組織培養(yǎng) D：基因克隆

15.目前分子標(biāo)記在種質(zhì)資源研究中的用途有：（）

A：繪制品種的指紋圖譜

B：種質(zhì)資源的遺傳多樣性及分類研究 C：物種的起源與演化 D：種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)、鑒定與創(chuàng)新

16.單克隆抗體制備主要步驟有：（）

A：免疫注射 B：細(xì)胞融合 C：篩選 D：克隆化

17.如果RAPD分析時(shí)所選用的隨機(jī)引物的序列為5’-ATCGTACGGGTT-3’，下列虛線部分為500—1000 pb長的DNA區(qū)域，請(qǐng)分析其中能進(jìn)行2的指數(shù)倍擴(kuò)增的有：()

A: 5’ATCGTACGGGTT— — —3’ B: 5’ — — —ATCGTACGGGTT 3’ C: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TACCATGCCCAA 3’ D: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TTGGGCATGCAT 3’

18.右下圖中剪刀所在位置是DNA分子上的某一酶的酶切位點(diǎn)，長方形是探針結(jié)合部位，試問1、2、3三種DNA樣品用該酶/探針組合進(jìn)行RFLP分析能得到的雜交信號(hào)條帶數(shù)分別是：

A： 1、2、1 B：1、2、2 C：1、1、1 D：1、1、2 19.影響原生質(zhì)體培養(yǎng)及植珠再生的因素主要有：（）

Ａ：原生質(zhì)體來源 Ｂ：基因型 Ｃ：培養(yǎng)基 Ｄ：滲透壓調(diào)節(jié)劑

20.原生質(zhì)體的應(yīng)用主要有哪些：（）

Ａ：種質(zhì)資源保存 Ｂ：原生質(zhì)體融合 Ｃ：篩選突變體 Ｄ：遺傳轉(zhuǎn)化

五、簡答題：將下列各題的答案填在下面的方框內(nèi)。

1.簡述PCR反應(yīng)原理。

2.如果你是某單位的技術(shù)人員，現(xiàn)欲建一園藝植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，請(qǐng)簡述實(shí)驗(yàn)室的布局及主要的儀器設(shè)備

3.闡述一下培養(yǎng)基的滅菌方法，滅菌時(shí)間。

4.體細(xì)胞雜種篩選與鑒定方法。

5.簡述常見啟動(dòng)子有哪些？

6.簡述轉(zhuǎn)基因植物的鑒定方法。

六、綜述題：將下列各題的答案寫在下面的方框內(nèi)。

1.1、通過對(duì)生物技術(shù)的學(xué)習(xí)，談?wù)勆锛夹g(shù)在園藝科學(xué)中的應(yīng)用與展望。

2.3、如果現(xiàn)已證明園藝植物的某一重要農(nóng)藝性狀是單基因控制的質(zhì)量性狀，且發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與控制該性狀的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記?，F(xiàn)有一傳統(tǒng)品種，此品種的其它性狀均十分優(yōu)良，唯獨(dú)該性狀表現(xiàn)不佳，試論述如何應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)的方法對(duì)該性狀進(jìn)行改良？

3.2、談?wù)勼w細(xì)胞雜種在育種中的應(yīng)用。

一、將下面詞組相對(duì)應(yīng)的中文譯成拉丁文或拉丁文譯成中文。

1.RT-PCR

2.轉(zhuǎn)基因植物

3.共培養(yǎng)

4.subtractive hybridization

5.基因組文庫

6.生物技術(shù)

7.抗原

8.SSH

9.培養(yǎng)基

10.RAPD

二、判斷下列各題正確與否，正確的填“Y”錯(cuò)誤的填“N”。

1.限制性片斷長度多態(tài)性技術(shù)（RFLP）是用已知的限制性內(nèi)切酶消化目標(biāo)RNA，電泳印跡，再用RNA探針雜交并放射自顯影，從而得到與探針同源的RNA序列酶切后在長度上的差異。

2.植物生物技術(shù)的外植體材料以離體操作為主。

3.理論上，從同一植物的根、莖、葉等不同器官中分離的DNA樣品它們之間不存在多態(tài)性；但分離Mrna再合成Cdna后可能存在豐富的多態(tài)性。

4.植物原生質(zhì)體分離時(shí)，常采用酶解的方法脫除細(xì)胞壁。

5.PCR擴(kuò)增的引物為單鏈DNA片段。

6.常用的報(bào)告基因吸c(diǎn)at、GUS、Ant、Luc、AFLP等。

7.愈傷組織原上指植物在受傷之后于傷口表面形成的一團(tuán)薄壁細(xì)胞，在組織培養(yǎng)中，則指在人工培養(yǎng)基上由外植體長出來的一團(tuán)有序生長的薄壁細(xì)胞。

8.DNA復(fù)制時(shí)，新合成鏈的延伸方向是從5’到3’方向。

9.Western雜交是以DNA或RNA為探針，檢測DNA鏈，用是于外源基因整合的鑒定及分析。

10.原生質(zhì)體指采用機(jī)械或酶解法去掉了細(xì)胞壁的裸露的且具有活力的細(xì)胞。

11.載體的條件是：能在宿主細(xì)胞中能自我自制并能穩(wěn)定保存，要有多個(gè)酶切位點(diǎn)，每種酶切位點(diǎn)最好只有一個(gè)，酶切后不損壞其自制能力及選擇標(biāo)記基因并能嵌于外源DNA具有可作為選擇。

12.植物轉(zhuǎn)基因的方法主要有：大腸桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、電擊法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、基因槍法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化及花粉管通道法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化等。

13.易高溫分解培養(yǎng)基，往往不能進(jìn)行高壓滅菌，通常采用過濾滅菌，即先將除去了這些不耐熱物質(zhì)的培養(yǎng)基的其他成份經(jīng)高壓滅菌后放置于無菌場所，若制備半固態(tài)培養(yǎng)基，須待培養(yǎng)基冷卻至60℃左右，再加入經(jīng)過濾滅菌的各種不耐熱成分溶液，再混勻放置，分裝備用。

14.培養(yǎng)基滅菌后其Ph值會(huì)略微降低。

15.胚搶救主要是對(duì)由于營養(yǎng)和或生理原因，造成難以播種成苗或要發(fā)育中期階段就敗育或退化的胚進(jìn)行中期離體培養(yǎng)。

三、填空題：將下列各題空缺部分的答案填在后面的方框內(nèi)，兩者用“，”隔開。

1.園藝植物組織培養(yǎng)一般要經(jīng)歷五個(gè)階級(jí)，即＿、＿、＿、＿、＿等。

2.原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法較多，大多數(shù)與細(xì)胞培養(yǎng)相似。主要的培養(yǎng)方法有三種，即＿、＿、＿。

3.分子標(biāo)記研究中應(yīng)用最廣泛的DNA鑒定技術(shù)有＿、＿、＿等四種。

4.可用于病毒及類病毒檢測的方法很多，主要有＿、＿、＿。

5.原生質(zhì)體培養(yǎng)的前提之一是獲得大量有活力的原生質(zhì)體，影響原生質(zhì)體的主要因素有＿、＿、＿、＿。

6.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、基因槍介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、花粉管通道法、無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

7.目前尚無防治病毒病的有效藥劑，在園藝植物病毒病的防治中常用的策略主要有＿、＿、＿、＿。

8.常用于植物組織培養(yǎng)的植物激素種類有＿、＿、＿等

9.植物轉(zhuǎn)基因研究的報(bào)告基因，在導(dǎo)入植物的24~48h內(nèi)就可以檢測結(jié)果，從而可以對(duì)轉(zhuǎn)基因程序的有關(guān)因素進(jìn)行快速評(píng)價(jià)和優(yōu)化，檢測該基因的方法有＿、＿、＿。

10.德國植物生理學(xué)家HABERLANDT對(duì)植物組織培養(yǎng)的杰出貢獻(xiàn)在于提出了___理論；組織培養(yǎng)中外植體再生的兩種主要途徑是_______和_______。

11.＿是從Thermus aquaticus 菌提取的熱穩(wěn)定性酶，分子量大約94kDa.12.在遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體中通常構(gòu)建有一些篩選基因或報(bào)告基因，如果實(shí)驗(yàn)很成功，且檢測方法正確，則下列基因的作用效果應(yīng)呈現(xiàn)的顏色分別是：LacZ基因重組子_____色菌斑；GUS呈______色；GFP呈_______色。

13.基因克隆是一系列技術(shù)的總稱，又稱為＿、＿、＿、＿等。

14.日前世界上有200多種植物成功地再生出單倍體植株，其中我國首先報(bào)道的有40多種。獲得單倍體的方法有三種＿、＿、＿。

15.園藝植物常用的脫病毒的途徑有＿、＿、＿、＿等方法。

四、選擇題：從備選答案中選出正確的結(jié)果，正確答案是唯一的。

1.可用于外植體消毒的方法有：()A：酒精消毒 B：HgCl2消毒 C：NaClO消毒 D：NaCl消毒

2.The most important contribution of Watson and Crick is:()

A：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型 B：RNA結(jié)構(gòu)模型 C：DNA是遺傳物質(zhì) D：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)

3.如果RAPD分析時(shí)所選用的隨機(jī)引物的序列為5’-ATCGTACGGGTT-3’，下列虛線部分為500—1000 pb長的DNA區(qū)域，請(qǐng)分析其中能進(jìn)行2的指數(shù)倍擴(kuò)增的有：()

A: 5’ATCGTACGGGTT— — —3’ B: 5’ — — —ATCGTACGGGTT 3’ C: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TACCATGCCCAA 3’ D: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TTGGGCATGCAT 3’ 4.基于現(xiàn)代生命科學(xué)的研究進(jìn)展，下列可能是遺傳物質(zhì)的有：()A：DNA B：RNA C：Protein D：多糖

5.影響原生質(zhì)體培養(yǎng)及植珠再生的因素主要有：（）

Ａ：原生質(zhì)體來源 Ｂ：基因型 Ｃ：培養(yǎng)基 Ｄ：滲透壓調(diào)節(jié)劑

6.植物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中常用的報(bào)告基因主要有：（）

A：cat B:GUS C;Ant D:GFP

7.單克隆抗體制備主要步驟有：（）

A：免疫注射 B：細(xì)胞融合 C：篩選 D：克隆化

8.組織培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)及其基本設(shè)備有：（）

Ａ：準(zhǔn)備室 Ｂ：制備室 Ｃ：無菌操作室 Ｄ：培養(yǎng)室

9.下列屬于現(xiàn)代生物技術(shù)研究的內(nèi)容有:()

A：有性雜交 B：體細(xì)胞雜交 C：組織培養(yǎng) D：基因克隆

10.原生質(zhì)體的應(yīng)用主要有哪些：（）

Ａ：種質(zhì)資源保存 Ｂ：原生質(zhì)體融合 Ｃ：篩選突變體 Ｄ：遺傳轉(zhuǎn)化

11.原生質(zhì)體融合的方式有：（）

A：對(duì)稱融合 B：非對(duì)稱融合 C：配子—體細(xì)胞融合 D：供受體融合12.基本的PCR所需的試劑主要有：（）

A：兩側(cè)的引物 B：DNA模板 C：TaqDNA聚合酶 D：Mg+ 13.植物病毒檢測可以用的方法有:（）

A：血清學(xué)檢測 B：PCR檢測 C：同工酶檢測 D：指示植物鑒定

14.園藝植物常見的病毒病有：（）

A：黃龍病 B：裂皮病 C：線蟲病 D：速衰病

15.如果DNA一條鏈?zhǔn)?’-ATCG TACG GGTT-3’，則能與其互補(bǔ)配對(duì)的另一條鏈可能是：（）

A：5’-ATCG TACG GGTT-3’ B：5’-AACC CGTA CGAT-3’ C：3’-TAGC ATGC CCAA-5’ D：3’-UAGC AUGC CCAA-5’

16.外源基因表達(dá)蛋白的檢測方法有：（）

A：ELISA B：Southern雜交 C：Western雜交 D：Northern雜交

17.園藝植物常用轉(zhuǎn)化方法有哪些：（）

A：農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化 B：基因槍法 C：PEG轉(zhuǎn)化法 D：電泳法

18.胚搶救在園藝植物上的應(yīng)用是多方面的，主要表現(xiàn)在：（）

Ａ：搶救發(fā)育不良或早期退化胚 Ｂ：克服遠(yuǎn)緣雜交不親和 Ｃ：用于柑橘合子胚搶救 Ｄ：三倍體育種

19.生物技術(shù)對(duì)園藝科學(xué)發(fā)展的貢獻(xiàn)有：（）

A：脫毒與快速繁殖 B：花藥培養(yǎng)以及小孢子培養(yǎng) C：胚搶救技術(shù) C：細(xì)胞融合技術(shù)

20.影響原生質(zhì)體分離的因素主要有：（）

Ａ：植物的類型 Ｂ：基因型 Ｃ：外植體類型 Ｄ：生理狀態(tài)

五、簡答題：將下列各題的答案填在下面的方框內(nèi)。

1.原生質(zhì)體再生植株的遺傳變異及其利用。

2.簡述轉(zhuǎn)基因植物的鑒定方法。

3.簡述目前園藝植物生物技術(shù)的主要研究內(nèi)容。

4.高溫易分解培養(yǎng)基如何滅菌？

5.簡述PCR反應(yīng)原理。

6.闡述一下培養(yǎng)基的滅菌方法，滅菌時(shí)間。

六、綜述題：將下列各題的答案寫在下面的方框內(nèi)。

1.1、通過對(duì)生物技術(shù)的學(xué)習(xí)，談?wù)勆锛夹g(shù)在園藝科學(xué)中的應(yīng)用與展望。

2.3、如果現(xiàn)已證明園藝植物的某一重要農(nóng)藝性狀是單基因控制的質(zhì)量性狀，且發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與控制該性狀的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。現(xiàn)有一傳統(tǒng)品種，此品種的其它性狀均十分優(yōu)良，唯獨(dú)該性狀表現(xiàn)不佳，試論述如何應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)的方法對(duì)該性狀進(jìn)行改良？

3.2、談?wù)勼w細(xì)胞雜種在育種中的應(yīng)用。

一、將下面詞組相對(duì)應(yīng)的中文譯成拉丁文或拉丁文譯成中文。

1.基因組文庫

2.RFLP

3.培養(yǎng)基

4.transcriptional gene silencing

5.Anther culture

6.subtractive hybridization

7.簡單序列重復(fù)

8.antibody

9.接種

10.CAPS

二、判斷下列各題正確與否，正確的填“Y”錯(cuò)誤的填“N”。

1.植物原生質(zhì)體分離時(shí)，常采用酶解的方法脫除細(xì)胞壁。

2.可用作病毒鑒定的草本指示植物種類很多，常用的有藜科、茄科、豆科、十字花科、葫蘆科等植物。

3.載體的條件是：能在宿主細(xì)胞中能自我自制并能穩(wěn)定保存，要有多個(gè)酶切位點(diǎn)，每種酶切位點(diǎn)最好只有一個(gè)，酶切后不損壞其自制能力及選擇標(biāo)記基因并能嵌于外源DNA具有可作為選擇。

4.DNA復(fù)制時(shí)，新合成鏈的延伸方向是從5’到3’方向。

5.易高溫分解培養(yǎng)基，往往不能進(jìn)行高壓滅菌，通常采用過濾滅菌，即先將除去了這些不耐熱物質(zhì)的培養(yǎng)基的其他成份經(jīng)高壓滅菌后放置于無菌場所，若制備半固態(tài)培養(yǎng)基，須待培養(yǎng)基冷卻至60℃左右，再加入經(jīng)過濾滅菌的各種不耐熱成分溶液，再混勻放置，分裝備用。

6.在DNA電泳中，分子量大的片段比分子量小的片段距負(fù)極更近。

7.原生質(zhì)體指采用機(jī)械或酶解法去掉了細(xì)胞壁的裸露的且具有活力的細(xì)胞。

8.PCR擴(kuò)增的引物為單鏈DNA片段。

9.花藥培養(yǎng)屬于小孢子培養(yǎng)，而花粉培養(yǎng)則屬于器官培養(yǎng)的范疇。

10.胚狀體是植物組織培養(yǎng)中的專門術(shù)語，是指由體細(xì)胞形成的、類似于生殖細(xì)胞形成的配子胚發(fā)育過程的胚胎發(fā)生途徑。

11.植物轉(zhuǎn)基因的方法主要有：大腸桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、電擊法介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、基因槍法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化及花粉管通道法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化等。

12.DNA雙鏈中AT間形成的氫鍵比CG間少。

13.核酸分析包括直接對(duì)病毒基因組核酸電泳分析和根據(jù)已知的基因組核酸序列設(shè)計(jì)引物對(duì)病毒及類病毒基因組的特異性片斷進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過觀察特異性條帶而對(duì)這些病原進(jìn)行鑒定。

14.柑橘珠心胚培可以有效脫除病毒，珠心胚是由珠心胚細(xì)胞形成的有性胚。

15.組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基多采用濕熱滅菌。

三、填空題：將下列各題空缺部分的答案填在后面的方框內(nèi)，兩者用“，”隔開。

1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、基因槍介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、花粉管通道法、無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

2.常用于植物組織培養(yǎng)的植物激素種類有＿、＿、＿等

3.原生質(zhì)體培養(yǎng)的前提之一是獲得大量有活力的原生質(zhì)體，影響原生質(zhì)體的主要因素有＿、＿、＿、＿。

4.園藝植物常用的脫病毒的途徑有＿、＿、＿、＿等方法。

5.目前尚無防治病毒病的有效藥劑，在園藝植物病毒病的防治中常用的策略主要有＿、＿、＿、＿。

6.在遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體中通常構(gòu)建有一些篩選基因或報(bào)告基因，如果實(shí)驗(yàn)很成功，且檢測方法正確，則下列基因的作用效果應(yīng)呈現(xiàn)的顏色分別是：LacZ基因重組子_____色菌斑；GUS呈______色；GFP呈_______色。

7.日前世界上有200多種植物成功地再生出單倍體植株，其中我國首先報(bào)道的有40多種。獲得單倍體的方法有三種＿、＿、＿。

8.要判斷哪一個(gè)克隆中具有我們所需要的基因就需要對(duì)所得到的重組克隆進(jìn)行篩選，篩選的方法主要有：＿、＿、＿等。

9.迄今為止，已在獼猴桃、馬鈴薯、苜蓿、萵苣、甘藍(lán)、蕃茄、柑橘等植物的原生質(zhì)體再生植株中觀察到變異，再生植株產(chǎn)生的變異主要有＿、＿、＿、＿。

10.狹義的植物生物技術(shù)是指：在離體的條件下，對(duì)植物（細(xì)胞）進(jìn)行遺傳改良或使其增殖的各種技術(shù)的總稱，包括＿＿和＿＿兩個(gè)大的層面。

11.＿是從Thermus aquaticus 菌提取的熱穩(wěn)定性酶，分子量大約94kDa.12.常見的啟動(dòng)子有＿、＿、＿等。

13.常用的遺傳標(biāo)記有______標(biāo)記;______標(biāo)記;_______標(biāo)記和_______標(biāo)記等四種不同水平的標(biāo)記。

14.分子標(biāo)記研究中應(yīng)用最廣泛的DNA鑒定技術(shù)有＿、＿、＿等四種。

15.進(jìn)行胚搶時(shí)，就最終對(duì)胚搶救成活及成苗率影響大小而言，所利用的組織優(yōu)劣順序是：＿、＿、＿、＿。

四、選擇題：從備選答案中選出正確的結(jié)果，正確答案是唯一的。

1.目前分子標(biāo)記在種質(zhì)資源研究中的用途有：（）

A：繪制品種的指紋圖譜

B：種質(zhì)資源的遺傳多樣性及分類研究 C：物種的起源與演化 D：種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)、鑒定與創(chuàng)新

2.基于現(xiàn)代生命科學(xué)的研究進(jìn)展，下列可能是遺傳物質(zhì)的有：()A：DNA B：RNA C：Protein D：多糖

3.園藝植物外植體脫除病毒的方法有：()

A：熱處理脫除病毒 B：莖尖培養(yǎng)脫除病毒 C：微芽嫁接脫除病毒 D：高壓滅菌脫除病毒

4.如果DNA一條鏈?zhǔn)?’-ATCG TACG GGTT-3’，則能與其互補(bǔ)配對(duì)的另一條鏈可能是：（）

A：5’-ATCG TACG GGTT-3’ B：5’-AACC CGTA CGAT-3’ C：3’-TAGC ATGC CCAA-5’ D：3’-UAGC AUGC CCAA-5’

5.影響原生質(zhì)體分離的因素主要有：（）

Ａ：植物的類型 Ｂ：基因型 Ｃ：外植體類型 Ｄ：生理狀態(tài)

6.基因分離克隆的基本步驟有：（）

A：實(shí)驗(yàn)材料的選擇 B：目標(biāo)DNA片段的制備與克隆 C：目的基因的純化

D：載體的構(gòu)建

7.園藝植物常見的病毒病有：（）

A：黃龍病 B：裂皮病 C：線蟲病 D：速衰病

8.組織培養(yǎng)技術(shù)在園藝植物上的應(yīng)用主要有：（）

Ａ：快速繁殖 Ｂ：提高育種效率，改良品種 Ｃ：脫毒 Ｄ：種質(zhì)保存

9.下列屬于現(xiàn)代生物技術(shù)研究的內(nèi)容有:()

A：有性雜交 B：體細(xì)胞雜交 C：組織培養(yǎng) D：基因克隆

10.胚搶救在園藝植物上的應(yīng)用是多方面的，主要表現(xiàn)在：（）

Ａ：搶救發(fā)育不良或早期退化胚 Ｂ：克服遠(yuǎn)緣雜交不親和 Ｃ：用于柑橘合子胚搶救 Ｄ：三倍體育種

11.影響原生質(zhì)體培養(yǎng)及植珠再生的因素主要有：（）

Ａ：原生質(zhì)體來源 Ｂ：基因型 Ｃ：培養(yǎng)基 Ｄ：滲透壓調(diào)節(jié)劑

12.右下圖中剪刀所在位置是DNA分子上的某一酶的酶切位點(diǎn)，長方形是探針結(jié)合部位，試問1、2、3三種DNA樣品用該酶/探針組合進(jìn)行RFLP分析能得到的雜交信號(hào)條帶數(shù)分別是：

A： 1、2、1 B：1、2、2 C：1、1、1 D：1、1、2 13.單克隆抗體制備主要步驟有：（）A：免疫注射 B：細(xì)胞融合 C：篩選 D：克隆化

14.如果RAPD分析時(shí)所選用的隨機(jī)引物的序列為5’-ATCGTACGGGTT-3’，下列虛線部分為500—1000 pb長的DNA區(qū)域，請(qǐng)分析其中能進(jìn)行2的指數(shù)倍擴(kuò)增的有：()

A: 5’ATCGTACGGGTT— — —3’ B: 5’ — — —ATCGTACGGGTT 3’ C: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TACCATGCCCAA 3’ D: 5’ ATCGTACGGGTT— — —TTGGGCATGCAT 3’

15.原生質(zhì)體融合在植物遺傳改良上的應(yīng)用主要表現(xiàn)在：（）

A：克服生殖障礙，創(chuàng)造新種質(zhì) B：轉(zhuǎn)移有利性狀，改善作物品質(zhì) C：作為育種中間材料，進(jìn)一步用作物改良 D：轉(zhuǎn)移部分染色體，獲得非對(duì)稱雜種

16.The most important contribution of Watson and Crick is:()

A：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型 B：RNA結(jié)構(gòu)模型 C：DNA是遺傳物質(zhì) D：DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)

17.植物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中常用的報(bào)告基因主要有：（）

A：cat B:GUS C;Ant D:GFP 18.常用的選擇標(biāo)記基因有：（）

A：抗生素基因 B：NPTⅡ基因 C：花青素基因 D：熒光素酶基因

19.赤霉素的生理作用主要包括：（）

Ａ：誘導(dǎo)莖細(xì)胞的伸長 Ｂ：對(duì)形成層的細(xì)胞分化有影響 Ｃ：可以解除種子、塊莖、鱗莖等休眠 Ｄ：抑制衰老

20.可以用于基因分離的方法有：（）

A：同源序列法 B：圖位克隆法 C：功能克隆法 D：差減雜交法

五、簡答題：將下列各題的答案填在下面的方框內(nèi)。

1.高溫易分解培養(yǎng)基如何滅菌？

2.試比較固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基的優(yōu)、缺點(diǎn)。

3.闡述一下培養(yǎng)基的滅菌方法，滅菌時(shí)間。

4.體細(xì)胞雜種篩選與鑒定方法。

5.簡述常見啟動(dòng)子有哪些？

6.如果你是某單位的技術(shù)人員，現(xiàn)欲建一園藝植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，請(qǐng)簡述實(shí)驗(yàn)室的布局及主要的儀器設(shè)備

六、綜述題：將下列各題的答案寫在下面的方框內(nèi)。

1.2、談?wù)勼w細(xì)胞雜種在育種中的應(yīng)用。

2.3、如果現(xiàn)已證明園藝植物的某一重要農(nóng)藝性狀是單基因控制的質(zhì)量性狀，且發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與控制該性狀的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記?，F(xiàn)有一傳統(tǒng)品種，此品種的其它性狀均十分優(yōu)良，唯獨(dú)該性狀表現(xiàn)不佳，試論述如何應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)的方法對(duì)該性狀進(jìn)行改良？

3.1、通過對(duì)生物技術(shù)的學(xué)習(xí)，談?wù)勆锛夹g(shù)在園藝科學(xué)中的應(yīng)用與展望。

第四篇：《園藝植物生物技術(shù)》實(shí)驗(yàn)教案

《園藝植物生物技術(shù)》實(shí)驗(yàn)教案

實(shí)驗(yàn)一 現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室與實(shí)驗(yàn)儀器

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)儀器是開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)平臺(tái)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室布局和儀器配置的掌握程度是學(xué)生知識(shí)結(jié)構(gòu)完整性的重要體現(xiàn)。通過現(xiàn)場參觀和老師講解加深同學(xué)們對(duì)現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)劃與布局及常用儀器設(shè)備的主要功能的認(rèn)識(shí)，掌握高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等關(guān)鍵儀器的使用方法。

二、實(shí)驗(yàn)場所選擇及實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

園藝學(xué)院植物分子生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室與開展現(xiàn)代生物技術(shù)研究直接相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室分工與布局和主要相關(guān)儀器：如與組織培養(yǎng)有關(guān)的超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、接種至、培養(yǎng)室等；與分子生物學(xué)有關(guān)的高速冷凍離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)等。

三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1、相關(guān)背景知識(shí)回顧：對(duì)課堂講述的各種生物技術(shù)如分子標(biāo)記、細(xì)胞和組織培養(yǎng)等操作過程進(jìn)行回顧，重要指出每個(gè)環(huán)節(jié)要用到的必備儀器的作用、性能指標(biāo)、操作注意事項(xiàng)及儀器選購中應(yīng)注意的問題等。

2、每班分為兩小組簡要介紹現(xiàn)代生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室的布局及功能分區(qū)情況；針對(duì)每個(gè)分區(qū)的重要儀器進(jìn)行講述，結(jié)束時(shí)對(duì)所有參觀內(nèi)容進(jìn)行簡要總結(jié)，并回答同學(xué)們的提問。

四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)有很多易損儀器或有毒試劑，參觀時(shí)要求同學(xué)們認(rèn)真記錄，不要隨意動(dòng)手，以保證儀器和人身安全。

五、思考題

1、根據(jù)參觀內(nèi)容，描述本次參觀有了解到的主要儀器的名稱、用途及使用中的注意事項(xiàng)。

2、一個(gè)現(xiàn)代化生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備的基本功能的必備儀器有哪些？

實(shí)驗(yàn)二 植物組織培養(yǎng)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

植物組織培養(yǎng)是現(xiàn)代生物技術(shù)研究的重要技術(shù)手段，在原生質(zhì)體融合、病毒脫除、離體快繁及遺傳轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。胡蘿卜以其培養(yǎng)體系成熟、再生容易而被視為組織培養(yǎng)的理想外植體材料，本實(shí)驗(yàn)通過胡蘿卜的組織培養(yǎng)使同學(xué)們掌握基本培養(yǎng)基的配制、滅菌及培養(yǎng)的基本技能。

二、實(shí)驗(yàn)原理

基于1902年德國科學(xué)家哈勃蘭特（Haberlandt）提出植物細(xì)胞的全能性理論，即指已分化的細(xì)胞仍然具有分化發(fā)育成新個(gè)體的潛能。在適宜的培養(yǎng)條件下，植物的細(xì)胞、組織或器官都具備再生成完整植物的能力。

三、主要儀器及試材

儀器：pH計(jì)、微波爐、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)室、三角瓶、封口膜、無菌濾紙、手術(shù)刀片、鑷子、酒精燈、記號(hào)筆等

試材：新鮮胡蘿卜，培養(yǎng)基配制所需相關(guān)試劑

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

（一）培養(yǎng)基母液的配制（小規(guī)模實(shí)驗(yàn)應(yīng)按比例減少，避免造成很大的浪費(fèi)）：

1、大量元素(10倍液)：稱取下列藥品分別溶解定容到1升后，加到5升存儲(chǔ)瓶中。

KNO

395 g NH4NO3

82.5 g KH2PO

48.5 g MgSO4?7H2O

18.5 g CaCl2?2H2O

22.0 g 注意事項(xiàng)：

（1）配置母液前要仔細(xì)清洗存儲(chǔ)容器

（2）應(yīng)按照順序分別徹底溶解后混合，每加完一種藥品，搖動(dòng)存儲(chǔ)瓶使其混合均勻；（3）溶解時(shí)最好加熱，以便充分溶解，避免沉淀的產(chǎn)生；

（4）夏季要用新制的蒸餾水，并加熱，這樣可以避免因?yàn)樗袔Ь窟^大而產(chǎn)生沉淀，同時(shí)可以減緩綠藻的生成；

（5）沉淀的產(chǎn)生一是由于溶解不充分就混合造成的渾濁型沉淀，所以配置時(shí)一定不要急；二是由于長菌而產(chǎn)生絮狀沉淀，所以要用新制的蒸餾水并加熱。

2、微量元素母液的配制(100倍液)：取少量(200-300ml)溫水依次加入下列藥品，每加一種藥品后攪拌溶解，最后定容到1L：

KI

0.083 g H3BO0.62 g ZnSO4*7H2O

0.86 g NaMoO4*2H2O

0.025 g CuSO4*5H2O

0.0025 g CoCl2*6H2O

0.0025 g

MnSO4*4H2O

2.23 g(MnSO4*H2O 1.69 g)注意：配好后在室溫下放置10 h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易產(chǎn)生結(jié)晶沉淀。配制過程中產(chǎn)生沉淀的原因有：1.前一個(gè)沒徹底溶解就加入了后一個(gè)藥品；2.蒸餾水pH 值過高，可加幾滴鹽酸校正。

3、甘氨酸和肌醇的配制(100倍液)：

甘氨酸：0.2 g溶解定容到1L；肌醇：10 g溶解定容到1L

4、鐵鹽的配制（100倍液）：

稱取EDTA 3.73 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.78 g，分別溶解后混合定容到1L，放入棕色細(xì)口瓶中，室溫放置10 h以上（防止結(jié)晶沉淀），然后放入4℃冰箱。

5、維生素B的配制（100倍液）：

VB組分 VB1(鹽酸硫氨素)VB6(鹽酸吡哆素)VB5(煙

酸)

改良MT 1g 1g 0.5g

MS 10 mg 50 mg 50 mg 分別稱取順序溶解在溫?zé)岬恼麴s水中，定容到1L。

注: 需要溶解完一個(gè)再加另一個(gè)；VB5不易溶解，需要攪拌，必要時(shí)可以加熱。

6、Vc的配制（100倍液）：

稱取Vc 0.5g 溶解在蒸餾水中，定容到1L即可。

7、其它溶液配制：

BA，NAA，IBA，GA3等激素類試劑可先用少量1N NaOH徹底溶解，再加水定容。配好后室溫放置一段時(shí)間，再放入冰箱中冷藏保存。有些試劑在乙醇或鹽酸中也可溶解，但比較而言，用堿溶解比較穩(wěn)定，不易產(chǎn)生沉淀。

注意：母液最好不要配制太多，如果配制的量較大，短時(shí)間內(nèi)用不完，最好分裝一部分到小的細(xì)口瓶中，在制作培養(yǎng)基時(shí)使用。這樣不容易產(chǎn)生沉淀。

（二）培養(yǎng)基配制

母液配好后，按以下體種（或質(zhì)量）量取，最后用蒸餾水定溶到1L,調(diào)節(jié)pH至5.8，用塑料燒杯放入微波爐中充分溶解后分裝滅菌。

大量元素(10倍液)

ml 微量元素(100倍)ml 甘氨酸和肌醇(100倍)

ml 鐵鹽（100倍）

ml 維生素B（100倍）ml Vc（100倍）

ml 蔗糖

g 瓊脂

7.5 g

（三）接種與培養(yǎng)

在超凈臺(tái)上接種后，用記號(hào)筆做好標(biāo)簽，放置到光照培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、實(shí)驗(yàn)中涉及到酒精及砷汞等危險(xiǎn)品，注意人身安全的環(huán)境安全，廢液不要隨意亂倒。

2、外植體消毒及接種操作要規(guī)范，注意超凈臺(tái)的衛(wèi)生，養(yǎng)成良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣。

六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理

一星期后，統(tǒng)計(jì)污染率，并對(duì)未污染材料的生長狀況進(jìn)行觀察，并分析產(chǎn)生污染的可能原因。

七、思考題

影響植物組織培養(yǎng)的因素有哪些？

主要參考文獻(xiàn)

1.張婭，曾君祉，周志勇，陳毓荃，黃華樑。胡蘿卜組織培養(yǎng)和高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。植物學(xué)通報(bào),2005，22:37-42。

2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室柑橘課題組。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。實(shí)驗(yàn)三 植物DNA的提取、純化及檢測

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

DNA 提取是開展分子生物學(xué)的重要前提之一，高質(zhì)量的DNA直接關(guān)系到分子標(biāo)記、基因克隆、圖譜構(gòu)建及功能基因組研究等工作的成敗。通過本實(shí)驗(yàn)應(yīng)了解常用DNA提取方法的原理和技術(shù)，掌握改良CTAB法提取植物DNA以及DNA檢測技術(shù)，為將來從事園藝植物生物技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

植物的遺傳物質(zhì)是DNA，植物細(xì)胞內(nèi)含有豐富的遺傳物質(zhì)。在機(jī)械研磨、高溫和去污劑的共同作用下，植物細(xì)胞破裂，DNA從細(xì)胞核釋放到提取緩沖液中。經(jīng)蛋白質(zhì)強(qiáng)變性劑處理結(jié)合離心，除去蛋白質(zhì)和色素等雜質(zhì)，再用乙醇沉淀便可獲得高純度的DNA。

DNA電泳是依據(jù)DNA帶負(fù)電荷，而不同濃度的瓊脂糖凝膠孔徑大小不同，在外加電場的作用下DNA由負(fù)極向正極移動(dòng)，分子量小的移動(dòng)快而分子量大的移動(dòng)慢，最終達(dá)到不同分子量大小的DNA分離的目的。

三、主要儀器及試材

水浴鍋、離心機(jī)、移液槍、研缽、離心管、核酸電泳系統(tǒng)等；新鮮健康植物葉片，液氮、及DNA提取有關(guān)試劑。

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 1.藥品的配制: CTAB提取液：

(1)100 mM Tris-HCl(PH 8.0)，1.5 M NaCl，50 mM EDTA(PH 8.0)(2)1% PVP，2% CTAB(3)取少許(1)加到(2)中，攪拌成糊狀,后加(1)至足量，65℃水浴充分溶解備用。使用前要在65℃溫浴一會(huì)兒，然后加入1-4%巰基乙醇，混均勻。苯酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）：

重蒸酚65℃水浴溶解，在燒杯中加入80ml溫?zé)岬恼麴s水，加入少許8-羥基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：異戊醇（24：1），加入20克Tris Base，磁力攪拌器上攪拌1.5 h左右至停止攪拌后很快分層，然后裝入棕色瓶中，4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.DNA的粗提

在裝有葉片的離心管中加入石英砂少許（約0.07克），用尖頭玻棒將材料研細(xì)后加入600 ul CTAB提取液，再繼續(xù)研磨一會(huì)兒使其懸浮均勻，然后在65℃水浴鍋中溫浴60分鐘，隔15分鐘取出上下輕輕顛倒幾次，水浴之后，加入500 ul苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），上下晃動(dòng)10分鐘以上，其間置于37℃水浴鍋中溫浴一會(huì)（冬季），使之充分混勻，然后10000-12000 rpm離心5-10分鐘，吸取上清液轉(zhuǎn)至另一離心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入-20℃冰凍無水乙醇1 ml，輕輕顛倒數(shù)次，混合均勻后冰凍30分鐘沉淀DNA，然后8000-10000 rpm離心5分鐘，棄上清液，加入1 ml 70%酒精浸泡2小時(shí)或過夜，8000 rpm離心5分鐘,棄酒精之后在工作臺(tái)上風(fēng)干DNA，注意不要過干，否則會(huì)使以后溶解困難。3.DNA的純化：

向風(fēng)干后的DNA中加入500 ul 1×TE，37℃水浴15-30分鐘至DNA完全溶解，加5 ul 5 mg/ml Rnase，37℃水浴6小時(shí)，然后加入700 μl苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），上下顛倒離心管約10分鐘，至充分混勻，10000-12000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入700 μl氯仿：異戊醇（24：1），顛倒10分鐘（方法同上），10000 –12000 rpm離心5分鐘，吸取上層液至另一離心管中，加入60 μl 5M NaCl，再加入1 ml冷凍的無水乙醇，輕輕顛倒，然后在-20℃冰箱中置30分鐘沉淀DNA，8000-10000 rpm離心2-3分鐘，使DNA分散狀緊貼在管壁上，棄酒精，加70%酒精1ml浸泡，2小時(shí)后換一次，后浸泡過夜，8000 rpm離心3分鐘后棄酒精，風(fēng)干，加50-100 μl TE充分溶解備用。

4、DNA檢測

（1）取DNA原液15 μl稀釋至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度計(jì)測定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值。高質(zhì)量的DNA要求：A260/A230>2.0； 1.7

（3）向一定量的DNA中加入限制性內(nèi)切酶EcoR I至4-5 U/μg DNA，37℃消化過夜，用0.5×TBE，0.8%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳3 h進(jìn)行檢測。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、實(shí)驗(yàn)中的液氮、氯仿、苯酚、EB等都是危險(xiǎn)或有毒物質(zhì)，操作時(shí)要戴手套，并在專門區(qū)域操作。

2、DAN電泳時(shí)只能由負(fù)極到正極，電泳時(shí)要注意電極是否正確。

六、思考題

簡述DAN提取的步驟及主要試劑的作用。

主要參考文獻(xiàn)

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室柑橘課題組。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。實(shí)驗(yàn)四 質(zhì)粒DNA的提取、純化及檢測

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取時(shí)最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3個(gè)主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNA的分離和純化。本實(shí)驗(yàn)以堿裂解法為例介紹質(zhì)粒的抽提過程，應(yīng)掌握堿裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。

二、實(shí)驗(yàn)原理 在pH 12.0-12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清液中，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。

三、主要儀器及試材

含有質(zhì)粒pUC18載體的大腸桿菌菌液及離心機(jī)、移液槍、離心管及質(zhì)粒DNA提取有關(guān)試劑。

液氮、及DNA提取有關(guān)試劑。

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

（一）試劑配制:

1、LB培養(yǎng)基:NaCl 10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，蛋白胨（Peptone）10g，瓊脂粉15g，加ddH2O至1000ml。分裝至500ml三角瓶（250ml/瓶）。高壓滅菌15min，室溫貯存。

2、X-gal（20mg/ml）:20mg X-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20℃避光保存。

3、IPTG（200mg/ml）:1g IPTG溶于4ml去離子雙蒸水中，定容至5ml，過濾滅菌后-20℃保存。

4、Amp（100mg/ml）:1g Amp溶于4ml去離子滅菌雙蒸水中，定容至5ml，-20℃保存。

5、溶液I: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH 8.0），10mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

6、溶液II:0.2N NaOH，1% SDS。配制方法：2N NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前臨時(shí)配制。

7、溶液III:醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。配制方法：5M KAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml（視冰醋酸情況，也可按6:3:1配制），貯存于4℃。

8、TE:10mM Tris-HCl（pH 8.0），1mM EDTA（pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

9、苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）。

10、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）。11、5×TBE:Tris-base 54g，硼酸27.5g，EDTA-Na·2H2O 4.65g，加ddH2O至1000ml。高壓滅菌15min，貯存于4℃。

12、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

13、Rnase A（RNA酶A）:不含DNA酶（DNase-free）RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝貯存于-20℃。14、6×loading buffer（上樣緩沖液）:0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。15、1%瓊脂糖凝膠:稱取1g瓊脂糖與三角燒瓶中，加100ml 1×TBE，微波爐加熱至完全熔化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5ug/ml（注意：EB為強(qiáng)誘變劑，操作時(shí)帶手套），輕輕搖勻，緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液1×TBE），即可上樣。

（二）實(shí)驗(yàn)步驟

1、取含有pUC18質(zhì)粒的大腸桿菌菌液于LB固體培養(yǎng)基上劃線37℃過夜培養(yǎng)。

2、用無菌牙簽或槍頭挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于20ml含有Amp抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床-250r/min過夜培養(yǎng)。

3、吸取1.5ml菌液，12000g離心1min，收集菌體，倒掉菌液；吸取1.5ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈。

4、加入200ul預(yù)冷的溶液I，重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)徹底混勻沉淀或碎塊）。

5、加入400ul新配置的溶液II，輕柔顛倒混勻（不可劇烈震蕩），并將離心管置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解（溶液II為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

6、加入300ul預(yù)冷的溶液III，溫和顛倒混勻，見白色絮狀沉淀，置于冰上3-5min，使雜質(zhì)充分沉淀（溶液III為中和液，此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時(shí)K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀）。

7、吸取800ul上清液（注意：不要吸到漂浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇或2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混勻，室溫放置5min，4℃離心12000g ×15min。

8、倒盡上清，加75%乙醇浸洗沉淀除鹽1-2次，4℃離心 10000g×10min，棄上清，將沉淀在室溫或超凈工作臺(tái)上風(fēng)干。

9、將沉淀溶于40ul 滅菌超純水或TE（含RNase A 20ug/ml），37℃水浴30min，以降解RAN，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

10、取制備的質(zhì)粒DNA 1-2ul，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣，1%瓊脂糖凝膠2.5V/cm電泳1h進(jìn)行檢測。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、實(shí)驗(yàn)中的液氮、氯仿、EB等都是有毒物質(zhì)，操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù)，盡量減少臺(tái)面污染。

2、DAN電泳時(shí)只能由負(fù)極到正極，電泳時(shí)要注意電極是否正確。

3、質(zhì)粒電泳檢測一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型。

六、思考題

簡述質(zhì)粒DAN提取的步驟。

主要參考文獻(xiàn)

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室柑橘課題組。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料）。

實(shí)驗(yàn)五 PCR技術(shù)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，是分子克隆技術(shù)中常用技術(shù)之一。PCR具有反應(yīng)快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。通過本實(shí)驗(yàn)應(yīng)掌握PCR原理，學(xué)習(xí)PCR操作過程。

二、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是在模板DNA、引物和dNTPs的存在環(huán)境下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)分為變性、退火、延伸三步，經(jīng)過一定的循環(huán)，介于兩個(gè)引物之間的特異DNA片段得到大量擴(kuò)增。

三、主要儀器及試材

含有外源cDNA片段的質(zhì)粒或轉(zhuǎn)基因蘋果、番茄葉片總DNA；外源基因的特異引物及PCR儀與相關(guān)試劑。

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1、調(diào)整模板濃度至5ng/ul。

2、按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻，離心5秒（注意加1滴礦物油覆蓋PCR管）。

Template DNA

2ul（20ng）10×buffer

2.0ul MgCl2（25mM）

1.5ul Primer F（10uM）

0.2ul Primer R（10uM）

0.2ul dNTPs（2mM）

2.0ul Taq（5U/ul）

0.2ul Add ddH2O to

20ul

3、PCR反應(yīng)循環(huán)條件設(shè)置：

95℃

3min

1cycle 94℃

1min

55℃

1min 72℃

90s

35cycles 72℃

10min

1cycle 4℃

forever

4、檢測：加2ul溴酚藍(lán)，混勻，短暫離心，取15ul反應(yīng)產(chǎn)物點(diǎn)樣電泳

5、在1%瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣電泳；EB染色，紫外觀察。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、引物設(shè)計(jì)應(yīng)具有特異性，依靠引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；引物分裝成多管，不宜反復(fù)凍融多次；

2、PCR反應(yīng)的各種成分不能遺漏，操作應(yīng)戴手套，冰上操作；

3、根據(jù)引物的Tm值和擴(kuò)增片段長度以及PCR儀的特性來設(shè)定PCR循環(huán)條件；

4、注意分析電泳檢測PCR產(chǎn)物時(shí)出現(xiàn)拖帶或非特異性擴(kuò)增帶、無DNA帶或DNA帶很弱的可能原因。

六、思考題

簡述PCR技術(shù)的原理和步驟。

主要參考文獻(xiàn)

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室柑橘課題組。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料

實(shí)驗(yàn)六 PCR產(chǎn)物的TA克隆

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

采用同源序列法克隆特定基因或DNA片段是果樹上常用的分子克隆方法。相對(duì)于粘性末端來說，克隆具有平末端的雙鏈PCR產(chǎn)物效率較低。目前，有兩種方法可以采用，一種是在特異引物設(shè)計(jì)時(shí)引入酶切位點(diǎn)，另一種是TA克隆。通過本實(shí)驗(yàn)應(yīng)掌握PCR產(chǎn)物TA克隆的原理，學(xué)習(xí)PCR產(chǎn)物純化及回收，以及PCR產(chǎn)物與TA克隆載體的連接。

二、實(shí)驗(yàn)原理

TA克隆是利用耐熱聚合酶，如Taq聚合酶、Tfl、Tth等具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，而不具有3’一5’外切酶的校準(zhǔn)活性，即在PCR產(chǎn)物的兩個(gè)3’末端加上未配對(duì)的單一A凸出尾，質(zhì)粒載體提供線性3’末端單一的T凸出尾，使該載體能夠直接與PCR產(chǎn)物高效連接。TA克隆技術(shù)比其它PCR克隆方法有更高的重組效率。

三、主要儀器及試材

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（Promega公司）、pMD18-T載體（TaKaRa公司）以及感受態(tài)大腸桿菌、高速冷凍離心機(jī)、移液槍、瓊脂糖凝膠電泳等相關(guān)儀器及試劑。

四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1、PCR擴(kuò)增片段純化回收

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，割膠，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒收集PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，具體操作步驟參考試劑盒說明書進(jìn)行。

2、連接反應(yīng) 反應(yīng)體系組成

pMD18-T

0.5-1.0 ul PCR fragment

1.0-4.5 ul ddH2O

0-3.0 ul Ligation Solution I

5.0 ul 混合后，置于室溫下放置數(shù)小時(shí)或過夜連接。

3、重組子轉(zhuǎn)化（熱激法）

1）在含適當(dāng)濃度的Ampicillin的LB平板上，涂抹4 ul IPTG（200mg/ml）和40 ul x-gal（20mg/ml），然后暗置30 min以上；

2）冰上冷凍新滅菌的1.5 ml 離心管； 3）取出感受態(tài)大腸桿菌，冰上放置凍融；

4）取新滅菌的1.5 ml 離心管，加入50 ul感受態(tài)細(xì)胞和10 ul連接反應(yīng)液，用移液槍輕輕吸打均勻，在冰上放置30 min；

5）熱激：將離心管在42 ℃下水浴90秒鐘。請(qǐng)勿搖動(dòng)離心管； 6）冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，1-2分鐘；

7）復(fù)蘇：每管加400 ul液體LB培養(yǎng)基，在37 ℃搖床溫和搖動(dòng)45 min-60 min； 8）涂皿：取150 ul均勻涂布于“1）”已制備好的LB平板上；

9）培養(yǎng)：在37 ℃下倒置培養(yǎng)12-16 h，即可觀察到藍(lán)白相間的菌落。白色菌落為含有外源插入片段的轉(zhuǎn)化子，藍(lán)色是載體自連的轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子可以在4 ℃下保持1個(gè)月；

10）單菌落培養(yǎng)：用滅菌的牙簽，挑選白色的單菌落到盛有含50 mg/ml Ampicillin的5 ml液體LB培養(yǎng)基的50 ml離心管中，在37 ℃搖床上培養(yǎng)過夜（12-16 h）。

4、質(zhì)粒DNA的分離 參考有關(guān)文獻(xiàn)。

5、檢測

采用相同的引物對(duì)進(jìn)行PCR再擴(kuò)增，或質(zhì)粒上根據(jù)插入片段兩端的酶切位點(diǎn)而進(jìn)行限制性酶切，通過電泳可以檢測出片段是否克隆成功。

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、連接溫度不宜太高，連接溫度過高（>28℃）可使背景增加，使重組克隆菌減少。降低連接溫度可以提高白斑率；

2、熱激過程注意勿搖動(dòng)離心管。

六、思考題

簡述PCR產(chǎn)物TA克隆的原理和步驟。

主要參考文獻(xiàn)

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室柑橘課題組。實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，2002，武漢（課題組內(nèi)部資料。

第五篇：植物生物技術(shù)

我對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的認(rèn)識(shí)與體會(huì)

園藝111班

蔡朝途

1131100916

轉(zhuǎn)基因技術(shù)（Genetically Modified，簡稱GM），是指運(yùn)用科學(xué)手段，將基因片段轉(zhuǎn)入特定生物中，并最終獲取具有特定遺傳性狀個(gè)體的技術(shù)。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的理論基礎(chǔ)來源于分子生物學(xué)?；蚱蔚膩碓纯梢允翘崛√囟ㄉ矬w基因組中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的基因片段?；蚱伪晦D(zhuǎn)入特定生物中，與其本身的基因組進(jìn)行重組，再從重組體中進(jìn)行數(shù)代的人工選育，從而獲得具有特定的遺傳性狀個(gè)體。該技術(shù)可以使重組生物增加人們所期望的新性狀，培育出新品種。人們常說的“遺傳工程”、“基因工程”、“遺傳轉(zhuǎn)化”均為轉(zhuǎn)基因的同義詞。

20世紀(jì)80年代末轉(zhuǎn)基因植物在美國問世至今，該項(xiàng)技術(shù)正以日新月異的速度迅猛發(fā)展，逐漸走入了人們的生活。人們認(rèn)為轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以在一定程度上通過科學(xué)技術(shù)手段讓其他生物、植物朝著對(duì)人類有利方向發(fā)展的技術(shù)。特別是遺傳學(xué)創(chuàng)立后近百年的轉(zhuǎn)基因育種則是采用人工雜交的方法，進(jìn)行優(yōu)良基因的重組和外源基因的導(dǎo)入而實(shí)現(xiàn)遺傳基因的改良。但是在過去的幾千年內(nèi)我們的祖先對(duì)農(nóng)作物遺傳基因的改良就一直不斷的突破著和改良著，那時(shí)轉(zhuǎn)基因的方式主要是對(duì)農(nóng)作物在自然條件下突變產(chǎn)生的優(yōu)良基因和重組體的農(nóng)作物的選擇和利用，通過人為的和自然的方式來積累優(yōu)良遺傳基因。因此我們可以說現(xiàn)在的轉(zhuǎn)基因技術(shù)與過去的傳統(tǒng)技術(shù)相比，他們的本質(zhì)都是通過獲得優(yōu)良基因人為的或者自然的進(jìn)行基因的遺傳改良。但是他們又有本質(zhì)上的區(qū)別：傳統(tǒng)技術(shù)只能在生物種內(nèi)個(gè)體間實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)所轉(zhuǎn)移的基因則不受生物體間親緣關(guān)系的限制；傳統(tǒng)的雜交和選擇技術(shù)一般是在生物個(gè)體水平上進(jìn)行，操作對(duì)象是整個(gè)基因組，所轉(zhuǎn)移的是大量的基因，不可能準(zhǔn)確地對(duì)某個(gè)基因進(jìn)行操作和選擇，對(duì)后代的表現(xiàn)預(yù)見性較差。而轉(zhuǎn)基因技術(shù)所操作和轉(zhuǎn)移的一般是經(jīng)過明確定義的基因，功能清楚，后代表現(xiàn)可準(zhǔn)確預(yù)期。所以我們可以說現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展和補(bǔ)充，我們將兩者緊密結(jié)合，可以大大地提高動(dòng)植物品種改良的效率。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，為人們帶來了新的福音，但新的問題也隨之涌現(xiàn)，對(duì)于

轉(zhuǎn)基因技術(shù)走進(jìn)生活這一事件，質(zhì)疑聲不絕于耳。我們應(yīng)該對(duì)其一分為二地看，既有利也有弊，人們應(yīng)該客觀地看待其利弊，將其作為一把雙刃劍來使用。

凡事都有兩面性，對(duì)于轉(zhuǎn)基因技術(shù)我們不能全部的否定也不能全部的肯定。從利的方面來說轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)人類有百利而無一害。自1983年世界第一例轉(zhuǎn)基因植物——煙草問世以來僅20多年的時(shí)間里，轉(zhuǎn)基因植物的研究和應(yīng)用就已經(jīng)得到了迅猛的發(fā)展，已有近1000例轉(zhuǎn)基因植物被批準(zhǔn)進(jìn)入田間試驗(yàn)，涉及的植物物種有50余個(gè)，已有48個(gè)轉(zhuǎn)基因植物品種被批準(zhǔn)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)有如下優(yōu)勢：第一，增加產(chǎn)量。在傳統(tǒng)作物中植入快速生長基因后，農(nóng)作物的特性得到了改善，不僅可縮短生長期而且還增加作物產(chǎn)量，使土地得到了最大限度的充分利用，也使人類從此告別缺糧的歷史。第二，改良品質(zhì)。植入不同的基因片段，可使食品的外觀、味道、口感甚至營養(yǎng)成分完全改變，將使人類的食物進(jìn)入一個(gè)隨心所欲的新時(shí)期。例如轉(zhuǎn)基因大米是通過人為改變大米的基因使其擁有更好的性狀的一種稻子結(jié)出來的大米。它可能是更具有抗?jié)?、抗旱、抗蟲害、增加了大米里的蛋白質(zhì)含量。第三，增強(qiáng)抗逆性。通過基因改變，使傳統(tǒng)作物具備了抵御病蟲害的能力，因此可大大減少農(nóng)藥和殺蟲劑的使用，防止環(huán)境污染；通過改良基因，人類能讓作物具有耐寒、耐熱、耐干旱或耐澇的不同特性，從而適應(yīng)不同的生長環(huán)境，農(nóng)作物將徹底告別靠天種植的歷史。例如20世紀(jì)80年代初期由我國學(xué)者周光宇提出的，我國目前推廣面積最大的用花粉管通道法培育出來的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，是對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)人類有利的最好的證明。該轉(zhuǎn)基因抗蟲棉最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術(shù)簡單不需要，裝備精良的實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)育種工作者易于掌握。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)給人類帶來福音的同時(shí)也帶來了危害。如：1999年，美國康奈爾大學(xué)的研究者約翰?洛希在英國《自然》雜志上發(fā)表報(bào)告，用涂有轉(zhuǎn)Bt基因玉米花粉的葉片喂養(yǎng)斑蝶，導(dǎo)致44%的幼蟲死亡。2004年，瑞士聯(lián)邦技術(shù)研究院踢球植物學(xué)研究所海爾比克教授發(fā)現(xiàn)，先正達(dá)研發(fā)的轉(zhuǎn)基因Bt-176玉米中，用來毒殺歐洲玉米螟的Bt毒素，無法分解，最終毒死了奶牛。2005年5月22日，英國《獨(dú)立報(bào)》又披露了知名生物技術(shù)公司“孟山都”的一份報(bào)告，以轉(zhuǎn)基因食品喂養(yǎng)的老鼠出現(xiàn)器官變異和血液成份改變的現(xiàn)象。2005年的11月16日，澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織（CSIRO）發(fā)表的一篇研究報(bào)告顯示，一項(xiàng)持續(xù)

4個(gè)星期的實(shí)驗(yàn)表明，被喂食了轉(zhuǎn)基因豌豆的小白鼠的肺部產(chǎn)生了炎癥，小白鼠發(fā)生過敏反應(yīng)，并對(duì)其他過敏源更加敏感，并據(jù)此叫停了歷時(shí)10年、耗資300萬美元的轉(zhuǎn)基因項(xiàng)目。2006年，俄羅斯科學(xué)院高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)和神經(jīng)生理研究所科學(xué)家伊琳娜?艾爾馬科娃博士研究發(fā)現(xiàn)，食用轉(zhuǎn)基因大豆食物的老鼠，其幼鼠一半以上在出生后頭三個(gè)星期死亡，是食用非轉(zhuǎn)基因大豆老鼠死亡率的6倍。2007年，在奧地利政府的資助下，澤特克教授及其研究小組對(duì)孟都山公司研發(fā)的“轉(zhuǎn)基因抗除草劑玉米NK603和轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米MON810的雜交品種”進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。在經(jīng)過長達(dá)20周的觀察之后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品影響了小鼠的生殖能力,《俄羅斯科學(xué)家證實(shí)轉(zhuǎn)基因食物是有害的》。2007年10月和11月，美國《紐約時(shí)報(bào)》等媒體報(bào)道，經(jīng)過長期周密跟蹤觀察，發(fā)現(xiàn)有兩種轉(zhuǎn)基因玉米種植導(dǎo)致傷害蝴蝶生存，對(duì)生態(tài)環(huán)境安全的威脅程度已經(jīng)超出可接受水平。為此，歐盟已經(jīng)做出了初步?jīng)Q定、禁止該轉(zhuǎn)基因玉米的種子銷售使用。2008年，美國科學(xué)家也證實(shí)了長時(shí)間喂食轉(zhuǎn)基因玉米，小白鼠的免疫系統(tǒng)會(huì)受到損害，該研究成果發(fā)表在同年《農(nóng)業(yè)與食品化學(xué)》雜志上。2009年12月，法國科學(xué)家發(fā)表了新的研究結(jié)果并證實(shí)，孟山都公司出產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)大鼠的肝臟和腎臟具有毒性，這些副作用是性別依賴的、也時(shí)常是劑量依賴的；其他副作用也見于大鼠的心臟、腎上腺、脾和造血系統(tǒng)。2010年4月16日，俄羅斯科學(xué)家公布了新的獨(dú)立研究成果，進(jìn)一步證明倉鼠食用轉(zhuǎn)基因大豆三代就會(huì)絕種！同時(shí)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展打破了自然發(fā)展的規(guī)律，或多或少破壞了生物界領(lǐng)域的和諧。轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康存在危害：第一，基因飄逸即基因流或基因水平轉(zhuǎn)移到其他近緣物種。如加拿大發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因油菜與野生近緣種間發(fā)生過交叉雜交,從而形成所謂超級(jí)雜草，導(dǎo)致野生等位基因的丟失，從而造成遺傳多樣性的喪失，影響生態(tài)平衡。第二，轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的殺蟲毒素可由根部滲入土壤，某種單一的轉(zhuǎn)基因植物的大量種植可能會(huì)對(duì)土壤生物及微生物和環(huán)境產(chǎn)生不良影響，因而減少本地區(qū)物種的多樣性。第三，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的毒性，能引起人的過敏反應(yīng)。1995 年發(fā)現(xiàn)美國國際先鋒公司轉(zhuǎn)巴西堅(jiān)如果基因的大豆能引起人過敏，在轉(zhuǎn)花生基因的作物中也有過過敏現(xiàn)象。第四，轉(zhuǎn)入植物的標(biāo)記基因(特別是抗生素基因),有可能通過某種途徑擴(kuò)散到其他微生物中并使其產(chǎn)生新的抗藥性，導(dǎo)致超級(jí)病原菌的產(chǎn)生。

總之，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展是不可逆轉(zhuǎn)的。然而,它的發(fā)展總會(huì)伴隨著各種利

弊問題。我們必須以一種謹(jǐn)慎的態(tài)度來看待轉(zhuǎn)基因技術(shù)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用對(duì)人類發(fā)展而言前景是廣闊 的，影響也是深遠(yuǎn)的。我們應(yīng)采取積極的態(tài)度對(duì)待轉(zhuǎn)基因技術(shù)的開發(fā)和利用，坦然面對(duì)在對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)運(yùn)用過程中帶來的是與非，在對(duì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)充分重視的同時(shí)加快安全性技術(shù)的研究，讓轉(zhuǎn)基因技術(shù)在促進(jìn)人類生存和發(fā)展中發(fā)揮重大作用，帶來科技領(lǐng)域和生物界領(lǐng)域的重大飛躍，讓轉(zhuǎn)基因技術(shù)真正造福于人類。

參考文獻(xiàn)

(1)文平，王仁祥.轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展[J].生物學(xué)教學(xué)，2005.12

(2)Russia says genetically modified foods are harmful

(3)劉松鑫.基因重組技術(shù)與倫理研究[J].攀枝花學(xué)院學(xué)報(bào).2010.6,27

(4)陳學(xué)敏.轉(zhuǎn)基因技術(shù)與生物多樣性的沖突[J].華中師范大學(xué)學(xué)報(bào).2010.11

(5)劉松鑫.基因重組技術(shù)與倫理研究[J]攀枝花學(xué)院學(xué)報(bào)。