第一篇：DNA提取方法和試劑作用匯總

1試劑的作用

氯仿的作用？

氯仿：克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提細胞基因組DNA時，通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇，為什么？

異戊醇：減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩定。

用乙醇沉淀DNA時，為什么加入單價的陽離子？

用乙醇沉淀DNA時，通常要在溶液中加入單價的陽離子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。DNA提取分為三個基本步驟

每個步驟的具體方法可根據樣品種類、影響提取的物質以及后續步驟的不同而有區別。

.細胞的破碎

細菌有堅硬的細胞壁，首先要破碎經胞。方法有三種;①機械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法;②化學試劑法：用SDS處理細胞;③酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，都可使細胞壁破碎。

利用研磨或者超聲破碎細胞，并通過加入去污劑以除掉膜脂。

加入蛋白酶，醋酸鹽沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉細胞內的蛋白，如與DNA結合的組蛋白。將DNA在冷乙醇或異丙醇中沉淀，因為DNA在醇中不可溶而黏在一起，這一步也能除掉鹽分。另外，目前也有利用吸附過柱的方法提取DNA的商業化試劑盒。

DNA提取的幾種方法(1).濃鹽法

A.利用RNA和DNA在電解溶液中溶解度不同，將二者分離，常用的方法是用1M 氯納抽提,得到的DNA粘液與含有少量蛋白質 氯仿一起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質,此時蛋白質凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上層水相中,用2倍體積95%乙醇可將DNA 鈉鹽沉淀出來.B.也可用0.15 MNaCL液反復洗滌細胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿---異醇法除去蛋白.兩種方法比較,后種方法使核酸降解可能少一些.C.以稀鹽酸溶液提取DNA 時,加入適量去污劑,如SDS可有助于蛋白質與DNA 的分離。在提取過程中為抑制組織中的DNase對DNA 的降解作用,在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑.通常用.15MNaCL,0.015M檸檬鈉,并稱SSC溶液,提取DNA.（2）.陰離子去污劑法;用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質變性,可以直接從生物材料中提取DNA.由于細胞中DNA與蛋白質之間常借靜電引力或配位鍵結合,因為陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA

（3）.苯酚抽提法：苯酚作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與DNA 聯結鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性質，用乙醇沉淀DNA。此時DNA是十分粘稠的物質，可用玻璃漫漫繞成一團，取出。此法的特點是使提取的DNA保持天然狀態

（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性質,將組織細胞破碎后,用低鹽溶液除去RNA，然后將沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,離心后收集上清液.在上清中加入固體氯化鈉調節至2.6M.加入2倍體積95%乙醇,立即用攪拌法攪出.然后分別用66%，80%和95%乙醇以及丙銅洗滌,最后在空氣中干燥,既得DNA樣品.此法提取的DNA中蛋白質含量較高,故一般不用.為除蛋白可將此法加以改良,在提取過程中加入SDS.1.動物來源的DNA的提取 1.1經典提取方法

酚抽提法、異丙醇沉淀法以及甲酞胺裂解法是提取DNA最為經典的方法，目前很多方法的改進都是在這些方法的基礎上進行的，這三種方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉(SDS)消化破碎細胞。在前兩種方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白質，再分別用乙醇或異丙醇沉淀DNA。甲酞胺法是利用高濃度的甲酞胺解聚蛋白質與DNA的結合，然后利用透析來處理DNA樣品。這些經典方法獲得的DNA純度很高，能夠滿足各種試驗的要求，但操作繁瑣，用時長，且所用試劑具有一定的毒性。

1.2 玻璃棒纏繞法

該 法 用 鹽酸肌裂解細胞，然后將細胞裂解物小心鋪在離心管中的乙醇上，用一個帶鉤的或前端為U形的玻璃棒在這兩層液體的交界面慢慢攪動，沉淀出的膠狀DNA纏繞在玻璃棒上。玻璃棒上的DNA經多次乙醇浸泡并于室溫下蒸干乙醇，由膠狀逐漸回縮，然后浸人TE中過夜，使其重新吸水膨脹進而和玻璃棒分離。這種方法對操作技術要求較高，但簡單快速。

1.3 血細胞DNA的快速提取法

采用 非離子變性劑NP40(乙基苯基聚乙二醇)代替SDS裂解細胞，提取細胞核，然后用酚/氯仿抽提DNA。這樣從血液中分離獲得的DNA純度高，能夠滿足各種臨床檢驗和實驗的需要。也可采用NP40和Tween-20同時作用破碎細胞膜，以避免SDS對以后步驟的負面作用。Ba sun i等 [‘〕采用了4種常用的從血液中提取DNA的方法:High Pure Viral Nucleic 試劑盒法、QlAamp試劑盒法、Tri-PureTM試劑分離提取法以及經典酚抽提法，對通常作拋棄處理的血凝塊進行人DNA 及病毒DNA的抽提，發現前兩種方法可以迅速高效獲得目的DNA，從而建立了由血凝塊中提取DNA的方法，擴大了臨床檢驗樣本的來源。

1.4 玻璃顆粒吸附法

在該 法 中首先利用含異硫氰酸肌的細胞裂解液裂解細胞，然后加人含有能夠與DNA 結合的玻璃顆粒的緩沖液，經沉淀收集結合染色體DNA的玻璃顆粒，利用洗脫液進行洗脫獲得DNA。不僅玻璃顆粒可以與DNA 進行結合，一定大小的硅膠顆粒也可以與 DNA進行結合，據此，不少實驗工作者實踐了很多利用顆粒結合DNA 的提取方法。Pichler等[2〕在從抹香鯨(Physeter macrocephalus)牙齒及骨骼中抽提DNA時采用了一種以二氧化硅為吸附介質的方法，從抹香鯨標本骨骼組織中鉆取的少量粉末中獲得了足夠用于分析的DNA產物，此方法擴大了對稀有哺乳動物DNA研究的取材范圍。Caldarelli-stefano等[3〕在從福爾馬林固定、石蠟包埋的人體組織標本中提取DNA時利用小磁珠作為結合核，也獲得了理想的純化 DNA。很多試劑公司也依此設計生產了許多顆粒提取試劑盒，Pint。等[4]就探討了采用 Gibc。公司的GlassMAX系統，對福爾馬林固定的組織進行DNA提取的具體操作方法，目前這些試劑盒在臨床上廣為應用，省時省力。

1.5 三乙醇胺月桂基硫酸鹽(TLS)法

由于 常 規 方法中使用的蛋白酶K的水解條件不好掌握，采用TLS來提取組織、細胞以及外周血DNA可以克服這一弊端。TLS是一種較強的表面活性劑，將其直接作用于細胞或組織勻漿，可迅速溶解細胞膜、核膜，而且蛋白質與其結合后即失去對DNA 的結合，進一步的純化可采用常規方法。

1.6 臨床病理標本的DNA提取方法

由于 PC R技術不僅可用于基因分離、核酸序列分析，還可用于突變體和重組體的構建、基因表達調控研究、基因病的診斷及腫瘤發生機理的探討等。近年來，PCR技術已廣泛應用于病理學研究，尤其對福爾馬林固定石蠟包埋病理標本進行相關的研究更成為關注的焦點。對于從這些病理標本中提取 DNA的方法研究也很多。一般采用酚/氯仿抽提法，該法雖然效率較高，但費時費力，而且其操作中要求多次離心，增加了樣品污染的可能性。近年來很多高效靈敏的方法在實踐中得以采用，這些方法通常采用加熱或微波法〔s〕去除包埋的石蠟，使用Sephadex G-5。柱色譜或鹽析法[s7等去除蛋白質。高文濤[71等在研究福爾馬林固定石蠟包埋組織 DNA提取方法對PCR的影響時，發現在組織切片中加人鰲合樹脂(Chelating Resin，亞氨基二乙酸)提取獲得的DNA可取得較好的PCR擴增結果。Coombs等〔s〕則采用熱循環方法，將標本上的蠟融人樣品溶液，在酶的作用下進行裂解，然后用Chelex-100進行吸附，離心去蠟，這種方法安全、簡便、有效、經濟。1.7 鹽析法

該 法用 飽 和氯化鈉代替有機溶劑去除蛋白質，所獲得的DNA質量可以滿足PCR模板的要求，但產率相對較低，純度較差。譚建明等[9]對上述鹽析法進行了改進，即將處理過的樣本加人SDS和蛋白酶K后，在56'C 消化1h，然后用飽和氯化鈉沉淀蛋白質，并經離心除去，上清直接用乙醇沉淀DNA。該法簡化了DNA的抽提步驟，可用于人體各種樣本DNA的提取，所獲DNA的純度可以滿足各種檢測的需要。植物來源的DNA提取

利用 基 因工程手段對植物進行定向改造，已成為當今植物育種學發展的一個新領域，植物基因工程操作離不開植物基因組總 DNA的制備，不同植物的核酸結合蛋白的情況各不相同，因而要采取不同的提取方法[10]。由于植物中次生代謝產物— 多酚類化合物可介導DNA降解，而多糖的污染也是影響植物DNA純度最常見的問題，這些多糖能抑制限制酶、連接酶及DNA聚合酶等酶類的生物活性。因此要從富含多酚和多糖的植物組織中分離獲得高質量的基因組 DNA也并非易事[11l。目前采用的方法有以下幾種。

2.1 十六烷基三乙基澳化按(CTAB)法

CTAB 是 一種陽離子去污劑，它能與核酸形成復合物，這些復合物在低鹽溶液中會因溶解度的降低而沉淀，而在高鹽溶液中可解離，從而使DNA和多糖分開，再用乙醇沉淀DNA 而除去CTAB。在該法中使用的聚維酮(PVP)與多酚結合形成復合物，從而可有效避免多酚類化合物介導的DNA降解[121。王卓偉等[13〕在對桑葉DNA提取方法研究過程中發現PVI〕還能有效地去除多糖。羅志勇等[14〕在研究中對這種方法進行了幾點改進: ①提高CTAB的濃度;②對于含多酚類較多的植物，增加CTAB提取緩沖液中琉基乙醇的含量，同時加人PVP使其與多酚類物質結合形成復合物;③增加低鹽沉淀緩沖液的量;④增加高鹽溶液中鹽的濃度。用改進的方法從人參、西洋參、三七等藥用植物中分離獲得了高純度的DNA, Porebski等[1s]在沉淀粗提 DNA時，將提取緩沖液中氯化鈉的濃度提高至2.5m o卜L-’以使DNA在高鹽緩沖條件下優先沉淀，可更有效地除去多糖。Stein等[16] 對傳統的CTAB法進行了優化，創建了一種從新鮮草本植物樣本中提取DNA的方法。首先在特制的有96個孔的托盤上種植植物樣本，并依照不同樣本在托盤中的位置進行編號，然后取適量植物葉子分裝在充滿提取液的塑料袋中，除去袋中的空氣并封口，再用特制的手工勻化器將各袋中的樣本混勻，56`C孵育 1h后將袋中的液體取出進行離心以及DNA 的沉淀。Xin等〔17〕則采用簡易的96孔托盤作為提取時的容器，將多種植物樣本經研磨處理后分別放在不同的孔中進行提取，在一天內由一人就可完成上千個樣本的DNA提取，為高通量植物基因分析及篩選提供了極大的便利。

2.2 SDS法

為 了避 免 CTAB法試驗步驟多、操作繁瑣的不足之處，近年來又提出了利用SDSTris-Cl--EDTA等直接裂解細胞使其釋放出DNA的方法]。在該法后續的DNA純化過程中通常采用酚/氯仿處理，但對于植物 DNA純化不是一個很好的選擇，因為酚的使用可降低DNA的提取效率和純度。在用該法提取DNA的過程中采用較大的離心力和較長的離心時間，然后用氯仿一異戊醇代替酚來去除變性蛋白質，從而克服了由于酚的摻人及殘留對以后酶切帶來的困難。用琉基乙醇代替SDS，對大豆DNA分離提取能夠更有效地去除蛋白質，而且可以有效防止褐變，獲得天然雙鏈高分子量的DNA產物，并且減少了SDS對 PCR、隨機擴增多態性DNA技術(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)等操作的影響。在對辣椒DNA進行提取時為了提高DNA的產率將待提取的植物材料首先在液氮中研磨成粉末，并且針對辣椒葉子中多酚類物質極少的特點將其中的加人PVP的步驟省去，消除了PVP對以后操作的影響.2.3 氯化千法在對稱猴桃的基因組DNA 提取過程中選用了氯化節法，與其他方法相比該法的得率較高，其原因可能是氯化節不僅可與植物細胞壁上的多糖經基反應生成醚，而且與細胞液中多糖物質的All基反應，起到破壞糖鏈的作用，利于DNA的釋放和提純。

2.4 高鹽低pH法

該 法 中 所用的提純試劑僅為無機鹽和異丙醇。通常采用的無機鹽為醋酸鉀，低pH的醋酸鉀是有效的蛋白質沉淀劑。與一般氯仿一異丙醇反復抽提去除蛋白質的操作相比該法操作更方便省時，所需樣品量少，適用于 瀕危植物DNA的提取。

2.5 果膠酶法

Ste ve n等 [2s采用果膠酶對植物細胞破碎后的抽提混合物進行消化處理使與DNA共沉淀的膠狀物質分解成小的片段，從而無法與DNA一起沉淀下來，降低了DNA的純化難度，提高純化效率。微生物來源DNA的提取

常規 的微 生物DNA提取多是根據某種微生物的具體特點選擇合適的方法。在實際的科學研究過程中，很多科學工作者通過實踐總結出許多快速實用的提取方法，現擇其中比較典型的加以總結。

3.1 細菌質粒的提取方法

質粒是獨立于細菌染色體DNA之外的環狀DNA，它能攜帶外源基因進人細菌進行擴增，或表達外源基因，是基因工程中常用的載體，在DNA重組技術、DNA測序、轉基因等方面具有廣泛的應用。對于細菌質粒的提

取比較經典的方法有:堿裂解法、煮沸法、SDS裂解法以及Triton-溶菌酶裂解法等。這些方法的選擇取決于質粒的大小、細菌菌株的性質等。Keunosky等GE_發展了一種以 Zn'+誘導DNA沉淀的方法，在該法中利用一定濃度的ZnCl:溶液使一定體積的細菌菌液質粒DNA大量沉淀，無需多次離心，大大簡化了抽提的步驟。

近年 來，一些生物技術公司，比如Promega公司及Qiagen公司等紛紛推出質粒抽提試劑盒，這些試劑盒多運用樹脂材料或硅膠來特異性的吸附質粒DNA，提取過程用時少，效率高。

3.2 真菌DNA提取方法

對 真菌 DNA的提取關鍵是破碎細胞，通常采取酶解破壁法或以液氮冷凍處理增加細胞壁脆性的物理破壁法。在這兩種方法中酶解破壁法較為簡單，易于操作和控制，而物理破壁法在處理過程中容易造成細胞核的大量破損。在提取獲得核酸一蛋白質復合物后，對其中蛋白質的沉淀也多采用傳統的氯仿一異戊醇沉淀法或高鹽沉淀法。韓利剛等C25用CTA13法直接從絲狀真菌的新鮮菌絲中提取DNA，并將所提取的DNA進行 RAPD，得到了較清晰的擴增圖譜。Loeffler 等[Z6為滿足快速靈敏準確的臨床檢驗的需要，利用MagNA Pure LC系統建立了一種實用的快速提取方法，該法自動化程度高，避免了可能的交叉污染。Manian等[z7〕在對真菌進行DNA抽提時采用幾個循環的快速制冷、煮沸以破碎真菌細胞壁，并通過Qiagen 公司的QIAquick DNA純化柱，迅速從極微量的真菌中獲得高純度的DNA大分子。3.3 結核桿菌DNA的提取方法

利用 PC R微孔板雜交技術檢測臨床標本中結核桿菌DNA是診斷結核桿菌感染的一種快速靈敏和特異的方法。從不同的臨床標本中獲得DNA是檢測準確和成功的關鍵。而不同來源的結核桿菌又分別受到不同來源材料的影響，所以提取方法各不相同。同時由于結核桿菌的細胞壁比較厚不易破碎，一般的微波法、異硫氰酸肌法、凍融法等難以破壞結核桿菌的細胞壁。通常采取的方法有:經典酶一酚一氯仿法，堿一SDS裂解法，堿裂解煮沸法，超聲裂解法，Chelex-100 法，玻璃粉一硅吸附法等。楊正林等[28〕通過對以上幾種方法的比較發現玻璃粉一硅吸附法操作簡單，假陽性低，適合臨床檢測使用。3.4 土壤微生物總DNA的提取方法

土壤 中 細 菌的含量豐富，種類齊全，從中提取細菌DNA可用于檢測不可培養的細菌，跟蹤某些目標菌或重組基因在自然環境中的行為，也可用來解釋土壤微生物生態系統中的基因的多樣性及其隨環境的變化。從土壤中提取和純化DNA是最關鍵的技術之一。Courtoi:等[29]對比了在土壤中直接裂解微生物體、然后提取DNA和先將微生物菌體通過梯度離心與土壤顆粒分開再進行提取的方法，利用PCR技術以及雜交技術檢測不同方法獲得DNA的種類和純度，發現前一種方法具有更高的效率，能夠提取獲得較多微生物物種的 DNA。張瑞福等[30]采用SDS高鹽提取法和透析袋回收法對9種不同來源的土壤進行微生物DNA的提取，與通常采用的對菌體細胞的超聲破碎法以及對粗提DNA的微型柱純化法相比，既保證了一定提取與回收效率，又兼顧了DNA的質量，使DNA在提取和純化過程中不會受到損傷。4 海洋生物DNA的提取方法

海洋 是 地 球上最大的生物資源庫，同時由于海水的保護使海洋生物變化很少，物種得到較好的保存，這樣就為研究生命現象的基本問題提供了豐富的資料。在利用這些資源探討諸如生命的起源、生物進化、生物與環境的關系、改造海洋生物以為人類服務(如生產某種藥物)時離不開對生物核酸的研究。對于海洋來源的動物、植物、微生物由于其不同于陸生生物的組織和細胞結構特點往往采用不同的DNA提取方法。

張海 琪 等 [31_在對不同方法保存的大黃魚(Pseudosciaena crocea)肌肉樣品基因組 DNA進行提取時發現，經福爾馬林、乙醇及含有EDTA的乙醇保存的樣品可以同鮮活樣品和冷凍樣品一樣獲得基因組DNA，但相比之下采用乙醇作為固定劑更方便快速，所提取的DNA用于RAPD分析，獲得了滿意的效果。楊文新等[32〕利用75%的乙醇固定鮑魚(Haliotis discus)樣本并進行DNA的提取，證明用乙醇固定海洋動物組織是一種切實可行的方法，材料處理后可同步提取，增加了實驗的同步性、可比性，適用于大量樣本的提取。由于組織中含有許多DNA酶，絕大多數DNA酶需要一個二價陽離子作為輔助因子，因此采用含適量EDTA的乙醇固定劑是野外標本采集和運輸的一種更簡便有效的方法。

韓兵 社 等 33:針對傳統的有機溶劑提取工藝進行改進，應用多種萃取液體系從廢棄物魷魚肝臟中提取核酸，與原工藝相比，核酸提取產量提高30%-60%，整體工藝得到簡化，而且避免了有機物的殘留。

赤 潮 是 在特定的環境前提條件下，海水中的某些浮游生物、原生動物或細菌爆發性增殖或高度聚集而引起水體變色的一種有害生態現象，對海洋漁業、水產資源以及人類的健康造成很大的威脅。發生赤潮的生物類型主要為藻類，銅綠微囊藻(Microcytis aeruginosa)是造成赤潮的藻類之一。陸源等[34〕用乙醇乙醚混合液對純化的銅綠微囊藻作預處理，破壞了其膠質鞘，從而使蛋白酶K和 SDS能更好地直接作用于其細胞壁，細胞內的DNA釋放完全，提高了總DNA的得率。通過提取獲得的DNA有助于開展對有害藻類的研究，為防范赤潮提供依據。在對 紫 菜(Porphyras p.)進行DNA提取時，郭寶太等[35〕先用海螺酶處理樣品制備紫菜體細胞，然后用SDS和蛋白酶K裂解細胞提取總DNA，再用Wizard DNA clean-up;樹脂進行純化。經海螺酶處理的紫菜細胞解決了通常采用的液氮破碎細胞后裂解物勃稠、DNA得率低且有嚴重的多糖污染等難題。但這種方法對植物組織需求量較多，不適于個體體積小的紫菜。劉必謙等[36〕采用美國Roche公司的DNA Isolation Kit for Cell and Tissue和上海生工公司的UNIQ-10小量柱式基因組DNA提取試劑盒對個體體積較小的圓紫菜(Porphyra suborbiculato)、鐵釘菜(Ishige okamurae)等進行DNA 的提取，獲得高純度的基因組DNA，完全能滿足酶切片段長度多態性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)技術的需要。

陳子 桂 等[371以海洋尾絲蟲(Uronema marinum)為材料，針對纖毛蟲難以建立培養以及個體豐度不高等特點，就微量條件下提取DNA的方法進行了探討，成功地獲得了活體直接提取、活體酚/氯仿抽提、固定標本直接提取以及固定標本酚/氯仿抽提等四種簡便有效的微量DNA提取方法，解決了纖毛蟲微量DNA提取的困難。

綜合 DN A的提取方法，雖然不同生物 DNA的提取方法不盡相同，但各種提取方法也有很多相通之處，可以相互借鑒。隨著生物技術的飛速發展，對這一技術的經驗總結將會越來越多，一些生物領域新的DNA提取方法也將逐漸固定下來，更為簡捷、高效的方法也必將出現，為基因工程提供更高純度的DNA.1）學習并掌握動物組織總DNA的提取方法及其原理。（2）從肝臟組織中提取到一定量的純凈的DNA樣品。【實驗原理】

DNA是一切生物細胞的重要組成成分，主要存在于細胞核中。通過研磨和SDS作用破碎細胞；苯酚和氯仿可使蛋白質變性，用其混合液（酚：氯仿：異戊醇）重復抽提，使蛋白質變性，然后離心除去變性蛋白質；RNase降解RNA，從而得到純凈的DNA分子。【儀器、材料、試劑】

（一）儀器 1．高速離心機 2．烘箱 3．冰箱 4．水浴鍋 5．微量移液器 6．高壓滅菌鍋

（二）材料 1．生理鹽水

2．十二烷基硫酸鈉（SDS）3．三羥甲基氨基甲烷（Tris）4．乙二胺四乙酸（EDTA）5．飽和酚 6．氯仿 7．異戊醇 8．無水乙醇 9．75%乙醇 10．蛋白酶K 11．RNase酶

12．手術剪刀、鑷子、吸水紙 13．微量取液器

14．研缽、1.5mL 離心管、一次性手套、1.5mL離心管架、記號筆

（三）試劑配制 1．Tris–HCL 1mol/L PH8.0 50ml 配制方法：

40ml雙蒸水，6.057g固體Tris放入燒杯中溶解，用濃鹽酸調PH值到8.0，轉移到50ml容量瓶中，加入雙蒸水定容，搖勻后，轉到準備好的輸液瓶中，貼上標簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存備用。

2．生理鹽水: 0.85%NaCL 100ml 配制方法：

在20ml雙蒸水中溶解0.85g固體NaCL，加水定容至100ml，搖勻后，轉到準備好的輸液瓶中，貼上標簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存備用。3．EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml 配制方法：

將9.08g的EDTA·Na2·2H2O溶解于40ml雙蒸水，用1g的NaOH顆粒（慢慢逐步加入）調PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA難溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA·Na2·2H2O。

4．TES緩沖液（釋放DNA）100ml 配制方法：

將0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml雙蒸水，在分別加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml的Tris-HCl(pH=8.0)，加定容至100ml, 搖勻后，轉到準備好的輸液瓶中，貼上標簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存備用。

5．10% SDS（變性劑 破細胞壁）100ml 配制方法：

將10g的十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解于80ml雙蒸水于68℃加熱溶解，用濃HCl調至PH=7.2，定容至100ml，搖勻后，轉到準備好的輸液瓶中，貼上標簽，4℃保存備用。6．蛋白酶K（降解蛋白質）：20mg/mL 無菌三蒸水溶解。7．RNA酶（降解RNA）配制方法：

將胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的Tris·CL（PH7.5）、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份存于–20℃。8．氯仿：異戊醇=24：1 100ml 按24:1的比例加入氯仿、異戊醇，搖勻，轉到準備好的瓶中，貼上標簽，4℃保存備用。9．TE緩沖液（溶解DNA）PH8.0 50ml 配制方法：

將0.5ml 的10mmol Tris-HCl(PH8.0)、0.1ml的0.5mol/l EDTA(PH8.0)加入到50ml的容量瓶中，調PH8.0定容至50ml搖勻后，轉到準備好的瓶中，貼上標簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存備用。【實驗步驟】

1．組織塊解凍，用生理鹽水洗去血污，剪取約0.5g組織，放入1.5ml離心管中，剪碎。2．加入0.45ml TES混勻，再加入50ul SDS（10%），5.0ul蛋白酶K（20mg/ml），充分混勻后，于56°C保溫4-6h，每2h搖1次。3．放置到室溫，加入等體積飽和酚（500ul），顛倒混勻，10000r/m，離心10m，分離水相和有機相，小心吸取上層含核酸的水相，到一個新的1.5ml離心管。4．加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），顛倒混勻，10000r/m，離心10分鐘，取上層轉移到新的1.5ml離心管中。5．加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），顛倒混勻，10000r/m，離心10分鐘，取上層清液到一個新的1.5ml離心管。6．加入2.5倍體積的-20°C預冷的無水乙醇沉淀DNA，觀察現象。7．12000 r/m，離心10分鐘，棄乙醇。8．-20°C保存的75%乙醇洗滌，10000 r/m，離心5分鐘，去乙醇，55°C干燥DNA。9．加入適量TE溶解DNA（具體依DNA的多少而定），-20°C保存備用。【注意事項】

1．抽提每一步用力要柔和，防止機械剪切力對DNA的損傷。2．取上層清液時，注意不要吸起中間的蛋白質層。3．乙醇漂洗去乙醇時，不要蕩起DNA。

4．離心后，不要晃動離心管，拿管要穩，斜面朝外。

第二篇：DNA提取過程中各種試劑的作用及原理

DNA提取過程中各種試劑的作用及原理

1．溶液I—溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小于8時，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環境。2．溶液II－NaOH－SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩定的。

但當pH＞12或pH＜3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時，該系統的pH就高達12.6，因而促使染色體DNA與質粒DNA的變性。

SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：

（1）溶解細胞膜上的脂質與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。（2）解聚細胞中的核蛋白。

（3）SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO3-…R＋-蛋白質的復合物，使蛋白質變性而沉淀下來。

但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中

（用RNase去除RNA時）受到干擾。

3.溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈堿性，為了調節pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調回pH至中性，使變性的質粒DNA能夠復性，并能穩定存在。而高鹽的3mol／L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與SDS－蛋白復合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復合物，使沉淀更完全。

4．為什么用無水乙醇沉淀DNA？

用無水乙醇沉淀DNA，這是實驗中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67％左右。

因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95％乙醇昂貴）。

但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95％乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置15－30分鐘即可。

5．在用乙醇沉淀DNA時，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達0.1～0.25mol/L？

在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質存在，影響DNA的酶切等反應，必須要進行洗滌或重沉淀。

6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來處理？

加進去的RNase本身是一種蛋白質，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復合物沉淀，再加KAc使這些復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質復合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。7．為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液？

在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩定性及緩沖液成分不產生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統（pKa＝7.2）和硼酸系統（pKa=9.24）等雖然也都符合細胞內環境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉化實驗時，磷酸根離子的種類及數量將與Ca2＋產生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA反應時，不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCl系統，而TE緩沖液中的EDTA更能穩定。

氯仿的作用主要是使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開，異戊醇的作用是消除抽提過程中出現的泡沫。

氯仿是強蛋白質變性劑，抑制RNA酶的活性，除去蛋白質污染。

基因組DNA-CTAB法

CTAB法原理(植物DNA提取經典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨),是一種陽離子去污劑,具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性.在高離子強度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB與蛋白質和多聚糖形成復合物,只是不能沉淀核酸.通過有機溶劑抽提,去除蛋白,多糖,酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來.注:CTAB溶液在低于15℃ 時會形成沉淀析出,因此在將其加入冰冷的 植物材料之前必須預熱,且離心時溫度不要低于15℃.基因組DNA-CTAB法

CTAB提取緩沖液的經典配方

Tris-HCl(pH8.0)提供一個緩沖環境,防止核酸被破壞;EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNase活性;NaCl 提供一個高鹽環境,使DNP充分溶解,存在于液相中;CTAB溶解細胞膜,并結合核酸,使核酸便于分離;β-巰基乙醇是抗氧化劑,有效地防止酚氧化成醌,避免褐變,使酚容易去除

基因組DNA-CTAB法

CTAB提取緩沖液的改進配方

PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡合物,能與多酚形成一種不溶的絡合物質,有效去除多酚,減少DNA中酚的污染;同時它也能和多糖結合,有效去除多糖.基因組DNA的提取核酸分離,純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時,應提供相應的緩沖體系采用有機(酚/氯仿)抽提時應充分混勻,但動作要輕柔離心分離兩相時,應保證一定的轉速和時間針對不同材料的特點,在提取過程中輔以相應的去雜質的方法基因組DNA的提取核酸分離,純化

蛋白質的去除:酚/氯仿抽提使用變性劑變性(SDS,異硫氰酸胍等)高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離,純化

多糖的去除:高鹽法:用乙醇沉淀時,在待沉淀溶液中加入1/2體積的5M NaCl,高鹽可溶解多糖.用多糖水解酶將多糖降解.在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積),氯苯可以與多糖的羥基作用,從而去除多糖.用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500 μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000(含1.2 M NaCl),冰浴20min.核酸分離,純化

多酚的去除:在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑:β-巰基乙醇,抗壞血酸,半胱氨酸,二硫蘇糖醇等加入易與酚類結合的試劑:如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇),它們與酚類有較強的親和力,可防止酚類與DNA的結合

鹽離子的去除:70%的乙醇洗滌核酸吸附,沉淀和溶解使用合適的吸附材料吸附核酸,其它的雜質均被洗掉,達到純化DNA的目的另一種方式加入1/10體積的NaAc(pH5.2,3M),用預冷的乙醇或異丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后應用70%的乙醇洗滌,以除去鹽離子等若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNasepH值為8.0,可防止DNA發生酸解。

基因組DNA提取常見問題

DNA中含有蛋白,多糖,多酚類雜質DNA在溶解前,有酒精殘留,酒精抑制后續酶解反應DNA中殘留有金屬離子有RNA的存留原因對策重新純化DNA,過吸附柱去除蛋白,多糖,多酚等雜質重新沉淀DNA,讓酒精充分揮發增加70%乙醇洗滌的次數(2-3次)加入RNase降解RNA 問題一:DNA樣品不純,抑制后續酶解和PCR反應.DNA提取常見問題材料不新鮮或反復凍融未很好抑制內源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈,DNA被機械打斷外源核酸酶污染反復凍融。盡量取新鮮材料,低溫保存材料避免反復凍融液氮研磨或勻漿組織后,應在解凍前加入裂解緩沖液在提取內源核酸酶含量豐富的材料的DNA時,可增加裂解液中螯合劑的含量,細胞裂解后的后續操作應盡量輕柔所有試劑用無菌水配制,耗材經高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中,避免反復凍融 問題二:DNA降解.DNA提取常見問題實驗材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全洗滌時DNA丟失。盡量選用新鮮(幼嫩)的材料動植物要勻漿研磨充分;G+菌,酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁.高溫裂解時,時間適當延長(對于動物細胞,細菌可增加PK的用量).增加吸附的時間,或低溫沉淀小心操作 問題三:DNA提取量少.

第三篇：DNA提取問題集

DNA提取問題集

默認分類 2009-12-31 18:59:50 閱讀155 評論0字號：大中小

提取植物DNA時遇到多糖成分的干擾，DNA質量一直不高，如何消除多糖的影響？ 參考見解：一般來說，SDS法提取的DNA會還有較多的多糖，使DNA成膠凍狀。而CTAB法提取可基本上除去多糖。如果是植物材料本身含糖量比較高，可用以下方法試一試：

1、在 DNA 未溶出之前，先用一些緩沖液洗去多糖。如可用緩沖液：100 mmol/LTris-HCl(pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol洗幾次。

2、使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍體積的無水乙醇，迅速混勻，多糖會先沉淀。

3、沉淀 DNA 時，使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入 1/2 體積的 5 mol/L NaCl，或加 NH4Ac 使終濃度為 10 mmol/L。或 0.5 mL DNA 液中加 0.12 5 mL 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13% PEG 8000（冰浴 1 h）。

4、多糖和 DNA 的共沉淀物進行再分離。如用 TE緩沖液反復清洗共沉淀 物，將清洗液合并再用醇沉淀 DNA，或將沉淀物溶解后，經瓊脂糖電泳，切下 DNA 部分再將膠回收，或者用多糖水解酶將多糖降解。還 有在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用而去除多糖。

上述方法還可組合使用，以達到最佳效果。然而這些方法均會在一定程度上減低 DNA 的提取量；如果材料較少或要求較高，則可考慮用柱層析方法，使用對 DNA 具有 特異性吸附的樹脂來純化 DNA。曾有文獻提到選用 Wizard Purification Kit，PRC-5 柱，Sephacryl S-1000 或 S-500，Qiagen Genomic tip 500/G，或者 CsCl 梯度離心純化 DNA。血樣4度保存了2月，現在按照酚常規提取方法不能提取出DNA，有什么解決辦法？ 參考見解：按照常規的酚/氯仿法不可能提不出來，下面是參考方法：

1、首先洗出白細胞，最好有1毫升以上血液。

2、加入5ml DNA提取緩沖液，(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混勻。

3、加入25ul 蛋白酶K ,使終濃度達到100ug/ml, 混勻，50℃水浴過夜。

4、用等體積的（酚，氯仿，異戊醇，25：24：1）混合物抽提一次，5000r/min，10min離心收集水相。

5、取水層，加入3倍體積-20℃預冷無水乙醇5000r/min，10min，75%乙醇5000r/min洗DNA，充分干燥將DNA溶于適量水中。

CTAB法提取水稻基因組DNA，TE 溶解后瓊脂糖膠電泳檢測，點樣孔附近有一條明顯的主帶。用MBI 公司產的限制性內切酶酶切過夜，鑒定時發現DNA已經被完全切爛，只在溴酚藍前存在微弱smear狀產物。換用NEB 公司產的酶，更換EP管，滅菌水之后重復幾次，結果還是如此。拿其他人的DNA 做對照，酶切結果正常。用異丙醇將DNA 重新沉淀，換了TE溶解，檢測主帶仍舊清晰，可是用酶切之后DNA還是被切爛。為什么？

參考見解：

1、公司的酶不行。

2、如做酶切，DNA最好不用異丙醇（因其不易揮發）而用無水乙醇沉淀。

3、酶量大或作用時間太長了。

建議重提DNA，取少許用超純水溶解（非TE），按照說明書進行酶切。要用新鮮樣品或液氮冷凍-70度保存的樣品。這樣通過降低內切酶的活性減少DNA的降解；

要得到全血基因組DNA，可以先用分層液密度梯度離心將淋巴細胞分離嗎？這樣做，與沉淀全血細胞然后破壞紅細胞得到的結果有何差異？ 參考見解：

1、覺得還是先分離細胞好，因為DNA和RNA大都是在細胞核內，有紅細胞反而不太好。從血里面提RNA，用淋巴細胞分離液先分離有核細胞的，效果還是不錯的。

2、現在提取全血的DNA,也就是提取淋巴細胞中的DNA，用密度梯度離心，只是富積淋巴細胞，能得到更多的DNA而已。一般如果DNA的量的要求不太多的話，沒必要。

3、如果對基因組的要求不高，可以試試這個方法。取EDTA-Na2抗凝血100μl加至1.5ml Eppendorf管中，加無菌重蒸水500μl；10 000r/分鐘離心3分鐘，棄凈上清；加20μl 5mol/L KI，旋渦振蕩30秒;0.9%NaCl 100μl,150μl氯仿/異戊醇(24∶1)，振蕩30秒；10 000r/分鐘離心5分鐘，吸上清100μl于另一Eppendorf管中，加異丙醇60μl，輕輕混勻，10 000r/分鐘離心5分鐘，棄上清；加冷無水乙醇1000μl，10 000r/分鐘離心5分鐘；棄去無水乙醇，37℃烤干；50μl無菌重蒸水或TE，混勻溶解備用。

從經福爾馬林處理后的組織標本中提取DNA可以嗎？

參考見解：可以的，國外有好多相關試劑盒，qiagen, roche等公司都有的。

100ml的大量提取，蛋白酶Ｋ是必需的嗎？它的作用是什么？用溶菌酶代替可以嗎？每次在用酚氯仿異戊醇抽提后，上層里面都是絮狀的蛋白質，離心幾次都沉淀不下來，請問是哪里出了問題？

參考見解：一般來說，蛋白酶的作用是將蛋白質消化成小的片段，促進核酸與蛋白質的分開，同時，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。而溶菌酶的作用是破壞微生物細胞壁，二者作用各異，不可替代。對于實驗中的蛋白問題，建議離心后先用竹簽挑出蛋白，小心吸取上層清液，再重復抽提幾次試試。

一般植物DNA提取的時候都不加蛋白酶K，這樣提出來的DNA鏈上的組蛋白等未被蛋白酶消化，不是很難除去嗎？那DNA是不是不純？可以用來酶切嗎？

參考見解：蛋白酶k的主要作用并不是消化組蛋白，而是消化細胞，在動物細胞DNA的提取也不加蛋白酶k也是可以的，植物細胞的較易破碎，不需要蛋白酶k的作用。protenase K作用：

1、消化組蛋白，釋放出DNA。

2、消化DNAse，提高DNA分子量。

建議還是加蛋白酶k為好，這樣提出來的 DNA分子量會高一點，且更純。提白粉孢子的總DNA，白粉孢子比較小，直接在研磨中加液氮研磨可以嗎？

參考見解：液氮研磨的方法應該可行的，做動物組織，植物組織多采用這種方法，植物纖維一樣可以用液氮研磨，要有耐心，邊加液氮邊研磨，研磨好后再抽提，應該是可以的。在CTAB法提取DNA時，有一些品種沒有DNA析出，是什么原因？ 參考見解：

1、用預冷的異丙醇來沉淀試試，同時研磨的時候要研的非常非常的細。

2、沒有看到析出物并不代表沒有沉淀，可以繼續下一步試驗，溶解的時候少加一點兒。

3、高離子強度下DNA與CTAB能形成共沉淀。可能DNA就這樣留在沉淀里了。提取DNA配方

CTAB為十六烷基三甲基溴化銨，CTAB提取緩沖液的經典配方

Tris-HCl(pH8.0)提供一個緩沖環境,防止核酸被破壞；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNase活性；

NaCl 提供一個高鹽環境,使DNP充分溶解,存在于液相中；

Cβ-巰基乙醇是抗氧化劑,有效地防止酚氧化成醌,避免褐變,使酚容易去除基因組DNA。

CTAB 4g

NaCl 16.364 g

1M Tris-HCl 20ml(PH8.0)

0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml滅菌

冷卻后0.2-1% 2-巰基乙醇（400ul）氯仿-異戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml異戊醇，搖勻即可。

提取內源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，怎樣更好的抑制內源核酸酶的活性？ 參考見解：在提取內源核酸酶含量豐富的材料的DNA時,可增加裂解液中螯合劑的含量,細胞裂解后的后續操作應盡量輕柔。

用試劑盒對農田土壤的的微生物群落DNA進行提取，雖然總DNA提出來了，可是用細菌的通用引物進行PCR的時候卻怎么也擴不出來，請有沒有什么好的辦法可以解決這個問題？

參考見解：環境特別是土壤的樣品成分復雜，尤其是有腐殖酸具有和DNA類似的性質，因此用一般的國內試劑盒無法提純。應當選用自制的提取方法，在裂解液中加入要加入PVP。洗滌后硅膠膜上仍有雜色殘留？

參考見解：細胞裂解不充分，裂解液和樣品要快速充分混勻。洗滌產物中DNA量很少或沒有？ 參考見解：

1、樣品中細胞或者病毒濃度低。

2、裂解液和樣品混合不均勻造成細胞的裂解不充分。

3、蛋白酶K活性下降造成細胞裂解的不充分。

4、溫浴時間不夠造成的細胞裂解不充分或蛋白降解不完全，盡量把組織切成小塊，延長溫浴時間，使裂解物中沒有顆粒狀物殘留。

5、在上柱前，裂解物中沒有加乙醇，或用低濃度乙醇代替無水乙醇。

6、DNA沒有有效洗脫，提高洗脫效率，可將離心柱在加入洗脫液后在室溫靜止至少1min，再離心。

7、洗脫液pH不合適，低pH值會減少DNA產率，確保洗脫液pH在7.0－8.5之間。8洗脫體積太大，超過200ul洗脫體積所得的DNA濃度會降低，但DNA總量不會減少。

第四篇：dna粗提取和鑒定

dna粗提取和鑒定

實驗用具

洋蔥或其他植物、洗潔精、食鹽、攪拌機或研缽(我們采用的是家用豆漿機)、紗布、漏斗、燒杯、玻璃棒、量筒(10mL一支)、滴管、試管(20mL兩支)、天平，dna粗提取和鑒定。95%酒精、蒸餾水、0.015mol/L的NaCl溶液、二苯胺試劑。

實驗材料的選取

凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但是使用DNA含量相對較高的生物組織，成功的可能性更大。

原理

①加入蒸餾水能使雞血細胞破裂

蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞內，使血細胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。

②加入洗滌劑和食鹽的作用

洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細胞膜，有利于DNA的釋放;食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。

③研磨不充分，對實驗結果產生的影響

研磨不充分會使細胞核內的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實驗結果，導致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。

④此步驟獲得的濾液中可能含有的細胞成分?

可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質。

實驗步驟

1.破碎細胞，獲取含DNA的濾液

動物細胞的破碎比較容易，以雞血細胞為例，在雞血細胞液中加入一定量的蒸餾水，同時用玻璃棒攪拌，過濾后收集濾液即可。如果實驗材料是植物細胞，需要先用洗滌劑溶解細胞膜。例如，提取洋

.蔥的DNA時，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進行充分的攪拌和研磨，過濾后收集研磨液。

2.去除濾液中的雜質

方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同;方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質，不分解DNA;方案三的原理是蛋白質和DNA的變性溫度不同。

注意事項

①用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質;用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質。因此，通過反復溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質。

②方案二是利用蛋白酶分解雜質蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質分開;方案三利用的是DNA和蛋白質對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質變性，與DNA分離。

DNA的析出與鑒定

將處理后的溶液過濾，加入與濾液體積相等、冷卻的酒精溶液，靜置2～3min，溶液中會出現白色絲狀物，這就是粗提取的DNA，鑒定材料《dna粗提取和鑒定》。用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。

取兩支20ml的試管，各加入物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液5ml，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4ml的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變藍。

實驗步驟

1.稱取30克已切碎的洋蔥，放入研缽中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L的氯化鈉溶液，充分研磨。

洋蔥含有揮發性刺激物，有效減少刺激，才能使實驗順利進行。上課前，教師可先將洋蔥放入冰箱冷凍一會兒，使其涼透但又不能結冰;或將洋蔥切成幾大塊，放入清水泡一會兒，讓其揮發性刺激物溶于水，可以減輕刺激。然后將洋蔥切碎備用。研磨的目的主要是使洋蔥細胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化鈉溶液，沒必要將洋蔥研成粥糊狀，后者既浪費時間又影響實驗效果。研磨時，切忌使用攪拌器(榨汁機)。使用攪拌器雖可以提高研磨效率，但攪拌器將洋蔥切成極細小的顆粒，無法通過過濾將洋蔥顆粒剔除。只能將酒精直接倒入濾液中，許多洋蔥小顆粒因為輕會漂浮起來，DNA藏在其中，無法分辨。學生看不到白色纖維狀粘稠物的DNA。

2.研磨后，用漏斗和紗布將汁液過濾到小燒杯中，得到濾液。

3.向濾液中加入95%的酒精溶液20mL，沿燒杯壁緩緩倒入，不要震動或攪拌。

此時，燒杯中的液體分為上、下兩層，下層較渾濁，上層澄清，很快上層溶液中就會有白色纖維狀粘稠物析出，用玻璃棒可將其輕輕卷起。這就是記錄生命遺傳信息的重要物質——DNA。DNA析出的過程中，切忌震動和攪拌(不震動易于分層，我們就能很容易觀察到上清液中的絲狀物;攪拌會使非常柔軟的DNA斷裂成小段，不易取出)。如果用玻璃棒DNA不易卷起，可改用表面打毛的牙簽，DNA提取物就纏繞在牙簽上了。

4.鑒定：取兩支試管，編為1、2號，各加入2mol/L的氯化鈉溶液2mL，向1號試管中加入一些白色纖維狀物，振蕩使其溶解，然后向兩支試管中各加入2mL二苯胺試劑，沸水浴加熱5分鐘。

注意事項

1.以血液為實驗材料時，每100ml血液中需要加入3g檸檬酸鈉防止血液凝固。

2.加入洗滌劑后，動作要輕緩、柔和，否則容易產生大量的泡沫，不利于后續步驟地操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時，動作要輕緩，以免DNA分子的斷裂，導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。

3.二苯胺試劑要現配現用，否則會影響鑒定的效果。

4.DNA的溶解度與NaCl溶液濃度的關系：

當NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時，隨濃度的升高，DNA的溶解度降低;當NaCl溶液濃度高于0.14mol/L時，隨濃度升高，DNA的溶解度升高。

5.盛放雞血細胞液的容器，最好是塑料容器。

雞血細胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于細胞內DNA的含量本來就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會更少。因此，實驗過程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以減少提取過程的DNA的損失。

第五篇：二苯胺試劑鑒定DNA

二苯胺試劑：鑒定 DＮA。

二苯胺試劑得配制

A 液：1。５ g 二苯胺溶于 1００ mL 冰醋酸中,再加 1５ mL 濃硫酸，用棕色瓶保存。如冰醋酸呈結晶狀態，則需加溫后待其熔化，再使用。

B 液：乙醛得體積分數為 0、2％得溶液.配制：將 0、1 mＬ B 液加入到 10 ｍL A 液中，現配現用.DＮA 得粗提取與鑒定

實驗原理

1、DＮA 在ＮａCl 溶液中得溶解度,就是隨著 NａCl 得濃度得變化而改變得。

當ＮaＣl 得物質得量濃度為０、14 ｍol／L 時，DNA 得溶解度最低.利用這一原理,可以使溶解在ＮaＣl 溶液中得ＤＮA 析出。

2、ＤNA 不溶于酒精溶液,但就是細胞中得某些物質則可以溶于酒精溶液.利用這一原理,可以進一步提取出含雜質較少得 DNＡ。

3、DＮA 遇二苯胺(沸水浴）會染成藍色，因此，二苯胺可以作為鑒定 DNA 得試劑。

注意事項

1、步驟 3 析出含 DＮA 得黏稠物中,蒸餾水要沿燒杯內壁緩緩加入,不能一次快速倒入。

2、實驗中有多個步驟都要用玻璃棒進行攪拌，但就是在不同得步驟中玻璃棒得用法不同。

實驗用具

雞血細胞液（５～1０ mL）;體積分數為 95%得冷酒精,蒸餾水，質量濃度為０、１ g/mＬ得檸檬酸鈉溶液，物質得量濃度分別為 2 mol/L 與０.015 mol／L 得 NaCl 溶液,二苯胺試劑；燒杯(10０ mL，1 個, ５０ ｍL，５０0 mL，各 2 個)，漏斗，試管（２0 ｍL,２個），玻璃棒,滴管,量筒（1０0 ｍL，1 個），紗布，鑷子，濾紙，鐵架臺,鐵環，三角架，酒精燈,石棉網,載玻片，試管夾。

實驗原理:

1、析出溶解在 NaC１溶液中得 DＮA。

２、用冷酒精提取出含雜質較少得ＤNA.

３、DNA 在沸水浴時被二苯胺染成藍色。

方法步驟:

１．提取細胞核物質:順時針方向攪拌，稍快,稍重.5 ｍin

2.溶解 DＮA:

3。析出含 DNA 得黏稠物：蒸餾水３００mＬ,逆時針方向攪拌，緩慢

4。過濾：取黏稠物

５。再溶解:順時針方向攪拌，較慢。３ ｍin

6。過濾:取濾液。

7．提取出含雜質較少得 DNA,逆時針方向攪拌，稍慢.5 min

８．DNA 得鑒定:沸水浴５min

【實驗十二】DNA 得粗提取與鑒定

實驗原理

DNA 在氯化鈉溶液中得溶解度,就是隨著氧化鈉得濃度得變化而改變得。當氯化鈉得物質得量濃度為 2 mol/L 時，DNＡ得溶解度最大，濃度為 0.１4 mol/L 時,ＤNA 得溶解度最低。利用這一原理，可以使溶解在氯化鈉溶液中得 DNA 析出.DNA 不溶于９5％得酒精溶液,但就是細胞中得某些物質則可以溶于酒精溶液。利用這一原理,可以進一步提取出含雜質較少得 DNA。

DNA 中含有脫氧核糖,能與二苯胺(沸水浴)反應生成藍色物質，因此,二苯胺可以作為鑒定 DNA 得試劑。

目得要求 1、學會 DNA 得粗提取與鑒定得方法。

２、觀察提取出來得 DNA 物質得顏色與形狀。

材料用具

材料：活雞或鮮血雞血。

儀器:離心機、恒溫水裕鍋、載玻片，玻璃棒，濾紙，滴管，量簡（100 mL,ｌ個),燒杯（10０ mL，l 個,50 mL、5０0 mL 各 ２個)，試管（２0 mL,2 個）,漏斗,試管夾,紗布.試劑:酒精得體積分數為 95%得溶液（實驗前置于冰箱內冷卻 24 h),蒸餾水,檸檬酸鈉得質量濃度為 0。1g/mＬ得溶液,氯化鈉得物質得量濃度分別為 2 mol/L 與 0．015 mol/L 得溶液，二苯胺試劑。

方法步驟

實驗前需要制備雞血細胞液(由教師完成)，制備得方法就是：取檸檬酸鈉得質量濃度為 0。1 g/ｍＬ得溶液（抗凝劑)1０0 mＬ,置于500 mL燒杯中.將宰殺活雞流出得雞血（約１80 mL)注入燒杯中,同時用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸鈉溶液充分混合,以免凝血.然后,將血液倒入離心管內，用 １000 ｒ/min 得離心機離。２ｍiｎ,此時血細胞沉淀于離心管底部。實驗時,用吸管除去離。心管上部得澄清液,就可以得到雞血細胞液.１．提取雞血細胞得細胞核物質

將制備好得雞血細胞液 5 mL～１0ｍＬ，注入到 50 ｍL 燒杯中。向燒杯中加入蒸餾水 20 mL,同時用玻璃棒充分攪拌 5 min,使血細胞加速破裂。然后，用放有紗布得漏斗將血細胞液過濾至５00mL.取其濾液。

２．溶解細胞核內得ＤNA

將氯化鈉得物質得量濃度為 2 mｏｌ得溶液 40ｍＬ加入到濾液中,并搖動燒杯,使其混合均勻,這時 DNＡ在溶液中呈溶解狀態。

３．析出含 DNA 得粘稠物

沿燒杯內壁緩緩加入蒸餾水，同時用玻璃棒不停地輕輕攪拌，這時燒杯中有絲狀物出現，注意觀察絲狀物呈什么顏色。繼續加入蒸餾水，溶液中出現得粘稠物會越來越多.當粘稠物不再增加時停止加入蒸餾水(這時溶液中氯化鈉得物質得量濃度相當于０、1４ moｌ/Ｌ）。

4。濾取含 DNＡ得粘稠物

用放有多層紗布得漏斗，過濾步驟 3 中得溶液至 500ｍL 得燒杯中,含 DNA 得粘稠物被留在紗布上。

5.將ＤＮA 得粘稠物再溶解

取 １個 5０ mL 燒杯,向燒杯內注入氯化鈉得物質得量濃度為 2 mol／L 得溶液 ２0ｍL。用鈍頭鑷子將紗布上得粘稠物夾至氯化鈉溶液中，用玻璃擇不停地攪拌，使粘稠物盡可能多地溶解于溶液中。

６。過濾含有 DNA 得氯化鈉溶液

取１個１00 mL 燒杯，用放有兩層紗布得漏斗過濾步驟 5 中得溶液。取其濾液,DＮＡ溶于濾液中。

７．提取含雜質較少得 DNＡ

在上述濾過得溶液中，加入冷卻得、酒精得體積分數為 ９５％得溶液 50ｍＬ(使用冷卻得酒精，對 DNA 得凝集效果較佳）,并用玻璃棒攪拌，溶液中會出現含雜質較少得絲狀物。用玻璃棒將絲狀物卷起,并用濾紙吸取上面得水分。這種絲狀物得主要成分就就是DNA。注意觀察絲狀物就是什么顏色得.8.ＤNA 得鑒定

取兩支20 mL得試管，各加入氯化鈉得物質得量濃度為0.01５ ｍｏl/L得溶液5 ｍL，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌,使絲狀物溶解.然后,向兩支試管中各加入4mｌL 得二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱 ５ ｍin，待試管冷卻后,觀察并且比較兩支試管中溶液顏色得變化。將觀察得結果填寫在《實驗報告冊》上。

結論

步驟８得 2 支試管中溶液顏色得變化說明了什么？將得出得結論填寫在《實驗報告冊》上.討論

1。提取雞血中得 DNA 時,為什么要除去血液中得上清液？

2．步驟回與步驟 3 中都需要加入蒸餾水,兩次加入得作用相同嗎？為什么？ 3。ＤNA 得直徑約為 20×10-1０ ｍ,實驗中出現得絲狀物得粗細就是否表示 1 個 DNＡ分子直徑得大小？