第一篇：DNA膠回收實(shí)驗技術(shù)總結(jié)

DNA膠回收實(shí)驗技術(shù)總結(jié)

一.提高膠回收量的辦法： 1)增加電泳時的上樣量。2)電泳緩沖液用新鮮配制的。

3)切膠時盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積：含目的片斷很少的膠就不要要了，不然影響回收率。

4)把切的兩塊或多塊膠融化后，無論多大的體積都用一個管子，轉(zhuǎn)移到同一個柱子上。5)溶膠時所加的溶液可多一點(diǎn)，這樣更有利于DNA與膜的結(jié)合，不過一般不要多余750ul。6)膠回收的關(guān)鍵是通過柱子的溶液的鹽濃度、酸堿性（電荷）和疏水性使DNA與柱子結(jié)合，因此，若電泳緩沖液的PH偏高，可在溶膠液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；為了使DNA分子更好的攔截在膜上，可以添加30％異丙醇在加熱溶解膠后的液體里。7)加洗脫液之前，將柱子在室溫放置幾分鐘（大約需10分鐘），以使乙醇充分揮發(fā)。8)最后少加些洗脫液，盡量減少回收體積，一般用30-50μl洗脫液洗脫（不能太少，否則無法浸濕膜反而不利于洗脫）；洗脫液滴在膜中央，以充分洗脫結(jié)合在膜上的DNA。

9)可以在加入洗脫液之后，可以在55度水浴5分鐘或放在50度水浴10分鐘以上再洗脫，或用封口膜密封4度過夜，第二天再離心回收，效果不錯。10)將離心后的洗脫液加回吸附柱，再次離心。

二.幾種PCR 產(chǎn)物回收的詳方法和步驟 1)普通膠回收

如果要膠回收，最好還是用試劑盒，方便，回收率也略高，實(shí)在要手工回收，可以切膠后加入3倍體積TE，水浴熔化后，酚、酚／氯仿抽提干凈，乙醇沉淀即可。另外好像還有冷凍法，沒作過，不是很清楚。2)從低熔點(diǎn)凝膠回收DNA 純化DNA片段 加與凝膠體積相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分鐘保溫，使凝膠完全溶解。待放至室溫，加等量酚（TE飽和，TE封在上層，取下層酚），輕輕混勻（不用混勻），12000rpm，3分鐘離心。反復(fù)1-2次。取上層液，加0.1體積3mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積無水乙醇，進(jìn)行乙醇沉淀。將純化的DNA加適量TE溶解，測定含量，備用（可用于目的基因結(jié)構(gòu)分析，探針制備等）。3)擴(kuò)增特異性好的PCR回收

如果PCR擴(kuò)增特異性好，只是簡單的PCR產(chǎn)物純化回收，可以在PCR產(chǎn)物中加入50ug／ml 的蛋白酶K，37度1h，酚／氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1體積的醋酸鈉，2.5體積的無水乙醇沉淀回收。

三.不需膠回收就可直接連接的方法 1)低溫冷凍析出法

跑電泳時用低熔點(diǎn)的agarose膠，跑到一定時候，將目的條帶所在的那一段膠切下，盡量切干凈，讓核酸直接暴露在膠的表面，并且，把底下沒有脫氧核酸的那點(diǎn)膠也盡量切掉，然后放入1.5ml EP管中，然后放在負(fù)75度冰箱中10－30分鐘，接著1，300rpm離心5－10分鐘，取10ul上清，加入連接體系中。將其余的液體也吸出，儲存在另一個管子中，做好標(biāo)記，放在－20度備用。2)酶切后的直接連接

在你酶切后可以直接的加入連接酶和另外的片斷進(jìn)行連接是可以篩選出連接好的片斷的.四、一些注意事項

1.電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話就是保證切下的帶沒有外源DNA污染。

2.切膠是要把整個目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對比較薄的膠來做，只要夠點(diǎn)樣即可，也可采用薄而寬的梳子來跑膠。

3.關(guān)于防護(hù)，在一般有機(jī)玻璃后就足夠了，戴上防護(hù)面具以保護(hù)眼睛，如果你戴樹脂眼鏡就可以了。

4.瓊脂糖對回收率有一定影響，如果瓊脂糖較多，可以增加溶膠液，保證體系鹽濃度。影響回收率的因素主要是柱子填料必須在適宜的緩沖環(huán)境中（如果用柱子的話）。對于小于１００ｂｐ的片段回收，可加至30%異丙醇。

5.如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，槍頭搗碎，過夜浸泡，即可。當(dāng)然你要將100bp在膠中位置定好切下。已標(biāo)記的探針用X片，未標(biāo)記的用EB。6.選用回收效率較高的柱子，比如進(jìn)口的Qiaquick spin column。

7.參照分子克隆用低熔點(diǎn)膠回收。除低熔點(diǎn)凝膠回收法外，如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方法回收DNA片段。

附注：

1．影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：

1)DNA分子大小遷移速率U與logN成反比（N為堿基對數(shù)目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結(jié)構(gòu)重復(fù)性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結(jié)構(gòu)緊密的電泳快（超螺旋>線性DNA）

2)瓊脂糖濃度：logU=logU0 Krt 膠濃度，U為遷移率，U0 為DNA的自由電泳遷移率，t為膠濃度，Kr為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNA Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb 1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.3)DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>單鏈開環(huán)。當(dāng)條件變化時，情況會相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及EB含量有關(guān)。

4)所加電壓：低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過5V/cm 5)堿基組成與溫度：一般影響不大4-30 ℃

6)嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)7)電泳緩沖液（0.5×TBE）的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的遷移率，無離子存在時，核酸基本不泳動，離子強(qiáng)度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導(dǎo)致DNA變性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。

2．溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時應(yīng)戴手套，盡量減少臺面污染。3．電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)（bromophenol blue, Bb）呈藍(lán)紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。

第二篇：膠回收及要點(diǎn)心得體會

膠回收的心得體會

膠回收

1.提高膠回收量的辦法： 1)增加電泳時的上樣量。2)電泳緩沖液用新鮮配制的。

3)切膠時盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積：含目的片斷很少的膠就不要要了，不然影響回收率。

4)把切的兩塊或多塊膠融化后，無論多大的體積都用一個管子，轉(zhuǎn)移到同一個柱子上。5)溶膠時所加的溶液可多一點(diǎn)，這樣更有利于DNA與膜的結(jié)合，不過一般不要多余750ul。6)膠回收的關(guān)鍵是通過柱子的溶液的鹽濃度、酸堿性（電荷）和疏水性使DNA與柱子結(jié)合，因此，若電泳緩沖液的PH偏高，可在溶膠液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；為了使DNA分子更好的攔截在膜上，可以添加30％異丙醇在加熱溶解膠后的液體里。7)加洗脫液之前，將柱子在室溫放置幾分鐘（大約需10分鐘），以使乙醇充分揮發(fā)。8)最后少加些洗脫液，盡量減少回收體積，一般用30-50μl洗脫液洗脫（不能太少，否則無法浸濕膜反而不利于洗脫）；洗脫液滴在膜中央，以充分洗脫結(jié)合在膜上的DNA。

9)可以在加入洗脫液之后，可以在55度水浴5分鐘或放在50度水浴10分鐘以上再洗脫，或用封口膜密封4度過夜，第二天再離心回收，效果不錯。10)將離心后的洗脫液加回吸附柱，再次離心。2.幾種PCR 產(chǎn)物回收的詳方法和步驟 1)普通膠回收

如果要膠回收，最好還是用試劑盒，方便，回收率也略高，實(shí)在要手工回收，可以切膠后加入3倍體積TE，水浴熔化后，酚、酚／氯仿抽提干凈，乙醇沉淀即可。另外好像還有冷凍法，沒作過，不是很清楚。2)從低熔點(diǎn)凝膠回收DNA 純化DNA片段 加與凝膠體積相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分鐘保溫，使凝膠完全溶解。待放至室溫，加等量酚（TE飽和，TE封在上層，取下層酚），輕輕混勻（不用混勻），12000rpm，3分鐘離心。反復(fù)1-2次。取上層液，加0.1體積3mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積無水乙醇，進(jìn)行乙醇沉淀。將純化的DNA加適量TE溶解，測定含量，備用（可用于目的基因結(jié)構(gòu)分析，探針制備等）。3)擴(kuò)增特異性好的PCR回收

如果PCR擴(kuò)增特異性好，只是簡單的PCR產(chǎn)物純化回收，可以在PCR產(chǎn)物中加入50ug／ml 的蛋白酶K，37度1h，酚／氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1體積的醋酸鈉，2.5體積的無水乙醇沉淀回收。3.不需膠回收就可直接連接的方法 1)低溫冷凍析出法

跑電泳時用低熔點(diǎn)的agarose膠，跑到一定時候，將目的條帶所在的那一段膠切下，盡量切干凈，讓核酸直接暴露在膠的表面，并且，把底下沒有脫氧核酸的那點(diǎn)膠也盡量切掉，然后放入1.5ml EP管中，然后放在負(fù)75度冰箱中10－30分鐘，接著1，300rpm離心5－10分鐘，取10ul上清，加入連接體系中。將其余的液體也吸出，儲存在另一個管子中，做好標(biāo)記，放在－20度備用。2)酶切后的直接連接

在你酶切后可以直接的加入連接酶和另外的片斷進(jìn)行連接是可以篩選出連接好的片斷的.1.瓊脂糖對回收率有一定影響，如果瓊脂糖較多，可以增加溶膠液，保證體系鹽濃度。影響回收率的因素主要是柱子填料必須在適宜的緩沖環(huán)境中（如果用柱子的話）。對于小于１００ｂｐ的片段回收，可加至30%異丙醇。

2.如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，槍頭搗碎，過夜浸泡，即可。當(dāng)然你要將100bp在膠中位置定好切下。已標(biāo)記的探針用X片，未標(biāo)記的用EB。3.選用回收效率較高的柱子，比如進(jìn)口的Qiaquick spin column。

4.參照分子克隆用低熔點(diǎn)膠回收。除低熔點(diǎn)凝膠回收法外，如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方法回收DNA片段。

第三篇：膠回收注意事項以及感受態(tài)細(xì)胞的制作

膠回收DNA注意事項

①切膠回收DNA片段是要把整個目的片斷所在位置的膠全部回收。所以為了減少膠的體積，我們 就可以用相對比較薄的膠來跑電泳，通常只要夠點(diǎn)樣即可，或是采用薄而寬的梳子來跑膠。這樣可減少回收試劑引起的一些后續(xù)麻煩。

②主要還是DNA的濃度，如果DNA濃度不夠，想膠小點(diǎn)也不可能。

③紫外燈下切下含待回收DNA的凝膠時，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。

④利用凝膠回收試劑盒DNA回收效率較低或者未回收到目的片段可能有以下幾個原因：膠塊未完 全溶解，可適當(dāng)延長水浴時間，并增加上下顛倒次數(shù)輔助溶解；膠塊體積太大，應(yīng)先將其切為小塊，分多次回收；電泳緩沖液pH太高，硅基質(zhì)膜在高鹽低pH結(jié)合 DNA，如pH太高，應(yīng)作適當(dāng)調(diào)整；漂洗液中未加入無水乙醇。

⑤可以改用去離子水洗脫。但是實(shí)驗室所用純水一般pH偏低，可利用NaOH適當(dāng)調(diào)高其pH 值，以增加洗脫得率。

⑥洗脫產(chǎn)物含有殘留的乙醇會影響后續(xù)酶切實(shí)驗，請確保徹底去除漂洗緩沖液，具體方法參見回收 效率低的解決方案。

⑦不可以使用更小洗脫體積（小于說明書提供的最小洗脫體積）進(jìn)行洗脫以提高濃度，因為說明書 提供的最少洗脫體積是能完全覆蓋吸附膜的最小體積，若減少體積則不能將DNA完全洗脫下來。

⑧電泳檢測只有一條目的帶，可以選用凝膠回收試劑盒。如果后續(xù)實(shí)驗對片段純度要求較高，建議 即使只有一條帶，也可以切膠純化，其回收得到片段的純度可能要比直接回收高一些。⑨瓊脂糖凝膠膠塊不溶可能是下述原因：瓊脂糖質(zhì)量不好；含目的片段的凝膠再空氣中放置過久，使膠塊失水、干燥，建議切膠后立即進(jìn)行回收或?qū)⒛z塊保存在4℃或-20℃；制膠的電泳緩沖液濃度過高或陳舊。關(guān)于膠回收切膠的一點(diǎn)注意事項

1.電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話就是保證切下的帶沒有外源dna污染。

2.切膠是要把整個目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對比較薄的膠來做，只要夠點(diǎn)樣即可，也可采用薄而寬的梳子來跑膠。

3.關(guān)于防護(hù)，在一般有機(jī)玻璃后就足夠了，戴上防護(hù)面具以保護(hù)眼睛，如果戴樹脂眼鏡就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者對于膠有特殊要求，例如要求不含 EB，可以采用點(diǎn)marker和帶刻度的尺子一起照相的方法來確定目的條帶在膠上的位置進(jìn)行切膠。

4.按照正常程序點(diǎn)marker跑膠，然后切下有marker的膠，EB染色，紫外燈下與帶刻度的尺子一起照相。由于要回收的帶與marker間的相對位置已 知，根據(jù)尺子來衡量未染色膠上目的帶的位置即可。如果覺得很難判斷，可以直接在marker邊點(diǎn)少量的樣，這樣位置就容易確定了。

一.提高膠回收量的辦法

1)增加電泳時的上樣量。

2)電泳緩沖液用新鮮配制的。

3)切膠時盡量只切有條帶的膠，減小切膠體積：含目的片斷很少的膠就不要要了，不然影響回收率。

4)把切的兩塊或多塊膠融化后，無論多大的體積都用一個管子，轉(zhuǎn)移到同一個柱子上。

5)溶膠時所加的溶液可多一點(diǎn)，這樣更有利于DNA與膜的結(jié)合，不過一般不要多余750ul。

6)膠回收的關(guān)鍵是通過柱子的溶液的鹽濃度、酸堿性（電荷）和疏水性使DNA與柱子結(jié)合，因此，若電泳緩沖液的PH偏高，可在溶膠液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；為了使DNA分子更好的攔截在膜上，可以添加30%異丙醇在加熱溶解膠后的液體里。

7)加洗脫液之前，將柱子在室溫放置幾分鐘（大約需10分鐘），以使乙醇充分揮發(fā)。

8)最后少加些洗脫液，盡量減少回收體積，一般用30-50μl洗脫液洗脫（不能太少，否則無法浸濕膜反而不利于洗脫）；洗脫液滴在膜中央，以充分洗脫結(jié)合在膜上的DNA。

9)可以在加入洗脫液之后，可以在55度水浴5分鐘或放在50度水浴10分鐘以上再洗脫，或用封口膜密封4度過夜，第二天再離心回收，效果不錯。

10)將離心后的洗脫液加回吸附柱，再次離心。

二.幾種PCR產(chǎn)物回收的詳方法和步驟

1)普通膠回收

如果要膠回收，最好還是用試劑盒，方便，回收率也略高，實(shí)在要手工回收，可以切膠后加入3倍體積TE，水浴熔化后，酚、酚/氯仿抽提干凈，乙醇沉淀即可。另外好像還有冷凍法，沒作過，不是很清楚。

2)從低熔點(diǎn)凝膠回收DNA

純化DNA片段 加與凝膠體積相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分鐘保溫，使凝膠完全溶解。待放至室溫，加等量酚（TE飽和，TE封在上層，取下層酚），輕輕混勻（不用混勻），12000rpm，3分鐘離心。反復(fù)1-2次。取上層液，加0.1體積3mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積無水乙醇，進(jìn)行乙醇沉淀。將純化的DNA加適量TE溶解，測定含量，備用（可用于目的基因結(jié)構(gòu)分析，探針制備等）。

3)擴(kuò)增特異性好的PCR回收

如果PCR擴(kuò)增特異性好，只是簡單的PCR產(chǎn)物純化回收，可以在PCR產(chǎn)物中加入50ug/ml 的蛋白酶K，37度1h，酚/氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1體積的醋酸鈉，2.5體積的無水乙醇沉淀回收。

三.不需膠回收就可直接連接的方法

1)低溫冷凍析出法

跑電泳時用低熔點(diǎn)的agarose膠，跑到一定時候，將目的條帶所在的那一段膠切下，盡量切干凈，讓核酸直接暴露在膠的表面，并且，把底下沒有脫氧核酸的那點(diǎn)膠也盡量切掉，然后放入1.5ml EP管中，然后放在負(fù)75度冰箱中10－30分鐘，接著1，300rpm離心5－10分鐘，取10ul上清，加入連接體系中。將其余的液體也吸出，儲存在另一個管子中，做好標(biāo)記，放在－20度備用。

2)酶切后的直接連接

在你酶切后可以直接的加入連接酶和另外的片斷進(jìn)行連接是可以篩選出連接好的片斷的。四、一些注意事項

1.電泳的buffer和gel都是新制的，切膠的臺子清理干凈，刀片最好洗凈滅菌，總之一句話就是保證切下的帶沒有外源DNA污染。

2.切膠是要把整個目的片斷所在位置的膠全部回收。為了減少膠的體積，可以用相對比較薄的膠來做，只要夠點(diǎn)樣即可，也可采用薄而寬的梳子來跑膠。

3.關(guān)于防護(hù)，在一般有機(jī)玻璃后就足夠了，戴上防護(hù)面具以保護(hù)眼睛，如果你戴樹脂眼鏡就可以了。

4.瓊脂糖對回收率有一定影響，如果瓊脂糖較多，可以增加溶膠液，保證體系鹽濃度。影響回收率的因素主要是柱子填料必須在適宜的緩沖環(huán)境中（如果用柱子的話）。對于小于１００ｂｐ的片段回收，可加至30%異丙醇。

5.如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，槍頭搗碎，過夜浸泡，即可。當(dāng)然你要將100bp在膠中位置定好切下。已標(biāo)記的探針用X片，未標(biāo)記的用EB。

6.選用回收效率較高的柱子，比如進(jìn)口的Qiaquick spin column。

7.參照分子克隆用低熔點(diǎn)膠回收。除低熔點(diǎn)凝膠回收法外，如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方法回收DNA片段。

附注：影響DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素：

1)DNA分子大小 遷移速率U與logN成反比（N為堿基對數(shù)目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結(jié)構(gòu)重復(fù)性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結(jié)構(gòu)緊密的電泳快（超螺旋>線性DNA）

2)瓊脂糖濃度：logU=logU0 Krt 膠濃度，U為遷移率，U0 為DNA的自由電泳遷移率，t為膠濃度，Kr為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNA Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb 1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.3)DNA構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀>線狀DNA>單鏈開環(huán)。當(dāng)條件變化時，情況會相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及EB含量有關(guān)。

4)所加電壓：低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過5V/cm

5)堿基組成與溫度：一般影響不大4-30 ℃

6)嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)

7)電泳緩沖液（0.5×TBE）的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的遷移率，無離子存在時，核酸基本不泳動，離子強(qiáng)度過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導(dǎo)致DNA變性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。

2．溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時應(yīng)戴手套，盡量減少臺面污染。

3．電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)（bromophenol blue, Bb）呈藍(lán)紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。

二、實(shí)驗原理

首先利用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳DNA片段，分離目的條帶DNA，然后紫外光下切割含目的DNA條帶的膠塊，利用膠回收試劑盒回收純化DNA片段。試劑盒的膠回收柱采用特殊硅基質(zhì)材料在一定的高鹽緩沖系統(tǒng)下高效、專一地吸附DNA、RNA的原理，配備設(shè)計獨(dú)特的離心吸附柱式結(jié)構(gòu)，使用常規(guī)臺式高速離心機(jī)，在幾分鐘之內(nèi)即可以高效回收核酸片段。

儀器與試劑

1、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)

2、紫外觀察分析儀

3、離心機(jī)

4、單面刀片

5、恒溫水浴鍋

注意事項：

? 切膠時應(yīng)快速操作，在紫外燈下時間長容易傷害到眼睛；

? 溴化乙錠染色后的DNA易受紫外光破壞，故盡量放置于暗室，切帶時應(yīng)使用長波長紫外燈，切膠時間盡量短。

? 膠塊一定要充分融化，否則將會嚴(yán)重影響DNA的回收率。? 把洗脫液加熱，使用時有利于提高洗脫液效率。

回收產(chǎn)物質(zhì)量： 回收產(chǎn)物的質(zhì)量主要指純度。常規(guī)電泳過程中，普通級別的瓊脂糖自帶的一些性狀不明的多糖，會連同 DNA 一起從凝膠中抽提出來，會強(qiáng)烈抑制后繼的連接、酶切、或者標(biāo)記、擴(kuò)增等實(shí)驗。從凝膠中回收 DNA 片斷，產(chǎn)物的純度自然是我們考慮的第一要務(wù)。對于大片斷 DNA 回收，質(zhì)量還包括了產(chǎn)物的完整與否，如果機(jī)械剪切力使得回收產(chǎn)物大小不一致，后果決不是你希望碰見的。而對于較小片斷回收，質(zhì)量其實(shí)還包括了回收產(chǎn)物的濃度。因為產(chǎn)物濃度太小，對后繼實(shí)驗同樣也有影響，比如連接、標(biāo)記實(shí)驗等等就很不爽，往往不得不再濃縮一次，增加了操作的復(fù)雜性。此外，極微量的純化介質(zhì)或者是某些試劑混入回收產(chǎn)物中也會對結(jié)果產(chǎn)生致命的影響。

回收率：回收得率，是我們考慮的另一個重要參數(shù)。由于上電泳的樣品量通常都很少，電泳的過程本身也會導(dǎo)致樣品的分散和損失，因而盡可能多的回收電泳凝膠條帶中的目的片斷，提高產(chǎn)物得率，對于后繼實(shí)驗來說是非常重要的。回收率的多少通常和回收產(chǎn)物的大小以及量的多少有關(guān)，比如 DNA 片斷越大，和固相基質(zhì)的結(jié)合力越強(qiáng)，就越難洗脫，回收率就低； 又比如說，DNA 的量越少，相對損失越大，回收率越低。因此，根據(jù)情況選擇不同的方法是很重要的。值得注意的是，由于樣品的大小和多少對回收率都有顯著的影響，所以回收率并非是一成不變的。雖然是幾乎不需要實(shí)驗技巧的簡單操作，如果你注意到一些小技巧 還是很有幫助的。DNA 回收純度取決于純化介質(zhì)對 DNA 吸附的特異性、洗滌雜質(zhì)是否徹底。而 DNA 回收率和濃度則與 elution buffer 的體積，以及 buffer 在柱子上停留的時間有關(guān)。較大的洗脫體積可以提高回收率，充分洗脫，但是會造成產(chǎn)物濃度太低不好用。

一、實(shí)驗原理

大腸桿菌經(jīng)過處理后可以攝取外源 DNA（Plasmid DNA、Phage DNA 等），處于這種狀態(tài)的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞（Competent Cell）。在基因工程實(shí)驗中，經(jīng)常要使用各種感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行 DNA 的轉(zhuǎn)化操作。實(shí)驗使用的感受態(tài)細(xì)胞的來源大體可以分為兩種： 一種是購買商品化的感受態(tài)細(xì)胞，但商品化感受態(tài)細(xì)胞成本高、運(yùn)輸及保存有一定困難（超低溫）；另一種是自己制備感受態(tài)細(xì)胞，實(shí)驗人員自己制作感受態(tài)細(xì)胞時，往往受到各種試劑及實(shí)驗條件等限制，制備的感受態(tài)細(xì)胞效率低，達(dá)不到實(shí)驗要求。目前，感受態(tài)細(xì)胞的制備常用冰預(yù)冷的CaCl2處理細(xì)菌的方法制備，即用低滲CaCl2溶液在低溫（0℃）時處理快速生長的細(xì)菌，從而獲得感受態(tài)細(xì)菌。此時細(xì)菌膨脹成球形，外源DNA分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基－鈣磷酸復(fù)合物粘附在細(xì)菌表面，通過熱激作用促進(jìn)細(xì)胞對DNA的吸收。在一定條件下，經(jīng)過連接后的DNA片段與感受態(tài)細(xì)胞混合保溫，可以進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞的DNA分子通過復(fù)制、表達(dá)，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，即可篩選出轉(zhuǎn)化體，即帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞。

二、實(shí)驗所需器材和試劑

器材：恒溫?fù)u床，電熱恒溫培養(yǎng)箱，臺式高速離心機(jī)，無菌工作臺，低溫冰箱，恒溫水浴鍋，制冰機(jī)，分光光度計，微量移液槍。

試劑：

1.LB固體和液體培養(yǎng)基。

2.含特定抗生素的LB固體培養(yǎng)基。3.100mM CaCl2溶液。

4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 稱取0.28g CaCl2(無水，分析純)，溶于50ml重蒸水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高壓滅菌。5.待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。

四、實(shí)驗注意事項 1.制作感受態(tài)細(xì)胞時應(yīng)使用專用的玻璃器皿或塑料容器。洗刷這些玻璃器皿或塑料容器時應(yīng)盡量洗凈。由于微量的洗滌劑或污染物都可能降低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，因此在洗刷完用于制作感受態(tài)細(xì)胞的專用玻璃器皿或塑料容器后，最好用去離子水浸泡一晚，然后再充分洗凈。

2.制作感受態(tài)細(xì)胞時使用的菌種，不應(yīng)使用4℃或常溫保存的傳代細(xì)菌。應(yīng)使用-70℃保存的菌種，在LB/抗生素平板培養(yǎng)基上分級劃線培養(yǎng)后，挑取單菌落。使用這種菌種制作的感受態(tài)細(xì)胞，能提高轉(zhuǎn)化效率。

3.培養(yǎng)感受態(tài)細(xì)胞制備用菌體時，OD 600值的測定應(yīng)隨時進(jìn)行，以使 OD 600 值控制在0.35～0.5之間。如果 OD 600值超出此范圍，可能降低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

4.用于感受態(tài)細(xì)胞制備的菌體培養(yǎng)停止后要立即處理，不要將培養(yǎng)液過長時間室溫放置，在冰中放置時也不要時間過長。

5.感受態(tài)細(xì)胞的制備操作過程中，離心后棄上清時要盡量棄盡，否則會降低感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

6.使用 Solution A、Solution B 懸浮沉淀時要用手指輕輕彈動 Microtube 管壁，禁止劇烈震蕩操作。

7.為了有效確認(rèn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，最好制作一批高純度的質(zhì)粒 DNA 分裝低溫（-20℃）保存，用作陽性對照，以確認(rèn)每批制作的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

感受態(tài)細(xì)胞的制備方法

1.菌種純化

① 使用LB/抗生素平板培養(yǎng)基（根據(jù)菌種性質(zhì)加入適當(dāng)?shù)目股兀媒臃N針挑取大腸桿菌（-70℃甘油保存菌），在平板培養(yǎng)基上分級劃線，以能夠出現(xiàn)單菌落為宜。

② 將上述劃線的平板培養(yǎng)基倒置于恒溫培養(yǎng)箱中 37℃過夜培養(yǎng)。

2.菌體培養(yǎng)

① 取20 ml φb×broth移至100 ml三角燒瓶中，塞上棉塞后高溫高壓滅菌，然后冷卻至室溫。

② 在劃線平板培養(yǎng)基上挑取單菌落，接種到①的培養(yǎng)基中。

③ 37℃振蕩（約 120 rpm）培養(yǎng)。

④ 測定OD 600值，當(dāng) OD 600 值達(dá)到0.35～0.5時（約培養(yǎng)5小時）放置冰中停止培養(yǎng)（如果 OD 600值超出此范圍將不能保證感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率）。

⑤ 進(jìn)行下一步操作。

3.感受態(tài)細(xì)胞的制備 ① 取上述菌體培養(yǎng)液 1 ml 于 1.5 ml Microtube 中（根據(jù)需要量確定 Microtube 數(shù)量）

② 1，500×g（一般的微型離心機(jī)約 4，000 rpm）4℃離心 5 分鐘，棄上清（注意盡量除盡上清）

③ 在每個 Microtube 中加入 100 μl 冰中預(yù)冷的 Solution A，輕輕彈動 Microtube 使沉淀懸浮，禁止劇烈振蕩

④ 1，500×g（一般的微型離心機(jī)約 4，000 rpm）4℃離心 5 分鐘，棄上清（注意盡量除盡上清）

⑤ 在每個 Microtube 中加入 100 μl 冰中預(yù)冷的 Solution B，輕輕彈動 Microtube 使沉淀懸浮，禁止劇烈振蕩

⑥ 感受態(tài)細(xì)胞制作完成。本感受態(tài)細(xì)胞可以直接用于 DNA 的轉(zhuǎn)化實(shí)驗，也可以于-80℃中保存，以備以后使用。在-80℃保存時，可以有效保存一年以上，但不能反復(fù)凍融，一旦融解后，不能再進(jìn)行-80℃保存

感受態(tài)細(xì)胞的 DNA 轉(zhuǎn)化

1.將-80℃保存的感受態(tài)細(xì)胞置于冰中融化 10 分鐘。

2.取 100 μl 的感受態(tài)細(xì)胞移至新的轉(zhuǎn)化管中。

3.向感受態(tài)細(xì)胞中加入 0.1 ng～10 ng（3 μl～10 μl）的轉(zhuǎn)化用 DNA，輕輕混勻后冰中放置 30 分鐘。

4.42℃水浴中放置 45 秒鐘后，立即于冰中放置 1～2 分鐘。

5.加入 890 μl 37℃預(yù)溫的 SOC 培養(yǎng)基。

6.37℃振蕩培養(yǎng) 1 小時。

7.取適量涂平板后，將平板倒置于 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一夜。

8.確認(rèn)培養(yǎng)菌落，進(jìn)行下步實(shí)驗。

為了提高轉(zhuǎn)化效率，實(shí)驗中要考慮以下幾個重要因素：

1.細(xì)胞生長狀態(tài)和密度: 細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時 為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600 來控制。

2.質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%。

3.試劑的質(zhì)量: 所用的試劑，如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。

4.防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行。

第四篇：現(xiàn)代教育技術(shù) 實(shí)驗總結(jié)

實(shí)驗報告

課題名稱：資源檢索

參與人員：12小組全體人員---指導(dǎo)老師：趙老師

實(shí)驗過程：我們小組的每個成員都按照趙老師的要求，分別查找并訪問與英語教學(xué)及師范教育相關(guān)的資源庫，且利用其提供的數(shù)字化資源學(xué)習(xí)和檢索了與本專業(yè)內(nèi)容相關(guān)的資料。我們每個成員還分別訪問了中國知網(wǎng)，并在中國知網(wǎng)上找了一些與英語教學(xué)相關(guān)的學(xué)術(shù)論文。實(shí)驗?zāi)康模菏炀氝\(yùn)用數(shù)字化圖書資源

心得體會：本實(shí)驗名為信息及信息檢索，在本實(shí)驗的完成過程中，首先，我們小組的每個成員都按照要求進(jìn)行了操作，基本達(dá)到了實(shí)驗?zāi)康?熟練運(yùn)用數(shù)字化圖書資源)隨著因特網(wǎng)和計算機(jī)的普及，教師這個職業(yè)也不再像人們傳統(tǒng)印象中的那樣，只需要教師，黑板和粉筆等就能很好的完成教學(xué)任務(wù)，達(dá)到教學(xué)目標(biāo)。現(xiàn)代教育對教師的要求更高。其中，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)快速檢索有效信息變得尤為重要。

在本實(shí)驗中，我們小組每個成員利用我校數(shù)字圖書館網(wǎng)站中提供的數(shù)字資源對與英語教學(xué)有關(guān)資源在資源庫里進(jìn)行了檢索。（泰克貝思師范教育專題數(shù)據(jù)庫、環(huán)球英語多媒體數(shù)據(jù)庫、超星數(shù)字圖書館）。這些數(shù)據(jù)庫提供的資源非常豐富，類別很全。我們利用這些數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查找或者檢索一些信息就非常方便快捷了。隨后，我們登錄了中國知網(wǎng)，在知網(wǎng)上檢索了一些與教育相關(guān)的學(xué)術(shù)論文，以便于日后能夠在此網(wǎng)站快速查找到所需資源。面對互聯(lián)網(wǎng)時代，信息資源的豐富化、多樣化和復(fù)雜化，從繁瑣的信息資源中獲取我們需要的信息變得尤為重要。尤其是在教師專業(yè)化的背景下，教育技術(shù)能力已經(jīng)成為教師專業(yè)能力結(jié)構(gòu)的重要組成之一。所以，掌握并熟練運(yùn)用數(shù)字化圖書資源是非常重要。以上就是本小組對此次實(shí)驗的心得體會。

第五篇：打膠安全技術(shù)交底

吊板打膠安全技術(shù)交底

為確保金長安大廈外立面，甩繩吊板打膠部位施工的安全順利進(jìn)行及打膠操作人員的人身安全，特作出以下交底：

1、打膠施工人員必須經(jīng)過專門培訓(xùn)，經(jīng)過安全生產(chǎn)管理局考試合格佩發(fā)高空作業(yè)上崗證；

2、凡患有高血壓、低血壓、心臟病、癲癇病、暈高癥等不適應(yīng)高空作業(yè)者，不能進(jìn)行高空打膠施工作業(yè)；

3、打膠施工前必須檢查所用繩子是否有磨損、斷股，滑板是否可靠，安全鎖是否正常，繩子物體是否牢固，繩子綁扎是否緊固；

4、在施工部位甩繩時，必須將主繩和安全繩甩到地面，嚴(yán)禁將繩子甩在半空中進(jìn)行打膠施工；

5、將主繩和安全繩甩到地面后，另一端綁扎在屋面牢固物體上，且要在對繩子易造成磨損位置加設(shè)膠墊等物品進(jìn)行保護(hù)，并要派專人進(jìn)行看護(hù)；

6、在打膠施工區(qū)域下方，拉設(shè)警戒線、掛警示牌，派專人進(jìn)行看護(hù)，嚴(yán)防無關(guān)人員進(jìn)入施工區(qū)域；

7、打膠施工中所使用的工具（膠槍、刮刀、毛刷等），材料（密封膠、美文紙、泡沫棒等），必須栓繩、裝袋，系在可靠位置或背在身上，以防高空墜落；

8、打膠施工時，施工人員必須戴好安全帽，系掛好安全帶，安全帶要高掛低用，掛在安全鎖上，安全帽要系好帽扣；

9、打膠施工時，每組施工班組施工必須要有主繩和安全繩，嚴(yán)禁不使用或不配備安全繩進(jìn)行打膠作業(yè)施工；

10、打膠人員在操作過程中，要時刻謹(jǐn)慎、注意力集中，要隨時注意作業(yè)行程空間內(nèi)有無障礙物或?qū)K子造成磨損、切割的其他鋒利物體；

11、在移動作業(yè)面下滑時，要緩慢滑行，嚴(yán)禁左右擺動急劇下滑或做其他危險性動作；12、13、作業(yè)時施工人員嚴(yán)禁在高空嬉戲、打鬧，嚴(yán)禁站在滑板上進(jìn)行施工作業(yè)； 在施工作業(yè)中，使用的美文紙、泡沫棒及剩下的膠皮，嚴(yán)禁在高空亂扔，必須存放在隨身攜帶的箱袋中，下到地面后統(tǒng)一送到垃圾箱；

14、頂層及首層看護(hù)人員，在打膠操作人員未下到地面前，要堅守崗位，隨時觀察主繩及安全繩的牢固可靠性，地面看護(hù)人員要嚴(yán)防無關(guān)人員進(jìn)入打膠區(qū)域內(nèi)，嚴(yán)禁私自離崗；

15、打膠施工中產(chǎn)生的多余密封膠，要裝入專門器皿內(nèi)，嚴(yán)禁到處亂涂亂抹，污染已完成成品面。

另：對各立面的打膠質(zhì)量明確如下：

1、打膠前必須用毛刷或棉紗等，對膠縫進(jìn)行除塵處理；

2、根據(jù)膠縫的大小合理填充泡沫棒，泡沫棒填充要均勻、合理無遺漏；

交底單位：北京沈飛鋁業(yè)幕墻工程有限公司

交底人：

接受交底單位：

接受人：