第一篇：實驗四 植物DNA的提取[定稿]

實驗四

植物DNA的提取

一、實驗目的

掌握CTAB法從植物葉片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法從植物葉片中提取基因組DNA，并進行純度分析。

二、實驗原理

1、核酸提取的基本原理

核酸是生物有機體中的重要成分，在生物體中核酸常與蛋白質結合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)兩大類，在真核細胞中，前者主要存在于細胞核中，后者主要存在于細胞質及核仁里。在制備核酸時，通過研磨破壞細胞壁和細胞膜，使核蛋白被釋放出來。

在濃氯化鈉溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化鈉溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來。分離得到核蛋白后，需進一步將蛋白等雜質除去，常采用的去除蛋白的方法有3種：①用含異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液，使其乳化，然后離心除去變性蛋白質，此時蛋白質凝膠停留在水相和氯仿相中間，而DNA溶于上層水相。用兩倍體積的無水乙醇溶液將DNA鈉鹽沉淀出來。如果用酸性乙醇或冰乙酸來沉淀，得到的是游離的DNA。②用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質變性，與核酸分離，從而從材料中直接提取出DNA。③用苯酚處理，然后離心分層，DNA溶于上層水相，蛋白變性后則停留在酚層內。吸出上面水層，加兩倍體積的無水乙醇溶液，得到白色纖維狀DNA沉淀。反復使用上述方法多次處理DNA核蛋白溶液，就能將蛋白等雜質較徹底地除去，得到較純的DNA制品。為了徹底除去DNA制品中混雜的RNA，可用RNA酶處理。生物材料中含有的脂肪物質和大部分的多糖，在用鹽溶液分離核蛋白和用乙醇或異丙醇分級沉淀時即被除去。

在DNA提取、制備的過程中，核酸極不穩定，許多因素可破壞其完整結構：①化學因素，核酸的結構在pH值4.0～11.0間較穩定，pH值在此范圍外就會使核酸變性降解，故制備過程應避免過酸過堿。②物理因素，DNA分子鏈很長，是雙螺旋結構，既有一定的柔性，又有一定的剛性，故強機械作用如劇烈攪拌會令DNA分子斷裂，不利于收集，應加以避免。③酶的作用，細胞中普遍存在的核酸酶在細胞壁或膜遭到破壞時被釋放出來，它會降解DNA分子。故須用酶的變性劑、抑制劑使之失活。操作過程最好在低溫(0℃左右)下進行。常用的酶抑制劑有檸檬酸鹽、氟化物、砷酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作為蛋白變性劑，同時可使核酸酶被破壞而失活。

2、CTAB法和SDS法的提取原理

（1）CTAB法是一種快速簡便的提取植物總DNA的方法.。CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種陽離子型去污劑，它不僅能使蛋白質變性，而且還能與核酸形成特異的核酸-CTAB復合物，這種復合物溶于高鹽緩沖液（≥0.7M NaCl），降低鹽濃度，通過超速離心能選擇性地沉淀核酸，并與多糖等可溶性雜質分開，CTAB-核酸復合物再用70-75%乙醇浸泡可脫掉CTAB。提取時先將新鮮的葉片在液氮中研磨，破碎其細胞，然后加入CTAB分離緩沖液，將DNA溶解出來，再經氯仿－異戊醇抽提除去蛋白質，最后通過異丙醇沉淀或低鹽離心得到DNA。

（2）SDS法也是提取植物DNA的常用方法。先將新鮮的葉片在液氮中研磨以機械力破本碎細胞壁，然后加入SDS使細胞膜破裂，并同時將蛋白質和多糖等雜質與核酸分開。加入KAc可使SDS—蛋白質復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式，使沉淀更加完全。

3、DNA的濃度測定和純度分析

（1）定磷法：是對樣品中核酸（DNA和RNA）含量的準確定量。將樣品中的核酸用強酸（硫酸或高氯酸）消化成無機磷，然后用定磷試劑對生成的無機磷酸進行滴定。定磷試劑是酸性鉬酸銨溶液，鉬酸銨能與無機磷酸定量結合成磷鉬酸絡合物，該絡合物能被抗壞血酸等還原劑還原成蘭色的鉬藍，在660nm處有最大光吸收。

（2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的RNA溶液或單鏈DNA的A260=0.022~0.024。1個A260相當于50ug/mL的DNA、40ug/mL的RNA。蛋白質的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。純的DNA的A260/A280在1.8左右，純的RNA的A260/A280在2.0左右。

三、試劑和器材：

(1)1M Tris-cl（pH8.0）：Tris l21.1g溶于蒸餾水，用濃HCl調至pH8.0以蒸餾水定容至1000ml(2)CTAB分離緩沖液： 2g CTAB，8.18g NaCL，0.74g EDTA.Na2.2H2O，10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0)，0.2mL巰基乙醇，加水定容到100mL。

(3)洗滌緩沖液（70%乙醇，10mmol/L乙酸銨）：70mL無水乙醇，0.077g乙酸銨，加水到100mL。(4)TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCL（pH7.4），1mmol/L EDTA(5)氯仿:異戊醇=24:1(6)液氮

(7)研缽，恒溫水?。?7～100℃），離心機，離心管。

四、操作方法：

(1)將10mlCTAB分離緩沖液加入50ml離心管中，置于65℃水浴中預熱。(2)稱取1.5g葉片，置于預冷的研缽中，倒入液氮，盡快將葉片研碎。(3)取1g粉末直接加入預熱的CTAB分離緩沖液中，輕輕轉動使之混勻。

(4)樣品于65℃保溫30分鐘，每5～10分鐘混勻一次。(5)加等體積（10ml）的氯仿－異戊醇，輕輕顛倒混勻。(6)室溫下4000r/min離心10分鐘。

(7)用膠頭滴管將上層水相吸入另一干凈的離心管中（注意不要吸動懸浮的細胞碎片和中間白色的蛋白質層），向離心管中加入2/3體積的異丙醇，輕輕混勻，使DNA析出。（有些情況下，這一步可以產生云霧狀的DNA析出，如果看不到云霧狀的DNA，樣品則可以在冰浴中放置數小時甚至過夜）。(8)用下述方法收集DNA：

如果呈云霧狀的DNA析出，則用玻璃棒在云霧狀的DNA中輕輕轉動，纏起DNA，然后將玻璃棒轉移至20mL洗滌緩沖液中浸泡洗滌10分鐘（不要將DNA沉淀從玻璃棒上弄掉）。

如果看不到云霧狀的DNA，可將離心管在4000r/min離心5分鐘，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加20mL洗滌緩沖液，輕輕轉動離心管，洗滌核酸沉淀10分鐘，然后離心，小心地倒掉上清液，讓DNA沉淀自然干燥20分鐘。(9)用玻璃棒纏出DNA，在室溫下使DNA自然干燥20分鐘。(10)

將自然干燥的DNA溶于1mLTE緩沖液中，—20℃保存備用。

(11)

取100uL稀釋20倍，測定A260，A280，A230，或作出吸收波譜200~400nm并計算濃度和得率。

(12)

取5~10uLDNA溶液做0.7%的瓊脂糖電泳，檢查DNA的大小和質量，以λ-DNA/HindⅢ做分子量標準，另取5uL做限制性酶切。

注意；所有操作均須溫和，避免劇烈震蕩。

五、思考題

1、CTAB、EDTA、巰基乙醇的作用是什么？

2、吸取樣品、抽提、及電泳時應注意什么？為什么？

第二篇：實驗四動物血液中DNA的提取-教案

授課教師常祖明學生人數 55

課題血液基因組DNA的提取

授課類型新授課授課方法講授、演示 教學用具多媒體、實驗室設備

教學目的掌握雞血DNA提取的原理及方法

教學重點理解實驗過程中每一步操作的目的及原理 教學難點 教學過程

一、實驗目的

1.掌握雞血DNA提取的原理；

2.掌握雞血DNA提取的方法及操作過程。

二、實驗原理

哺乳動物的成熟紅細胞已經高度分化，因而當中沒有細胞核，無法提取DNA。禽類的血細胞則可以。禽類代謝旺盛，血液中紅細胞更多，而且紅細胞中有完整的細胞核、大量的染色體。且材料易得、經濟。用雞血細胞做實驗材料有兩個原因。一是因為雞血細胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細胞極易吸水脹破，而用動物肝臟細胞作實驗材料常常需要勻漿和離心，對設備要求較高，操作繁瑣，歷時較長。

三、實驗儀器 1.水浴鍋：55℃

2.離心機：8000轉、12000轉 3.離心管：5ml（120個）

4.移液槍：10μl、680μl、700μl、800μl、900μl、1ml 5.容量瓶：100ml 6.取血針及管

四、實驗材料及藥品

實驗材料：普通家雞：需血液4.08ml（每管136(l）1.無水乙醇

作用：DNA沉淀劑、洗滌劑。

商品信息：瓶/500ml，分析純AR。

理化性質：無色澄清液體。有灼燒味。易流動。極易從空氣中吸收水分，能與水和氯仿、乙醚等多種有機溶劑以任意比例互溶。

儲存：儲存于陰涼、通風的庫房。遠離火種、熱源。庫溫不宜超過30℃。保持容器密封。應與氧化劑、酸類、堿金屬、胺類等分開存放，切忌混儲。采用防爆型照明、通風設施。禁止使用易產生火花的機械設備和工具。

危害：易燃，具刺激性。蒸氣與空氣能形成爆炸性混合物，爆炸極限3.5%～18.0%（體積）。2.檸檬酸

作用：ACD抗凝血劑成分之一。在抗凝劑中，中和檸檬酸鈉的堿性。商品信息：分析純AR，白色塑料瓶/500g，理化性質：無臭，有很強的酸味，白色粉末或顆粒，易溶于水和醇。在潮濕的空氣中微有潮解性。

儲存：在濕空氣中有輕微潮解，需陰涼密封干燥保存。

危害：檸檬酸濃溶液對黏膜有刺激作用。檸檬酸可燃。粉體與空氣可形成爆炸性混合物，遇明火、高熱或與氧化劑接觸，有引起燃燒爆炸的危險。3.檸檬酸鈉

作用：ACD抗凝血劑成分之一。能與血液中的鈣離子結合成螯合物，而使鈣離子失去凝血作用，從而阻止血液凝固。

商品信息：檸檬酸三鈉分析純500克/瓶。

理化性質：有機化合物，外觀為白色到無色晶體。無臭, 有清涼咸辣味。常溫及空氣中穩定, 在濕空氣中微有溶解性, 在熱空氣中產生風化現象。加熱至150℃失去結晶水。易溶于水、可溶于甘油、難溶于醇類及其他有機溶劑，過熱分解，在潮濕的環境中微有潮解，在熱空氣中微有風化，其溶液 pH 值約為8。儲存： 常溫密閉保存 危害：無毒 4.尿素

作用：禽血裂解液成分之一。尿素能非常有效地使蛋白質變性，尤其能非常有效地破壞非共價鍵結合的蛋白質。

商品信息：化學試劑分析純 500克/瓶（塑料瓶裝）理化性質：無色柱狀結晶或白色結晶性粉末，溶于水，乙醇和苯，難溶于乙醚，不溶于氯仿。儲存：密封避光保存。

危害：避免與皮膚和眼睛接觸。5.十二烷基硫酸鈉(SDS)作用：禽血裂解液成分之一。裂解核酸-蛋白質復合體，用于從蛋白質中分離核酸。商品信息：500g/分析純AR。

理化性質：白色或淡黃色粉末。溶解性：溶于水，呈透明溶液，溶液呈中性。易溶于熱水，溶于水，溶于熱乙醇，微溶于醇，不溶于氯仿、醚。儲存：密封陰涼干燥保存 防止受潮受熱 危害：對粘膜和上呼吸道有刺激作用，對眼和皮膚有刺激作用?？梢鸷粑到y過敏性反應。該品可燃，具刺激性，具致敏性。遇明火、高熱可燃。受高熱分解放出有毒的氣體。6.1M Tris-HCl(PH8.0)緩沖液

作用：禽血裂解液成分之一。提供一個緩沖環境，防止DNA被破壞 商品信息：瓶/100ml，無色、澄清溶液

理化性質：Tris中文品名為三羥甲基氨基甲烷，瓶/500g。是一種白色結晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，對銅、鋁有腐蝕作用，有刺激性的化學物質。

儲存：室溫保存。

危害：毒性低，可致癌，不要直接接觸皮膚。7.乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）

作用：配制0.5M EDTA（PH8.0）溶液。螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制脫氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。商品信息：瓶/250g。理化性質：無味無臭或微咸的白色或乳白色結晶或顆粒狀粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值約為5.3。可由EDTA與氫氧化鈉和碳酸鈣作用制得。

儲存：于陰涼、通風的庫房。遠離火種、熱源。應與氧化劑分開存放，切忌混儲。配備相應品種和數量的消防器材。儲區應備有合適的材料收容泄漏物。

危害：對粘膜和上呼吸道有刺激作用。對眼睛、皮膚有刺激作用。本品可燃，具刺激性。8.蛋白酶K（共需300μl，每管10μl）作用：消化組蛋白，釋放出DNA；消化DNase，提高DNA產量 商品信息：（20mg/mL）1ml/支。

理化性質：一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，從林伯氏白色念球菌中純化得到。儲存：保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融，有效保證12月。危害：使用時注意不要接觸皮膚，以免損傷皮膚表面的蛋白質。9.Tris飽和酚（共需60ml，每管2ml）作用：強蛋白質變性劑。商品信息：瓶/250ml。理化性質：為淺黃色透明液體，上層為Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羥基喹啉和0.1%的β-巰基乙醇。

儲存：4℃避光保存。

危害：Tris飽和酚有較強的腐蝕性，應盡量避免皮膚直接接觸或吸入體內。如發現變為黃色或棕色，表明發生氧化，不能使用。10.氯仿（三氯甲烷）

作用：蛋白質變性劑，加速有機相與液相分層，去除核酸溶液中的跡量酚。商品信息：瓶/500ml。

理化性質：無色透明重質液體，極易揮發，有特殊氣味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。儲存：保存在密封的棕色瓶中。

危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空氣逐漸被氧化生成劇毒的光氣。11.異戊醇

作用：減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩定。商品信息：瓶/500ml。

理化性質：無色液體，有不愉快的氣味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有機溶劑。

儲存：儲存于陰涼、通風的庫房。遠離火種、熱源。庫溫不宜超過30℃。保持容器密封。應與氧化劑、酸類等分開存放，切忌混儲。采用防爆型照明、通風設施。禁止使用易產生火花的機械設備和工具。儲區應備有泄漏應急處理設備和合適的收容材料。

危害：吸入、口服或經皮膚吸收有麻醉作用。其蒸氣或霧對眼睛、皮膚、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神經系統功能紊亂，長時間接觸有麻醉作用。易燃，其蒸氣與空氣可形成爆炸性混合物，遇明火、高熱能引起燃燒爆炸。12.無水葡萄糖

作用：ACD抗凝血劑成分之一。商品信息：500g/瓶。

理化性質：無色結晶或白色結晶性粉末；無臭、味甜。水中易溶，在乙醇中微溶。儲存：無水葡萄糖易吸水結塊，因此應密封保存。危害：無。

五、實驗試劑 1.75%的乙醇

{75ml + 25ml水} → 100ml75%的乙醇

2.ACD抗凝劑 100ml（共需48ml，每管0.8ml）

{檸檬酸0.48g + 檸檬酸鈉1.32g + 葡萄糖1.47g} →加水至100ml，滅菌后備用。3.禽血裂解液 100ml（共需51ml，每管1.7ml）

{尿素12g + SDS 1g + 1M Tris-HCl(PH8.0)10ml + 0.5M EDTA(PH8.0)20ml} →加水定容至100ml，備用。

【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {水80ml + EDTA-2Na 18.61g} →用NaOH（約2g）調至PH8.0 →定容至100ml →分裝后高壓滅菌備用。注：需加入NaOH調至PH8.0才能完全溶解。4.氯仿-異戊醇（24:1）共需54ml，每管1.8ml {氯仿 96ml + 異戊醇 4ml} = 100ml，4℃保存

5.酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）共需60ml，每管2ml {氯仿-異戊醇（24:1）40ml + Tris飽和酚40ml} = 80ml，4℃保存 6..TE緩沖液 PH8.0 50ml {10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液 0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml} → →定容到50ml →高壓滅菌后冷卻4℃保存 【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {水 80ml + EDTA-2Na 18.61g} →用NaOH（約2g）調至PH8.0 →定容至100ml →分裝后高壓滅菌備用。注：需加入NaOH調至PH8.0才能完全溶解?！?0mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液】的配制：10ml {1M Tris-HCl PH8.0緩沖液100μl + 水9.9ml} →定容至10ml → 10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液

六、實驗步驟

1.采用翅靜脈采血，抽取血液5mL，溶于20mL 75%的乙醇中，振蕩混勻，配成家雞血樣25ml（酒精：血＝4：1）目的：乙醇可以抑制DNA水解酶的活性，防治DNA降解，并且75%有防止血液凝固的作用。75%乙醇效果比無水乙醇效果好，血樣不至于太干澀。酒精:血(4:1)混合的血樣保存時間長，可達4個月。

2.取血樣(酒精:血＝4:1)680(L至5mL離心管中，8000轉離心1分鐘，棄上清； 目的：去除血樣中大部分的乙醇，保證后面蛋白酶K的活性。

3.加800(LACD搖勻，8000轉離心1分鐘，棄上清；再加800(LACD搖勻，8000轉離心1分鐘，棄上清；

目的：ACD抗凝劑可以螯合血液中的鈣離子，防治血細胞凝集成團凝固，影響血細胞的破碎和對血細胞里DNA的提取。多次離心可以去除血樣中的乙醇，保證后面蛋白酶K的活性。4.加1700(L裂解液，10(L蛋白酶K（100(g），搖勻，55℃水浴保溫過夜； 目的：DNA裂解液的作用是破壞細胞膜、核膜,并使組織蛋白與DNA分離，抑制細胞中DNase的活性；而蛋白酶k的作用是將蛋白質降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來，蛋白酶k還可以消化DNAse，提高DNA產量。55℃水浴保溫過夜可以讓蛋白酶K充分發揮作用。

5.加2mL飽和酚，搖勻至無塊狀物，12000轉離心10分鐘；

目的：飽和酚是強蛋白質變性劑，可以將蛋白質及降解后的產物充分變性，變性后的蛋白質溶解度減低，易沉淀。

6.吸取上層透明的DNA溶液至另一5mL離心管中，注意不要攪拌下層的酚－蛋白層；

目的：加入飽和酚后溶液分層，上層是透明的DNA溶液，再往下是變性的蛋白質，飽和酚的比重最大在最下層。

7.加2mL酚-氯仿-異戊醇（25：24：1），搖勻至懸浮液，12000轉離心10分鐘； 目的：加入酚-氯仿-異戊醇進一步去除DNA溶液中的殘留蛋白質。

8.吸取上層DNA液于另一5mL離心管中，加1.8mL氯仿-異戊醇溶液，搖勻，12000轉離心10分鐘； 目的：由于酚與水有部分混溶，DNA水溶液中會混有部分酚，由于氯仿和酚互溶而不溶于水，用氯仿-異戊醇在抽提一次可以把酚帶走。

9.吸取上層DNA液900(L于另一5mL離心管中，加無水乙醇至滿，顛倒混合，試管中出現白色團塊，即是DNA；

目的：DNA水溶液是DNA以水合狀態穩定存在，當加入乙醇時，乙醇與DNA不相溶但與水相溶，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合收集。用無水乙醇的目的是乙醇中如果含有水，DNA會部分溶于水中，降低DNA沉淀的產量。

10.吸出試管中的無水乙醇，加75%的乙醇，混合，吸出75%的乙醇，重復2次；

目的：像前面步驟中加入的抗凝血劑中的檸檬酸鈉、葡萄糖，裂解液中的SDS、EDTA-2Na，在氯仿及醇中的溶解度低，經乙醇沉淀后的DNA中會有以上雜質存在。以上雜質有個共同的特征就是都易溶于水，故用75%的乙醇洗滌，可以利用其中的15%的水溶解這些雜質除去。11.將DNA自然晾干后溶入1000(L TE緩沖液，-20℃保存；

目的：乙醇已揮發除去，TE緩沖液一可以抑制Dnase活性，二維持一定堿性PH值，有助于DNA的溶解和穩定。

七、實驗注意事項

1.在整個實驗過程中應嚴格執行無菌操作； 2.部分藥品有毒，操作中應注意安全防護；

3.剛投入水浴時可以稍快速的晃動，之后的晃動一定要輕柔； 4.抽提時不要有太力振動，操作也要仔細，盡量避免DNA斷裂；

5.吸出試管中的無水乙醇時用的槍頭一定要剪過的，這點很重要，過尖的槍頭會把DNA鏈弄斷。

八、思考題

1.本實驗中幾次用到的不同濃度乙醇的作用是什么？

九、實驗安排

全班55人，按照學號分組，每6人一組，共9組，最后一組7人。每組作3個離心管，共用一個研缽。

每3組（共18人9個離心管）共同進行離心操作。

第三篇：實驗四 植物RNA的提取及其電泳鑒定2

實驗四 植物RNA的提取及其電泳鑒定

一、原理植物細胞內含有細胞質RNA、細胞核RNA和細胞器RNA。細胞質RNA包括mRNA、rRNA、tRNA。細胞核RNA主要有細胞質RNA的前體及小分子細胞核RNA(snRNA)、染色質RNA(chRNA)等。細胞器RNA主要指線粒體RNA及葉綠體RNA。這些RNA統稱細胞總RNA，其中大量的是rRNA，占80％左右?；蜣D錄產物mRNA在總RNA中只占1％～5％。不同的mRNA在分子大小、核苷酸序列，以及在細胞內轉錄水平等方面各不相同，但真核細胞mRNA 3ˊ末端都具有20～200個不等的多聚腺苷酸的尾，稱為poly(A)結構。利用poly(A)結構可以把mRNA從總RNA中分離出來。對于Northern雜交可以使用植物細胞總RNA，也可以使用由總RNA中分離出的mRNA。

植物細胞RNA提取中的主要問題是防止RNA酶的降解作用。RNA酶是一類水解核糖核酸的內切酶，它與一般作用于核酸的酶類有著顯著的不同，不僅生物活性十分穩定，耐熱、耐酸、耐堿，作用時不需要任何輔助因子，而且它的存在非常廣泛，除細胞內含有豐富的RNA酶外，在實驗環境中，如各種器皿、試劑、人的皮膚、汗液、甚至灰塵中都有RNA酶的存在。因而，生物體內源、外源RNA酶的降解作用是導致RNA提取失敗的致命因素。

內源RNA酶來源于材料的組織細胞，提取自始至終都應對RNase活性進行有效抑制。RNA提取過程中將蛋白質變性劑與RNase抑制劑聯合使用效果較理想。蛋白質變性劑包括酚、氯仿、SDS、Sarkosyl(十二烷酰肌氨酸鈉)、DOC(脫氧膽酸鈉)、鹽酸胍、異硫氰酸胍、4—氨基水楊酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉等；RNA酶抑制劑有RNasin(RNase阻抑蛋白)、氧釩核糖核苷復合物等。

外源RNA酶的抑制主要是使用DEPC(焦碳酸二乙酯C2Hs-O-CO-O-CO-O-CxH5)，它能與RNase分子中的必需基團組氨酸殘基上的咪唑環結合而抑制酶活性，用于水、試劑及器皿的RNase滅活。DEPC與肝素合用效果增強，值得注意的是DEPC在Tris溶液中很不穩定，很快分解成CO2 及C2H5OH，因而不能用于Tirs溶液的RNase滅活。水及其它溶液的滅活一般使用0.05％～0.1％DEPC，37℃處理過夜，也有人采用磁攪0.5小時以上的做法。DEPC處理后的溶液還需高壓滅菌，以去除殘存的DEPC。若DEPC去除不凈，會破壞mRNA活性。不能高壓滅菌的試劑要使用經過DEPC處理的滅菌蒸餾水配制，然后用0.22μm 濾膜過濾。含有Tris的試劑用經DEPC處理過的水配制，再經高壓消毒。玻璃器皿可以在180℃烘烤8小時以上，不能烘烤的器皿用0.1％的DEPC水處理過夜后再高壓滅菌。

提取全過程必須在清潔無塵的環境中進行。操作人員要使用一次性的手套拿取物品，盡可能避免一切污染機會。提取時使用的器皿應經過硅烷化處理，以防止RNA被吸附在器皿壁上，造成損失。RNA電泳使用的電泳槽需用去污劑洗滌，水沖洗，乙醇干燥。再浸入3％ H202溶液中，室溫下放置10分鐘以上，再用DEPC溶液處理過的水沖洗干凈?？傊?，實驗中所用的試劑、器皿都要經過RNase滅活處理。盡管如此，有時還會出現在提取的后期RNA被降解的問題。這是因為RNase活性的抑制只是一個暫時的現象，一旦抑制劑濃度下降RNase就有可能恢復活性。對于RNA提取來說，這是一個潛伏的危險。在提取的前階段，提取液中無疑是有足夠的抑制劑，但到了提取后期，抑制成分逐漸減少，殘存的RNase就會復活而引起RNA降解。另外，提取后期發生的RNase污染，那怕是極輕微的，也會使到手的產品降解，因而提取后期要更加小心。

影響植物RNA提取的另一個問題是水溶性的細胞代謝物如酚、多糖等易與RNA結合成膠凍狀的不溶物或有色的復合物，它們能影響RNA的質量及產量。人們采用了多種處理方法來解決這個問題，如對組織提取液進行高速離心去除多糖；采用低pH值的提取緩沖液抑制酚的解離及氧化；或用β—巰基乙醇、PVP來抑制酚類的干擾等。

（一）總RNA的提取

用于研究基因表達的總RNA提取時首先要考慮的問題是材料的選取及預處理。由于基因表達與生理狀態密切相關，因而取材時必須考慮材料的生理狀態，必要時還要對材料進行預處理，即施加某種因素，誘導目的基因表達，如進行光照、暗處理、或加入誘導物等。

材料的破碎與植物細胞總DNA的提取相同，采用液氮冷凍及在液氮中研磨。預處理過的材料要盡早地投入到液氮中，投入前要盡可能保持材料完整及新鮮，不要讓材料壓碎及破損。因為植物材料在破損時會引起多酚類物質的積累及氧化，使組織變褐而影響RNA分離。細胞膜裂解也與DNA提取相同，主要使用SDS或Sakosyl、酚等。

由于細胞內RNA主要以核蛋白體形式存在，所以總RNA提取的路線是細胞破碎，使核蛋白體從細胞內釋放；采用使蛋白質變性的做法，令核蛋白體解析，RNA迅速與蛋白質分離，大量地釋放到溶液中；然后用酚、氯仿有機溶劑抽提，去除蛋白質雜質，使核酸進入水相；再選擇性沉淀RNA，使之與DNA分離；所得RNA再進行必要的純化，最后用乙醇或異丙醇沉淀RNA。

至于植物細胞總RNA的提取方法，同植物總DNA提取一樣，沒有一種固定的通用方法。文獻中報導的植物細胞總RNA的提取方法很多，但綜合起來看，分離的主要依據不外乎如下幾點：① 用酚及去污劑SDS或Sakosyl破碎細胞膜并去除蛋白質；② 酚、氯仿反復抽提純化核酸；③ LiCl選擇性沉淀去除DNA及其它不純物；④ 3mol／L乙酸鈉(pH6)沉淀RNA，DNA在上清液中；⑤ CsCl密度梯度離心，去除多糖等雜質，純化RNA。

目前用于Northern 雜交植物總RNA提取方法根據主要試劑可分為苯酚法、異硫氰酸胍（或CTAB）法及氯化鋰沉淀法：

1、苯酚法：該法利用苯酚協助破碎細胞；酚／氯仿變性蛋白質并反復抽提核酸；3mol／L乙酸鈉選擇沉淀RNA；提取液中使用4—氨基水楊酸及三異丙基萘磺酸鹽抑制RNase活性。該方法操作簡單、經濟，可用于從植物葉、莖、根及萌發幼苗中提取總RNA或核RNA。

2、異硫氰酸胍法：異硫氰酸根及胍離子都是很強的蛋白質變性劑。異硫氰酸胍與十二烷基肌氨酸鈉合用可使核蛋白體迅速解體；與還原劑β—巰基乙醇合用能強烈抑制RNase 活力，因而是制備RNA的一種常用試劑。

傳統的異硫氰酸胍法需利用CsCl離心分離RNA(沉到管底)。這種做法操作時間長、設備要求高。經改進，目前使用的方法使操作大大地簡化，并可同時提取多個樣品。做法是將異硫氰酸胍、β—巰基乙醇、十二烷基肌氨酸鈉三者合用，強有力抑制了RNA降解，增加了核蛋白體的解離，將大量的RNA釋放到溶液中，然后用酸性酚進行抽提，既可保證RNA穩定，又可抑制DNA解離，使DNA與蛋白質一起沉淀，RNA被抽提進入水相，用異丙醇沉淀RNA后，經酚／氯仿再次抽提進行純化。該方法提取的RNA 用于Northern 雜交可以得到滿意結果。

3、氯化鋰沉淀法：該方法的主要原理是在一定的pH條件下，Li+使RNA發生特異性沉淀，通過多級沉淀可提高RNA的純凈度。利用氯化鋰選擇性沉淀時，因提取緩沖體系不同有多種不盡相同的氯化鋰法，有的使用硼酸緩沖液，加入還原劑二硫蘇糖醇抑制RNase活性，用SDS變性核蛋白；有的使用Tris—HCl緩沖體系，用苯酚及蛋白酶K處理蛋白；還有的使用高濃度尿素變性蛋白質同時抑制RNase。氯化鋰沉淀法雖也有效，但沉淀過程較為繁瑣，并存在著Li+的污染問題。

（二）mRNA的分離

從總RNA中分離mRNA主要是利用親和層析的原理。植物mRNA的3ˊ—端具有poly(A)結構，可用oligo(dT)—纖維素(寡聚(dT)—纖維素)或Poly(U)—Sepharse(多聚(U)—瓊脂糖)親和層析技術來純化mRNA?？俁NA在流經寡聚(dT)—纖維素層析柱時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA 3／—端多聚(A)殘基與連接在纖維素柱上的寡聚(dT)殘基間配對，形成氫鍵，使mRNA被吸附在柱上。不具poly(A)結構的RNA，不能發生特異性結合而從柱中流出。結合在柱上的mRNA可以用低鹽緩沖液或蒸餾水洗脫。因為在高鹽溶液中堿基間的氫鍵穩定，在低鹽狀態下易解離，水打破poly(A)與(dT)間的氫鍵，使mRNA洗脫。

層析中涉及到的緩沖液有兩種，一是上樣緩沖液，也有人稱結合緩沖液。各文獻報道的結合緩沖液都由Tris·C1、EDTA、氯化物鹽類及去污劑組成。不同之處是有的使用0.5mol/L的NaCl、有的使用0.5mol／L的LiCl。不管使用哪種鹽，都為高濃度，以促進poly(A)與寡聚(dT)結合。第二種是洗脫緩沖液，除Tris、去污劑的濃度減半外(也有Tris 量不減半的)，最大的變化是不含氯化物或含低濃度的LiCl。其作用是解除Poly(A)與寡聚(dT)的結合，使mRNA洗脫下來。

在沒有特制的層析柱時，可以用無菌硅化的巴斯德吸管或lml的注射器做層析柱，出口端用無菌硅烷化過的玻璃纖維填充。寡聚(dT)纖維素用上樣緩沖液懸浮后裝柱。柱體積在0.25ml左右。裝柱后用0.1mol/L 的NaOH 洗柱，上樣緩沖液平衡。RNA的樣品量一般在2~5mg，體積為lml左右。上樣前樣品要經過變性處理，置沸水浴中加熱數分鐘后立即置冰浴中。上樣后就要立即收集流出液，這時流出液中可能含有一些未能與纖維素結合的mRNA。將流出液加熱至65℃維持6~7分鐘，然后快速冷卻再重新上樣，如此反復多次，以使mRNA充分被吸附在纖維素柱上，用5~10倍體積的結合緩沖液洗柱，這時rRNA、tRNA 等逐漸被冼脫，而mRNA掛在柱上。洗脫至流出液的OD260值幾乎為零，換用低鹽的洗脫緩沖液洗脫mRNA，部分收集器收集，測定每管中的mRNA濃度，合并含mRNA的洗脫液，用乙醇沉淀mRNA，于-70℃保存。

（三）RNA樣品質量檢測

用于Northern雜交的RNA樣品應是純凈的，無明顯的DNA、蛋白質污染，無小分子有機物復合，無提取試劑的污染。分子完整，無嚴重降解。同DNA樣品質量檢測相同，主要有紫外吸收法及瓊脂糖凝膠電泳法兩種。

1、紫外吸收法

① 純度檢測：在分光光度計上分別測定樣品在230nm、260nm、280nm的吸收值，計算A260/A280及A260／A230的比值。純凈的RNA樣品A260/A280的比值應在1.7~2.0之間，若小于1.7則表明樣品中有蛋白質或酚試劑污染。此時，可用等體積的酚／氯仿重新抽提去除蛋白質；用氯仿、乙醚抽提去除殘酚。在抽提過程中RNA損失較大(約60％)。A260/A230的比值應大于2.0，如小于2.0則表明RNA被異硫氰酸胍污染。這時可以通過乙醇或異丙醇重新沉淀(可反復幾次)來去除。關于DNA雜質的存在與否紫外分光光度法不能予以明確說明。

② 濃度測定：純凈的RNA樣品(無DNA及核苷酸雜質)260nm的光吸收值等于1.0時，RNA的含量為37 μg/m1。根據此吸收值與濃度的關系可求出任一RNA樣品的濃度。

RNA含量(μg／m1)＝A × 稀釋倍數× 37 μg／m1 當對含量要求不十分精確時，可近似認為A260=1.0 時的RNA濃度為40μg/m1。測定時如果按如下做法可使計算簡化：取4μl RNA樣品，加蒸餾水至lml，以蒸餾水或TE為空白測定A260值，該數值× 10 即為樣品RNA濃度(μg/μl)。

2、瓊脂糖凝膠電泳法

由于RNA分子結構與DNA不同，因而RNA電泳時有著與DNA電泳的不同之處。因RNA為單鏈分子，鏈內配對堿基很易通過氫鍵結合而形成二級以至三級結構。不同的RNA分子空間結構不同，因而RNA分子在未變性的條件下分子量與泳動率無嚴格的相關性。在變性條件下電泳，破壞RNA的空間結構，才能使RNA的泳動距離與其分子量對數值成正比。變性后的RNA泳動速度比天然RNA小1/2左右。在不需要測定RNA分子量時，使用濃度1.0％~1.4％的非變性瓊脂糖凝膠也可將不同的RNA分子分離。當需要對所提取的RNA樣品進行快速檢測時可使用非變性膠。

總RNA樣品中的主要成分是28S的rRNA、18S的rRNA及5SrRNA。電泳后在膠板上呈現三條明顯的條帶。在上樣量小時，5SrRNA的條帶有時顯示不清。若在變性膠上，這三條帶的遷移率分別與5.1kb、2.0kb 及0.12kb 的標準RNA的遷移率相近。從量上看，溴化乙錠染色后28SrRNA條帶的亮度應為18SrRNA的兩倍。如果28SrRNA的亮度不如18SrRNA條帶，表明樣品中RNA有降解。發生降解的原因主要是RNase滅活不好，或操作中溫度過高。防止的方法是操作全過程在4℃低溫條件下或冰上進行。操作中一次性手套要經常更換，盡量避免RNase污染。

二、植物總RNA的提取方法

（三）TRIZOL法小量提取RNA（Invitrogen Co.）

1、于1.5ml離心管中加入1ml TRIZOL提取液；

2、稱取0.1g液氮研磨后的材料，轉移到提取液中，漩渦振蕩混勻，15-30℃靜置5min； 3、4℃，12000g，離心10min；取上清；

4、加0.2ml氯仿，劇烈搖動15sec，15-30℃放置2-3min，4℃，12,000g，離心15 min；

5、取水相，加0.25ml異丙醇，0.25ml高鹽溶液，顛倒混勻，15-30℃放置10min，4℃，12,000g離心10 min，去上清；

6、用1ml冰預冷的75％乙醇洗滌沉淀，漩渦振蕩，4℃，7500g離心5min；

7、真空泵吸除乙醇，用DEPC-ddH2O溶解RNA，55-60℃溶解10min，迅速冰浴，稍離心

8、-20℃短時間保存，-80℃保存長期保存。

高鹽溶液（100mL）：0.8M檸檬酸鈉 23.528g；1.2M NaCl 7.013g

三、RNA電泳檢測

在含有甲醛的凝膠上進行的RNA電泳應小心，甲醛蒸氣有毒，含有甲醛的溶液應在化學通風櫥內配制，含甲醛溶液的電泳槽應盡可能蓋嚴。操作步驟如下：

1、配制5×甲醛凝膠電泳緩沖液：0.1M MOPS（pH7.0）；40mM 乙酸鈉；5mM EDTA（pH8.0）

將20.6g 3-（N-瑪琳代）丙磺酸（MOPS）溶于800ml經用DEPC處理的50mM乙酸鈉溶液。用2M氫氧化鈉將溶液的pH值調至7.0，加10ml經用DEPC處理的0.5M EDTA(pH8.0)，在加經用DEPC處理的水至溶液總體積為1L。上述溶液經用0.2μm微孔濾膜過濾除菌，避光保存于室溫。光照或高壓后溶液逐漸變黃，淡黃色的緩沖液可正常使用，而深黃色緩沖液則不然。

2.、制備凝膠

將適量瓊脂糖溶于水（1%），冷卻至60℃，加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液和甲醛至終濃度分別為1×和2.2M（將12.3M甲醛貯存液、瓊脂糖水溶液和5×甲醛凝膠電泳緩沖液按1:3.5:1.1比例混合即可）。再化學通風櫥內灌制凝膠，于室溫放置30分鐘或更長時間，使凝膠凝固。

3、在一滅菌的1.5ml離心管內混合下列液體，以制備樣品：RNA（30μg）

4.5μl；5×甲醛凝膠電泳緩沖液

2.0μl；甲醛

3.5μl；甲酰胺

10.0μl 于65℃溫育15分鐘，冷浴冷卻，離心5秒鐘使管內所有液體集中于管底。每一泳道至多可分析30μg RNA，通常用10-20μg細胞總RNA進行Northern雜交，可以檢測高豐度mRNA（占mRNA總量的0.1%以上）。許多批號的試劑級甲醛溶液已足夠純，不需經過任何預處理即可直接使用。但如果甲醛溶液呈黃色，需在溶液中加入Dowex XG8混合床樹脂置磁力攪拌器上攪拌1小時，再用Whatman1號濾紙過濾2次，進行去離子甲醛應分裝成小份，充氮保存于-70℃。

4、加2μl滅菌的并經用DEPC處理的甲醛凝膠加樣緩沖液。

甲醛凝膠加樣緩沖液：50% 甘油；1mM EDTA（pH8.0）；0.25% 溴酚藍；0.25% 二甲苯青FF；

5、加樣前，將凝膠預電泳5分鐘，電壓降為5V/cm，隨后將樣品加至凝膠加樣孔。可用已知大小的RNA作為分子量標準參照物，如用18S和28SrRNA或者9S兔β-珠蛋白mRNA，這些RNA的長度分別為6333、2366和710個核苷酸。也可以從BRL購置已知大小的RNA的混合物作為分子量標準參照物。通常分子量標準參照物的泳道位于凝膠邊緣，便于電泳后將其切去進行溴化乙錠染色，可能的話在分子量標準參照物以及欲轉移至硝酸纖維素濾膜或尼龍膜的樣品之間留一個空白泳道。

6、將凝膠浸入1×甲醛凝膠加樣緩沖液中，3-4V/cm電壓降進行電泳。電泳緩沖液不需進行持續循環，電泳1-2小時后，收集并混合兩個液槽的緩沖液，再加入電泳槽中，即可繼續電泳。

7、電泳結束后（溴酚藍遷移出約8cm），切下分子量標準參照物的凝膠，浸入溴化乙錠溶液（0.5μg/ml,用0.1M乙酸銨配制）中染色30-45分鐘。在凝膠旁放置一透明尺，在紫外燈下照像。測量照片上每個RNA條帶至加樣孔的距離，以RNA片段大小的1g對數值對RNA條帶的遷移距離作圖，用所得曲線計算從凝膠轉移到固相支持物后通過雜交所檢出的RNA分子的大小。

小心：溴化乙錠是一種強烈的誘變劑并有中度毒性，使用含有這種染料的溶劑時應戴手套，用后應進行凈化處理。紫外線照射有危害，對眼睛尤甚。為盡量避免受到照射② RNA沉淀未完全溶解

2、A260/A280<1.65。可能的原因是：

① 檢測吸光度時，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高② 樣品勻漿時加的試劑量太少③ 勻漿樣品時未在室溫放置5分鐘④ 吸取水相時混入了有機相⑤ RNA沉淀未完全溶解

3、RNA降解。可能的原因是：① 組織取出后沒有馬上處理或冷凍② 待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃③ 細胞在用胰酶處理時過度④ 溶液或離心管未經RNase去除處理⑤ 電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5

4、DNA污染。可能的原因是：① 樣品勻漿時加的試劑量太少 ② 樣品中含有有機溶劑（如乙醇，DMSO等），強緩沖液或堿性溶液

五、植物RNA提取過程中難點的相應對策

（一）酚類化合物的干擾及對策：

許多植物組織特別是植物的果實（如蘋果、櫻桃、李子、葡萄等）和樹木類植物中富含酚類化合物。酚類物質的含量會隨著植物的生長而增加。因而從幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，針葉類植物的針葉中多酚的含量比在落葉植物的葉子中要高得多。在植物材料勻漿時，酚類物質會釋放出來，氧化后使勻漿液變為褐色，并隨氧化程度的增加而加深，這一現象被稱為褐化效應（browning effect）。被氧化的酚類化合物（如醌類）能與RNA穩定地結合，從而影響RNA的分離純化。但Newbury等發現RNA提取的難易程度與材料中酚類物質的總量之間并無相關性，因此認為不是所有的酚類化合物都影響RNA的提取。但一般認為所謂的“縮合鞣質”即聚合多羥基黃酮醇類物質（如原花色素類物質）是影響RNA提取的一類化合物。目前去除酚類化合物的一般途徑是在提取的初始階段防止其被氧化，然后再將其與RNA分開。

1、防止酚類化合物被氧化的方法：

① 還原劑法：一般在提取緩沖液中加入(-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）或半胱氨酸來防止酚類物質被氧化，有時提取液中(-巰基乙醇的濃度可高達2％。(-巰基乙醇等還可以打斷多酚氧化酶的二硫鍵而使之失活。Su等認為在過夜沉淀RNA時加入(-巰基乙醇（終濃度1％）可以防止在此過程中酚類化合物的氧化。硼氫化鈉（NaBH4）是一種可還原醌的還原劑，用它處理后提取緩沖液的褐色可被消減，醌類化合物可被還原成多酚化合物。

② 螯合劑法：螯合劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很強的結合多酚化合物的能力，其結合能力隨著多酚化合物中芳環羥基數量的增加而加強。原花色素類物質中含有許多芳環上的羥基，因而可以與PVP或不溶性的PVPP形成穩定的復合物，使原花色素類物質不能成為多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步驟中被除去。用PVP去除多酚時pH值是一個重要的影響因素，在pH8.0以上時PVP結合多酚的能力會迅速降低〔11〕。當原花色素類物質量較大時，單獨使用PVPP無法去除所有的這類化合物，因而需要與其它方法結合使用。

③ Tris-硼酸法：如果提取緩沖液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以與酚類化合物依*氫鍵形成復合物，從而抑制了酚類物質的氧化及其與RNA的結合。這一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取緩沖液中不再加入其它還原劑。但如果Tris-硼酸濃度過高（＞0.2M）則會影響RNA的回收率。

④ 牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素類物質與BSA間可產生類似于抗原－抗體間的相互作用，形成可溶性的或不溶性的復合物，減小了原花色素類物質與RNA結合的機會，因此提高了RNA的產量。BSA與PVPP結合使用提取效果會更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用時要加入肝素以抑制RNase的活性。

⑤ 丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷凍研磨后的植物材料，可以有效地從云杉、松樹、山毛櫸等富含酚類化合物的植物材料中分離到高質量的RNA。

2、酚類化合物的去除：

通過Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以將未被氧化的酚類化合物去除。與PVP、不溶性PVPP或BSA結合的多酚，可以直接通過離心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提時除去。Manning利用高濃度的2-丁氧乙醇（50％）來沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50％ 2-丁氧乙醇的緩沖液洗滌RNA沉淀以去除殘留的多酚。他認為即使多酚被氧化，其氧化產物仍可以溶解在高濃度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，無需再用NaBH4來處理。

（二）多糖的干擾及對策：

多糖的污染是提取植物RNA時常遇到的另一個棘手的問題。植物組織中往往富含多糖，而多糖的許多理化性質與RNA很相似，因此很難將它們分開。在去除多糖的同時RNA也被裹攜走了，造成RNA產量的減少；而在沉淀RNA時，也產生多糖的凝膠狀沉淀，這種含有多糖的RNA沉淀難溶于水，或溶解后產生粘稠狀的溶液。由于多糖可以抑制許多酶的活性，因此污染了多糖的RNA樣品無法用于進一步的分子生物學研究。在常規的方法中，通過SDS-鹽酸胍處理可以部分去除一些多糖；在高濃度Na+或K+離子存在條件下，通過苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通過LiCl沉淀RNA也可以將部分多糖留在上清液中。但即使通過這些步驟仍會發現有相當多的多糖與RNA混雜在一起，所以還需要用更有效的方法來解決植物RNA分離純化時多糖污染的問題。

用低濃度乙醇沉淀多糖是一個去除多糖效果較好的方法。在RNA提取液或溶液中緩慢加入無水乙醇至終濃度10％～30％，可以使多糖沉淀下來，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的勻漿液中加入乙醇，如Lewinsohn等在從裸子植物的木質莖中提取RNA時，在勻漿上清液中加入乙醇至終濃度10％以沉淀多糖。但Tesniere等在從葡萄漿果組織中提取RNA時，是在用CsCl超離心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入終濃度30％乙醇來沉淀多糖的，進一步純化了RNA樣品。

另一個常用的方法是醋酸鉀沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉組織的RNA時在勻漿上清液中加入1/3體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液以沉淀多糖；Ainsworth在提取酸模植物花組織的RNA時加入的是1/5體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花葉和花粉的RNA時是加1/3體積的8.5M醋酸鉀（pH6.5）溶液到勻漿液中以除去多糖等雜質。在提取某些植物材料的RNA時，是將上述兩種方法結合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA時，是在勻漿液中加入0.25體積的無水乙醇和0.11體積的5M醋酸鉀溶液以去除多糖雜質。Su等在去除褐藻的多糖時，單獨使用乙醇或醋酸鉀都無效，只有兩者結合使用效果最佳。Fang等認為緩沖液中含有高濃度的NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松樹RNA時，緩沖液中NaCl的濃度為2.0M和1.0M，通過氯仿抽提和乙醇沉淀RNA將RNA與多糖分離。Manning是將胡蘿卜種子等材料苯酚提取后的上清液稀釋，調節Na+離子濃度至80mM，然后加入0.4體積的2-丁氧乙醇來沉淀去除多糖。

（三）蛋白雜質的影響及對策：

蛋白質是污染RNA樣品的又一個重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦屬于蛋白質，因而要獲得完整的、高質量的RNA就必須有效地去除蛋白雜質。常規的方法是在冷凍的條件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取緩沖液中含有蛋白質變性劑，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等，這樣在勻漿時可以使蛋白質變性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K來降解蛋白雜質。進一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白質。

Wilcockson利用蛋白質與RNA在高氯酸鈉溶液中的溶解度不同將它們分離。在70％高氯酸鈉溶液中，RNA的溶解度大于蛋白質的溶解度，因而將大部分蛋白質沉淀下來。接著在離心上清液中加入兩倍體積的無水乙醇，這時RNA能沉淀下來而能溶于70％高氯酸鈉溶液中的殘留蛋白質仍然留在上清液中。這樣可以除去絕大部分的蛋白質。

（四）次級代謝產物的影響及對策：

從植物組織中提取高質量RNA的另一個難點是許多高等植物組織尤其是成熟組織能產生某些水溶性的次級代謝產物，這些次級代謝產物很容易與RNA結合并與RNA共同被抽提出來而阻礙具有生物活性的RNA的分離。因不能確定這些次級產物具體是什么物質，所以，目前還沒有什么特殊的方法來解決這個問題。Baker等綜合Hughes等的選擇性沉淀法、Chirgwin的氯化銫梯度離心法和Iversen等的RNA回收方法純化了松樹種子、成熟松樹針葉等植物組織的RNA。

由于植物組織特別是高等植物組織細胞內外組成成分的復雜多樣性，使得植物組織RNA的提取相對于其它生物材料來說要困難的多。實踐中經常會發現，即使同一種植物的不同組織其RNA提取方法會有很大的不同；含有某種干擾因素的不同植物材料，其適用的RNA提取方法可能不同；即使是同一種植物同一種組織材料，但來源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一樣。所以，對于某一植物或其組織來說，其相應的RNA提取方法必需經過摸索和實踐才能確立。

隨著植物分子生物學研究領域的拓寬，可以肯定地說，在作為其研究基礎的植物材料RNA提取過程中還會出現新的難點，但隨著不斷地探索和經驗的積累，科學工作者們一定會迅速地解決這些難點，為植物分子生物學的發展鋪平道路。

思考題

1、RNA純化過程中如何避免RNA酶的污染？

2、如何檢測已純化RNA的質量？

第四篇：DNA提取問題集

DNA提取問題集

默認分類 2009-12-31 18:59:50 閱讀155 評論0字號：大中小

提取植物DNA時遇到多糖成分的干擾，DNA質量一直不高，如何消除多糖的影響？ 參考見解：一般來說，SDS法提取的DNA會還有較多的多糖，使DNA成膠凍狀。而CTAB法提取可基本上除去多糖。如果是植物材料本身含糖量比較高，可用以下方法試一試：

1、在 DNA 未溶出之前，先用一些緩沖液洗去多糖。如可用緩沖液：100 mmol/LTris-HCl(pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol洗幾次。

2、使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍體積的無水乙醇，迅速混勻，多糖會先沉淀。

3、沉淀 DNA 時，使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入 1/2 體積的 5 mol/L NaCl，或加 NH4Ac 使終濃度為 10 mmol/L?；?0.5 mL DNA 液中加 0.12 5 mL 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13% PEG 8000（冰浴 1 h）。

4、多糖和 DNA 的共沉淀物進行再分離。如用 TE緩沖液反復清洗共沉淀 物，將清洗液合并再用醇沉淀 DNA，或將沉淀物溶解后，經瓊脂糖電泳，切下 DNA 部分再將膠回收，或者用多糖水解酶將多糖降解。還 有在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用而去除多糖。

上述方法還可組合使用，以達到最佳效果。然而這些方法均會在一定程度上減低 DNA 的提取量；如果材料較少或要求較高，則可考慮用柱層析方法，使用對 DNA 具有 特異性吸附的樹脂來純化 DNA。曾有文獻提到選用 Wizard Purification Kit，PRC-5 柱，Sephacryl S-1000 或 S-500，Qiagen Genomic tip 500/G，或者 CsCl 梯度離心純化 DNA。血樣4度保存了2月，現在按照酚常規提取方法不能提取出DNA，有什么解決辦法？ 參考見解：按照常規的酚/氯仿法不可能提不出來，下面是參考方法：

1、首先洗出白細胞，最好有1毫升以上血液。

2、加入5ml DNA提取緩沖液，(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混勻。

3、加入25ul 蛋白酶K ,使終濃度達到100ug/ml, 混勻，50℃水浴過夜。

4、用等體積的（酚，氯仿，異戊醇，25：24：1）混合物抽提一次，5000r/min，10min離心收集水相。

5、取水層，加入3倍體積-20℃預冷無水乙醇5000r/min，10min，75%乙醇5000r/min洗DNA，充分干燥將DNA溶于適量水中。

CTAB法提取水稻基因組DNA，TE 溶解后瓊脂糖膠電泳檢測，點樣孔附近有一條明顯的主帶。用MBI 公司產的限制性內切酶酶切過夜，鑒定時發現DNA已經被完全切爛，只在溴酚藍前存在微弱smear狀產物。換用NEB 公司產的酶，更換EP管，滅菌水之后重復幾次，結果還是如此。拿其他人的DNA 做對照，酶切結果正常。用異丙醇將DNA 重新沉淀，換了TE溶解，檢測主帶仍舊清晰，可是用酶切之后DNA還是被切爛。為什么？

參考見解：

1、公司的酶不行。

2、如做酶切，DNA最好不用異丙醇（因其不易揮發）而用無水乙醇沉淀。

3、酶量大或作用時間太長了。

建議重提DNA，取少許用超純水溶解（非TE），按照說明書進行酶切。要用新鮮樣品或液氮冷凍-70度保存的樣品。這樣通過降低內切酶的活性減少DNA的降解；

要得到全血基因組DNA，可以先用分層液密度梯度離心將淋巴細胞分離嗎？這樣做，與沉淀全血細胞然后破壞紅細胞得到的結果有何差異？ 參考見解：

1、覺得還是先分離細胞好，因為DNA和RNA大都是在細胞核內，有紅細胞反而不太好。從血里面提RNA，用淋巴細胞分離液先分離有核細胞的，效果還是不錯的。

2、現在提取全血的DNA,也就是提取淋巴細胞中的DNA，用密度梯度離心，只是富積淋巴細胞，能得到更多的DNA而已。一般如果DNA的量的要求不太多的話，沒必要。

3、如果對基因組的要求不高，可以試試這個方法。取EDTA-Na2抗凝血100μl加至1.5ml Eppendorf管中，加無菌重蒸水500μl；10 000r/分鐘離心3分鐘，棄凈上清；加20μl 5mol/L KI，旋渦振蕩30秒;0.9%NaCl 100μl,150μl氯仿/異戊醇(24∶1)，振蕩30秒；10 000r/分鐘離心5分鐘，吸上清100μl于另一Eppendorf管中，加異丙醇60μl，輕輕混勻，10 000r/分鐘離心5分鐘，棄上清；加冷無水乙醇1000μl，10 000r/分鐘離心5分鐘；棄去無水乙醇，37℃烤干；50μl無菌重蒸水或TE，混勻溶解備用。

從經福爾馬林處理后的組織標本中提取DNA可以嗎？

參考見解：可以的，國外有好多相關試劑盒，qiagen, roche等公司都有的。

100ml的大量提取，蛋白酶Ｋ是必需的嗎？它的作用是什么？用溶菌酶代替可以嗎？每次在用酚氯仿異戊醇抽提后，上層里面都是絮狀的蛋白質，離心幾次都沉淀不下來，請問是哪里出了問題？

參考見解：一般來說，蛋白酶的作用是將蛋白質消化成小的片段，促進核酸與蛋白質的分開，同時，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。而溶菌酶的作用是破壞微生物細胞壁，二者作用各異，不可替代。對于實驗中的蛋白問題，建議離心后先用竹簽挑出蛋白，小心吸取上層清液，再重復抽提幾次試試。

一般植物DNA提取的時候都不加蛋白酶K，這樣提出來的DNA鏈上的組蛋白等未被蛋白酶消化，不是很難除去嗎？那DNA是不是不純？可以用來酶切嗎？

參考見解：蛋白酶k的主要作用并不是消化組蛋白，而是消化細胞，在動物細胞DNA的提取也不加蛋白酶k也是可以的，植物細胞的較易破碎，不需要蛋白酶k的作用。protenase K作用：

1、消化組蛋白，釋放出DNA。

2、消化DNAse，提高DNA分子量。

建議還是加蛋白酶k為好，這樣提出來的 DNA分子量會高一點，且更純。提白粉孢子的總DNA，白粉孢子比較小，直接在研磨中加液氮研磨可以嗎？

參考見解：液氮研磨的方法應該可行的，做動物組織，植物組織多采用這種方法，植物纖維一樣可以用液氮研磨，要有耐心，邊加液氮邊研磨，研磨好后再抽提，應該是可以的。在CTAB法提取DNA時，有一些品種沒有DNA析出，是什么原因？ 參考見解：

1、用預冷的異丙醇來沉淀試試，同時研磨的時候要研的非常非常的細。

2、沒有看到析出物并不代表沒有沉淀，可以繼續下一步試驗，溶解的時候少加一點兒。

3、高離子強度下DNA與CTAB能形成共沉淀。可能DNA就這樣留在沉淀里了。提取DNA配方

CTAB為十六烷基三甲基溴化銨，CTAB提取緩沖液的經典配方

Tris-HCl(pH8.0)提供一個緩沖環境,防止核酸被破壞；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNase活性；

NaCl 提供一個高鹽環境,使DNP充分溶解,存在于液相中；

Cβ-巰基乙醇是抗氧化劑,有效地防止酚氧化成醌,避免褐變,使酚容易去除基因組DNA。

CTAB 4g

NaCl 16.364 g

1M Tris-HCl 20ml(PH8.0)

0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml滅菌

冷卻后0.2-1% 2-巰基乙醇（400ul）氯仿-異戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml異戊醇，搖勻即可。

提取內源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，怎樣更好的抑制內源核酸酶的活性？ 參考見解：在提取內源核酸酶含量豐富的材料的DNA時,可增加裂解液中螯合劑的含量,細胞裂解后的后續操作應盡量輕柔。

用試劑盒對農田土壤的的微生物群落DNA進行提取，雖然總DNA提出來了，可是用細菌的通用引物進行PCR的時候卻怎么也擴不出來，請有沒有什么好的辦法可以解決這個問題？

參考見解：環境特別是土壤的樣品成分復雜，尤其是有腐殖酸具有和DNA類似的性質，因此用一般的國內試劑盒無法提純。應當選用自制的提取方法，在裂解液中加入要加入PVP。洗滌后硅膠膜上仍有雜色殘留？

參考見解：細胞裂解不充分，裂解液和樣品要快速充分混勻。洗滌產物中DNA量很少或沒有？ 參考見解：

1、樣品中細胞或者病毒濃度低。

2、裂解液和樣品混合不均勻造成細胞的裂解不充分。

3、蛋白酶K活性下降造成細胞裂解的不充分。

4、溫浴時間不夠造成的細胞裂解不充分或蛋白降解不完全，盡量把組織切成小塊，延長溫浴時間，使裂解物中沒有顆粒狀物殘留。

5、在上柱前，裂解物中沒有加乙醇，或用低濃度乙醇代替無水乙醇。

6、DNA沒有有效洗脫，提高洗脫效率，可將離心柱在加入洗脫液后在室溫靜止至少1min，再離心。

7、洗脫液pH不合適，低pH值會減少DNA產率，確保洗脫液pH在7.0－8.5之間。8洗脫體積太大，超過200ul洗脫體積所得的DNA濃度會降低，但DNA總量不會減少。

第五篇：實驗二 植物核酸的提取-教案

授課教師 學生人數 55 課 題 實驗二 植物基因組DNA的提取 授課類型 新授課 授課方法 講授、演示 教學目的 掌握CTAB法提取植物基因組DNA的原理與方法 教學重點 理解每一步實驗操作的目的 教學難點 實驗操作過程中的一些注意事項 教學過程

一、背景知識

1.DNA在細胞中存在的位臵？植物細胞DNA存在的位臵和動物細胞有何不同？（圖）教學用具 多媒體

2.DNA的存在形式

雙螺旋結構圖

雙螺旋結構組成

染色體是怎樣形成的？

一級結構（核小體=雙螺旋+組蛋白）-二級結構（螺線管）-三級結構（超螺線管）-四級結構（染色體）

真核生物基因組DNA是經過四級包裝形成了染色體，先是DNA形成雙螺旋結構，再與組蛋白形成核小體（一級結構），壓縮7倍，再形成螺旋管（二級結構），壓縮6倍，之后再形成超螺旋管（三級結構），壓縮40倍，最后超螺旋管壓縮形成染色體（四級結構），再壓縮5倍，正常細胞中基因組DNA是以染色質（相當于一級結構）形式存在，在細胞分裂的中期以染色體形式存在，真核生物細胞質DNA主要是以裸露的環狀DNA形式存在，沒有核小體結構。

3.遺傳物質核酸除了DNA外還有另外一種，即RNA，它與DNA在結構上的區別？（圖）

RNA基本單位中間的五碳糖是核糖，含氮堿基尿嘧啶（U）替代 胸腺嘧啶（T）4.核酸的理化性質

（1）形狀：DNA為白色類似石棉樣的纖維狀物，RNA的純品呈白色粉末或結晶。

（2）溶解性：一般都溶于水，不溶于乙醇、異丙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水。（3）保存：在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶液中較穩定。

二、實驗目的

1.掌握CTAB法提取植物基因組DNA的原理 2.CTAB法提取植物基因組DNA的實驗方法

三、實驗原理

1.核酸在細胞中的存在方式，是以核酸-蛋白質復合物的形式存在，如一級結構核小體（圖）：DNA螺旋+組蛋白

2.通過低溫研缽破壞植物細胞壁

3.加入CTAB溶解細胞膜，CTAB與核酸形成核酸-CTAB復合物，使核酸與蛋白質分離。

4.加入高鹽溶液溶解核酸-CTAB復合物，加入蛋白質變性劑使蛋白質變性沉淀出來，離心除去蛋白質。5.加入核酸沉淀劑，溶解CTAB，并使和核酸沉淀出來，離心得到核酸沉淀。

四、實驗儀器 1.水浴鍋

2.離心機（12管）：3臺 3.研缽：10個

4.移液槍（包括槍頭）：1ml、400ul

五、實驗材料與藥品

實驗材料：新鮮菠菜葉片 1.十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）

作用：溶解細胞膜并與核酸結合，便于分離核酸。商品信息：瓶裝/100g。

理化性質：白色或淺黃色結晶體至粉末狀，有刺激氣味，易溶于異丙醇，可溶于水,震蕩時產生大量泡沫，化學穩定性好，耐熱、耐光、耐壓、耐強酸強堿。有吸濕性，在酸性溶液中穩定；溶于10份水，溶于熱水、乙醇、三氯甲烷,易溶于異丙醇水溶液,微溶于丙酮,不溶于乙醚和苯。

儲存：在陰涼，干燥，通風良好的地方，遠離不相容的物質。危害：高毒，對皮膚及粘膜刺激性小，有輕微脫脂作用。2.1M Tris-HCl PH8.0緩沖液

作用：提供一個緩沖環境，防止核酸被破壞 商品信息：瓶/100ml，無色、澄清溶液

理化性質：Tris中文品名為三羥甲基氨基甲烷，瓶/500g。是一種白色結晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，對銅、鋁有腐蝕作用，有刺激性的化學物質。

儲存：室溫保存。

危害：毒性低，可致癌，不要直接接觸皮膚。3.乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）

作用：螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制脫氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。

商品信息：瓶/250g。

理化性質：無味無臭或微咸的白色或乳白色結晶或顆粒狀粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值約為5.3?？捎蒃DTA與氫氧化鈉和碳酸鈣作用制得。

儲存：于陰涼、通風的庫房。遠離火種、熱源。應與氧化劑分開存放，切忌混儲。配備相應品種和數量的消防器材。儲區應備有合適的材料收容泄漏物。

危害：對粘膜和上呼吸道有刺激作用。對眼睛、皮膚有刺激作用。本品可燃，具刺激性。4.Tris飽和酚

作用：強蛋白質變性劑。商品信息：瓶/250ml。

理化性質：為淺黃色透明液體，上層為Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羥基喹啉和0.1%的β-巰基乙醇。

儲存：4℃避光保存。

危害：Tris飽和酚有較強的腐蝕性，應盡量避免皮膚直接接觸或吸入體內。如發現變為黃色或棕色，表明發生氧化，不能使用。5.β-巰基乙醇（2-巰基乙醇）

作用：提供一種還原劑，這樣酚類物質（植物材料特別是老的材料中含有大量的酚類物質）就不能被氧化成醌（醌易與DNA發生共價結合，使DNA發生褐變，從而影響你提DNA的實驗）。巰基乙醇兼有消除CTAB震蕩時產生的泡沫的作用。

商品信息：瓶/100g。

理化性質：無色透明液體，具有少許硫醇氣味。易溶于水，乙醇和乙醚等有機溶劑，與苯可以任意比例混溶。水中溶解度：1mg/mL。

儲存：對空氣敏感，易吸潮。使容器保持密閉，儲存在陰涼、干燥通風處。打開了的容器必須仔細重新封口并保持豎放位臵以防止泄漏。建議貯存溫度 2-8℃。

危害：高毒吸入、攝入或經皮膚吸收后會中毒。對環境有危害，對水體可造成污染。本品可燃。6.氯化鈉（NaCl）

作用：CTAB-核酸復合物在高鹽溶液中易溶。商品信息：瓶/500g，分析純AR。

理化性質：白色晶體狀。易溶于水、甘油，微溶于乙醇、液氨；不溶于濃鹽酸。在空氣中微有潮解性。穩定性比較好。

儲存：儲存于陰涼、通風的庫房。遠離火種、熱源。應與氧化劑分開存放，切忌混儲。危害： 7.無水乙醇

作用：DNA沉淀劑、洗滌劑。商品信息：瓶/500ml，分析純AR。

理化性質：無色澄清液體。極易從空氣中吸收水分，能與水和氯仿、乙醚等多種有機溶劑以任意比例互溶。儲存：儲存于陰涼、通風的庫房。遠離火種、熱源。庫溫不宜超過30℃。保持容器密封。應與氧化劑、酸類、堿金屬、胺類等分開存放，切忌混儲。采用防爆型照明、通風設施。禁止使用易產生火花的機械設備和工具。

危害：易燃，具刺激性。蒸氣與空氣能形成爆炸性混合物，爆炸極限3.5%～18.0%（體積）。8.氯仿（三氯甲烷）

作用：蛋白質變性劑，加速有機相與液相分層，去除核酸溶液中的少量酚（酚易溶于氯仿）。商品信息：瓶/500ml。

理化性質：無色透明液體，極易揮發，有特殊氣味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。儲存：保存在密封的棕色瓶中。

危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空氣逐漸被氧化生成劇毒的光氣。9.異戊醇

作用：減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩定。

商品信息：瓶/500ml。

理化性質：無色液體，有不愉快的氣味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有機溶劑。

儲存：儲存于陰涼、通風的庫房。遠離火種、熱源。庫溫不宜超過30℃。保持容器密封。應與氧化劑、酸類等分開存放，切忌混儲。采用防爆型照明、通風設施。禁止使用易產生火花的機械設備和工具。儲區應備有泄漏應急處理設備和合適的收容材料。

危害：吸入、口服或經皮膚吸收有麻醉作用。其蒸氣或霧對眼睛、皮膚、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神經系統功能紊亂，長時間接觸有麻醉作用。易燃，其蒸氣與空氣可形成爆炸性混合物，遇明火、高熱能引起燃燒爆炸。10.異丙醇

作用：DNA沉淀劑，DNA在異丙醇的溶解度更低，所以用異丙醇來沉淀更完全，而后由于異丙醇不易揮發，所以用乙醇洗去異丙醇，乙醇揮發快。用-20度預冷異丙醇沉淀效果較等體積乙醇沉淀好；異丙醇約和2.5倍體積的乙醇效果相當；但DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀會使部分DNA溶解損失；所以多選用-20度預冷異丙醇。一般6500倍到8000倍重力10分鐘就可以將異丙醇沉淀的核酸緊密的離到管底。

商品信息：棕色玻璃瓶/500ml。

理化性質：無色透明具有乙醇氣味的可燃性液體。有似乙醇和丙酮混合物的氣味，能與醇、醚、氯仿和水混溶，不溶于鹽溶液。

儲存：儲存于陰涼、通風的庫房。遠離火種、熱源。庫溫不宜超過30℃。保持容器密封。應與氧化劑、酸類、鹵素等分開存放，切忌混儲。采用防爆型照明、通風設施。禁止使用易產生火花的機械設備和工具。儲區應備有泄漏應急處理設備和合適的收容材料。

危害：微毒類，高濃度蒸氣具有明顯麻醉作用，對眼、呼吸道的黏膜有刺激作用，能損傷視網膜及視神經。常溫下可引火燃燒，其蒸汽與空氣混合易形成爆炸混合物。11.PVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）

作用：PVP是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶的絡合物質，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結合，有效去除多糖。

商品信息：白色塑料瓶/100g。

理化性質：白色或乳白色粉末或顆粒，有微臭。溶于水、堿、酸及極性有機溶劑。儲存：室溫干燥保存。危害： 12.液氮（LN2）

作用：低溫導致植物組織凍裂，方便研磨使細胞破碎，使DNA釋放完全；低溫情況下各酶處于低活性狀態，有利于抑制DNAase的作用，保護DNA。商品信息：分析純

理化性質：-196℃。液態的氮氣。是惰性的，無色，無臭，無腐蝕性，不可燃，溫度極低。儲存：儲存于陰涼、通風的庫房。庫溫不宜超過30℃。危害：汽化時大量吸熱接觸造成凍傷。

六、實驗試劑

1.氯仿-異戊醇（24:1）100ml-20ml=80ml {氯仿 96ml + 異戊醇 4ml} = 100ml，4℃保存 2.酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）40ml {氯仿-異戊醇（24:1）20ml + Tris飽和酚20ml} = 40ml，4℃保存 3.TE緩沖液 PH8.0 50ml {10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液 0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml} → → 定容到50ml → 高壓滅菌后冷卻4℃保存 ? 【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {蒸餾水 80ml + EDTA-2Na.2H2O 18.61g} → 用NaOH（約2g）調至PH8.0 → 定容至100ml → → 分裝后高壓滅菌備用。注：需加入NaOH調至PH8.0才能完全溶解。? 【10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液】的配制：10ml {1M Tris-HCl PH8.0緩沖液100μl + 水9.9ml} → 定容至10ml → 10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液 4.2%CTAB抽提液 250ml

{CTAB 4g + 無水乙醇 5ml + 水100ml} → 加入200ml燒杯中 → 加熱溶解 → 再依次加入 → → {5M NaCl 56ml + 1M Tris-HCl（PH8.0）20ml + 0.5M EDTA 8ml} → 定容至250ml → 高壓滅菌冷卻后加入 → {1%β-巰基乙醇（400ul）2ml + PVP-40 5g} → 4℃保存 ? ? 【5M NaCl溶液】配制：100ml {NaCl 29.22g + 水90ml} → 加熱到80℃溶解冷卻后 → 定容至100ml → 高壓滅菌備用 【1%（v/v）β-巰基乙醇】配制：10ml {β-巰基乙醇 100μl +水9.9ml} → 1%β-巰基乙醇10ml 5.蒸餾水

所有藥劑用水都要純凈水經高壓滅菌冷卻

七、實驗步驟

（一）實驗前準備

1.研缽、異丙醇-20℃預冷；【研缽10個、異丙醇75ml】

2.將2%CTAB抽提液從4℃冰箱內取出在65℃水浴預熱；【CTAB抽提液30ml】 3.稱取30份新鮮菠菜葉片，每份1g，稱重時去葉脈；【菠菜葉片30g】 4.用蒸餾水沖洗葉片，濾紙吸干水分，將葉片用剪刀剪小?！鞠雌?、濾紙、剪刀】

5.實驗器材：冰箱、65℃水浴鍋、液氮、10ml離心管90個、藥匙、移液槍（1ml、100μl、400μl）、離心機（10000r/min）

6.實驗藥劑：酚-氯仿-異戊醇30ml（每管1ml）、氯仿-異戊醇60ml（每管2ml）、無水乙醇12ml（每管400 μl）、TE緩沖液3ml（每管100μl）

（二）破碎細胞，釋放溶解核酸

1.將葉片臵于預冷的研缽（實驗前-20℃預冷）中，倒入液氮，盡快研磨成粉末；

? 目的：低溫導致植物組織凍裂，方便研磨使細胞破碎，使DNA釋放完全；低溫情況下各酶處于低活性狀態，有利于抑制DNase的作用，保護DNA。

2.將粉末加入10ml離心管中，加入 1ml預熱的CTAB 抽提緩沖液，輕輕攪動搖勻； ? 目的：CTAB可以溶解細胞膜并與DNA結合，便于分離DNA。加入β-巰基乙醇和PVP-40的目的是減少植物中酚類物質的影響。EDTA的作用是螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制脫氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。Tris-HCl提供一個緩沖環境，防止DNA被破壞。高鹽溶液可以更好的溶解核酸-CTAB復合物。

3.將離心管臵于 65℃的水浴中保溫40分鐘，期間每隔10分鐘輕輕搖晃幾次。? 目的：水浴使CTAB抽提液和葉片充分反應。

（三）抽提去掉蛋白質

1.將水浴的離心管取出，冷卻 2分鐘后，加入1ml酚-氯仿-異戊醇，振蕩 2分鐘，使兩者混合均勻，12000 r/min離心10分鐘； ? 目的：第一次離心溶液分3層，上-中-下層：CTAB-核酸-變性蛋白-有機溶劑

2.取上清液（含CTAB-核酸）至新的10 ml離心管中，加入2ml氯仿-異戊醇，輕輕顛倒離心管，混勻，12 000r/min離心10分鐘。? 目的：第二次離心進一步去掉變性蛋白，去掉多余的酚

（四）沉淀核酸

1.小心取上清液（含CTAB-核酸）臵于一個新的10ml離心管中（盡量避免吸取中間層）,加入2.5ml的異丙醇（-20℃預冷），將離心管慢慢上下搖動30秒，使異丙醇與水層充分混合，室溫放臵15分鐘至能見到DNA絮狀物； ? 目的：異丙醇為DNA沉淀劑，異丙醇與CTAB互溶，但不與核酸相溶。用-20℃預冷的異丙醇沉淀效果較等體積乙醇沉淀好，異丙醇約和2.5倍體積的乙醇效果相當，但核酸微溶于乙醇，使用乙醇沉淀會使部分核酸溶解損失；所以多選用-20度預冷異丙醇。核酸在異丙醇的溶解度更低，所以用異丙醇來沉淀更完全。異丙醇易溶于CTAB，但不與核酸相溶。2.10000r/min離心10分鐘,小心倒去上清液。? 目的：第三次離心使核酸沉淀到管底。

（五）核酸的洗滌

用400ul無水乙醇洗滌核酸沉淀直至無色，10000r/min離心10分鐘，傾去上清液晾干。? 目的：異丙醇不易揮發，所以用乙醇洗去異丙醇及多余的NaCl，乙醇揮發快。

（六）保存

向下層離心物中加入100μl TE緩沖液進行溶解，臵于-20℃冰箱保存，以便下次課用。? 目的：一般長期保存DNA，貯存在TE緩沖液中比較好。TE為含EDTA的Tris-HCl(PH 8.0)緩沖液：其中比較關鍵的成分是EDTA，日常環境中不可避免的存在DNase，而DNase的活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。鎂離子存在條件下，DNase I可隨機剪切雙鏈DNA的任意位點；二價錳離子存在條件下，DNase I可在同一位點剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個核苷酸突出的粘末端。TE中含有的EDTA可以螯合金屬離子，從而使DNase失活。而Tris-HCl的作用主要是維持一定堿性PH值，有助于DNA的溶解和穩定。不加EDTA也是可以的，而且EDTA會影響下游酶切，連接反應以及質粒轉染進細胞的效率，如果接下來要做這些實驗是應該避免使用含EDTA的緩沖液的。短期儲存DNA也可以使用ddH2O，有助于DNA連接等效果。

八、實驗注意事項

1.在整個實驗過程中應嚴格執行無菌操作； 2.部分藥品有毒，操作中應注意安全防護；

3.磨樣時最好是加液氮，磨樣速度要快，使材料處于低溫狀態； 4.剛投入水浴時可以稍快速的晃動，之后的晃動一定要輕柔； 5.抽提時不要有太力振動，操作也要仔細，盡量避免DNA斷裂；

6.將異丙醇吸出時用的槍頭一定要剪過的，這點很重要，過尖的槍頭會把DNA鏈弄斷。

九、思考題

1.本實驗中用到的各種試劑的作用是什么？ 2.本實驗中進行了幾次離心操作，每次的目的？

十、實驗安排

全班55人，按照學號分組，每6人一組，共9組，最后一組7人。每組作3個離心管，共用一個研缽。

每3組（共18人9個離心管）共同進行離心操作。