第一篇：PCR過程問題全解

如何防止PCR形成引物二聚體？

在PCR后的電泳帶形成很寬很亮的帶，對照marker時都不容易看出其大小，具體是什么原因呢？PCR時模板DNA濃度一般是多少最合適？

答：1這條亮帶如果在100bp一下就可以考慮是引物二聚體了，形成引物二聚體的原因很多，如引物設計的不好，在兩端容易形成回文結構或是兩條引物之間也可能會互補配對；退火溫度沒有達到最佳，實在不行就做個溫度梯度吧；再就是試著改變一下循環數，也許會有幫助。

PCR模板大約在104-106個拷貝。

答2：我覺得是目的條帶含量太多了，如果點樣太多，負載量太大，就會造成跑膠時條帶太寬。可以試著減少模板量，稀釋10倍或是減少循環數。

答3：1.從引物自身著手，重新設計引物，這是最根本解決這一問題的辦法；

2.可能模板有問題；PCR后的電泳帶形成很寬很亮的帶，可能是模板濃度過高或者循環次數過多所導致；

3.Taq酶，引物，Mg2+濃度可能過高，可降低它們的濃度；

4.取你所要加的上下游引物混合后，在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘，然后迅速拿出至于冰塊之上瞬時冷卻，這時再加入反應體系當中，引物二聚體就會消失的；

5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增強特異性；

6.PCR反應體系的配制在冰上進行，最后加TAq酶，PCR結束后，產物勿放置在室溫下過長時間，有人認為室溫下有些Taq酶會將多余的引物合成為二聚體。

7.增加循環數可以適當降低引物二聚體；

8.降低退火溫度后有條帶，則應逐漸提高溫度，若提高溫度的同時產物量減少，則考慮增加鎂離子濃度（根據擴增片斷長度而定，片段長則相應鎂離子濃度應該高一些）；

9.若降低退火溫度，發現還是只有引物二聚體，而且鎂離子的濃度在 20-25mmol/l沒有區別，則考慮Buffer等試劑沒有完全融解、混勻，導致吸取的試劑濃度不對。

10.以上次的pcr產物作模板二次pcr，可以提高引物與模板的特異性，減少引物二聚體，如果兩次時間間隔短的話，可以把原產物稀釋100－1000倍，如果間隔較長可以稀釋50－100倍。

PCR假陰性的原因分析

PCR的假陽性問題是在PCR誕生之初就被深刻認識到了，同時由于造成假陽性的因素相對單一，因此假陽性并不是困惑檢驗工作的主要原因。如果一個項目只是陽性率高敏感性好的話，那么可以認為其陰性結果具備很高的可排除性，仍然有相當的臨床適用價值。但PCR的假陰性在檢驗工作中仍很嚴重，并且用些因素經常被人忽略，嚴重的影響了PCR的使用。可以想象一種假陽性和假陰性都很高的項目，有什么樣的診斷價值。造成PCR假陰性的原因是復雜的，也是多樣的。主要有：

1.PCR儀本身的質量問題。PCR儀設計原理上的差異和經常出現的質量問題（如：溫控不準等）給臨床帶來了諸如非特異性擴增（假陽性）、擴增效率下降(假陰性）等問題.2.離心機問題。離心機的質量或使用不正確，造成離心標本模板沒有分離出來造成假陰性，竊以為這是最易被忽視的問題。其時離心機使用問題不僅在PCR，在整個檢驗工作中都是最易被忽視的問題，只是因為在其他工作中不象PCR那樣明顯影響檢測結果罷了。

離心機是常用的固液分離設備，其利用離心過程中的離心力而將密度不同的物質分離出來。因此離心機的關鍵在于離心加速度而不是轉速，根據牛頓定律可知離心力加速度與轉速和有效半徑的有關的，因此對于不同有效半徑的離心機相同的轉速其離心加速度是不同的，轉速的調節要因離心機而異，但很遺憾，日常工作中忽視了這個問題。有效半徑短的離心加速度就小，同樣的時間離心效果就差可能造成分離不出導致假陰性。同時由于高速離心機高速旋轉與空氣摩擦會產生大量的熱，因此對于稱能上幾萬轉/分而沒有抽真空的離心機實際轉速本人持懷疑態度。

3.試劑開殼劑和操作問題造成標本DNA沒有暴露出來，致使擴增無法進行，這是造成假陰性的又一主要因素。

問題1：無擴增產物

現象：正對照有條帶，而樣品則無

原因:

1.模板:含有抑制物，含量低

2.Buffer對樣品不合適

3.引物設計不當或者發生降解

4.反應條件：退火溫度太高，延伸時間太短

對策:

1.純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量

2.更換Buffer或調整濃度

3.重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內二級結構）或者換一管新引物

4.降低退火溫度、延長延伸時間

問題2：非特異性擴增現象：條帶與預計的大小不一致或者非特異性擴增帶原因：

1.引物特異性差

2.模板或引物濃度過高

3.酶量過多

4.Mg2+濃度偏高

5.退火溫度偏低

6.循環次數過多

對策：

1.重新設計引物或者使用巢式PCR

2.適當降低模板或引物濃度

3.適當減少酶量

4.降低鎂離子濃度

5.適當提高退火溫度或使用二階段溫度法

6.減少循環次數 問題3：拖尾

現象：產物在凝膠上呈Smear狀態。

原因：

1.模板不純

2.Buffer不合適

3.退火溫度偏低

4.酶量過多

5.dNTP、Mg 2+濃度偏高

6.循環次數過多

對策：

1.純化模板

2.更換Buffer

3.適當提高退火溫度

4.適量用酶

5.適當降低dNTP和鎂離子的濃度

6.減少循環次數

問題4：假陽性

現象：空白對照出現目的擴增產物

原因：

靶序列或擴增產物

的交*污染

對策：

1.操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外；

2.除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管

及加樣槍頭等均應一次性使用。

3.各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存

請問PCR引物存放時間是多少？

這要看是什么狀態，要是粉末的話，在－20度可以存放好幾年；要是已經把引物稀釋成液體狀態的話，存放時間就要短一點了，但也可以存放一年左右的時間，甚至更長。

不過這也要看你們實驗室的冰箱是不是經常開啟，要是是的話，存放時間就很受影響，實驗室的冰箱就是經常打開，而且有時候大家找東西要找好長時間，所以引物總是用半個多月的時間，效力就下降了，PCR后的條帶明顯就沒有以前亮了。

建議你合成引物的時候，讓公司每個OD分裝成一管，每次你用的時候，取一管稀釋成使用濃度；或者先稀釋到儲存濃度，分裝后要用的時候再稀釋到使用濃度。另外一定要注意避免反復凍融，反復凍融會使存放時間變短的。

最簡單的就是分裝了,以儲存濃度保存,稀釋10或20微升,就可以用好些次,即可避免反復凍融還可以避免整管引物都被污染.干粉－20度可以保存一年，稀釋后－20度可以保存半年。

可以先稀釋成100uM，分裝成幾管。然后再稀釋成50uM和20uM的。每次用20uM的做PCR即可。盡量避免反復凍融。

稀釋用的水PH值要求大于7（TE比滅菌去離子水好），并且無菌。

真空干燥的DNA呈干膜狀或粉末狀在離心管底部，開啟瓶蓋時小心不要丟失.稀釋方法：1 OD260引物干粉約為33微克；

堿基的平均分子量為324.5；

引物的分子量=堿基數 x 堿基的平均分子量；

引物的摩爾數=質量數 / 引物分子量

舉例：一管標明為2 OD的20堿基的引物，分子量=20 x 324.5=6490 質量數=2 x 33 =66μg

摩爾數=66 / 6490 =0.010 μmol= 10 nmol

若您需要溶解為10μM(=10pmol/μl)的溶液，只需加10/=10pmol/ul,=1mlddH2O充分溶解即可。

如何提高PCR反應的特異性引物

引物設計：引物長度適當，18-24mers，并保證序列獨特性，以降低序列在非目的片段中存在的可能性，但長度大于24核苷的引物并不意味著有更高的特異性，較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，反而降低特異性，而且長序列比短序列雜交慢，影響產量； 引物濃度：引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會導致非特異性產物擴增。---生物秀實驗頻道

Mg2+

較高的Mg2+濃度可以增加產量，但也會降低特異性。為了確定最佳濃度，從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進行最適Mg2+濃度測定

退火溫度

Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。退火溫度一般設定為比引物的Tm低5℃的溫度。合理的退火溫度為55-70℃。在理想狀態下，退火溫度應足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合 巢式PCR 使用巢式引物進行連續多輪擴增，由于同兩套引物都互補的靶序列很少，巢式PCR的使用降低了擴增多個靶位點的可能性，從而提高PCR反應的特異性和靈敏度 遞減PCR 通過在PCR的前幾個循環使用嚴謹的退火條件提高特異性。循環設在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個循環降低1℃到2℃，直到退火溫度低于Tm 5℃。這樣，特異性最高的目的模板會被優先擴增，并在隨后的循環中繼續擴增占據優勢

熱啟動PCR 通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR 儀達到變性溫度。最常用的是熱啟動DNA 聚合酶，常溫時該酶活性被抑制，94-95℃加熱數分鐘后回復正常活力開始反應，這樣可以避免起始循環溫度下的非特異性擴增，大大提高了PCR反應的靈敏度及特異性。熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一

PCR增強劑

包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿等，能構降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級結構區。

PCR擴增過程中常見的問題及解決方法

PCR技術具有高度的特異性、選擇性、靈敏性，而且快速、簡便、易于自動化，因此在臨床醫學工作中受到廣泛的重視及合理的應用。目前在我國許多基層醫療單位均已相繼開展PCR研究用應用工作。PCR技術很簡單，原理也很清楚，因此有條件的單位都能較順利地上馬，但畢竟PCR技術是一種新生事物，受到許多條件因素的影響，所以要做得好也不容易。在PCR技術應用過程中會遇到這樣或那樣的問題，更甚至會得到與事實完成相反的結果。為了使我們能夠順利地開展PCR工作，更好地發揮PCR技術的工具作用，我們根據多年來PCR工作總結的經驗，對PCR擴增過程中經常出現的一些問題進行簡要的總結，提供給廣大科研工作者作為參考，拋磚引玉，不足之處歡迎指正。

一、假陽性擴增

在實驗過程中有時會碰到所檢驗的樣本全部陽性，而且擴增產物電泳條帶亮度均一，這是擴增系統受到污染時最典型的一種表現，需仔細檢查，排除污染源，一般應從以下步驟著手：

⒈ 試劑污染：

廠方提供的試劑或其中的某種組分在出廠或運輸、貯存過程中受到污染。檢測方法，可按試劑盒說明書將試劑分裝好，直接置于PCR儀中擴增（不加陰性對照，可加適量蒸餾水），便可簡單而有效地判斷試劑是否已受到污染。

⒉ 實驗室污染：

這是最常見的污染源，由于PCR技術可以在幾個小時內將模板中某些特異性序列擴增到數百萬倍以上，擴弗產物可能在電泳等過程中污染移液器、操作臺或隨著蒸發所形成氣溶膠而污染整個實驗室。擴增產物又是最有效的模板，一旦出現產物污染其污染程度都較嚴重。判斷方法：可以將實驗中最關鍵步驟如試劑分裝、樣品處理等轉移到一個新的環境中或轉移到超凈工作臺中完成。當然，所用的移液器、吸咀管（離心管）都應徹底更換。解決方法：實驗室污染是PCR擴增過程中最易出現的現象，而且一旦出現污染，消除污染源又極其困難，往往需對整個實驗室及實驗器材徹底清洗處理，所以應該以預防為主，實驗過程中嚴格遵守實驗基本要求，樣品處理與擴增產物及電泳應盡量分開，最好能在兩個房間進行。擴增前處理所用的移液器及擴增后點樣用的移液器應嚴格地分開，不可互換。PCR室應保持良好的通風、清潔、最好能專用。

⒊ 采樣污染：

在實驗過程中，有時會出現一批結果陽性率很高，一批結果陽性率又下降很多，如此反復，這種現象大都是由于采樣時污染所致，一般來講正規試劑生產廠家，其試劑出廠時都要經過嚴格的質量檢測、批間，特別是批內差異都極小，不致出現如此明顯的反復，這種現象主要是由于收集樣本的試管或吸管受到污染所致。PCR擴增非常敏感，而一般實驗室對重復使用的試管所進行的洗滌方法往注不能去除痕量DNA，這些痕量DNA便成為PCR模板，出現陽性擴增結果，由于采樣試管受污染程度不一，所以出現忽高忽低的現象解決方法建議使用一次試管及吸咀取樣。

二、假陰性擴增：

如果連續幾次擴增結果都是陰性，或已知陽性樣本出現陰性擴增結果，一般認為這是假陰性，出現這現象有以下幾種原因：

⒈ 儀器故障：

出現全陰結果，首先考慮到儀器運轉是否正常。正確判斷儀器的工作狀況，是排除假陰性其它原因的基礎，儀器運轉是否正常是PCR擴增最關鍵的步聚之一。判斷儀器是否正常，首先要測定加熱體的溫度是否準確，波動范圍是否答合要求，各孔之間差異是否符合要求，PCR擴增往往對儀器加熱溫度及各管間的差異要求有很高的精度，如果誤差太大，勢必出現假陰性。必須注意的是不能過信名牌，我們經常發現一些名牌機器溫度差異高達二度以上。

⒉ 試劑失效或無效：

了解機器是否正常，便可對試劑進行檢測。首先要了解試劑是否超過有效期，試存放方法是否達到要求，如果試劑盒在有效期內，貯存方法是正確，那么就應該仔細、慎重地判斷試劑是否是無效試劑或稱不合格試劑。可以用已知陽性樣本，或試劑盒提供的陽性對照，嚴格按說明書操作擴增一次，然后把擴增產物用雙蒸水稀釋1000倍，作為模板進行第二次擴增，判斷結果，如果是陰性說明試劑無效或不合格，如果結果陽性那么可用以下方法判定試劑的靈敏度。

⒊ 試劑的敏感度：

有時試劑檢測的陽性率偏低，所謂陽性率偏率就是指出現假陰性結果，這種現象往往與以下三種因素有關：①試劑質量不過關；②操作方法不規范；③主觀判斷標準不科學。對于試劑質量及操作是否正確這兩點是比較容易檢查并合理改進。這里著重提一下：目前經常碰到的一些不科學概念，我們習慣用某些樣本應該陰性，某些樣本應該陽性，或簡單地以陽性率。主觀概念判斷試劑是否合格這是極不科學的主觀推論。如對乙肝血清的測定，就不能用抽象的陽性率應該是60％或20％這樣的概念來判斷，同樣也不能用“二對半”的結果評判“PCR結果”，這是因為“二對半”與“PCR”是兩種完全不同的檢測方法，其檢測結果的意義有質的區別，它為醫務人員提供的信息是大不相同的，更加之所使用的“二對半”試劑是否能作為質量評價標準仍待考定。目前世界上較公認的標準品只有雅培的“兩對半”試劑，國內的“二對半”試劑據衛生部抽查資料表明，一度合格率在50％以下，怎么可能作為質量評定標準呢！對試劑敏感度的評價標準應該使用下述方法科學地評價，首先選擇標準樣本如HBV全序列質粒，標準陽性血清，結核菌菌體等用合適的介質如血清、痰液等進行有限稀釋按1：

10、1：100、1：1000、1：10000如此逐步提高稀釋度價其試劑的敏感度，一般認為如果標準陽性乙肝的血清用正常血清稀釋10000倍以上，結核菌每毫升中在100個左右仍能測出陽性結果時，試劑的敏感度是足夠的，判斷試劑的靈敏度是足夠的，判斷試劑的靈敏度后仍需判斷試劑的檢測覆蓋，因為病原微生物有不同的型或變異株，合格的試劑不應漏檢。最后還要判斷試劑盒的異性，一般的實驗室可以用不同病原體的樣本按說明書操作來判斷其對其它病原體擴增時是否也有陽性出現，其特異可達到怎樣的精度，經過以上三個方面的研究便可以科學地判斷試劑的質量。

三、擴增產物拖尾

有時擴增產物電泳后出現一個個螢光團（Smear現象）或出現一連串的條帶，這些種現象主要與以下幾種因素有關：

⒈ 擴增系統不完善：

這種現象表明出現非特異性擴增，而產生非特異性擴增與擴增系統中鎂離子濃度、引物濃度、DNTP濃度有密切關系，需認真調整以期避免這種現象出現。另外也可以適當提高退火溫度，從而提高擴增特異性。

⒉ 模板處理方法不完善：

PCR擴增技術的原理雖然非常簡單，但這一技術的合理應用是極其復雜的，如對PCR主要成分之一DNA聚合酶的影響因素很多，這些因子是怎樣作用于聚合酶，其作用機制至今仍不清楚，因此對樣本處理不當不妥可能抑制擴增，也可能導致非特異擴增。一般分泌物樣本，應取脫落細胞為主，避免采集過多的膿性分泌物，痰液樣本一定要充分液化，等等。

⒊ 引物設計不合理：

引物設計應遵循以下幾個原則。首先，引物一般應由15-30個BP組成；其次，引物中堿基應是隨機分布，不能有一串相同堿基或出現其它不常見結構；第三，GC堿基含量應在45-55％左右；第四，兩個引物在3′未端不能出現同源性。其中以引物與基因組之間的同源性是產生非特異性擴增的最主要原因，而我們一般在設計引物時往往只了解其基因組中的某一段序列，因此我們必須充分利用這些資料巧妙地設計出一組合理的引物，并通過反復比較、證實，最后才能確定其能否用于檢測。

四、產物電泳單螢光帶及多螢光帶一般PCR擴增后，對擴增結果的判斷最簡單的方法是，瓊脂糖電泳，溴乙淀染色，在320nm的紫外激發觀察其螢光條帶，如果有明顯和特異性擴增產物，就會在電泳平板預期的位置出現一條清晰的螢光亮帶，按標準擴增系統配制的反應液，其引物濃度在0.1-0.5mM，一般經30個循環擴增后，仍有相當數量的游離引物存在，因此在電泳平板就有一條20BP左右（電泳速度較快）的淡淡的引物螢光帶，這樣每次電泳結果就有兩條滎光帶，一條在前面的，每個點樣樣本都有的引物帶。

引物設計相當重要，由于基因組有龐大數量的DNA序列，除了特異性的擴增外，往往很容易產生非特異性產物。如果引物與基因組存在較廣泛的同源性，那么就會出現嚴重的非特異性擴弗，引物不僅與特異性的擴增區域結合，而且也與其它區域發生一系列非特異性結合，而選擇引物時，常須考慮敏感性問題，特別是臨床檢驗試劑盒，為了能把少至幾個病原體檢出，我們大都采用在病原體基因組中重復出現的DNA序列設計引物，如果這些重復序列沒有嚴格的同源性，就在可能出現不同長度的擴增產物而出現多條帶擴增。

病原體變異，與前面所述一樣，我們為得高敏感性經常使用具有重復序列的基因作為引物設計的區段，在有些病原體，比如結核桿菌在治病過程中，會發生嚴重畸變，也包括其遺傳物質的變化，出現染色體的缺失、不等位交換、其它序列的插入等。如果這些缺失與不等位交換正好發生在我們所選擇的擴增序列上，也會出現不同長度的擴增產物，從而產生多條擴增產物帶。

PCR基因擴增技術簡單易行，應用日趨廣泛，但其影響因素很多，在實踐過程中時常現現這樣或那樣的問題，甚至得不到預期的結果，或出現無法解釋的現象。誠然，近年來在大量科學工作者的共同努力下，取得了許多寶貴的經驗，使這一技術日趨完善，畢竟PCR是一項近幾年才出現的新技術，許多問題至今仍然不能得到很好地解釋或解決。想信隨著對PCR的深入研究，在PCR的應用過程中不斷總結經驗，PCR這一新技術將會為人類的發展作出更大的貢獻。

PCR產物的電泳檢測時間

一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規則甚致消失。

假陰性，不出現擴增條帶

PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及，④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

假陽性

出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。

靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現非特異性擴增帶

PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數 過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶 則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次 數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

出現片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環次數。

克隆PCR產物

1)克隆PCR產物的最優條件是什么？

最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4℃過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求，為提高連接效率，需4℃過夜。

2)PCR產物是否需要用凝膠純化？

如凝膠分析擴增產物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

3)如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？

A）涂布未轉化的感受態細胞。

如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質粒，或產生氨芐抗型的菌落。

B）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。

例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養過夜，產生1000個菌落。轉化率為： 產生菌落的總數/鋪板DNA的總量。

鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉化率為：

1000克隆X10（3次方）ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug

轉化pGEM-T應用10（8次方）cfu/ ug感受態細胞

如沒有菌落或少有菌落，感受態細胞的轉化率太低。

C）如用pGEM-T正對照，或PCR產物，產生>20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態細胞），表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。

T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質量標準好無核酸酶污染，不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。

D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉化高頻率感受態細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應為白斑，如產生>20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。

4)對照實驗結果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？

A）連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數克隆，為提高效率，需4℃過夜。

B）插入片段帶有污染，使3`-T缺失，或抑制連接，抑制轉化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數，插入片段需純化，或重新制備。如產生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。

C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時有發生。UV過度照射會產生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。

D）帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料（TM042）。

E）高度重復序列可能會不穩定，在擴增中產生缺失和重排，如發現插入片段高頻率地產生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞

PCR反應體系與反應條件

標準的PCR反應體系：

10×擴增緩沖液 10ul

4種dNTP混合物

各200umol/L

引物

各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

Taq DNA聚合酶 2.5u

Mg2+

1.5mmol/L 加雙或三蒸水至 100ul

PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

設計引物應遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。做配藥品，稀釋引物，PCR實驗中，對水的要求要很高么?

配制一般化學試劑使用二級水即可。

配制生化試劑，包括引物稀釋、PCR所用水，以及轉膜、核酸抽提等，必須使用二次蒸餾水或一級水。

[1] PCR引物設計的原則

引物設計有3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應(即錯配)。

具體實現這3 條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primer length），產物長度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內部穩定性(internal stability, 用?G 值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及發夾結構（duplex formation and hairpin）的能值，在錯配位點（false priming site）的引發效率，引物及產物的GC 含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內切酶位點，引進突變等。根據有關參考資料和筆者在實踐中的總結，引物設計應注意如下要點：

1.引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應[2]。

2.引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現3 個以上的連續堿基，如GGG 或CCC，也會使錯誤引發機率增加[2]。

3.引物3’端的末位堿基對Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A 的錯配效率明顯高于其他3 個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A[3][4]。另外，引物二聚體或發夾結構也可能導致PCR 反應失敗。5’端序列對PCR 影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物[2]。

4.引物序列的GC 含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。

5.引物所對應模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使復性條件最佳。Tm 值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)[6][7]。

6.?G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性。應當選用3’端?G 值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間?G 值相對較高的引物。引物的3’端的?G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA 聚合反應[6]。

7.引物二聚體及發夾結構的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行[8]。

8.對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR 產物的載體的相應序列而確定。

值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR 因為產物序列相對固定，引物設計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。

[2] 擴增較大片段DNA的PCR方法

一般PCR方法在擴增大片段DNA時的局限性：

通常所用的PCR方法都在兩個方面有局限，即目標產物精確程度和合成片段的大小。Pfu(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶，具有完整的3'外切酶校讀活性（3'-editing-exonuclease），可以將每個循環中堿基的錯配率由10*-4降到10*-3，從而提高PCR產物的準確性。但它在擴增1.5-2.0kb片段時，效率比Klentaq l(Taq DNA聚酶N-末端缺失突變體，類似于E.coli DNA聚合酶I Klenow片段）或AmpliTaq（全長的Taq DNA聚合酶）等聚合酶差；在擴增5.0-7.0kb片段時亦不比各種形式的Taq DNA聚合酶（如Ampli Taq、Klentaq

1、Klentaq 5等N-末端缺失的變異株）有明顯優越之處。因而以往的PCR反應產物限制在5.0kb以內。超出這一范圍，PCR擴增反應效率將明顯下降，同時產物會降解。即使將延伸時間定為30分鐘（10倍于通常所需）亦無改進。

利用兩種DNA聚合酶進行較大片段DNA的擴增

美國華盛頓大學醫學院的Barnes WM等對前述問題進行了深入系統的研究，認為：PCR反應效率低最主要的原因是由于錯配的堿基阻礙了延伸反應的正常進行，Pfu DNA聚合酶雖然可以通過“校讀”功能糾正錯配的堿基，但亦可能降解引物，尤其是在較長反應時間下；酶濃度較高時，反應效果更差。因此必需將Pfu DNA聚合酶的濃度控制在較低狀態，同時配合使用Klentaq l等DNA聚合酶，這樣既可以有效地去除錯配，又可以使Klentaq l等催化的延伸反應順暢進行。實驗證實，按15:1 的比例混合使用Klentaq l和Pfu DNA聚合酶，引物大小為27-33nt,即可使反應有效進行。當然，對于各種不同條件的反應，兩種類型酶的最佳配比需要具體考慮。

控制脫嘌呤反應增強擴增效率

在PCR反應體系中某些成分耐熱性較差，會影響反應效率。DNA聚合酶的熱穩定性一般都是較好的，可能是模板DNA在溫度較高的環境中某些位點發生脫嘌呤反應從而阻礙反應的順利進行。Lindahl和Nyberg的研究結果顯示：在70℃ pH7.4的條件下，單鏈DNA脫嘌 呤反應的速度是雙鏈DNA的4倍；100℃ pH7.0時，100kb的堿基中每分鐘將有1個位點脫嘌呤。這一反應與緩沖體系中酸堿度的變化有關。人們注意到：三羥甲基氨基甲烷（Tris）的酸解離常數（pKa）會隨溫度升高而改變，平均每升高1℃，pKa值降低0.03。因而，在25℃時pH8.55的PCR反應體系，到95℃熱變性時，pH值將變為6.45，這就很可能誘導脫嘌呤反應。為了解決這一問題，可以采取下列措施：

縮短熱變性時間，Barnes等在擴增35kb的大片段時，變性條件為95℃5秒，取得滿意結果；

盡可能使升溫、降溫過程縮短，可選擇使用導熱性能優越的薄壁反應管及較為先進的擴增設備；

適當提高反應體系的pH值，反應最初應控制在pH8.8-9.2范圍；

適當增加延伸時間（可長至20分鐘）。使用這種方法可以擴增最大為35kb的DNA片段，產物的準確性亦有充分保證，克服了以往基因克隆過程中出現的DNA分子內的堿基重排和可能的毒性危險等問題。

酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2。5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。

dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。

Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。

PCR反應條件的選擇

PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。

溫度與時間的設置： 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。

②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復性溫度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允許范圍內，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。

③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時，DNA合成幾乎不能進行。

一、RT-PCR

1.cDNA產量的很低

可能的原因：

*RNA模板質量低

*對mRNA濃度估計過高

*反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足

*同位素磷32過期

*反應體積過大，不應超過50μl

2.擴增產物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺

*最常見的原因在于您的反應體系是PCR的反應體系而不是RT-PCR的反應體系

*與反應起始時RNA的總量及純度有關

*建議在試驗中加入對照RNA *第一鏈的反應產物在進行PCR擴增時，在總的反應體系中的含量不要超過1/10

*建議用Oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物（GSP）用于第一鏈合成。由于RNA模板存在二級結構，如環狀結果，有可能導致GSP無法與模板退火；或SSⅡ反轉錄酶無法從此引物進行有效延伸。

*目的mRNA中含有強的轉錄中止位點，可以試用以下方法解決：

a.將第一鏈的反應溫度提高至50℃。b.使用隨機六聚體代替Oligo(dT)進行第一鏈反應。

3.產生非特異性條帶

*用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。

*在PCR反應中，非特異的起始擴增將導致產生非特異性結果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結果的產生。

*由于mRNA剪切方式的不同，根據選擇引物的不同將導致產生不同的RT-PCR結果。

4.產生彌散（smear）條帶

*在PCR反應體系中第一鏈產物的含量過高

*減少引物的用量

*優化PCR反應條件/減少PCR的循環次數

*在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時，其產生的寡核苷酸片段會產生非特異性擴增，一般會顯示為彌散背景。

5.產生大分子量的彌散條帶

*大多數情況下是由于退火溫度過低而導致的非特異性的起始及延伸產生的 *對于長片段的PCR，建議將反應體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200）

6.在無反轉錄酶的情況下，對照RNA獲得擴增結果

*通常是由于對照RNA中含有痕量DNA而導致的。由于進行體外轉錄時不可能將所有的DNA模板消除。建議可將第一鏈cDNA稀釋1:

10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。

*有可能是引物二聚體的條帶

7.擴增產物滯留在加樣孔中

*有可能是由于模板量過高而導致PCR結果產生了高分子量的DNA膠狀物。建議將第一鏈結果至少稀釋100倍再進行二次擴增。

*另外，在二次PCR時使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當增高或進行熱啟動以提高特異性。

8.SSⅢ與SSⅡ有何不同？

*具有更高的熱穩定性（達50℃）

*具有更長的半衰期（達220分鐘）

*對PCR無抑制

*干冰運輸

*Tdt活性更低

SuperScriptⅢ反轉錄酶

9.為什么有人更喜歡用SSⅢ而不是ThermoScript？

ThermoScript如果保存不當會引起活性很快降低，SSⅢ則更穩定。

10.為什么使用基因特異性引物（GSP）？

GSP在擴增低豐度的轉錄本時是最好的。OligodT引物建議用于高質量RNA及全長轉錄本的逆轉錄；隨機引物用于mRNA片段的逆轉錄。

11.什么情況下需要使用RNase H？

在第一輪PCR中RNA/DNA雜合體不能正常變性時

12.根據不同的目的選擇不同的系統：

目的建議

RT與PCR使用不同的引物

或需要靈活選擇PCR DNA聚合酶

兩步法RT-PCR系統

高靈敏度

一步法或兩步法RT-PCR系統

高特異性

含有適當的DNA聚合酶的兩步法RT-PCR系統

或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系統

高保真度

含有Pfx Taq酶的兩步法RT-PCR系統

長的反轉錄結果

通常使用兩步法RT-PCR系統可達到最佳結果

含Elongase酶的一步法RT-PCR系統

二、Generacer

1.如何針對Generacer試劑盒設計基因特異性引物（GSP）？

使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設計引物時需要注意以下幾點要求：

*50-70％的GC含量，以提高引物熔點（Tm）

*23-28個堿基長度，以提高引物特異性

*降低3’端GC含量，將引物非特異性結合的可能性降至最低

2.為什么得不到RACE產物？

*加入Hela對照

*低質量的RNA模板

*逆轉錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長模板cDNA的合成

*目的基因豐度太低，可以通過提高PCR的循環次數來解決，建議使用巢式PCR

*目的基因沒有表達，可以通過使用兩條GSPs來分析cDNA中是否含有目的基因

*目的基因太長而不適合進行反轉錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的Oligo dT來得到全長cDNA，使用隨機引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進行PCR。

*cDNA模板屬于困難模板，可以通過以下方法解決：優化PCR反應參數及反應體系；降低退火溫度；使用5-10％的DMSO幫助通過高GC含量區；使用高保真度和高延伸能力的酶進行PCR反應。

3.RACE的PCR結果有雜帶

RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：

*GSP與其他cDNA的非特異性結合會導致在擴增目的產物時得到無關產物。

*GeneRacer引物和cDNA的非特異性結合會導致產生一端帶有GeneRacer引物序列的PCR產物。

*RNA降解。

*PCR管或試劑污染。

注意：雜帶一般是因為沒有優化PCR條件，可以加入陰性對照來確定。

4.得不到全長的5’RACE PCR產物

*CIP反應后的RNA降解產生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無降解。

*CIP脫磷酸不完全，可以增加反應中CIP的量或減少RNA的量。

*PCR產生了雜帶，并不是真正的連接產物，可以使用上述建議優化PCR。

三、PCR

在進行PCR時：

*請確保您沒有使用過量的起始DNA或者過高濃度的引物，也沒有加入過量的Mg++

*請確保您使用了恰當的退火溫度

*請確保您沒有使用過量的DNA聚合酶

四、引物

1.應該選擇哪種純化方法？

取決于實驗目的和引物的長度

2.為什么我訂購了50nmol，但是收到卻只有40nmol？

50nmol是起始量

3.怎樣制備100μM的儲液？

體積（μl）=質檢報告上的nmol數目×10

4.怎樣設計引物？

*一般長度20-30bp；

*至少50%的GC含量；

*避免引物二聚體和二級結構；

*引物對的Tm值應該接近。

5.引物序列有插入或缺失？

*使用上游和下游引物多測幾個克隆。

*請選擇正確的純化方法。

6.PCR無結果？

*請檢查引物設計是否正確；

*請檢測OD讀數是否正確；

*做一個陽性對照和一個陰性對照。

第二篇：ICP許可證申請問題全解

ICP經營許可證申請問題

什么是ICP經營許可證

ICP許可證，也稱互聯網信息服務業務經營許可證，或者增值電信業務許可證中的互聯網信息服務業務。

為規范互聯網秩序，根據中華人民共和國國務院令第291號《中華人民共和國電信條例》、第292號《互聯網信息服務管理辦法》，國家對提供互聯網信息服務的ICP實行許可證制度。

ICP許可證由各地通信管理部門核發。

ICP經營許可證申請流程：

ICP許可證，也稱互聯網信息服務業務經營許可證，或者增值電信業務許可證中的互聯網信息服務業務。

根據中華人民共和國國務院令第291號《中華人民共和國電信條例》、第292號《互聯網信息服務管理辦法》，國家對提供互聯網信息服務的ICP實行許可證制度。

ICP許可證由各地通信管理部門核發。ICP證申請過程是:

貴單位提交材料-----我們整理材料--------提交相關機構審批(2-3個工作日)-------提交通信管理局審批發證(30-60個工作日內)

ICP許可證申請條件：

（一）經營者為依法設立的公司；

（二）注冊資本最低限額為100萬元人民幣；

（三）有可行性研究報告和相關技術方案；

（四）有與開展經營活動相適應的資金和專業人員；

（五）有必要的場地和設施；

（六）有為用戶提供長期服務的信譽或者能力；

（七）最近三年內未發生過重大違法行為。

ICP許可證申請材料：

ICP許可證由各地通信管理部門核發。ICP證申請單位應準備的材料：

一、公司法定代表人簽署的經營增值電信業務的書面申請(尚未獲得企業法人營業執照、擬成立有限責任公司的，應當由全體股東簽署;擬成立股份有限公司的，應由全體發起人簽署)。

*內容應包括：申請電信業務的名稱、業務覆蓋范圍、公司名稱、通信地址、郵政編碼、聯系人、聯系電話、電子信箱地址等。

二、公司的企業法人營業執照副本及有效復印件(尚未獲得企業法人營業執照的申請者，應當提交公司的企業名稱預先核準通知書或工商預登記證明)。公司注冊資金不得少于100萬元人民幣。

三、公司概況。包括：公司基本情況，擬從事增值電信業務的內部機構設置、技術力量和經營管理人員情況(必須具備不少于兩名中級職稱以上的專業技術人員或具有兩名以上具有相關專業的大學畢業生，生產人員按實際需要配備。申辦時應提供相關人員的學歷證明或職稱證書，以及其在公司的任職情況)，與從事經營活動相適應的場地(場地平面圖，房屋產權證明和租賃證明)、設施(已購或欲購的設備清單)等情況。

*人員證明應該包括人員在公司的任職情況和技術專業的本科畢業證書、設施是指從事相關電信業務須購買的設備。

四、經會計師事務所審計的最近的公司驗資報告(正式件及復印件)。同時要提交相關會計師事務所的資質證明。

*驗資報告必須是最近一年內的，而且要與公司章程里的股東情況相一致。超過一年的驗資報告還需提供公司最近的財務審計報告。會計師事務所的資質證明一般是指會計師事務所營業執照復印件。

五、公司章程，公司股權結構及股東的有關情況(自然人股東應提供股東身份證復印件，法人股東應提供股東公司章程)。

*有效公司章程要求復印件上應當有所有股東的簽字(法人股東應蓋法人公司章)。

六、項目可行性研究報告和技術方案。包括：經營電信業務的業務發展和實施計劃、技術方案、服務項目、業務實現方式、覆蓋范圍、市場調研與分析、收費方案、預期服務質量、投資分析、社會效益和經濟效益等。

七、為用戶提供長期服務和質量保障的措施(經營者應能提供全天24小時的通信聯絡手段。有受理用戶申告、及時處理用戶故障的服務保障措施和迅速修復系統故障的能力，并建立必要的工作制度)。

八、信息安全保證措施。包括信息內容的安全、網絡運行的安全、安全保障責任制等安全保障制度(擬從事互聯網信息服務業務的，見相關附件：從事互聯網信息服務業務網絡與信息安全保證書)。

九、證明公司信譽的有關材料。

*指公司獲得的獎項(沒有可不提供)。

十、公司法定代表人簽署的公司依法經營電信業務的承諾書(尚未獲得企業法人營業執照、擬成立有限責任公司的，應當由全體股東簽署;擬成立股份有限公司的，應由全體發起人簽署)。

十一、申請經營的電信業務依照法律、行政法規及國家有關規定須經有關主管部門事先審核同意的，應當提交有關主管部門審核同意的文件。(具體咨詢電話見此文檔最后)

十二、公司法定代表人對申請材料真實性的承諾。

十三、申請業務中包含互聯網信息服務的，須提交擬經營網站的域名證書。

*域名證書的域名所有者必須是公司本身或者公司的股東。域名所有者是公司的股東的，還要提供股東的域名轉讓使用授權書。

十四、應提交的其他材料。

ICP許可證需要多長時間能下證：

如果材料完善、并將填寫正確的ICP申請表送至通信管理局后，ICP證將在60個工作日內頒發下來。

注冊資金不足100萬怎么申請ICP：

注冊資金不足100萬怎么申請ICP?申請ICP許可證的條件之一就是要滿足申請資金達到100萬元，如果注冊資金不足的話，也可以辦理ICP，下面我們就來介紹幾種方法，供您參考。

可以去做增資，把公司注冊資金增資到100萬。也可以找ICP代辦公司，讓他們幫你解決問題。金三咨詢是一家很不錯的ICP代辦公司，如果需要的話，可以前來聯系，電話：4006661429

申請ICP經營許可證注銷應報送的材料：

ICP經營許可證又稱互聯網經營許可證，是增值電信業務經營許可證的一種，其業務種類是互聯網信息服務業務。ICP經營許可證的有效期為5年，在有效期內不想繼續使用該證書了，或者到了有效期不想繼續經營該項業務了，就要到相關部門辦理注銷了。注銷這一資質時需要準備好下列材料。

申請互聯網信息服務(ICP)經營許可證項目注銷應報送的材料：

一、單位介紹信。

二、公司企業法人營業執照有效復印件、公司章程、會計師事務所出具的驗資報告及法人身份證復印件。(變更前后的營業執照都要提供)

三、提供ICP經營許可證原件。

四、申辦互聯網信息服務(ICP)經營許可證項目注銷申請書。

第三篇：《散步》全解

七年級上冊教材全解 01 散

步 莫懷戚

●學習目標 1．知識與能力

整體感悟課文內容，通過比較閱讀提高審美情趣。2．過程與方法

精讀時，你將學會以小見大、結尾升華主題的寫作方法。3．情感價值觀

細讀品味后，你還會從文中受到尊老愛幼、珍愛親情、珍愛生命的情感熏陶。

●文題全解 1．題目解說

散步的意思是隨便走走，是一種休息方式。本文主要寫的就是作者一家三代四口人一次典型的散步經歷。所以文題就是文章主要內容的高度濃縮，也是文章的線索，作者通過把散步中幾個相關的細節連綴起來，從而揭示祖孫三代人互敬互愛的這個主題。2．作者簡介

莫懷戚，當代作家。3．背景資料

本文選自1985年8月2日的《中國青年報》。作者寫此文之前，確實有一次全家三輩四口人散步的親身經歷，里面的真人真景及部分真事也與課文內容毫無二致，但作者并沒有產生創作動機。1985年，作者從他的好友美國漢學家柯爾特先生那里得知：在美國人眼里，中國人尊老愛幼、贍養父母是全世界做得最好的，而在美國是不可想像的。作者聽后感慨不已：我們自己丟掉的，發達國度的人卻拾起來。于是作者開始重新審視這份看起來很陳舊已無什么價值的民族遺產。寫作的念頭就此產生了。

●正文全解

1．句段全解

我們在田野散步：我，我的母親，我的妻子和兒子。【散：sǎn散文，松散；sàn散開，散步】

【段解：這段交待事件：散步；地點：田野；人物：我、我的母親、我的妻子、我的兒子。屬于“開門見山”開頭法。】

母親本不愿出來的。她老了，身體不好，走遠一點就覺得很累。我說，正因為如此，才應該多走走。母親信服地點點頭，便去拿外套。【信服：相信并佩服】她現在很聽我的話，就像我小時候很聽她的話一樣。【句解：這句話表達了一個中年兒子與老年母親所特有的骨肉深情。兒子小時候聽母親的話，說明兒子是好兒子，母親是好母親；母親老了，聽成年兒子的話，說明母親懂得尊重兒子，而兒子也懂得關心老人。母子之間的感情是親切的、和諧的、始終如一的。】

【段解：這段交待了散步的緣由(原因)。并且為下文背母親埋下了伏筆。】

天氣很好。今年的春天來得太遲，太遲了，有一些老人挺不住。但是春天總算來了。我的母親又熬過了一個嚴冬。【熬：áo熬夜；āo熬菜。嚴冬：寒冷的冬天】

這南方初春的田野，大塊小塊的新綠隨意地鋪著，有的濃，有的淡；樹上的嫩芽也密了；田里的冬水也咕咕地起著水泡。這一切都使人想著一樣東西——生命。

【段解：這兩個自然段是一個過渡。其中第四自然段描繪了新綠、嫩芽、冬水，展現了春天的氣息，生命的呼喚，寫得富有詩意。讀后使人似乎聞到了鄉間田野泥土的芬芳，襯托了作者一家散步時祥和、歡樂的情緒。語言清新，文字優美。】

我和母親走在前面，我的妻子和兒子走在后面。小家伙突然叫起來：“前面也是媽媽和兒子，后面也是媽媽和兒子。”【句解：寫出了兒子的天真可愛、聰明智慧，話里充滿了生活的情趣。】我們都笑了。

【段解：這一段開始入題，用兒子的話為下文所要揭示的深刻思想內容做鋪墊。】

后來發生了分歧：【分歧qí：不一致，有差別】母親要走大路，大路平順；我的兒子要走小路，小路有意思。不過，一切都取決于我。我的母親老了，她早已習慣聽從她強壯的兒子；我的兒子還小，他還習慣聽從他高大的父親；【句解：這兩句話中前后加點的詞不能互換。她“早已習慣”寫的是上一代母子關系，他“還習慣”寫的是下一代父子關系。同是一個“我”，在母親眼里是“強壯”的，而在兒子的眼里則是“高大”的。用詞符合實際、準確恰當。】妻子呢，在外面，她總是聽我的。一霎時，【霎（shà）時：時間短】我感到了責任的重大。我想一個兩全的辦法，找不出；我想拆散一家人，分成兩路，各得其所，【各得其所：每一個人或事物都得到合適的安頓。】終不愿意。我決定委屈兒子，因為我伴同他的時日還長。【時日：時間和日期。】我說：“走大路。”【句解：走大路方便老人。“我”理所當然地照顧母親。反映了對母親的尊敬和孝順。】

但是母親摸摸孫兒的小腦瓜，變了主意：“還是走小路吧。”【句解：走小路孩子感興趣。母親慈祥，想讓孫子高興，改變了主意。反映了母親對孫子的喜歡和愛護。“走大路”“”走小路”這兩處細節描寫，具體體現了一個幸福的家庭在散步中互敬互愛的融洽氣氛。】她的眼隨小路望去：那里有金色的菜花，兩行整齊的桑樹，盡頭一口水波粼粼的魚塘。【粼粼(1ín)：形容波光。】【句解：敘事中穿插景物描寫，展現春天的生機，春天的活力，透露出一種新的希望。】 “我走不過去的地方，你就背著我。”母親對我說。

【段解：這兩個自然段寫“我：愛幼，更尊老；母親聽從兒子，更愛孫子。展現了一家人相互體諒、生活和諧的畫面。】

這樣，我們在陽光下，向著那菜花、桑樹和魚塘走去。到了一處，我蹲下來，【蹲：dūn 蹲下；樽zūn：酒樽】背起了母親，妻子也蹲下來，背起了兒子。我的母親雖然高大，然而很瘦，自然不算重；兒子雖然很胖，畢竟幼小，自然也輕。但我和妻子都是慢慢地，穩穩地，走得很仔細，好像我背上的同她背上的加起來，就是整個世界。【句解：這句話的含義是：“我”和“妻子”人到中年，站在人生的中點上，肩負著承前啟后的責任。對上，肩負著贍養老人的義務；對下，承擔著培養教育子女的重任。形象地表明了我對生活有一種使命感。】

【段解：這一段主要寫散步時“我”背母親，妻背兒子過水溝的細節。刻畫了一家人尊老愛幼的動人場面。最后一句是全文的畫龍點睛之筆，揭示了中年人要對生活有一種使命感，因為中年人肩負著承前啟后的責任，對繼承和發揚中華民族尊老愛幼的傳統美德起著橋梁和紐帶作用。】

●整體把握

1．主題全解

作者通過選取祖孫三代一家人在田野里散步這個生活側面，生動地展示了這一家人互敬互愛、和睦相處的深厚感情和生活情趣，體現了中華民族尊老愛幼的傳統美德。2．結構全解

略

●問題研究

1．寫法歸納

(1)按照順敘展開，事件一目了然。

本文開頭交待了事件發生的時間、地點、人物、緣由，屬于“交待要素”開頭法。接著作者按照事情發展順序寫出了事情的開始、發展、高潮和結尾。記敘的六要素在本文體現得非常清晰，使讀者對事件一目了然。這種記敘的順序就是順敘。

(2)選取平凡小事，以小見大立意。

采用日常生活中看似平常的題材，來表現具有深刻社會意義的主題，這種寫法就是以小見大立意法。采用這種方法寫文章，要求選取平凡生活中富有典型意義的題材。并非隨意撿來的一件小事、一個場景、一個生活片段便可以表明一個大道理的，要能從本質上把握“小事”與整個時代、社會和生活的內在聯系。

《散步》寫祖孫三代人在一起散步的平凡小事，表現出一家人之間的互敬互愛，體現了中華民族的傳統美德。作者選取“散步”這一生活側面，表現那種對人類社會的繁衍、發展具有重要意義的道德、情感，用的是“以小見大”的寫法。文章不長，但是寫得情趣盎然，很有波瀾。兒子“叫起來”是一波，一波初平，行路分歧又起，最后小路遇水塘阻擋是余波，矛盾的產生和解決進一步突出了家人之間的深厚感情，使散步過程饒有意趣。

2．重點難點

理解通過細節描寫，展示人物感情的寫法。

細節是指人物細微的舉止行動或細微的情節。細節具有典型意義，如果運用恰當，會耐人尋味。在《散步》一文中表現互敬互愛的細節有：母親和兒子發生分歧，“我”經過思考決定：“走大路”——走大路方便老人。“我”理所當然地照顧母親，反映了對母親的尊敬。母親改變了主意：“還是走小路吧!”——走小路孩子感興趣。母親慈祥，想讓孫子高興，改變了主意，體現了母親對孫子的喜歡和愛護。這兩處細的情節，反映了兩代人的具體心態，表現了一個幸福的家庭在散步中互敬互愛，十分融洽的氣氛。又如：“我蹲下來，背起了母親，妻子也蹲下來，背起了兒子。”這個背母親的細微動作，不只有尊老的含義，也體現出了“我”具有的一種使命感。●練習全解

一

朗讀全文。題目“散步”是從文章主要事件的角度確定的，你覺得這個標題好嗎?請你換一個角度為本文擬一個標題，并說說你的理由。

本題在標題上做文章，意在整體把握課文內容，也是揣摩標題藝術。第一問，可以回答“好”，也可以回答“不好”，只要言之成理即可。另擬標題，可以各顯神通，擬好后交流一下，相互評判，鼓勵創意。

二

“我蹲下來，背起了母親，妻子也蹲下來，背起了兒子??但我和妻子都是慢慢地，穩穩地，走得很仔細，好像我背上的同她背上的加起來，就是整個世界。”說說你對這段話的理解，并與同學交流。

本題要求理解語句的深層含義，重點應放在“整個世界”四個字上，兼及其他。

答案參見“句段全解”中最后一段的“段解”。

三

下面這篇短文也是講三代人的故事。與課文比較，哪個故事更感動你?說說你的理由。

三

代

林文煌

在交叉路口轉彎的時候，我的腳踏車把一位陌生先生的右腳踝壓傷了。本來我是安全避閃的，當我看到那位先生一手牽著一個剛會走路模樣的小男孩，一手牽著一個步履蹣跚的年老中風病患者時，我立刻緊急煞車，把車頭傾向一邊。豈料就在這時，他突然急速地跨前一步，自己撞了上來。

我趕緊跳下車，不安地說：“對不起!對不起!”

他一邊彎下腰按摩腳踝，一邊和氣地抬起頭：“我不怪你，是我自己撞上的??也許是我太多慮了，我以為車子如果不會撞上我的小孩，便會撞上我的父親，于是下意識地上前阻擋。”

在我驚魂未定、訥訥不知所措的時候，那位先生已牽著小孩和老者慢慢離去，我愣愣地目送他們，三個腳步遲緩的背影構成一幅感人的畫面。我有擱下車子跟上去幫助那位先生的沖動。可是，我沒有那樣做：我發覺小孩和老者好像那位先生肩上的一副擔子的兩頭，再艱苦他也不肯放下任何一頭的。

《三代》與《散步》主題相近，又有差異，情節則差別較大。本題作比較閱讀，培養鑒賞能力。閱讀是個性化行為，“感動”這種情感更是個性化的，說《散步》更感動人，可以；說《三代》更感動人，也可以，能言之成理就好。《三代》說的是，寧可自己受傷，也要保護一老一小；《散步》說的是，孝順第一。衡量作品，也要從社會價值上去考慮。

第四篇：不動產業務整理手冊(問題參考)全解

不動產業務整理手冊

不動產業務與問題整理手冊

（僅供參考）

2016年6月

I

不動產業務整理手冊

業務案例整理

1.房產、土地均已辦理第一次轉移登記，但在房產再次或多次辦理轉移過程中土地未隨之辦理轉移登記，要求將土地使用權直接辦理到現房產權利人名下的情況。建議：可以辦理。需查清歷次房產登記檔案，理清產權交易和房產變化脈絡，脫節的歷次權利人全部到場簽字，并作詢問筆錄，審查相關稅費，無查封、抵押等限制條件的，可以直接辦理到現房產權利人名下。如有查封情形，需權利人到法院主張權利，解封后再辦理。

如缺少中間權利人的，需在門戶網站公告30日后，按上述辦法直接辦理到現房產權利人名下。

主要依據：“地隨房走”，“房隨地走”，《物權法》第一百四十七條“建筑物、構筑物及其附屬設施轉讓、互換、出資或者贈與的，該建筑物、構筑物及其附屬設施占用范圍內的建設用地使用權一并處分。”

2.房產在第一次轉移登記后再次或多次轉移登記，土地已預區分但未辦理轉移登記的，要求直接辦理到現房產權利人名下的情況。

建議：可以辦理。需查清歷次房產登記檔案，理清產權交易和房產變化脈絡，歷次權利人全部到場簽字并作詢問筆錄，審查相關稅費，無查封、抵押等限制條件的，可以直接辦理到現房產權利人名下。如有查封情形，需權利人到法院主張權利，解封后再辦理。

如缺少中間權利人的，需在門戶網站公告30天后，按上述辦法直接辦理到現房產權利人名下。

房產屬房改房或集資建房的，需查看出讓金繳納情況，收回協議和出讓合同。（最好能查到當地政府關于房改房的處置意見，即政策性文件。）

3.房產在第一次轉移登記后再次或多次轉移登記，土地未辦理預區分的，要求直接辦理到現房產權利人名下的情況。

建議：同時符合以下條件的可以辦理：出讓土地、土地用途沒改變，取得規劃竣工驗收合格證且無查封、抵押等限制條件。

不動產業務整理手冊

需查清歷次房產登記檔案，理清產權交易和房產變化脈絡，歷次權利人全部到場簽字，并作詢問筆錄，審查相關稅費，無查封、抵押等限制條件的，可以直接辦理到現房產權利人名下。同時，在網站發布“土地已轉移情況”的公告，如有查封情形，需權利人到法院主張權利，解封后再辦理。

如缺少中間權利人的，需在門戶網站公告30日后，按上述辦法直接辦理到現房產權利人名下。

不動產權證只記錄房產信息。原土地證信息寫在“權利其它狀況”欄中，并注明“土地未分攤”字樣。受理業務部發函給開發公司，督促盡快辦理預區分登記，隨即通過OA抄報土地利用處（科）（有的地方叫地租處），由土地利用處（科）審查該宗地批后監管情況，15日內反饋到不動產登記中心。（備注：此辦法需要局內部協調有關業務[處]科室共同參與）

如土地用途改變，需開發商到土地利用科辦理相關手續后方可辦理。如土地利用處（科）發現該宗地有違反合同、擅自提高容積率等事項的，應及時采取制約措施。

4.房產已辦理第一次轉移登記，出讓土地未分攤，要求單獨作房產抵押的情況。

建議：可以辦理。單獨房產抵押，房產證“不變不換”，可以只辦理房產抵押。但應告知抵押權人可能存在的隱患。如單方產要轉移需要告知權利人不可轉移。

抵押登記時還需提供大土地證的復印件，抵押權人書面說明“已知曉土地未分攤”。并在房產證記事欄中記明不動產單元號。

（備注：此辦法要與事先協調告知房產公司以及相關金融單位）

5.房產已辦理第一次轉移登記，劃撥土地未分攤，要求單獨作房產抵押的情況。

建議：可以辦理。單獨房產抵押，房產證“不變不換”，可以只辦理房產抵押，但登記人員應告知抵押權人可能存在的隱患。

抵押登記時需提供大土地證的復印件，抵押權人書面說明“已知曉宗地為劃撥土地和土地未分攤”，抵押權人與抵押人書面承諾“實現抵押權時，首先補交土地價款”。并在房產證記事欄中記明不動產單元號。

（備注：這是山東的做法，值得商榷，應該說是存在瑕疵和風險的。）

不動產業務整理手冊

6.房產已抵押，要求辦理土地抵押（獨用宗）的情況。

建議：可以單獨辦理土地抵押（抵押期限不超過房產抵押期限)。但房產未抵押的，要求房地一致辦理。

7.土地已抵押，要求辦理房產登記并抵押（獨用宗）的情況。

建議：需抵押權人同意，收回并注銷土地證和他項權利證，辦理不動產權證后再辦理抵押登記。

8.房產、土地以前分開抵押的，解押時分開解還是一塊解的問題。

建議：以前分開做抵押的，解押時應分開解。

（但是否應該規定，如果解壓后還需再抵押時是否必須房地一并抵押？）

9.開發商用多幢房產辦理在建工程抵押，現想解除其中一幢，能否辦理。

建議：這種情況需要看當時抵押是否分幢抵押，如果是分幢抵押可以解除其中一條記錄,沒有分開抵押的話，需要開發商解除全部的抵押，重新抵押。

不解除抵押的情況下也可以在不動產登記證明上注明，不需要先解除抵押再辦理。

10.開發商用幾幢房子中未出售的房產（其中一部分已出售）辦理在建工程抵押的，能否辦理

建議：可以辦理，需要除去其中已經出售的一部分

11.宅基地只有房產證，沒有土地證，能否辦理不動產權證？

建議：不能辦理。必須能找到合法的土地審批手續才能辦理不動產權證。

12.宅基地沒有房產證，能否直接辦理土地證轉移登記？

建議：不能辦理。只有辦理不動產權證后方可轉移。

13.土地大證掛接問題

建議：對于沒有小土地證的，辦理業務前需要進行土地分攤，確保房產證與土地

不動產業務整理手冊

證保持權利一致，然后辦理業務。如果強制掛接大證，會導致權利不一致，出現以下問題：

1、查封登記、抵押登記，如果掛接大土地證，大土地證會被查封、抵押，會影響該宗地上的其它不動產辦理業務。

2、掛接土地大證，做完第一次轉移后土地大證信息會進入歷史，影響后續業務辦理，下次再做業務時需要從歷史表中把原來的土地大證信息進行恢復。

3、對于儲藏室、車庫等，是否掛接大證？如果主輔都掛土地大證，會導致證書的土地面積累加。

按照正常業務流程應該如下：

日照現在已經不做土地的分攤，經與局方協商，按照以下方法處理：（1）已經有小土地證或是分割證明的需要掛接對應的小土地證或分割證明。（2）沒有小土地證或是分割證明的不要掛接土地證書，直接掛在宗地上。

（這就是我的觀點之一，也就是原來有的沿用，沒有的直接掛大宗地）

不動產業務整理手冊

14.自然人之間的擔保抵押能否辦理的問題。

建議：房地可以辦理。單獨以土地抵押的不辦理。

《中華人民共和國物權法》中均未對抵押權人的范圍進行限制

實施細則中第八十一條【抵押登記提交材料】自然人、法人、其他組織為保障其債權的實現，依法以不動產設定抵押的，可以由當事人持不動產權屬證書、抵押合同與主債權合同等必要材料，共同申請辦理抵押登記。

債權合同中包含有抵押條款的，可以只提供債權合同。

15.房產已辦理第一次轉移登記，土地未預區分，需不需要收回原土地證，土地證能不能再做剩余部分抵押的問題。

建議：需收回原土地證，在記事欄注明相關事宜，如不能收回，需在門戶網站發布公告，公告內容注明“土地已轉移情況”。土地證不能再做抵押登記。

16.房屋權利性質是房改房，走轉移登記，那么房屋性質會發生改變嗎？

所有房改房的土地使用權類型都是劃撥，而且，土地使用權類型是劃撥的在出售給另一個人時，在辦理另一個人新土地證時都必須依照當地政府規定補交相應的土地出讓金，補交后土地的使用權類型自然就變為了出讓性質，這是房產的性質應變為商品房。

17.宅基地土地證已經辦理完過戶，新土地證還未發放，能否辦理房產過戶？

建議：不能辦理。土地已經確權。不能辦理轉移。國家會統一確權房產，直接辦理不動產證。

18.房地產開發商委托辦理業主不動產證，土地證房產證都沒有的情況下做轉移登記。小區比較老，沒有辦理出土地證和房產證。

建議：可以先做房地產商的首次登記，不出證書，然后再做轉移登記。19.7個土地證要辦成一個不動產證書，土地未分攤，權利人不變

建議：能辦理。必須材料齊全，先土地注銷，然后進行首次登記

土地證的權利人都是同一人，僅僅是將7個土地證合起來，不涉及土地的轉移，不動產業務整理手冊

抵押，查封等業務。

20.7個土地證，上面有抵押 信息，現局方要求7個證再有抵押的狀態下合成一個土地證，然后再走抵押變更流程，問是否可以辦理？（上面還有房產信息）

建議：能辦理。必須材料齊全，先土地注銷，然后進行首次登記，確認沒有進行任何的土地使用權與房屋所有權的登記

土地證的權利人都是同一人，僅僅是將7個土地證合起來，不涉及土地的轉移，抵押，查封等業務

21.房產做過預告登記，現在要做轉移登記，買賣雙方不變，業務人員想直接做轉移業務；

建議：不能辦理。

房產做過預告登記，數據是有預告狀態的，會有一條實測數據和一條預測數據，如果不做預轉現業務，有可能會出現一個房產證可以做兩次業務的情況。22.一宗地占多個地籍子區，地籍子區代碼無法選擇

不動產暫行條例有一條說明跨子區相關業務處理，由一個登記機構進行登記，登記結果通知相關部門，子區代碼定主要子區區域（或由局方定）

23.辦理抵押登記或轉移登記，土地證跟房屋所有權證用途不一致如何辦理？

土地存在多用途情況，按實際的填寫即可。

24.只有土地批復，但未發土地證，有房產證，如何辦理轉移登記或抵押登記業務

土地批復相當于土地登記證書，配號過程可以不勾選土地證。辦理登記需要在審批意見中備注說明該情況

25.小區已經發房產證，土地總證被法院查封（查封時已經告知法院部分房產已經賣給有關業主）能否辦理不動產轉移登記？

已查封不能進行轉移登記，如果進行國有建設用使用權及房屋所有權首次登記是可以的

國有建設用地使用權被查封或者預查封的，申請人與查封被執行人一致的，不影響辦理國有建設用使用權及房屋所有權首次登記

26.開發商開發的小區已頒發總的土地使用證，但業主只頒發了房產證，沒有頒發分攤后的土地使用證，小區內業主房屋發生轉移應如何辦理？

對于已建設完畢的小區土地總面積不再分攤，在新發的不動產登記證書上只標注

不動產業務整理手冊

好房屋發生轉移業主的具體位置。原登記在開發商名下的土地證書由市不動產登記中心收回，七日內拒不交回的依法公告注銷，公告期15個工作日，公告所需時間不計算在登記辦理期限內。公告期滿無異議或者異議不成立的，應當及時記載于不動產登記簿。

對于未完全建成的小區，土地總證書暫不收回，等全部竣工后，開發商將土地總證書連同樓盤信息表一并交回市不動產登記中心,分攤時按照樓座基地面積分攤，基底面積以陽臺外1.5米為界。

27.土地性質是劃撥土地的房改房、經濟適用房、部分公房出售（劃撥土地上建住宅）等是否可以出售

對于土地性質是劃撥土地的房改房、經濟適用房、部分公房出售（劃撥土地上建住宅）等，按照成交價的1%收取土地出讓金后辦理過戶,對于上述三種情況以外的劃撥土地協議出讓方式，但不簽到出讓合同和網上審批，按現行基準地價的70%繳納出讓金后予以登記。

28.雙用途的怎么辦理

一宗土地上同時存在商業與住宅用途的宗地，對于兩種用途界限清晰的，按實際用途進行劃分后再進行登記；無法分清界限的，如一層是商鋪，二層以上是住宅的，對于住宅不再分攤，商業要進行分攤。

29.城中村建房用地（土地為代管國有土地，屬宅基地），房產證辦理了過戶手續，現申請過戶領取不動產證書，如何解決？

雖然城鎮居民與房改房可以按地稅評估價的1%收取出讓金后辦理，但是這種土地暫時不能辦理，因為對于出讓金的繳納方式無法確定（不符合城市規劃，沒法簽訂出讓合同。濰坊也一直沒辦，辦了幾戶是按照基準地價的40%收取的出讓金，但是利用科認為應當是70%）。

30.不動產統一登記后，土地是否還要分攤？若分攤如何分？

應該進行分攤，按樓基座分攤（建議是樓體最外端向外1.5米為分攤范圍）。31.已發放的房產證占地面積超出土地證上的土地范圍，如何辦理？

這屬于違建，只登記合法部分，如果違建很少（沒有超過5%），可以按照實際建筑面積進行登記。

不動產業務整理手冊

32.小區內各業主已經取得房產證，土地總證被法院查封，能否辦理不動產轉移登記？

需要與法院進行溝通。

33.辦理登記業務時，是否進行婚姻關系審核，還是誰申請登記誰？

婚前不用審核，婚后可以約定，也可以審核。

34.單位職工房改房未辦理產權證，現在原單位已破產，如何辦理不動產證書？

到房管部門找房改資料，如果房改資料齊全，可以辦理。資料不齊則補上對應的材料。

35.同一宗地在多個金融部門進行抵押

由不動產登記中心負責給除首次辦理抵押登記之外的相關金融部門出具抵押貸款告知書，履行告知責任。同時在不動產登記證明上標注清楚抵押貸款的順序。36.同一宗地用土地使用證或房產證辦理抵押登記或轉移登記的，原土地使用證與房產證用途不一致

可以辦理抵押登記，用途按照原用途填寫；如發生轉移需辦理登記，必須先辦理房或地用途變更手續，使其一致后再進行不動產登記。37.土地使用年限即將到期辦理抵押登記，分兩種情況處理：

1、用途是住宅的，根據《中華人民共和國物權法》第一百四十九條“住宅建設用地使用權期間屆滿的，自動續期”的規定，無論土地是否到期均可辦理抵押登記。

2、用途是住宅以外其他用途的，抵押期限在土地剩余使用年限以內的，可辦理抵押登記，否則不能辦理。

38.有土地批復文件，未進行土地確權登記，但已辦理房產證，能否辦理房產轉移或抵押業務？

抵押業務可以辦理，轉移的話需要稅費齊全（土地房產均齊全，主要是出讓金和契稅），就可辦理。

39.房產坐落在兩宗土地上，開發商用房產總證作抵押，能否辦理？

先由開發商提出書面申請，再合宗。合宗時開發商寫出承諾，承諾放棄土地使用年限長的年限（需要審核合宗后是否符合建設用地規劃許可，是否符合建設條件，是否調整了容積率。）。

40.民間借貸的個人對個人，個人對公司或是公司對公司的，能否辦理不動產抵押？

自然人、個人之間可以辦理抵押登記，典當行的抵押也可以辦理，但是非金融的不動產業務整理手冊

法人之間要小心并依法辦理，特別是法人之間不可以走款 41.開發商用房產總證作抵押，土地未分割的，能否辦理？

可以辦理，先公告，再辦理。

42.開發商用其中一棟房產辦理在建工程抵押，同時土地也已經辦理抵押，現在想用另一棟房產辦理在建工程抵押的，能否辦理？

可以辦理，辦理時需要注明土地的抵押順位（在不動產登記證明上注明即可，告知金融機構）。

43.土地已辦理抵押，現在申請辦理房產抵押，能否辦理？

可以，抵押額不能超過總的房地價值。

44.農村宅基地抵押登記能否辦理？有房產證，土地不符合一戶一宅規定的，能否辦理轉移、抵押、更名等手續？

因為相關法律沒有出臺，所以不能辦理抵押登記。對于轉移的，可以依法收回后再審批給他人。

45.土地抵押未到期，已有業主辦理預告登記，現其他業主申請辦理預告抵押登記，是否應解除土地抵押登記？

不需要解除土地抵押，但是需經第一家金融機構同意后再辦理。

第五篇：橋梁工程總結全解

名詞解釋

1.橋梁全長：橋梁兩端兩個橋臺的側墻或八字墻后端點之間的距離。對于無橋臺的橋梁為橋面行車道的全長

2.多孔跨徑總長：梁式橋、板式橋涵的多孔跨徑總長為多孔標準跨徑的總長；拱式橋涵為兩岸橋臺內起拱線的距離，其他形式橋梁為橋面系車道長度。

3.跨徑：結構或構件支承間的距離。對于梁式橋、斜拉橋和懸索橋，它是指相鄰兩橋墩中線之間的距離，或墩中線至橋臺臺背前緣之間的距離；對于拱橋，則是指凈跨徑。

4.計算跨徑：對于具有支座的橋梁，是指橋跨結構所支承的相鄰墩臺上的支座中心之間的距離；不設支座的橋梁為上、下部結構相交面中心間的水平距離

5.凈跨徑：指設計洪水位上相鄰兩個橋墩之間的凈距。

6.橋面凈空：橋梁行車道、人行道上方應保持的空間界限。

7.五點重合法：求懸鏈線拱的拱軸系數時，要求拱圈的五個關鍵控制截面，即拱頂，兩拱腳和兩個四分點達到壓力線和拱軸線必須重合，從而使各拱圈截面不產生過大的彎矩峰值，這種設計方法稱為五點重合法。

8.矢跨比：指拱橋中拱圈（或拱肋）的計算矢高與計算跨徑之比。9.純壓拱：在某種荷載作用下任意截面彎矩等于零

10.合理拱軸線：一些特殊的分布荷載，和荷載分布規律有關的拱軸線。

11.拱橋按結構體系分類：簡單體系拱橋、組合體系拱橋、剛架體系拱橋

1.簡單體系拱橋：橋面系是局部承力和傳力結構，不考慮與主拱聯合受力。是有推力拱，水平推力由墩臺和基礎直接承受。

2.組合體系拱橋：可以是有推力拱，也可以是無推力拱。

3.剛架系桿拱橋：剛架系桿拱中拱肋與橋墩固結，不設支座，采用預應力鋼絞線作為拉桿來平衡拱的推力，拉桿獨立于橋面系之外，不參與橋面系受力，而橋面系為局部受力構件。

12.斜拉橋塔梁之間的組合方式：漂浮體系、支承體系（包括半漂浮體系）、塔梁固結體系、剛構體系。1漂浮體系：主梁在順橋方向變形不受索塔約束，主梁水平荷載不直接傳遞到索塔。

優點：順橋向負擔小和主梁彎矩分布均勻，縱橋向周期長，減輕地震作用。

缺點：結構剛度小，順橋向變形大，施工期間穩定性差。

2支承體系：塔梁之間有豎向支承、在順橋向有一定水平約束的結構形式，其中半漂浮體系在順橋向無約束。優點：索塔對主梁懂得縱向水平約束剛度越小，結構受到的水平地震作用越小，順橋向水平變形增大。缺點：剛度較大的支點使得主梁出現比較大得負彎矩。

3塔梁固結體系：塔梁之間固結，但塔與墩之間用支座傳遞荷載的結構形式。

優點：索塔彎矩小、主梁受力均勻，整體升溫引起溫度應力小。缺點：結構剛度小，變形較大，支座承受反力大。

4剛構體系：塔、梁、墩三者之間固結的結構形式。

優點：剛度大，變形小，索塔部位不要設置支座，結構維護容易，施工過程穩定性好。缺點：支點處主梁彎矩大，索塔要承受很大的溫度應力和水平地震作用。

13.鞍座：設在塔頂及橋臺上直接支承主纜并將主纜荷載傳遞給塔及橋臺的裝置。

14.錨碇：錨塊基礎、錨塊、主纜錨固系統及防護結構等的總稱。

問答題

一．橋梁的組成？

橋梁結構一般分為上部結構與下部結構。上部結構包括橋面鋪裝、橋面系、承重結構，以及連接部件；下部結構為橋墩、橋臺和基礎，有時下部結構僅含橋墩與橋臺，將橋梁基礎單列。橋梁上、下部結構之間常采用連接。上部結構是在線路遇到障礙而中斷時，跨越這類障礙的主要承載結構。下部結構的主要作用是承受上部結構傳來的荷載，并將它及本身自重傳給地基。

二．橋梁有哪些基本類型？按照結構體系分類，各種類型的受力特點是什么？

答:梁橋、拱橋、斜拉橋、懸索橋。按結構體系劃分，有梁式橋、拱橋、鋼架橋、纜索承重橋（即懸索橋、斜拉橋）等四種基本體系。梁式橋：梁作為承重結構是以它的抗彎能力來承受荷載的。拱橋：主要承重結構是拱肋或拱圈，以承壓為主。剛架橋：由于梁與柱的剛性連接，梁因柱的抗彎剛度而得到卸載作用，整個體系是壓彎構件，也是有推力的結構。纜索橋：它是以承壓的塔、受拉的索與承彎的梁體組合起來的一種結構體系。

三．公路橋面的構造？橋梁上有哪些基本的附屬設施？

公路橋面構造包括行車道鋪裝、排水防水系統、人行道（或安全帶）、緣石、欄桿、照明燈具和伸縮縫等。附屬設施包括橋面系、伸縮縫、橋梁與路堤銜接處的橋頭搭板和錐形護坡等。

四．預應力鋼筋的布置：縱向力筋、橫向力筋和豎向力筋 縱向力筋的布置：

1.連續配筋：對小跨度的等截面連續梁橋，采用就地灌注施工的，其縱向力筋可按照結構各部位的受力要求進行連續配筋。

2.分段配筋：大跨度變截面預應力梁橋通常采用懸臂施工方法。懸臂伸出施工時，對梁體施加負彎矩筋；在兩梁段合龍后（稱為體系轉換），再張拉正彎矩筋和其它力筋。

3.逐段加長力筋：由于力筋供料長度、施工方法和結構受力等方面的原因，有時需要采用連接器把主筋對接或逐段加長。逐孔施工、頂推法施工的連續梁常用。

4.體外布筋：力筋布置在主梁截面以外的箱內，配以橫隔板、轉向塊等構造，對梁體施加預應力。

5.后連續力筋：對于采用先簡支后連續方法施工的預應力混凝土連續梁橋，后連續采用預應力筋布置，必須先預留張拉槽孔和預埋管道，待連續部分的混凝土澆筑完畢后，穿束張拉后連續的力筋，實現整體梁的連續。

五．箱梁的受力特點和簡化計算？ 箱梁橋上的恒載一般是對稱作用的，它使箱梁發生彎曲，而車輛活載一般是偏心作用，使箱梁發生扭轉。另外，風力，列車橫向搖擺力，支座高程的誤差以及基礎不均勻沉降等也會使箱梁發生扭轉。對曲線橋，即便是對稱作用的荷載，也會導致箱梁扭轉，因此，結構所受到的外力可綜合表示一偏心作用的荷載.簡化計算1 經驗估值法 2用修正偏心壓力法求活載內力增加系數 經驗估值法：對于箱型具有一定厚度且有橫隔板加勁的箱型梁，忽略歪扭變形的畸變應力：將活載偏心作用引起的約束扭轉正應力和扭轉堅應力分別估計為活載對稱作用下平面彎曲正應力的15%和剪應力的5% 用修正偏心壓力法求活載內力增大系數：鑒于箱梁截面橫向剛度和抗扭剛度大，則荷載作用下梁發生變形時可以認為橫截面保持原來形狀不變，即箱梁各個腹板的擾度也呈線性規律。因此通常可以將箱梁腹板近似看做等截面的梁，先按修正偏壓法求活載偏心作用下邊腹板的荷載分配系數，再乘以腹板總數，這樣就可以得到箱梁截面活載內力的增大系數。六．拱橋的分類

1、按行車道位置分：上乘式、中乘式、下乘式

2、按結構體系分（承重結構受力圖式分）：簡單體系拱橋、組合體系拱橋、剛架系桿拱橋

受力特點：簡單體系拱橋：橋面系是局部受力與傳力結構，不考慮與主拱聯合受力

組合體系拱橋：主拱與梁等構件共同受力，對主拱的受力要求相對降低

剛架系桿拱橋：采用預應力鋼絞線作為拉桿來平衡拱的推力，拉桿不參與橋面系受力，橋面系為局部受力構件

3、按主拱的截面形式分：板拱、肋拱、雙曲拱、箱拱

七．拱橋高程：橋面高程、拱頂地面高程、起拱線高程和基礎底面高程。

拱橋橋面的高程的確定：一方面由兩岸線路的縱斷面來控制，另一方面還要保證橋下凈空能滿足泄洪或同行的要求。

起拱線高程：為了盡量較小橋墩基礎底面的彎矩，節省墩臺圬工數量，選擇低拱腳設計方案。八．為什么說拱橋的主拱的矢跨比是拱軸設計中的主要參數之一？ 拱橋的水平推力與垂直反力之比值，隨矢跨比的減小而增大；當矢跨比減小時，拱的推力增大，反之則水平推力減小；無鉸拱隨矢跨比減小其彈性壓縮、溫度變化、混凝土收縮及墩臺位移產生的附加內力越大；拱的矢跨比過大使拱腳段施工困難；矢跨比對拱橋的外形及周圍景觀的協調產生影響

九．矢跨比對拱橋受力的影響？ 計算表明，恒載的水平推力與垂直反力之比值，隨矢跨比的減小而增大。當矢跨比減小時，拱的推力增大，反之則水平推力減小。推力大，相應地在拱圈內產生的軸向力也大，對拱圈本身的受力狀況是有利的，但是對墩臺基礎不利。同時，當拱圈受力后因其彈性壓縮，或因溫度變化、混凝土收縮，或因墩臺位移等原因，都會在無鉸拱的拱圈內產生附加內力，而拱愈坦即矢跨比越小，附加內力越大。十．拉索布置形式：

1.索面數量：單索面、雙鎖面和多索面。雙索面分為雙平行索面和雙斜索面。

2.拉索在順橋向布置有輻射形、扇形和豎琴形。

輻射形：拉索傾角大，傳遞豎向荷載效率高，張力水平分立小，減輕主梁軸向壓力。

扇形：索力傳遞接近于最合理，構造能滿足施工要求。

豎琴形：優點：避免拉索之間相互交叉的視覺效應，景觀效果好，且對主梁的軸向變形約束剛度大。缺點：豎向傳力效果比較差。

3.拉索布置按間距分類：密索和稀索。

密索體系：拉索布置密集，可以改善主梁受力條件，索力較小，錨固方便。

稀索體系：主梁無索跨度大，彎矩大，要求主梁截面大，自重也大，索的拉力大，錨固困難。

十一．斜拉索的組成：鋼索、兩端的錨具、減震裝置和保護措施。十二．懸索橋：由主纜、加勁梁、塔柱和錨定組成。懸索橋的結構體系根據加勁肋的構造分為：單跨、三跨簡支和三跨連續。

懸索橋的分類：自錨式懸索橋、帶斜拉索的懸索橋、斜拉-懸索混合的懸索橋。

懸索橋與其他橋式相比，為什么跨度大，優勢體現在哪里？

1材料用量和截面設計方面。其他橋型的承重構件的截面面積，隨著跨度增加而增加，致使材料用量大。而大跨度懸索橋加勁梁不是主要承重構件，面積不需要隨跨度增大而增大。

2構件設計方面：許多構件截面積的增大時容易受到客觀制約的，但懸索橋的主纜、錨定和塔這三項主要承重構件在擴充其截面積或承載能力方面遇到的困難比較小。3主纜具有非常合理的受力形式。對于拉壓構件，應力在截面上得分布比較均勻，對受彎桿件，在彈性范圍內應力分布呈三角形。就充分發揮材料的承載能力來說，拉壓的受力方式較受彎合理，而受壓構件需要考慮穩定性問題。由于主纜瘦啦，截面設計較容易，因此懸索橋跨度是最大的。（為什么懸索橋的跨度最大？）

4在施工方面。主纜先架好，而主纜可以有細小鋼絲集合而成，使得建造大跨度橋梁使用的大直徑纜索能夠通過小型安裝完成。主纜完成后就是一個現成的懸吊式腳手架。雖然要采取措施防御大風，但同其他橋比起來風險也較小。凈跨徑: 對于梁橋是指設計洪水位上相鄰兩個橋墩或橋墩與橋臺之間的凈距離；對于拱橋是指兩拱腳截面最低點之間的水平距離。計算跨徑: 對于有支座的橋梁，是指橋跨結構相鄰兩個支座中心的距離，用表示;對于拱橋,是指相鄰兩拱腳截面形心點之間的水平距離 3 橋梁全長: 指橋梁兩端兩個橋臺的側墻或八字墻后端點之間的距離，對于無橋臺的橋梁為橋面系行車道的全長.4 設計洪水位: 橋梁設計中按規定的設計洪水頻率計算所得的高水位 5 荷載折減系數：計算結構受力時，考慮活荷載標準值不可能全部布滿和各構件受載后的傳遞效果不同，對荷載進行折減的系數。分為橫向折減系數和縱向折減系數。6 偶然作用：是指在結構使用期間出現的概率很小，一旦出現，其值很大且持續時間很短的作用。永久作用：是指在結構使用期間，其量值不隨時間而變化或其變化值與平均值比較可忽略不計的作用。可變作用：是指在結構使用期間，其量值隨時間變化，且其變化值與平均值比較不可忽略的作用。9 荷載橫向分布影響線：指表徑橋路上車輛、人群荷載沿橫橋上對主梁分配的荷載程度的系數 矢跨比：指拱橋中拱圈（或拱肋）的計算矢高與計算跨徑之比（），亦稱拱矢度，它是反映拱橋受力特性的一個重要指標 合理拱軸線：能使拱的各個截面彎矩為零的拱軸線。五點重合法：求懸鏈線拱的拱軸系數時，要求拱圈的五個關鍵控制截面，即拱頂，兩拱腳和兩個四分點達到壓力線和拱軸線必須重合，從而使各拱圈截面不產生過大的彎矩峰值，這種設計方法稱為五點重合法。凈矢高：指從拱頂截面下緣至相鄰兩拱腳截面下緣最低點連線的垂直距離，以表示。標準跨徑: 對于梁橋，是指兩相鄰橋墩中心線之間的距離，或橋墩中心線至橋臺臺背前緣之間的距離；對于拱橋，則是指凈跨徑，用表示 連拱作用 ：支承在有限剛度橋墩上德連續多孔拱橋，在拱圈受力時，各孔拱圈橋墩變形相互影響的作用 預拱度：為了平衡橋梁使用時的上部結構和施工時支架的各變形值，在橋梁澆筑時預先施加的一個上拱值。17 簡單體系拱橋是有推力拱，拱的水平推力直接由墩臺或基礎承受，主拱圈是橋跨結構的主要承重構件 拱橋的聯合作用是指當活載作用于橋跨結構時，拱上建筑參與主拱圈共同承受活載的作用 橋梁的建筑高度是指橋面與橋跨結構最低邊緣的高差

20總跨徑是計算跨徑之和 作用效應是指永久作用、可變作用、偶然作用等橋梁作用于橋梁上引起其結構外加變形或約束變形 22 建筑高度：指橋上行車路面（或軌頂）標高至橋跨結構最下緣之間的距離。橋下凈空高度：指設計洪水位或通航水位至橋跨結構最下緣之間的距離。橋梁高度：指橋面與低水位之間的高差或為橋面與橋下線路路面之間的高差 容許建筑高度：公路（或鐵路）定線中所確定的橋面（或軌頂）標高，對通航凈空頂部標高之差，又稱為容許建筑高度。最不利荷載組合：對于橋梁結構可能同時存在的荷載，使其產生最不利效應時的荷載組合。拱軸系數：是指拱腳的恒載集度和拱頂恒載集度的比值 作用效應組合：對結構上可能同時出現的作用，按照產生最不利效應時進行的組合。

簡答題 梁式橋按承重結構的靜力體系的分類和特點？

分為簡支梁橋、懸臂梁橋、、連續梁橋、T形鋼構橋及連續-鋼構橋。簡支梁橋受力簡單梁中只有正彎矩，體系溫變、張拉預應力等均不會在梁中產生附加內力，設計計算方便，最易設計成各種標準跨徑的裝配式結構。將簡支梁橋梁體加長，并越過支點就成為懸臂梁橋。將簡支梁梁體在支點上連接形成連續梁，連續梁受溫度變化及混凝土收縮等影響產生的縱向位移也就較大，使伸縮縫及活動支座的構造復雜化。T形剛構是一種墩梁固結、具有懸臂受力特點的梁式橋。連續鋼構橋是預應力混凝土大跨梁式橋的主要橋型之一，它綜合了連續梁和T形鋼構橋的受力特點，將主梁做成連續梁體，與薄壁橋墩固結而成。主拱圈高度如何擬定？

答：根據跨徑大小、荷載等級、主拱圈材料規格等條件決定 選擇拱軸線的原則？常用的拱軸線型有哪些？什么是合理拱軸線？ 答：選擇拱軸線的原則是盡可能降低由于荷載產生的彎矩值，充分利用圬工材料抗壓性能。常用的拱軸線型有圓弧線、拋物線和懸鏈線。合理拱軸線是拱橋上拱圈截面只受軸向壓力而無彎矩作用的拱軸線。“五點重合法”如何確定空腹式懸鏈線拱的拱軸線和拱軸系數？

答：五點重合法：使懸鏈線拱軸線接近其恒載壓力線，即要求拱軸線在全拱有5點（拱頂、拱腳和1/4點）與其三鉸拱恒載壓力線重合。6 簡支梁橋的設計計算應包括哪些內容？

答：有受彎構件正截面承載力計算、受彎構件斜截面承載力計算、裂縫寬度計算、撓度計算。簡述“全預應力混凝土梁”和“部分預應力混凝土梁”各自的優缺點？ 答：全預應力是在全部荷載最不利組合作用下，正截面上混凝土不出現拉應力。部分預應力是在全部荷載最不利組合作用下構，構件正截面上混凝土允許出現裂縫，但裂縫寬度不超過規定容許值。懸臂梁橋和連續梁橋為什么比簡支梁橋具有更大的跨越能力？它們的主要配筋特點是什么？

答：這主要是由于懸臂體系梁橋和連續體系梁橋存在支點負彎矩，所以，其跨中彎矩比相同跨徑相同荷載的簡支梁橋的跨中彎矩顯著減小。同時，由于跨中彎矩的減小可以減小跨度內主梁的高度，從而降低鋼筋混凝土用量和結構自重，而這本身又導致了恒載內力的減小，所以它們具有更大的跨越能力。由于負彎矩的存在，它們主要的配筋特點是在支點附近需要配置承受負彎矩的力筋，在跨中附近需要配置承受正彎矩的力筋。懸索橋的基本組成、構造類型、結構體系和受力特點？

答：其主要結構由主纜、橋塔、錨碇、吊索、加勁梁等組成，構造類型組合體系橋型，結構體系為利用主纜和吊索作為加勁梁的懸掛體系，受力特點是在吊索的懸吊下，加勁梁相當于多個彈性支承連續梁，彎矩顯著減小；懸索橋的活載和恒載通過吊索和索夾傳遞至主纜，再通過鞍座傳至橋塔頂，經橋塔傳遞到下部的橋墩和基礎；主纜除承受活載和加勁梁的恒載外，還分擔一部分橫向風荷載并將它直接傳到塔頂。什么叫矮塔部分斜拉橋，它有什么特點？

答：1，埃塔部分斜拉橋由于拉索不能提供，足夠的支承剛度，故要求主梁的剛度較大。因拉索只提供部分剛度，所以命名其為部分斜拉橋。

2，特點：塔較矮；梁的無索區較長，沒有端錨索；邊跨與主跨比值較大，一般大于0.5；梁高較大；受力一梁為主，索為輔；斜拉鎖的應力變幅較小，可按體外預應力索布置。連續梁橋中通常布置三向預應力筋，他們分別和什么內力相對應？

答：縱向預應力抵抗縱向受彎和部分受剪，豎向預應力抵抗受剪，橫向預應力抵抗橫向受彎 斜拉橋的基本組成、構造類型、結構體系和受力特點？

答：斜拉橋由斜索、塔柱、主梁三部分組成，是一種橋面體系受壓，支承體系受拉的多次超靜定結構。從塔柱上伸出并懸吊起主梁的高強度鋼索起著主梁彈性支承的作用，從而大大減小梁內彎矩，使梁截面尺寸減小，減輕了主梁的重量，加大了橋的跨越能力。在這三者中，塔柱以承壓為主有時還要承受較大彎矩，主梁受彎也受軸向壓力或拉力。為什么大跨度連續梁橋沿縱向一般設計成變高度的形式？

答：

1、大跨度連續梁橋恒載內力占得比重比較大，選用變高度梁可以大大減少跨中區段因恒載產生的內力；

2、變高度梁符合內力分布規律；

3、采用懸臂法施工時，變高度梁又與施工的內力狀態相吻合；

4、從美學觀點出發，變高度梁比較有韻律感，特別是位于城市中的橋梁 變高度連續體系梁橋箱梁的梁高應如何擬定？

答：在不受截面設計中建筑高度限制的影響的前提下，連續箱梁的梁高宜采用變高度的，其底曲線可采用二次拋物線、折線和介于兩者之間的1.5-1.8次拋物線形式，具體的選用形式應按照各截面上下緣受力均勻、容易布束確定。根據已建成橋梁資料分析，支點截面的梁高H支約為（1/16—1/20）L(L為中間跨跨長)，跨中梁高H中約為（1/1.6—

1、2.5）H支。在具體設計中，還要根據邊跨與中跨比例、荷載等因素通過幾個方案的比較確定。什么是拱上建筑？實腹式和空腹式拱上建筑的組成？

答：由于主拱圈是曲線型，一般情況下車輛無法直接在弧面上行駛，所以在行車道系與主拱圈之間需要有傳遞荷載的構件和填充物。這些主拱圈以上的行車道系和傳載構件或填充物統稱為拱上建筑。

實腹式拱上建筑由拱腔填料、側墻、護拱和橋面系等部分組成，一般適用于小跨徑拱橋。空腹式拱上建筑最大的特點在于具有腹孔和腹孔墩。腹孔有拱式腹孔、梁(板)式腹孔兩種形式。腹孔跨徑不宜過大，腹孔的構造應統一。

橋梁縱斷面的設計的主要內容有哪些項？

答:橋梁縱斷面設計包括確定橋梁的總跨徑,橋梁的分孔,橋道的標高,橋上和橋頭引道的縱坡以及基礎的埋置深度等。混凝土橋面是由哪些部分組成的？各部分的作用是什么？

答：

1、道床：減弱對橋的沖擊；緩和列車的震動；防治枕木移位；將車輪集中荷載分布到梁頂面；調整軌底標高。

2：橋面鋪裝：防治車道板磨耗；保護主梁免受雨水侵蝕；減緩沖擊；分散汽車荷載。

3：防排水系統：使橋面快速排水，防治橋面水滲透到主梁內部；增加結構的耐久性。

4：伸縮縫：使橋面自由伸縮，橋面連續，車輛駛過時平順，防止雨水和雜物滲入。

5：防撞墻：防治汽車重裝橋面護欄，同時作為機動車道和人行道或非機動車道的分隔帶 17 橋面的防排水系統有何作用？常用的構造措施和施作方法有哪些？

答：應迅速排除橋面上積水，并使滲水的可能性降至最小限度。城市橋梁排水系統應保證橋下無滴水和結構上無漏水現象 設置橋梁縱坡的原因和目的是什么？

答:為使雨水迅速排除，防止或減少雨水對鋪裝層的滲透，從而保護了行車道板，延長橋梁使用壽命。橋面鋪裝、伸縮縫的作用、要求和類型？

答：橋面鋪裝作用是保護橋梁主體結構，承受車輪的直接磨損，防止主梁遭受雨水的侵蝕，并能對車輛集中荷載起一定的分布作用。因此，橋面鋪裝應有一定的強度，防止開裂，并耐磨損。主要類型有普通水泥混凝土、防水混凝土、瀝青混凝土。伸縮縫為了保證橋跨結構在氣溫變化、活載作用、混凝土收縮與徐變等影響下按靜力圖示自由變形，要求1.能保證結構溫度變化所引起的伸縮變形2.車輛駛過時應能平順、不打滑、無突跳、過大的噪聲與振動3.具有安全排水防水的構造防止雨水侵蝕、垃圾及泥土的阻塞對伸縮縫本身以及對橋面以下支座和其他結構的損壞、對功能正常發揮作用。類型有充填式伸縮縫、鋼板伸縮縫、橡膠伸縮縫、組合伸縮縫。行車道板的定義是什么？其作用是什么？

答：定義：行車道板是直接承受輪壓的混凝土板，它與主梁梁肋和橫隔梁聯結在一起的結構板。作用：承力、傳力、連接。畫圖表示出溫度降低時拱彈性中心處的水平力。P302 23 畫出系桿拱橋簡圖，指明系桿位置所在，簡述其作用。拱橋如何處理不等跨分孔問題 ?

1、采用不同的矢跨比：矢跨比與推力大小成反比

2、采用不同的拱腳標高

3、調整拱上建筑的重力

4、采用不同類型的拱跨結構：小跨采用板拱，大跨采用肋拱或中承式拱 拱橋的優缺點（P19和P229）優點：

（1）在豎直荷載的作用下所產生的水平反力，使得與同跨徑、同截面的梁相比，拱的彎矩和撓度及剪力要小得多

（2）拱橋的跨越能力很大，外形美觀 缺點

(1)

主拱在合攏之前不是拱結構，需要借助其他輔助措施，施工難度大

(2)

拱腳水平推力較大，下部結構的工程數量也相應增加，對地基條件要求較高(3)

拱以受壓為主，穩定性能問題突出 拱橋與梁橋相比在受力性能上有哪三點差異？

豎向荷載作用下，支承處存在水平推力，且全拱均勻相等

由于水平推力使拱橋截面彎矩比同截面的梁橋小

主拱主要承受彎壓內力 拱橋的主要設計標高有哪四個？

拱橋的設計標高主要有四個：橋面標高、拱頂底面標高、起拱線標高和基礎底面標高 29 拱軸線的型式與拱上建筑的布置一般有哪四點關系？ 小跨徑實腹式拱橋采用圓弧線拱軸線

小跨徑空腹式拱橋采用懸鏈線拱軸線

大、中跨徑可采用空腹式近似懸鏈線拱軸線

輕型拱橋或全透空的大跨徑拱橋可采用拋物線拱軸線

拱橋如何處理不等跨分孔問題？

1、采用不同的矢跨比：矢跨比與推力大小成反比

2、采用不同的拱腳標高

3、調整拱上建筑的重力

4、采用不同類型的拱跨結構：小跨采用板拱，大跨采用肋拱或中承式拱 分析題

一

預應力混凝土連續梁梁橋活載內力計算的方法？

答：1.按空間結構計算活載內力 按空間結構計算連續梁橋活載內力的方法有：

(1)按最不利布載計算各主梁(肋)的荷載橫向分布系數，按平面桿系結構計算繪制該主梁(肋)的縱橋向內力影響線；

(2)將荷載乘以荷載橫向分布系數，沿橋梁縱向按最不利位置分別將荷載加至影響線正負效應區，即可求得絕對值最大的正負活載內力。2.按平面桿系結構計算活載內力 計算方法與空間結構類同，只是無需計算橫向分布系數。二 預應力混凝土連續剛構梁橋的主梁截面和預應力筋布置特點？ 答：

1、由于剛構橋的主梁除了在跨中部分承受正彎矩外，在支點附近還要抵抗較大的負彎矩，因此在進行截面設計時往往要加強截面底部的混凝土受壓區。常用形式有帶馬蹄形的T形截面，箱型截面，適用于中等跨徑及大跨徑的橋梁。為了適應向支點處逐漸增大的負彎矩，梁高及梁底均可相應地加大。

2、帶掛梁剛構橋的懸臂部分只承受負彎矩，因此將預應力筋布置在梁肋頂部和橋面板內，以獲得最大的作用力臂，預應力筋分直筋和彎筋兩類，直筋的一部分在接縫處端面上錨固，一部分直通至懸臂端部錨固在牛腿端面上。肋內的彎筋則隨著施工的推進逐漸下彎而傾斜錨固在各安裝塊件(或現澆段)上。為了使位于梁肋外承托內的力筋也能下彎錨固，通常還要使它們在平面內也作適當彎曲。下彎的力筋能增加梁體的抗剪能力。在大跨徑橋梁中還可在肋內設置專門的豎向預應力筋來增強梁肋的抗剪作用。

對于帶鉸剛構橋，懸臂部分也可能出現正負異號的彎矩，在此情況下梁的底部也應布置適當的縱向預應力筋。

三

如何用等代荷載、內力影響線計算拱橋的活載內力？ 答：

1、計算集中力荷載：

①首先畫出計算截面的彎矩影響線、水平推力和支座豎向反力影響線；

②根據彎矩影響線確定集中力荷載最不利（最大、最小）的加載位置；

③以荷載值乘以相應位置的影響線坐標，求得最大彎矩（最小彎矩）及相應的水平推力和支座豎向反力。

2、計算均布力：

①下圖是某等截面懸鏈線無鉸拱橋左拱腳處的彎矩及水平推力和支座豎向反力影響線，首先將均布荷載布置在影響線的正彎矩區段。

②根據設計荷載和正彎矩區影響線的長度，可由《拱橋》手冊的均布荷載表查得最大正彎矩的等代荷載及相應水平推力和豎向反力的均布荷載和，及相應的面積。

③再以分別乘以最大正彎矩及相應水平推力和豎向反力的面積，即可求得拱腳截面的內力。最大正彎矩：

與相應水平推力：

與相應豎向反力：

式中：─—為荷載橫向分布系數；—為車道折減系數；

則與相應的拱腳截面的軸向力為：

同理，再將荷載布置在影響線的負彎矩區段，可求得最大負彎矩及相應水平推力﹑豎向反力和拱腳截面的軸向力。

④其它相應截面的軸向力和剪力分別按式下兩式計算。

拱頂：

軸向力：

拱腳：

其它截面：

拱頂：

數值很小，一般不計算

剪 力：

拱腳：

其它截面：

數值較小，一般不計算

《公路圬工橋涵設計規范》(JTG D61-2005)第5.1.1條中規定，計算由汽車荷載產生的拱的各截面正彎矩時，拱頂至拱跨1/4點應乘以折減系數0.7，拱腳應乘0.9，拱跨1/4點至拱腳，用直線插入法確定。

四

實腹式懸鏈線拱的拱軸線和拱軸系數如何確定（含拱軸系數公式推導）？

答：定拱軸線一般采用無矩法，即認為主拱圈截面僅承受軸向壓力而無彎矩。

拱軸系數的確定：拱軸系數：，拱頂恒載分布集度為 ：

（4-20）

拱腳恒載分布集度為：

（4-21）

式中： ─—分別為拱頂填料、拱圈材料及拱腹填料的容重；

─—為拱頂填料厚度，一般為300～500mm；

─—為主拱圈厚度；

─—為拱腳處拱軸線的水平傾角； 由幾何關系有

（4-22）

由以上各式可以看出，盡管只有

為未知數，其余均為已知，但仍不能直接算出。所以，在具體計算值時可采用試算法確定。具體做法如下：

①先根據拱的跨徑和矢高假設，再由《拱橋》附錄表（Ⅲ）-20查得拱腳處的值；

②將值代入式（4-21）計算出后，再與一同代入式（4-11），即可求得值。

③再與假設的值比較，如兩者相