第一篇：微生物菌種純度檢測技術規程

微生物菌種純度檢測技術規程范圍

本規程規定了古菌、細菌、真菌、病毒（種）純度檢測的程序和方法。

本規程適用于從事微生物菌種資源保藏及研究的機構、大學、企業、個人等。術語、定義

下列術語和定義適用于本規程

2.1

純度檢測 purity check

指通過適當的方法檢測菌種是否為純培養物。

2.2

純培養pure culture

由單個細胞的后代組成的培養物，即單細胞培養物或無性繁殖系。通常是由挑取單個菌落或利用單胞分離技術，移種繁殖獲得。菌種的純度檢測

3.1 古菌和細菌的純度檢測

3.1.1 菌落形態

在特定的培養基上，將待檢測培養物稀釋涂布或平板劃線，適宜培養后，同一平板上的單菌落的大小、形狀、顏色、質地、光澤等是否相似；對于兩種或以上形態的出發菌株，應再分別挑取單菌落劃線或稀釋涂布培養，檢測是否重復出現相同特征。

3.1.2 細胞形態

對數生長期的培養物革蘭氏染色反應應呈現一致性；細胞形狀、大小、莢膜等特征應相似

3.1.3 芽孢大小、位置、形狀

宜檢測樣品是否形成芽孢，對形成芽孢的菌種，其芽孢大小、位置、形狀應相似。

3.2 放線菌菌種純度檢測

3.2.1 菌落形態

在特定的培養基上，將待檢測培養物稀釋涂布或平板劃線,挑取單菌落，適宜培養后，在同一平板上單菌落形狀、大小、表面狀況、質地、光澤、顏色等應相似。如懷疑為細菌污染，則30℃液體培養24小時，培養液不應渾濁，如渾濁則視為細菌污染。

3.2.2 培養特征

分別接種三種以上培養基，在三種以上培養基上的培養特征應想同，包括氣生菌絲、基內菌絲、可溶性色素的顏色等。

3.2.3 孢子絲及孢囊

在特定的培養基、培養溫度及培養時間等條件下，孢子著生方式、孢子絲形態及其顏色或孢囊著生位置（氣絲或基絲）、孢囊的形狀，大小應呈現出一致性。

3.3 酵母菌種純度檢測

3.3.1 菌落形態

應對菌落形態相似性進行檢測。在特定的培養基上，通過對待檢測菌株進行稀釋或劃線涂布平板獲取單菌落，一定的培養條件下，比較同一平板內，菌落的大小、形狀、顏色、隆起、表面狀況、質地、光澤等應一致。

3.3.2 個體形態

應對檢測樣品的個體形態進行檢測。在指定的培養基及培養條件下，細胞形狀、大小及細胞的增殖方式應一致。

3.3.3 繁殖方式

酵母繁殖的方式應一致，如是芽殖，出芽的方位、數量應一致。

3.4 絲狀真菌菌種純度檢測

3.4.1 菌落特征

菌落的形態等表觀特征應一致。

3.4.2 菌絲特征

在特定的培養基和培養條件下，菌絲分隔、菌絲形態等應一致。

3.4.3 其他主要顯微特征應一致

3.4.4 檢測是否有細菌污染

3.4.5 對于外觀上不能確定菌種純度的，利用單胞分離技術獲得純培養物進行對比，其菌絲、孢子等特征應與原始菌株的描述一致。

3.5 病毒的純度檢測

3.5.1 純粹檢查

應將待檢病毒液直接接種含硫乙醇酸鹽培養基（T.G）、酪蛋白胨瓊脂培養基（G.A）、葡萄糖蛋白胨湯。通過一定溫度時間培養后，檢查結果應無細菌生長為純粹。

3.5.2 支原體檢查

檢測由禽胚組織或其細胞所培養的病毒應用改良Frey氏培養基。檢測其它培養方法所得病毒應用支原體培養基。任何一次瓊脂平板上出現支原體菌落，判為陽性。陽性對照中至少有一個平板長菌落，而陰性對照中無菌落生長，則檢驗有效。

3.5.3 外源病毒檢查

病毒類制品在毒種選育和生產過程中，經常使用動物或細胞基質培養，因此，有可能造成外源因子（特別是外源病毒因子）的污染。為了保證制品質量，需要對毒種和細胞進行外源因子檢測。

3.5.3.1 病毒種子批外源因子檢查

對病毒主種子批或工作種子批，應抽取足夠檢測試驗需要量的供試品進行病毒外源因子檢測。在試驗前應用特異性抗體（血清）中和本病毒（或單克隆抗體），所用的抗體免疫源應采用與生產疫苗（或制品）不同種而且無外源因子污染的細胞（或動物）制品。如果病毒曾在禽類組織或細胞中繁殖過，則抗體不能用禽類來制備。若用雞胚，應來自SPF雞群。以下方法可以選擇一種或多種進行。

3.5.3.1.1 動物試驗法

3.5.3.1.1.1 小鼠試驗法

取15－20g小鼠至少10只，用經抗血清中和后的病毒懸液，每只腦內接種0.03ml，同時腹腔接種0.5ml。至少觀察21天。在觀察期內至少有80％最初接種的小鼠存活，試驗才有效。如果沒有小鼠出現病毒感染，為符合要求。解剖所用在試驗24小時后死亡或有患病體征的小鼠，直接觀察期病理改變，并將有病變的相應的組織懸液通過腦內和顱腔接種另外至少5只15－20g小鼠，并觀察21天，如果沒有小鼠出現病毒感染，則符合要求。

3.5.3.1.1.2 乳鼠試驗法

取出生后24小時內的乳鼠至少10只，用經抗血清中和后的病毒懸液，腦內接種0.01ml，同時腹腔接種至少0.1ml。每天觀察，至少14天。在觀察內至少有80％最初接種的乳鼠存活，試驗才有效。如果沒有小鼠出現病毒感染，為符合要求。解剖所有在試驗24小時后死亡或有患病體征的乳鼠，直接肉眼觀察其病理改變，并取有病變的相應的組織和腦、脾制備成懸液通過腦內和腹腔接種另外至少5只出生后24小時內乳鼠，并每天觀察至接種第14天，如果沒有小鼠出現病毒感染，則符合要求。

3.5.3.1.2 細胞培養法

3.5.3.1.2.1 非血吸附檢查

用經抗血清中和后的病毒懸液，接種于生產用的同種的細胞。細胞至少接種6瓶，每瓶病毒懸液接種量不少于培養液總量的25％。于36±1℃培養，觀察14天，必要時可更換細胞培養液，未見細胞病變（CPE）為陰性，符合要求。

3.5.3.1.2.2 血吸附病毒檢查

上述接種病毒的各個細胞于第6－8天后和第14天，取出2瓶進行血吸附病毒檢查。用0.2％－0.5%雞和豚鼠紅細胞混合菌懸液覆蓋于細胞表面，分別置于2－8℃，20－25℃，30分鐘后顯微鏡下觀察，未見血球吸附現象為陰性，符合要求。

3.5.3.1.3 雞胚檢查法

在禽類組織或細胞中繁殖過的病毒種子需用雞胚檢查禽類病毒的污染。選用9－11日和5－7日齡兩組SPF雞胚，每組至少5只，分別于尿囊腔和卵黃囊接種經抗體血清中和后的病毒懸液，每胚0.5ml。孵育7日后，取尿囊液用豚鼠和雞血細胞混合懸液做血球凝集試驗應為陰性。被接種的雞胚至少80％存活7天，試驗有效。

3.5.3.2 生產用細胞外源因子檢查

3.5.3.2.1 細胞直接觀察

每批生產用細胞應留取5％（或不少于500ml）,細胞懸液不接種病毒，作為對照細胞加入與疫苗生產相同的細胞維持液，置于與疫苗生產相同的條件下培養，觀察14天，在顯微鏡下觀察是否有細胞病變（CPE）出現，無細胞病變（CPE）出現者為陰性，符合要求。在觀察期末至少有80％的對照細胞培養物存活，試驗有效。

3.5.3.2.2 血清吸附病毒檢查

對生產用細胞外源因子檢查的（1）項細胞培養物在觀察期末取至少25％的細胞培養瓶進行血吸附病毒檢查。（方法同病毒種子批外源因子檢查的血吸附病毒檢查）

參考文獻

[1] 劉志恒，姜成林主編.放線菌現代生物學與生物技術.北京：科學出版社,Pp1-353.2004

[2] 楊蘇聲主編.細菌分類學.北京：中國農業大學出版社,Pp1-145.1997

[3] 沈萍，彭珍榮主譯.《微生物學》，第五版，中文版,高等教育出版社，2004

[4] 中國科學院微生物研究所《常見與常用真菌》編寫組.常見與常用真菌.北京：科學出版社,P1-317，1978

[5] 中國科學院微生物研究所《菌種保藏手冊》編著組.菌種保藏手冊.北京：科學出版社,P1-839，1980

[6] David R.Boone et al.Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology.Second Edition.Volume One.Springer.2001

[7] Kirk P.M., P.F.Cannon, J.C.David and J.A.Stalpers(ed).Dictionary of the Fungi.9th edition.CABI Publishing.2001

第二篇：氫氧化鈉檢測 氫氧化鈉純度檢測

氫氧化鈉檢測 氫氧化鈉純度檢測

一：氫氧化鈉檢測概述（003）

科標無機檢測中心提供氫氧化鈉檢測、氫氧化鈉純度檢測、氫氧化鈉成分檢測、氫氧化鈉含量檢測等相關分析、檢測服務。氫氧化鈉，俗稱燒堿、火堿、片堿、苛性鈉（香港亦稱“哥士的”），為一種具有高腐蝕性的強堿，一般為片狀或顆粒形態，易溶于水并形成堿性溶液，另有潮解性，易吸取空氣中的水蒸氣。用途很廣，如制造肥皂、紙漿、人造絲，整理棉織品，精煉石油，提煉煤焦油產物等。制法有電解法和化學法兩種。

二：氫氧化鈉的主要用途

氫氧化鈉用途極廣。用于制祁雖溶液、造紙漿、肥皂、染料、人造絲、制鋁、石油精制、棉織品整理、煤焦油產物的提純，以及食品加工、木材加工及機械工業等方面。

使用氫氧化鈉最多的部門是化學藥品的制造，其次是造紙、煉鋁、煉鎢、人造絲、人造棉和肥皂制造業。另外，在生產染料、塑料、藥劑及有機中間體，舊橡膠的再生，制金屬鈉、水的電解以及無機鹽生產中，制取硼砂、鉻鹽、錳酸鹽、磷酸鹽等，也要使用大量的燒堿。三：主要檢測產品

碳酸鈣、無水高氯酸鋰、工業過硫酸鹽產品、工業氯化鈣、工業用高純氫氧化鈉、化纖用氫氧化鈉、工業硼化物、工業硼酸、工業用氫氧化鈉、工業碳酸鈉、工業用合成鹽酸、工業硝酸 濃硝酸、工業硫酸、工業氫氧化鎂、工業氫氧化鈣、副產鹽酸、工業碳酸氫鈉、工業高錳酸鉀、工業氯化鈣等。碳酸鈣、無水高氯酸鋰、工業過硫酸鹽產品、工業氯化鈣、工業用高純氫氧化鈉、化纖用氫氧化鈉、工業硼化物、工業硼酸、工業用氫氧化鈉、工業碳酸鈉、工業用合成鹽酸、工業硝酸 濃硝酸、工業硫酸、工業氫氧化鎂、工業氫氧化鈣、副產鹽酸、工業碳酸氫鈉、工業高錳酸鉀、工業氯化鈣等。

四：主要檢測項目

化合物含量、單質含量、水分、氯化物、重金屬含量、灼燒殘渣、PH值、不溶物含量、水溶物含量、密度、白度、吸油量、活化度測定、酸堿度、篩余物含量、粒度、堆積密度、松散度、105℃揮發物等。

第三篇：NY_T 528-2002_食用菌菌種生產技術規程

NY/T 528-2002 食用菌菌種生產技術規程

基本信息

【英文名稱】Technical inspection of pure culture making of edible fungi 【標準狀態】被代替 【全文語種】中文簡體 【發布日期】2002/8/27 【實施日期】2002/12/1 【修訂日期】2002/8/27 【中國標準分類號】暫無 【國際標準分類號】暫無

關聯標準

【代替標準】暫無 【被代替標準】暫無

【引用標準】GB 4789.28-1994,GB 9687-1988,GB 9688-1988

適用范圍&文摘

暫無

第四篇：微生物實驗菌種保藏方案

一、石蠟油低溫保藏法

本方法的原理是在長好的斜面菌上覆蓋滅菌的液體石蠟，達到菌體與空氣隔絕，使菌處于生長和代謝停止狀態，同時石蠟油還防止水分蒸發，在低溫下達到較長期的保藏菌種的目的。保藏溫度要求在-4～4℃下。液體石蠟法適用于不產孢子的菌種。具體操作是：菌種為斜面培養菌種，斜面不宜過長；選擇純凈優質石蠟油，置三角燒瓶中經過121℃高壓蒸汽滅菌1～2h，將其放烘箱中(160℃左右)干熱處理，去除滅菌時滲入的水分，待石蠟油變得清澈透明后冷卻即可加入斜面，斜面上不能出現氣泡，液蠟添加量以高出斜面頂部約1cm為宜。

二、甘油管冷凍保藏法

1．試驗方法介紹本法也是利用微生物在甘油中生長和代謝受到抑制的原理達到保藏目的。其方法是，將80%的甘油高壓蒸汽滅菌待用。將培養好的斜面菌種用無菌水制成高濃度的菌懸液(108～1010/ml)。取1ml滅菌甘油放入與甘油充分混勻，使甘油濃度約為10%-30%，于-70℃下凍存。-20℃保存時間較短。或采用體積比為8：2的甘油－生理鹽水，加入新鮮培養的菌體肉湯，混合均勻后至-20℃冰箱保存。

2．效果該法適用于一般細菌的保存，同時也適用于鏈球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種，適用范圍廣，操作簡便，效果好，無變異現象發生。甘油－生理鹽水保存液保存菌種優于甘油原液，其原因可能是加入生理鹽水適當降低了甘油的高滲作用，且有肉湯培養物適量增加保存液的營養成分，從而更好地保護了待保存的菌株。

三、真空冷凍干燥法

1．試驗原理

真空冷凍干燥保藏法是兼具低溫、干燥、除氧三方面菌種保藏的主要因素，除不宜于絲狀真菌的菌絲體外，對病毒、細菌、放線菌、酵母及絲狀菌孢子等各類微生物都適用，不宜用凍干法保存的微生物不到2%。冷凍干燥法是在低溫下快速將細胞凍結，然后在真空條件下干燥，使微生物的生長和酶活動停止。為了防止在冷凍和水分升華過程中對細胞的損害，要采用保護劑來制備細胞懸液，使菌在凍結和脫水過程中起到保護作用的溶質，通過氫鍵和離子鍵對水和細胞所產生的親和力來穩定細胞成分的構型。即是使樣品中的水分在冰凍狀態下，抽真空減壓，使凍結的冰直接升華為水蒸氣，使樣品達到干燥。干燥后的微生物在真空下封裝，與空氣隔絕，達到長期保藏的目的。

2．試驗步驟

1）安瓿管準備選取規格約直徑為8mm，高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%鹽酸浸泡8～10h，再經自來水沖洗多次，用蒸餾水涮洗2～3次，烘干；在每管內放入打好菌號及日期的標簽，字面朝向管壁，管口塞好棉塞，滅菌備用。

2）保護劑的選擇及制備冷凍干燥保藏法使用的保護劑種類很多，效果不盡相同，通常采用高分子化合物與低分子化合物混合使用效果更好。在配制時注意比例、濃度、pH和滅菌方法。一些對熱敏感的保護劑如血清等用過濾除菌，牛奶、葡萄糖及乳糖等要控制滅菌溫度。一般情況下，多數菌種可以用脫脂乳糖等要控制滅菌溫度。一般情況下，多數菌種可以用脫乳為保護劑。

3）菌種準備及分裝菌種要求為生長良好的純種，菌齡以處于穩定期為好，孢子是新鮮的。每支長好的斜面加2～3ml保護劑，用接種環將菌苔輕輕刮起(注意勿刮起培養基)，制成菌懸液。如用液體培養的菌種，則需經離心收集和用滅菌生理鹽水洗滌細胞，收集的菌體用保護劑懸浮制成菌懸液。懸液中菌數要求達到108～1010cfu/ml為宜。懸液制備完成盡快分裝和凍結。分裝安瓿時可用滅菌的長滴入安瓿管底部，裝量可依據冷凍干燥機效能而定。

4）預凍分裝好的安瓿管需要進行預凍，即放在-30～-40℃下凍結20～60min，也可以用干冰和無水乙醇凍5～10min。

5）冷凍干燥經預凍的安瓿放入干燥箱中開始抽真空干燥。此時干燥箱溫度控制在-30℃以下，并盡快使真度達到66Pa以下。此后可還漸升溫以加速水分升華，但升溫不宜過快，以

免引起樣品融化。干燥時間視凍干機效率、樣品裝量及性質等而定，以樣品最終水分含量達到1%～3%為準。具體操作時是根據凍干樣品呈酥塊工松散片狀；真空度接近空載時最高真空；樣品溫度與管外溫度接近。

干燥完畢將安瓿管在真空下用火焰燒熔密封，并用高頻真空檢測真空度。

6）保藏及凍干管的啟用密封好的凍干管在4℃或-18℃下保藏。當需用凍干菌種時，取出安瓿管用酒精表面消毒，用小砂輪在無菌條件下打開，或將安瓿頂部在酒精燈火焰上灼燒，迅速滴上冷的無菌水，使管破裂，然后用鑷子等輕輕敲碎管口，加入0.3～0.5ml液體培養基溶解凍干菌塊成為懸液，用無菌滴管或接種環移至斜面或液體培養基進行培養。

7）影響菌株生長因素

①菌的質量：保藏的菌種應培養在營養豐富的最適條件下，使之進入穩定期，稍老一些的菌體對環境抵抗力強。另處，作為冷凍干燥的菌懸液細胞濃度要高不同的菌對冷凍干燥的耐受程度不同，如果保存的菌液細胞濃度不高，就會使以后傳種造成困難，保存期也會受到影響。

②保護劑：不同種類的保護劑對不同微生物的作用是不同的，如個別菌種在脫脂乳作保護劑的情況下死亡率高達99.99%，而采用葡聚糖等混和保護劑時死亡率大大減少。一般情況下，那些容易保存的菌種對保護劑的要求不很嚴格，而不易保存的菌種對保護劑的要求卻很苛刻。因此，選擇好的保護劑是冷凍干燥保存菌種的關鍵因素。

③干燥速度：實驗表明，慢速干燥比快速干燥存活率高，如青霉菌6h干燥存活率為67.3%，而3h為59%。

④空氣的影響：冷凍干燥后空氣對細菌細胞影響較大，可導致細胞損傷進而死亡，故在凍干后應立即在真空下融封，才有利于長期保存。

⑤溫度的影響在干燥和真空狀況下溫度的影響遠沒有上述幾項因素重要，因此可以在室溫下保存，但許多微生物在4℃保存的存活率要比在室溫下高1倍。⑥含水量的影響：水分含量過高對菌存活不利，完全脫水也不利于保存，一般把干燥后的細胞含水量控制在3%以下(1%～3%)。⑦復蘇培養：打開安瓿管后加入無菌水使 凍干菌融化，融化速度慢比快速融化的成活率要高。

菌種能否適宜于凍干保存，需經過實驗來證明，一般是在保存1個月進行復蘇培養，如果菌的成活率高于10%，即認為可用凍干保存法保存，以后6個月、2年、5年、10年再進行檢查存活情況，以確定保存期的上限。

凍干保藏的效果因微生物種類而異，一般是細菌＞放線菌＞真菌＞藻類，而菌絲體不宜用此法保存。

3．試驗效果冷凍干燥保存的菌種存活時間長、效果好，一般菌種可保存5年以上，有的可保藏15年以上不發生變異。還具有體積小、不易污染、便于運輸等優點，是一種用得最為廣泛的菌種保藏方法。

4．試驗儀器及試劑冷凍干燥備有不同型號和類型，但都由四個部分組成：干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷凍系統。干燥箱可控制溫度范圍為-40～40℃。

四、液氮超低溫保存

1．試驗原理本方法是近年推廣使用的一種菌種保存法。大多數微生物如病毒、噬菌體，立克氏體，各種細菌、放細菌、支原體，各種絲狀菌、酵母、藻類和原蟲，特別是一些無法用凍干保存的微生物，都可用此法長期保存。工業微生物高產菌種也逐步采用此法保存。液氮保存的原理是微生物在-130℃以下溫度時，它的新陳代謝作用停止，化學反應也消失，而液氮溫度可達-196℃，在這種情況下可以長期保存。

2．試驗步驟

1)安瓿管準備一般要求用95%料或GG17的玻管制作，以能承受巨大的溫差變化而不破損，大小根據需要而定。用印同在管壁上書寫菌號，160℃烘干，加棉塞滅菌備用。

2)菌種準備在最適培養基斜面上培養得到健壯菌種，制成懸浮液，如為不產孢子的真菌，則采用斜面或液體振蕩培養，制成菌絲片段。將菌懸淮分裝至滅菌安瓿管中，每管0.2～0.5ml，然后用火焰將安瓿熔封。

3)凍結將熔封后的安瓿管入大慢速凍結器上，以每分鐘下降1℃的速度冷凍，當安瓿管溫度下降至-35℃時，即可把安瓿管移入液氮內作長期保藏。

4)菌種的復蘇培養直至全部溶化為止，當溶化后即開啟安瓿移至培養基內培養，扣作時應特別注意安全，防止爆炸或凍傷，不宜戴線手套，要戴皮手套操作

3．試驗儀器及試劑

1）保護劑與冷凍干燥保存一樣，液氮保存菌種也需要有保護物質，可以用10%的甘油，使用方便、效果好，但有些菌對甘油敏感，效果不佳，可選用其他保護劑，常用的有5%～10%(V/V)二甲基亞砜；20%二甲亞砜加1%蛋白陳；吐溫80及0.4mmol聚乙烯氮戊環等，糖類也可作為一種保護劑，但濃度適當加以控制。

2）液氮罐

第五篇：微生物菌種、毒株的管理規定2013版

微生物菌種、毒株的管理規定

為加強可感染人類的高致病性病原微生物菌種、毒株的管理，保障人體健康和公共衛生安全特制定本規定。

一、菌種、毒株的保藏和管理嚴格按《中華人民共和國傳染病防治法》、《病原微生物實驗室生物安全管理條例》、《可感染人類的高致病性病原微生物菌種、毒株管理規定》等法律、行政法規的規定執行。

二、設立《微生物實驗室菌種登記表》，其內容包括：菌種編號、菌種名稱、菌種來源、保存日期、數量、保存條件、存放位置、保管人。

三、嚴格的登記制度、建立詳細的總賬及分類賬。

四、根據菌種的特性選擇適宜的保存方式。采用雙人管理。

五、根據菌種情況，定期檢測菌種品質，發現菌種變異或退化時應及時報告，并查明原因。

六、菌種的發放需要雙保管人員同時在場的情況下才能進行。每次使用標準菌株都應做好使用記錄，包括標準品的名稱、編號、使用時間等。

七、購買的標準菌株初次復蘇使用時，應批量保存在菌種管中，-20℃以下保存。

八、新的標準菌株復蘇后，傳代最多不超過3次，如超過3次將不再作為標準菌株使用。

九、標準菌株保存管一經解凍使用后，不得再次凍存。

十、菌種必須裝在密封的專用容器內高壓滅菌銷毀，并做好銷毀記錄。

十一、菌種、毒株失竊要及時報告處理，并有相應的應急預案。

微生物實驗室菌種、毒株管理者：