第一篇：細胞生物學實驗社會實踐報告

建立一個動物細胞培養室與植物細胞培養室所需的條件與社會價值

無菌環境是細胞離體培養的最基本條件，所以構建一個細胞培養室需要保證工作環境不受微生物和其他有害物質污染，并且干燥無煙塵。細胞培養室的設計原則一般是無菌操作區設在室內較少走動的內側,常規操作和封閉培養于一室,而洗刷消毒在另一室。

一、基礎實驗室配置

⑴消毒間：消毒間主要為了處理實驗器材以及實驗材料，營造一個無菌的試驗環境，一般消毒間會配備超凈實驗臺、高壓滅菌鍋、排風滅火設備、細菌過濾設備、干熱消毒柜、電爐、酸缸等。

⑵無菌操作間：一般由緩沖間和操作間兩部分組成。緩沖間在外側，多用于實驗之前的準備，例如：更衣，準備實驗材料，處理實驗數據等，可放置電冰箱,冷藏器及消毒好的無菌物品等。操作間放置凈化工作臺及二氧化碳培養箱,離心機,倒置顯微鏡等。工作人員進入操作間一定要消毒并更衣。

（3）培養基配制間：主要用于配置細胞培養所用的培養基。主要包括冰箱、天平、微波爐、pH計、培養基分裝器、藥品柜、器械柜、抽氣泵、電爐、各種規格的培養瓶、培養皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶、儲藏瓶等。

（4）培養室：用于培養細胞，放置以接種的培養基等。為了控制培養室的溫度和光照時間及其強度，培養室的房間不要窗戶，但應當留一個通氣窗，并安上排氣扇。室內溫度由空調控制，光照由日光燈控制。天花板和內墻最好用塑料鋼板裝修，地面用水磨石或瓷磚鋪設，一般要分兩間，一為光照培養室，一為暗培養室。培養室外應有一預備間或走廊。培養室應配有培養架、轉床、搖床、光照培養箱、生化培養箱、自動控時器等。

（5）洗滌間：主要用于清洗實驗之后的用具。除配置水槽外，還需配置洗液皿、落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗器等，有需求的還可以配置洗瓶機。

以上基礎設施若實驗室條件不夠，可將消毒間，培養基配制間，洗滌間合并一起，但注意實驗室衛生以及儀器擺放，房間要保持清潔，明亮。

二、輔助實驗室

細胞學鑒定室：其功能是對培養材料進行細胞學鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學儀器不受潮濕和灰塵污染。應配置各種顯微鏡、照相系統等。

生化分析室：在以培養細胞產物為主要目的的實驗室中，應建立相應的分析化驗實驗室，以便于對培養物的有效成分隨時進行取樣檢查。離心機、酶聯免疫檢測儀、天平、PCR儀等。

溫室：用于試管苗的鍛煉和移植，為試管苗提供滿足生長的適宜環境條件。常用設備有：溫室、彌霧裝置、蔭棚、移栽床、缽、盆、基質等（用于植物細胞培養室）。

實驗器材匯總： CO2培養箱：37度+/-0.5度；能調節溫度和CO2濃度

冰箱：4度或-20度家用冰箱，保存一般制劑；-70度保存蛋白制劑 水質純化裝置：凈化水質用于清洗或配制培養液

培養器皿分玻璃和塑料兩種，玻璃器皿適用于大部分細胞生長，可重復使用，塑料器皿方便，即開即做，無需清洗。

多孔培養板：為塑料制品。可供細胞克隆及細胞毒性等各種檢測實驗使用。其優點是節約樣本及試劑，可同時測試大量樣本，易于進行無菌操作。培養板分為各種規格，常用的規格有：96孔、24孔、12孔、6孔、4孔等。

Oa貯液瓶：主要用于存放或配制各種培養用液體如培養液、血清及試劑等。貯液瓶分為各種不同規格，如1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、5ml等。

Ob吸管：主要分為刻度吸管、無刻度吸管?？潭任苤饕糜谖?、轉移液體，常用的有1ml、2ml、5ml、10ml等規格。無刻度吸管分為直頭吸管及彎頭吸管，除可以作吸取、轉移液體外，彎頭尖吸管還常用于吹打、混勻及傳代細胞。

手術刀或解剖刀、手術剪或解剖剪（彎剪及直剪），用于解剖動物、分離及切剪組織，制備原代培養的材料；眼科虹膜小剪（彎剪或直剪），用于將組織材料剪成小塊；血管鉗及組織鑷、眼科鑷（彎、直），用于持取無菌物品（如小蓋玻片）夾持組織等；口腔科探針或代用品，用以放置原代培養之組織小塊。社會價值： 細胞培養實驗室的社會價值在于，為實驗提供基礎，促進細胞培養的發展，細胞培養的好處如下：

1.直接觀察活細胞的形態結構和生命活動。用于細胞學、遺傳學、免疫學、實驗醫學和腫瘤學 等多種學科研究.2.直接觀察細胞的變化可便于攝影。3.研究細胞種類如低等到高等到人類、胚胎到成體、正常組織到腫瘤。4.便于使用各種技術：相差、熒光、電鏡、組化、同位素標記等方法觀察和研究細胞狀況。5.是分子生物學和基因工程學的研究對象，也是其主要的組成部分。6.易于施用物理、化學生物的實驗研究。7.易于提供大量生物性狀相似的實驗對象,耗資少比較經濟。8.成為生物制品單克隆抗體生產和基因工程等的材料來源。

第二篇：細胞生物學實驗總結

細胞自主實驗方法總結

自主實驗是在老師的指導和幫助下學生自己設計實驗且自己準備實驗所需的一切準備工作來完成的實驗。平時做實驗老師占重要地位但自主實驗中學生占重要地位。自主實驗中學生自己思考設計出實驗方案，實驗所需試劑，實驗方法和步驟然后按該方案來做實驗。

老師讓學生做自主實驗的原因是老師想培養學生的動手能力，合作能力，想讓學生獨立思考，想讓學生親自動手做實驗，最重要的一點是把理論知識結合實踐。

細胞培養是在體外模擬體內的生理環境，培養從機體中取出的細胞，并使之生存和生長的技術為細胞培養技術。

本實驗采用了微量全血培養技術，培養人體外周血小淋巴細胞,使原處于 G0期的淋巴細胞轉化為淋巴母細胞, 進而進行有絲分裂，增殖成功率高、技術方法完善。把體外增殖的小淋巴細胞裂解,對細胞核染色體進行染色和 固定,制得人染色體標本,用于進行染色體組型分析，取得了令人滿意的效果。

人和動物細胞培養是動物細胞工程的一項基本技術。目前,動物細胞培養主要用于通過大量的細胞培養獲得有經濟價值的生物產品和細胞本身。1966 年以前基本上用 Mo o r he a d 等，1960年建立的人外周血白細胞培養技術,該方法比較完善,成功率高。但缺點是取血量多,手續較麻煩。近30 多年來國內外絕大多數均采用微量全血培養技術,不但取血量少,而且可略去一些繁瑣操作過程,如離心、分離血漿等,做起來既方便,也節省人力和物力, 比較適于推廣和使用。

本實驗對實驗操作要求比較高。實驗進行前，無菌室及無菌操作臺以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%酒精擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10分鐘后，才開始實驗操作。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70%酒精擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。操作做成中也要保證不污染。

第三篇：細胞生物學實驗思考題

細胞生物學實驗思考題

1、為什么暗視場照明的視場暗黑，而樣品像明亮？相差顯微鏡鏡檢時，為什么要用綠色濾色鏡觀察活體樣本？

暗視場顯微鏡照明光線不直接進入物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的；

為獲得好的效果，要用波長范圍窄的單色光，選用綠色濾光鏡，不但可滿足這個要求，而且綠色可吸收紅外光，減少發熱。

2、為什么活細胞不易染色，從細胞生物學角度解釋原因。

染色劑一般有劇毒，而細胞膜具有選擇透過性，會將一部分對細胞有害的物質阻擋在細胞外，所以活細胞難以染色。而當細胞死亡后，細胞膜失去選擇透過性，染色劑得以進入，細胞就被染色。

3、簡述中性紅染液、詹納斯綠B染液用于細胞超活染色的原理。

Janus green B活體細胞染色的機理：Janus green B是毒性較小的堿性染料，可專一性地對線粒體進行超活染色，這是由于線粒體內的細胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態（即有色狀態），呈藍綠色；而線粒體周圍的細胞質中，這些染料被還原為無色的色基（即無色狀態）。

Neutral red 堿性染料活體染色的機理：neutral red為弱堿性染料，對液泡系（即高爾基體）的染色有專一性，只將活細胞中的液泡系染成紅色，細胞核與細胞質完全不著色，這可能與液泡中某些蛋白質有關。

4、什么是細胞骨架？它有何主要功能？

生物學中細胞骨架指真核細胞中與保持細胞形態結構和細胞運動有關的纖維網絡。包括微管、微絲和中間絲。

細胞骨架不僅在維持細胞形態，承受外力、保持細胞內部結構的有序性方面起重要作用，而且還參與許多重要的生命活動，如：在細胞分裂中細胞骨架牽引染色體分離，在細胞物質運輸中，各類小泡和細胞器可沿著細胞骨架定向轉運；在肌肉細胞中，細胞骨架和它的結合蛋白組成動力系統；在白細胞(白血球)的遷移、精子的游動、神經細胞軸突和樹突的伸展等方面都與細胞骨架有關。另外，在植物細胞中細胞骨架指導細胞壁的合成。

5、列舉你所知道的動、植物細胞中由微絲組成的結構。

肌原纖維、微絨毛、應力纖維

6、顯示細胞骨架的原理是什么？說明實驗中使用的TritonX-100、戊二醛、考馬斯亮藍R-250的作用。

原理：用考馬斯亮藍對細胞骨架進行染色，染色觀察前，應首先用去垢劑抽提掉胞質中的除骨架以外的其他蛋白。

TritonX-100：非離子型去垢劑，可使細胞質膜中和細胞質中的蛋白質和全部脂質被溶解抽提。

戊二醛：固定細胞

考馬斯亮藍R-250：蛋白質染料，對細胞骨架染色。

7、顯示脂類時，制片及染色有何特殊之處？

制片時需要用10%甲醛鈣固定液進行固定，要求用蘇丹Ⅲ飽和溶液染色，但是對不同部位的脂類進行處理時有區別。

8、簡述Fenulgen反應的原理和實驗的關鍵步驟。

原理：DNA經弱酸水解后，嘌呤堿與脫氧核糖間的糖苷鍵打開，并且使脫氧核糖與磷酸間的磷脂鍵打開，在脫氧核糖的一端形成游離的醛基，醛基在原位與Schiff試劑結合，形成紫紅色復合物，使細胞內含有DNA的部位呈紫紅色的陰性反應。關鍵步驟：①Schiff試劑遮光染色30min，一定要遮光；

②壓片時，一定要壓均勻，否則細胞會重疊，影響觀察； ③洗玻片上的試劑，要注意樣品不被洗掉。

9、試述差速離心法分離細胞器的原理。

在一定的離心場中（選用離心機的一定轉速），球心顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質的黏度。在一均勻的懸浮介質中離心一定時間，組織勻漿中的各種細胞器及其它內含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。

10、試述密度梯度離心法分離細胞器的原理。

用一定的介質在離心管內形成一連續或不連續的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。

11、為什么要事先向小鼠腹腔注射淀粉肉湯懸浮液？吞噬細胞的變形運動及吞噬作用的生物學機理是什么？

①誘導小鼠腹腔大量產生巨噬細胞，使其聚集； ②細胞膜具有一定的流動性。

第四篇：《細胞生物學實驗》教學大綱

《細胞生物學實驗》教學大綱

課程名稱：細胞生物學實驗

課程編號：12030037

課程類別：專業基礎課/必修課

學時/學分： 24/0.75

開設學期：第四學期

說明

一、課程性質

細胞生物學實驗是生物科學和生物工程專業一門重要的必修基礎課程，在生命學科的本科教學中有著十分重要的地位。通過實驗，不僅使學生加深對細胞生物學理論知識的理解和認證，同時通過對細胞生命現象的觀察和親手操作，使學生獲得有關細胞生命活動的感性知識，有效地提高理論課的教學效果，并使學生掌握細胞生物學實驗的基本原理、方法和技能，培養和提高學生實驗設計和應用各種實驗技術的能力，培養和訓練學生的創新意識和創新能力，培養嚴謹的科學態度和實事求是的作風，提高發現問題、分析問題和解決問題的能力，為今后獨立從事教學或科學研究打下堅實的基礎。

二、教學目標

通過細胞生物學實驗，使學生們更加牢固地掌握細胞生物學基本知識和基本理論，對細胞的結構和功能有全面、真實的認識，使學生們掌握細胞生物學的基本實驗方法和技能。

三、學時分配表 序號

實驗項目實驗 時數 實驗

類型

內容與要求 小計實驗1細胞膜的滲透性及細胞凝集反應4設計性了解細胞膜的滲透性及各類物質進入細胞的速度，掌握細胞凝集反應的實驗方法及細胞凝集的原理實驗2葉綠體的分離與熒光觀察3驗證性掌握熒光顯微鏡的原理和使用方法；觀察葉綠體的自發熒光與次生熒光；

通過對植物葉綠體的分離，了解細胞器分離的一般原理和方法實驗3植物細胞骨架的觀察4驗證性掌握光學顯微鏡觀察植物細胞骨架的原理和方法實驗4雞血細胞的體外融合6綜合性了解PEG誘導細胞融合的基本原理，通過PEG誘導雞紅細胞之間的融合實驗，初步掌握細胞融合技術實驗5巨噬細胞吞噬現象的觀察7綜合性通過對小白鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞血紅細胞的活動觀察，加深理解細胞吞噬作用的過程和意義；掌握小白鼠腹腔注射給藥方法和頸椎脫臼處死法合計24

四、實驗方法與要求建議

本課程采用傳統的實驗教學方法，2人一組操作，結合多媒體、小組討論與集體討論、實驗設計、教學錄像、細胞生物學小知識和小技巧介紹等多種教學手段，幫助學生通過本課程的學習全面地掌握細胞生物學的基本實驗方法與技能以及實驗設計的思路，以提高學生從事教學和科學研究的綜合素質。

要求學生認真預習，熟悉實驗的內容，了解所用的儀器用具；實驗中嚴格按操作規程進行，仔細觀察，及時記錄實驗現象及結果，認真做好每一天的實驗報告；實驗結束后仔細分析和總結實驗結果；使用貴重精密儀器時，應嚴格遵守操作規程，對任何自己不熟悉的實驗儀器都不要隨意操作；在操作過程中發現任何意外現象都要及時向任課教師報告；在實驗過程中制造的任何垃圾都要丟到垃圾筐里（或先放在自己的桌面廢物缸內），嚴禁隨地投棄。

五、考核方式及要求

1.考核方式：考試（√）；考查（）

2.成績評定：

計分制：百分制（√）；五級分制（）；兩級分制（）

成績構成：實驗成績（100分）=實驗預習（10％）+實驗態度、衛生、安全（10％）+實驗操作（25％）+實驗報告（25％）+實驗考試（30％）。

本文

實驗一 ?細胞膜的滲透性及細胞凝集反應

一、實驗性質

實驗類別：專業基礎課/必修

實驗類型：設計性

計劃學時：4學時

實驗分組：2人/組

二、實驗目的

1.了解細胞膜的滲透性及各類物質進入細胞的速度，分析影響細胞膜滲透性的因素；

2.理解凝集素使細胞發生凝集反應的原理，觀察細胞的凝集現象。

三、實驗的基本內容和要求

1.制備羊血細胞懸液，加1份羊血和10份0.17mol/LNaCl溶液。

2.制備土豆凝集素的。

3.取10支試管分別加入1mL稀釋羊血和10mL不同濃度的試劑，觀察是否溶血，如不溶血，觀察溶液的顏色有無深淺的變化。

4.用滴管吸取土豆凝集素和2%紅細胞懸液各一滴，置載玻片上，充分混勻，靜置20min后于低倍鏡下觀察血球凝集現象。以PBS液加2%紅細胞懸液作對照實驗。

四、實驗儀器設備及材料

10ml移液管、1ml移液管、試管架、試管、燒杯、顯微鏡、粗天平、載玻片、蓋玻片、土豆塊莖、0.17mol/L氯化鈉、0.17mol/L硝酸鈉、0.12mol/L硫酸鈉、0.17mol/L氯化銨、0.17mol/L醋酸銨、0.12mol/L草酸銨、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮、新鮮羊血（加抗凝劑）、PBS緩沖液

五、實驗操作要點

1.血細胞懸液的制備

2.低滲溶液

3.血紅細胞的滲透性實驗

4.土豆凝集素的制備

5.凝集反應

六、實驗教學建議

先讓學生通過查資料和實驗指導書提前預習該實驗，實驗課上讓1-2位學生來講實驗原理，操作步驟，其他同學做補充，老師做點評和總結，指出實驗中注意事項等。學生自己以小組為單位配置所有藥品并進行實驗。

實驗二 葉綠體的分離與熒光觀察

一、實驗性質

實驗類別：專業基礎課/必修

實驗類型：驗證性

計劃學時：3學時

實驗分組：2人/組

二、實驗目的

1.通過植物細胞葉綠體的分離，了解細胞器分離的一般原理和方法；

2.觀察葉綠體的自發熒光和次生熒光，并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。

三、實驗的基本內容和要求

葉綠體的分離與觀察、菠菜葉片徒手切片觀察。

四、實驗儀器設備及材料

研缽、粗天平、紗布、量筒、離心管、滴管、普通離心機、熒光顯微鏡、普通光學顯微鏡、0.35mol/L的NaCl、0.01%丫啶橙、新鮮菠菜

五、實驗操作要點

1.葉綠體的分離與觀察

2.菠菜手切片觀察

六、實驗教學建議

先讓學生通過查資料和實驗指導書提前預習該實驗，實驗課上讓學生來講實驗原理和操作步驟，其他同學做補充，老師做點評和總結，指出實驗中注意事項之后學生再進行實驗等。

實驗三 植物細胞骨架的觀察

一、實驗性質

實驗類別：專業基礎課/必修

實驗類型：驗證性

計劃學時：4學時

實驗分組：1人/組

二、實驗目的

了解細胞骨架的結構特征及制備技術。

三、實驗內容

制備植物細胞骨架、用光學顯微鏡觀察細胞骨架的原理和方法。

四、實驗儀器設備與試劑

1.材料：洋蔥鱗莖

2.試劑

(1).磷酸鹽緩沖液

(2)M緩沖液

(3)1% TritonX-100：用M緩沖液配置。

(4).2%考馬斯亮藍R-250： 46.5ml甲醇、7 ml 冰醋酸、46.5ml蒸餾水。

(5).3%戊二醛：用6mmol/L磷酸鹽緩沖液配置。

(6).0.2M磷酸鹽緩沖液。

3.器材和儀器：小燒杯 鑷子 滴管 載玻片 蓋玻片 顯微鏡

五、實驗操作要點

1.取材：撕取洋蔥鱗莖內表皮細胞（約1cm2大?。┲糜谘b有6mmol/L磷酸鹽緩沖液的燒杯中，使其下沉；

2.抽提：吸去磷酸鹽緩沖液，用1% TritonX-100處理20~30min.；

3.沖洗：吸去TritonX-100，用M緩沖液洗3次，每次10min；

4.固定：3%戊二醛固定30min；

5.沖洗：6mmol/L磷酸鹽緩沖液洗3次，每次10min；

6.染色：0.2%考馬斯亮藍R-250染色20min；

7.制片：用蒸餾水洗1-2次，將標本置于載玻片上，加蓋片；

8.觀察：光鏡下可見表皮細胞的輪廓，細胞內存在著染成藍色、粗細不等的纖維網絡結構，即為構成細胞骨架的微絲束。

六、實驗教學建議

先讓學生通過查資料和指導書提前預習該實驗，實驗課上讓學生來講實驗原理，其他同學做補充，老師做點評和總結，指出實驗中注意事項，學生進行實驗。

實驗四 雞血細胞的體外融合一、實驗性質

實驗類別：專業基礎課/必修

實驗類型：綜合性

計劃學時：6學時

實驗分組：2人/組

二、實驗目的

掌握細胞融合原理，應用PEG融合細胞的方法以及細胞融合率的計算。

三、實驗內容

動物細胞的制備、融合和觀察。

四、實驗儀器設備與試劑

1.材料：家雞

2.試劑：

(1).50%PEG（MW4000）

(2).Hanks液

(3).0.85%生理鹽水

(4).肝素

3.器材和儀器

注射器、試管、離心管、移液管、酒精燈、載玻片、蓋玻片、水浴鍋、普通光學顯微鏡、離心機

五、實驗操作要點

1.雞血細胞的獲得

2.促融劑的配制

3.雞紅細胞的收集

4.細胞融合反應

5.終止反應

6.鏡檢

六、實驗教學建議

先讓學生通過查資料和指導書提前預習該實驗，實驗課上讓學生來講實驗原理，其他同學做補充，老師做點評和總結，指出實驗中注意事項，學生進行實驗。

實驗五 巨噬細胞吞噬現象的觀察

一、實驗性質

實驗類別：專業基礎課/必修

實驗類型：綜合性

計劃學時：7學時

實驗分組：2人/組

二、實驗目的

1.通過對小白鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞活動的觀察，加深理解細胞吞噬作用的過程及其意義；

2.掌握小鼠腹腔注射給藥和脊椎脫臼處死方法。

三、實驗內容與要求

對小白鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞活動的觀察、理解細胞吞噬作用的過程；掌握小鼠腹腔注射給藥和脊椎脫臼處死方法。

四、實驗儀器設備與試劑

（一）器材

顯微鏡、解剖盤、剪刀、鑷子、載玻片、蓋玻片、注射器、吸管、吸水紙

（二）試劑

1.0.85%生理鹽水

2.Alsever溶液

3.4％臺盼藍染液

4.6％淀粉肉湯(含臺盼藍染液)

（三）材料

1.小白鼠

2.1% 雞紅細胞懸液

自健康雞翼靜脈采血或從集市殺雞處接血lml(防止污染)，放入盛有4ml AlseVer溶液瓶中，混勻置4℃冰箱保存備用(一周內使用)。使用前加入0.85％生理鹽水離心(1 500r／min 10min)洗滌二次，再用生理鹽水配成l％濃度懸液。

五、實驗操作要點

1.在實驗前—天，給小白鼠腹腔注射6％淀粉肉湯(含臺盼藍)1m1。注射時，先用右手抓住鼠尾提起，放在實驗臺上，用左手的拇指和食指抓住小鼠兩耳和頭頸皮膚，將鼠體置于左手心中，把后肢拉直，用左手的無名指和小指按住尾巴與后肢，前肢可用中指固定，即可在腹部后l／2處的一側注射。進針勿過深，否則易損害肝及血管等，造成出血致死；

2.?實驗時，每組取一只注射過淀粉肉湯的小白鼠，腹腔注射l％雞紅細胞懸液lml，輕按小白鼠腹部，使懸液分散；

3.?20min后，用脊脫臼法處死小鼠(右手抓住鼠尾，用力向后拉，左手拇指與食指同時向下按住鼠頭，使脊髓與腦髓間斷開致鼠死亡)；?

4.將小鼠置于解剖盤中，剪開腹部，把內臟推向一側，用不裝針頭的注射器或吸管吸取腹腔液；

5.?每人取一張干凈載玻片，滴一滴腹腔液，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。

六、實驗教學建議

先讓學生通過查資料和指導書提前預習該實驗，實驗課上讓學生來講實驗設計思路，其他同學做補充，老師做點評和總結，指出實驗中注意事項、學生進行實驗。

參考教材

[1]細胞生物學實驗（第二版).楊漢民主編，高等教育出版社 [2]細胞生物學實驗指導.李素文主編，高等教育出版社

[3]細胞生物學實驗教程.安利國主編，科學出版社

第五篇：提交 細胞生物學實驗教案匯總

細胞生物學實驗

Cell Biology Experiment

目 錄

1.顯微鏡的結構及細胞形態觀察、大小測量和死活細胞鑒定 2.液泡系和線粒體的活體染色 3.葉綠體的分離與觀察

4.DNA的細胞化學——Feulgen反應 5.多糖的顯示——PAS反應

6.細胞內堿性蛋白和總體蛋白的原位顯示 7.細胞骨架的光學顯微觀察和永久制片技術 8.植物原生質體的制備與融合 9.蠶豆根尖微核試驗 10.膜的通透性

11.血細胞的分化和不同類型血細胞的觀察

實驗報告要求

1．注意頁面四邊留白，不要擠到頁邊！2．抬頭填寫完整。

3．注意事項自己總結，不要抄襲！4．組長檢查后上交存檔。

生物繪圖注意事項

1．2H 以上繪圖鉛筆削尖、繪圖橡皮、直尺

2．邊看顯微鏡邊按視野中實際情況繪圖，以精確為主，不能藝術加工。

3．應找到最典型、最能說明繪圖目的的物像來繪圖。先輕勾出輪廓，檢查無誤后，再以準確清晰的線作最后描繪。

①實線表示輪廓，虛線表示被遮蔽但需表現的輪廓，線粗細應均勻有規律

②圓點的疏密表示明暗、凹凸（越暗的地方點越多）點點時筆尖直立，點大小、疏密要均勻、整齊、渾圓，不能像“，”。

4．用尺向右側引出水平指示線，線右端平齊字注在右側。圖下方寫上所畫圖的名稱及放大倍數。圖的右側和下方需寫文字說明，所以圖應繪在繪圖紙上偏左上方的位置。

5．一幅圖只要詳細畫出部分結構，其余勾畫出輪廓即可。

規范

不規范

實驗一 普通顯微鏡的使用及細胞形態觀察、大小測量和死活細胞鑒定

一、實驗目的

1．熟悉普通光學顯微鏡的基本構造和性能，掌握使用方法。2．了解細胞的一般形態和基本結構。

3．掌握顯微測微尺的使用，對細胞大小有一直觀認識。4．了解鑒定死活細胞的方法。

二、實驗原理

1．顯微測微尺的使用

鏡臺測微尺：表示絕對長度，長1 mm，分成100小格，每小格為0.01mm。不被用來直接測量，而是用它來校正目鏡測微尺，故其質量對所測微體影響極大。

目鏡測微尺：是一塊比目鏡筒內徑稍小的有標尺的圓形玻璃片，標尺長10毫米、分為100格。需要鏡臺測微尺校正為絕對長度再測定細胞大小。

2．死活細胞鑒定:臺盼藍是一種低毒的活體染色劑，只能透過質膜受損的細胞或死細胞。

三、實驗用品 1．試驗材料：

洋蔥內表皮細胞

口腔上皮細胞、（人的口腔上皮細胞是扁平、多邊形的，形狀不很規）

2．試劑

0.2%臺盼藍溶液 3．儀器

測微尺（2套）、普通光學顯微鏡、刀片、鑷子、玻璃滴管、吸水紙、牙簽。

四、試驗方法

一、細胞死活的鑒定

0.2%臺盼藍染色5-10分鐘后進行觀察。

二、細胞大小測量

1）測量時，鏡臺微臺尺換成樣本，2)目鏡測微尺來測量細胞的大小

3)改變顯微鏡的放大倍率，則需對目鏡測微尺重新進行標定。

三、細胞形態的觀察

五、注意事項

取口腔黏膜上皮細胞注意的問題

1．口腔上皮細胞主要分布在口腔兩側頰部。用消毒牙簽的鈍端，在漱凈的口腔任意一側的頰部，輕輕刮幾下。

2．取材前，口腔一定要用清水漱凈，去除口腔內的食物殘渣。

3．用方簽在口腔壁上輕輕刮動，不要刮在牙縫里，因為牙齒上刮下來的是食物碎屑，不是口腔上皮細胞。

六、作業

1．繪制口腔黏膜上皮細胞及洋蔥內表皮細胞圖（2-3個細胞）

2．列表寫出洋蔥內表皮細胞長軸、短軸長度，并計算平均值。（取3個細胞）3．取口腔黏膜上皮細胞注意的問題 4．生物繪圖注意事項

實驗二 線粒體和液泡系的超活染色與觀察

一、實驗目的

1、了解細胞和細胞器的超活染色技術。

2、觀察動、植物活細胞內線粒體、液泡的形態、數量和分布,了解植物細胞液泡系的發育過程。

二、實驗原理

活體染色是指對生活有機體的細胞或組織能著色但又無毒害的一種染色方法。它的目的是顯示活細胞內的某些結構，而不影響細胞的生命活動和產生任何物理、化學變化以致引起細胞的死亡?；钊炯夹g可用來研究生活狀態下的細胞形態結構和生理、病理狀態。

根據所用染色劑的性質和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內活染與體外活染兩類。體內活染是以膠體狀的染料溶液注入動、植物體內，染料的膠粒固定、堆積在細胞內某些特殊結構里，達到易于識別的目的。

體外活染又稱超活染色，它是由活的動、植物分離出部分細胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細胞的某種結構上而顯色。

活體染色之所以能固定、堆積在細胞內某些特殊的部分，主要是染料的電化學特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣，它們彼此就發生了吸引作用。但不是任何染料都可以作為活體染色劑之用，應選擇那些對細胞無毒性或毒性極小的染料，而且總要配成稀淡的溶液來使用。一般是以堿性染料最為適用，可能因為它具有溶解在類脂質的特性，易于被細胞吸收，Janus green B和中性紅兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對于線粒體和液泡系的染色各有專一性。

線粒體是細胞內重要的細胞器，線粒體內膜上分布有細胞色素氧化酶，該酶能使詹姆斯綠B保持在氧化狀態，呈現藍綠色從而使線粒體顯色，而細胞質中的染料被還原成無色。液泡 5

是細胞內濃縮產物的主要場所，有十分重要的功能。中性紅是液泡的特殊染色劑，將液泡染成紅色。在活細胞中，細胞質和細胞核不著色。如果細胞死亡，染料會彌散開來，使核著色。

三、實驗用品

（一）器材

顯微鏡、恒溫水浴鍋、鑷子、刀片、載玻片、蓋玻片、吸管、牙簽、吸水紙等。

（二）試劑

1、Ringer 溶液 生理鹽水、緩沖液

氯化鈉0.85g（變溫動物用0.65g）；氯化鉀 0.25g ；

氯化鈣 0.03g ；蒸餾水100ml 2、10%、1/3000中性紅溶液

稱取0.5中性紅溶于50ml Ringer溶液，稍加熱（30-40度）使之很快溶解，用濾紙過濾，裝入棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，失去染色能力。

臨用前，取已配制的1%中性紅溶液1ml，加入29mlRinger溶液混勻，裝入棕色瓶備用。3．1%、1/5000詹姆斯綠B溶液

稱取50mg詹姆斯綠B溶于5ml Ringer溶液中，稍加 微熱（30-40度）使之溶解，用濾紙過濾后，即為1%原液。取1%原液1ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液，裝入瓶中備用。最好現用現配，以保持它的充分氧化能力。

（三）材料

人口腔上皮細胞、洋蔥鱗莖內表皮細胞、小麥幼根根尖。

四、實驗方法

(一)線粒體的超活染色與觀察

1、人口腔粘膜上皮細胞線粒體的超活染色觀察

載玻片→ 37℃水浴鍋的金屬板→滴兩滴詹納斯綠B染液

牙簽→從口腔粘膜刮取上皮細胞→放入載玻片染液→染色10-15分鐘（注意不可使染液干燥, 必要時可再加滴染液）→蓋上蓋玻片用吸水紙吸去四周溢出的染液→觀察 2.洋蔥鱗莖表皮細胞線粒體的超活染色

載玻片→撕取一小片洋蔥鱗莖內表皮滴→一滴詹納斯綠B染液→染色10-15分鐘 吸去染液→加一滴Ringer液，注意使洋蔥內表皮展平→蓋上蓋玻片→觀察

（二）液泡系的超活染色與觀察

刀片→小麥幼苗根尖→切一縱切面→中性紅染色5-10分鐘

吸去染液→加一滴Ringer液→蓋上蓋玻片→鑷子輕輕下壓蓋玻片→觀察 五．實驗結果

在小麥根尖細胞制片中，可見細胞質中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長點向延長區觀察，在一些已分化長大的細胞內，液泡的染色較淺，體積增大，數目變少。在成熟區細胞中，一般只有一個淡紅色的巨大液泡，占據細胞的絕大部分空間，將細胞核擠到細胞一側貼近細胞壁處。六．注意事項

1、詹姆斯綠B溶液現用現配，以保持它的充 分氧化能力。

2、實驗中速度要快，以免組織細胞死亡。

七、作業 ．畫出你所觀察到的線粒體和液泡的圖像.2 ．總結實驗成功或失敗的原因.實驗三 葉綠體的分離與觀察

一、實驗目的

通過植物細胞葉綠體的分離，了解細胞器分離的一般原理和方法。

二、實驗原理

細胞器分離的過程包括兩個主要階段：破碎細胞和細胞組分的分離。葉綠體的分離采用在等滲溶液中進行組織勻漿、分離。葉綠體的分離采用差速離心或密度梯度離心法進行。差速離心主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細胞器。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類推，達到分離不同大小顆粒的目的。差速離心的分辨率不高，沉降系數在同一個數量級內的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。

三、實驗用品

1.材料： 菠菜葉片

2.試劑：蒸餾水，0.35mol/L氯化鈉溶液

3.儀器：普通離心機、天平、顯微鏡、鑷子、載玻片、蓋玻片、離心管、吸水紙等

四、實驗方法

1.菠菜葉片(去葉脈)3g → 0.35mol/L氯化鈉15ml→研磨(冰浴)→勻漿過濾(6層紗布)→濾液在1000rpm離心2min→棄沉淀，上清液3000rpm離心5min →去上清液→沉淀為葉綠體(混有部分細胞核)，用0.35mol/L氯化鈉溶液懸浮 →滴片觀察

2.取葉綠體懸液1滴置于載玻片上，加蓋玻片后用用普通光學顯微鏡觀察葉綠體的形態結構 3.菠菜葉手切片觀察

新鮮菠菜葉，刀片切出一斜面置于載玻片上，滴加1-2滴NaCl溶液，蓋上蓋片，顯微鏡下觀察。用鑷子攝取或刀片刮取新鮮菠菜葉片葉肉，滴加1-2滴NaCl溶液，作臨時裝片。

五、實驗結果

1.普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖型，高倍鏡下可看到葉綠體內部含有較深的綠色顆粒，即基粒。

2.菠菜葉手切片在普通光鏡下可以看到三種細胞：表皮細胞、保衛細胞、葉肉細胞。葉肉細胞呈長方形或類方形，內含大量帶有綠色的葉綠體顆粒。另外，視野下還可見到大量散在的點狀或類圓狀葉綠體顆粒。

3.紅辣椒細胞中有許多紅色小顆粒，這就是雜色體。雜色體分散在細胞質中。

六、注意事項

1.葉綠體的分離應在等滲溶液(0.35mol/L氯化鈉)中進行,以免滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。

2.分離過程最好在0-5℃的條件下進行；如果在室溫下，要迅速分離和觀察。3.離心機使用：離心管要平衡

七、作業

1.根據顯微觀察結果，繪制菠菜葉的結構模式圖。

實驗四 細胞骨架的光學顯微觀察和永久制片技術

一、實驗目的

掌握植物細胞內細胞骨架的光學觀察方法，了解細胞骨架在細胞內的分布特點。

二、實驗原理

細胞骨架是指細胞質中縱橫交錯的纖維網絡結構，按組成成分和形態結構的不同可分為微管、微絲和中間纖維。它們對細胞形態的維持、細胞的生長、運動、分裂、分化和物質運輸等起重要作用。

光學顯微鏡下細胞骨架的形態學觀察多用1% Triton X-100處理細胞，可將細胞質膜中和細胞質中的蛋白質和全部脂質被溶解抽提，而細胞骨架系統的蛋白質被保存，再用考馬斯亮藍R250染色，使得胞質中細胞骨架得以清晰顯現。

Triton X-100：是非離子型表面活性劑（去污劑）。適當濃度的Triton X-100處理細胞時，可將細胞質膜中和細胞質中的蛋白質和全部脂質被溶解抽提，但細胞骨架系統的蛋白質不受破壞而被保存。這樣，使細胞骨架圖像更清晰。

考馬斯亮藍R250是一種普通的蛋白質染料，它可以使各種細胞骨架蛋白質著色，并非特異地顯示微絲，但是由于有些細胞骨架纖維在該實驗條件下不夠穩定，例如微管；還有些類型的纖維太細，在光學顯微鏡下無法分辨，因此我們看到的主要是微絲組成的應力纖維（微絲束），直徑約40nm左右。

戊二醛能固定，較好的保存細胞骨架成分。

M－緩沖液： 穩定F-肌動蛋白使得細胞骨架纖維保持聚合狀態并且較為舒張，便于觀察。磷酸緩沖液（PBS）：含有生理鹽水，可使細胞不被破壞，能保持原有狀態下的結構。

三、實驗用品 1.實驗材料

新鮮洋蔥鱗莖的內表皮。2.實驗器材

普通光學顯微鏡、10mL小燒杯、鑷子、刀片、載玻片、蓋玻片、載玻片、蓋玻片、、擦鏡紙、PH 計、水浴鍋。3.試劑：

M－緩沖液、磷酸緩沖液（PBS）、3%戊二醛、1%Triton-100、0.2%考馬斯亮藍R250

四、試驗方法

21.用鑷子撕取洋蔥鱗葉內側的表皮若干片（約0.5cm大小若干片），置于1.5ml離心管中，加入PBS（1.5mL左右），使其下沉（10min左右）。2.吸去緩沖液，用1%Trion X-100處理15-20min。3.吸去Trion X-100，用M緩沖液洗3次，每次5min。4.用3%戊二醛固定30min。

5.PBS（1.5ml左右）洗3次，每次3min，濾紙吸去殘液。6.0.2%考馬斯亮藍R250染色至少30min。

7.蒸餾水洗滌2次，然后將樣品置于載玻片上，加蓋玻片，在普通光學顯微鏡下觀察。8.選取觀察效果好的制作永久切片于脫水劑中每級5-10min，第一滴阿拉伯樹膠封片。

五、實驗結果

觀察：鏡下可見洋蔥表皮細胞輪廓，微絲束呈深藍色。轉換高倍鏡觀察，轉動微調，可見細胞骨架的立體結構。

六、注意事項：

1.撕取洋蔥鱗莖內表皮不可帶莖肉，樣本要展開鋪平。

2.去垢時間不要超過30min。

3.染色時間需掌握好，必要時可分別設不同染色時間比較。

4.由微絲組成的應力纖維（張力纖維）是一種動態結構，細胞充分貼壁鋪展時纖維挺直、豐富；反之，細胞收縮變圓，應力纖維彎曲，甚至部分解聚消失而顯稀少。

七、作業

繪出植物細胞骨架微絲的分布圖。（2-3個細胞）補充：

① 6mmol/L PBS(pH6.8)A液：NaH2PO4·2H2O 936mg/1000ml B液：Na2HPO4·12H2O 2148mg/1000ml

工作液：A液53.7ml + B液46.3ml（用NaHCO3調pH值至6.8）② M緩沖液（pH值7.2）咪唑 50mmol/L KCl 50mmol/L MgCl2 0.5mmol/L EGTA 1 mmol/L EDTA 0.1 mmol/L 巰基乙醇1 mmol/L 甘油4 mmol/L 加蒸餾水至1000ml，用1mol/L HCL調pH值為7.2。

③ 1%TritonX-100: TritonX-100 1ml M緩沖液99ml ④ 0.2%考馬斯亮藍R250染液： 考馬斯亮藍R250 0.2g 甲醇 46.5ml 冰醋酸 7ml 蒸餾水 46.5ml 5.3%戊二醛

25%戊二醛12ml PBS（2液）88ml ⑤脫水劑 50%乙醇 70%乙醇 95%乙醇 100%乙醇 二甲苯

實驗五 DNA的顯示—— Feulgen反應

一、實驗目的

1、了解Feulgen染色反應原理；

2、掌握Feulgen染色的方法，觀察染色結果。

二、實驗原理

根據DNA經鹽酸水解后，打開了嘌呤堿基和脫氧核糖連接的鍵，在脫氧核糖的一端形成游離的醛基。這些醛基就在原位與Schiff試劑結合，形成紫紅色的化合物。所以凡有DNA的部位，就呈現為紫紅色。

Feulgen反應是特異性顯示DNA的最經典方法，即可進行DNA定位顯示，又可用顯微分光光度計進行定量分析。Feulgen反應對組織中DNA的檢測具有高度專一性。組織中除DNA外還有多糖、RNA和其他自由醛基可以被鹽酸酸解掉。

三、實驗用品

四、實驗方法

①取小麥根尖和洋蔥內表皮（綠豆大?。┙腩A熱至60℃的1N HCl中水解，時間10 min。10

②蒸餾水洗后，轉入Schiff液中避光染30 min，待根尖變為深紅色； ③在新配亞硫酸水中洗3次，每次 1 min；

④自來水洗 5 min，在載玻片上切下深紅色根尖備用； ⑤制片鏡下觀察，根尖鑷子搗碎壓片。

五、注意事項

六、作業

繪圖描述所觀察到的試驗結果。

實驗六 多糖的顯示——PAS反應

一、實驗目的

通過PAS反應，了解糖原顯示的基本原理、方法以及糖原在細胞中的分布。

二、實驗原理

PAS反應是顯示多糖的最經典、也是最直接的細胞化學方法。用具有強氧化作用的過碘酸處理使多糖中葡萄糖的乙二醇基氧化成兩個游離的醛基，醛基與Schiff試劑結合可形成紫紅色的化合物，顏色深淺與多糖含量成正比。單糖易被抽提掉，多糖包括糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂、淀粉和纖維素。

三、實驗用品

1.材料：馬鈴薯塊莖

2.試劑：0.5%高碘酸、schiff試劑、亞硫酸水、70％酒精 3.器材：顯微鏡、刀片、鑷子、載玻片、蓋玻片、水浴鍋

四、實驗方法

1、取馬鈴薯塊莖切成薄片，浸入過碘酸溶液10分鐘；

2、用70％的酒精沖洗1次；

3、將薄片放入Schiff試劑中20－25分鐘；

4、在新配亞硫酸水中洗3次，每次 1 min；

5、蒸餾水洗片刻；

6、將薄片放在載玻片上吸去水分，加上蓋玻片，鏡下觀察。

五、注意事項

按上述操作，細胞中水溶性糖類已喪失，被染色的是不溶性的碳水化合物。

六、作業

繪制實驗結果，并描述。

實驗六 細胞內堿性蛋白和總體蛋白的原位顯示

一、實驗目的

1.掌握細胞內酸、堿性蛋白的鑒別方法； 2.了解酸、堿性蛋白在細胞內的分布情況。

二、實驗原理

蛋白質是一種兩性電解質，在堿性環境中，蛋白質帶負電，在酸性環境中，蛋白質帶正電。所以，利用各種蛋白質在不同ph下，因等電點不同而產生的與固綠染液（一種弱酸性染料它對堿性物質的親和力強）結合能力的差異。對細胞中的蛋白質染色，可使細胞內的酸性蛋白（等電點偏向酸性）和堿性蛋白（等電點偏向堿性）分別顯示。總體蛋白pI4.7-6.75，組蛋白pI8.5。試驗用酸性染料pH2.2，堿性染料pH8.0 核酸的存在會影響實驗結果,用三氯醋酸處理可提出核酸。

三、實驗用品

1、試驗材料

洋蔥鱗莖內表皮或根尖

2、試劑

10%福爾馬林、5%三氯醋酸、0.1%酸性固綠染料（酸染）、0.1%堿性固綠染料（堿染）

3、器材

顯微鏡、水浴鍋、載玻片、蓋玻片、吸水紙

四、實驗方法

1.材料固定 洋蔥鱗莖內表皮若干片，10%福爾馬林固定液中固定15min，蒸餾水洗2次。2.抽提核酸 5％三氯醋酸中90℃，15min，蒸餾水洗數次（3min以上）以沖去痕跡的三氯醋酸。3.染色

①一張片滴加0.1％堿性固綠(pH8.0)中染色5～10min。

②另一張片滴加0.1％酸性固綠(pH2.2)中染色5～10min(視染色深淺而定)。

蒸餾水沖洗（3min），蓋上蓋片鏡檢。

五、實驗結果

用PH2.2酸性固綠染液染色結果，細胞中蛋白質均被染成綠色，此即總體蛋白在細胞內的分布?？傮w蛋白-堿性蛋白=酸性蛋白。

用pH8.0堿性固綠染液染色結果，只有細胞核內染色質被染綠色（或淺藍色），此即堿性蛋白在細胞內的分布。

六、注意事項

使用三氯醋酸處理的目的？

用5%TCA提取DNA是該實驗中的關鍵。DNA必須被提取，以使染色質的負電荷下降，用熱TCA提取核酸后，固綠在堿性pH下，堿性蛋白可以選擇性地被染色，如未被提取，不能染色，或整個切片染成藍綠色，水洗或進入酒精即褪色。

七、作業

1、繪制酸、堿性蛋白在細胞內的分布圖。

2、總結本次實驗的得失。

實驗八 植物原生質體的制備與融合

一、實驗目的

1.學習植物原生質體的分離制備技術，觀察原生質體形態。2.學習細胞融合技術，觀察融合細胞的形態及變化。

二、實驗原理

除去植物細胞壁的裸露細胞，稱為原生質體，是開展基礎研究的理想材料。植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，常用酶解法分離原生質體，其原理是使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細胞壁成分，除去細胞壁。

細胞融合又稱細胞雜交指離體條件下用人工的方法把不同的細胞通過無性方式融合成一個雜合細胞的技術。許多化學、物理學和生物學方法可誘導原主質體融合，現在被廣泛采用并證明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和電融合法。PEG作為一種高分子化合物，20～50％的濃度能對原生質體產生瞬間沖擊效應，原生質體很快發生收縮與粘連，隨后用高Ca高pH法進行清洗，使原生質體融合得以完成。

三、實驗用品

1.器具：顯微鏡、離心機、離心管、剪刀、鑷子、吸管、小培養皿、載片、蓋片、300目濾網。

2.試劑：酶混合液、洗滌液、20%蔗糖液、PEG溶液、高鈣高pH溶液

(1)酶混合液(9CPW):

(2)洗滌液（9CPW）1％纖維素酶

pH 5.6 0.5-0.7％果膠酶

27．2 mg／L KH2PO4 101.0 mg／L KNO3 1480．0 mg／L CaCl2·2H2O 246．0 mg／L MgSO4 0．16 mg／L KI 0．025 mg／L CuSO4 9％ W／V甘露醇

500mg／L MES pH 5.6(3)PEG融合液（pH 5.6）40% PEG(MW 1000-6000)0.3 mol/L葡萄糖 3.5mmol/L CaCl2·2H2O 0.7mm0l/L KH2PO4（4）高鈣高pH溶液（pH 10.5）0.1mol/L CaCl2·2H2O 0.1mol/L甘露醇 0.05mol/L Tris 3.材料：菠菜、韭菜葉片

四、實驗方法

1、分離原生質體

① 撕葉下表皮

② 酶解 將撕去下表皮的葉片剪成0.5mm寬小塊，放在盛有5mL酶液的小培養皿或帶蓋三 角瓶中，讓去除下表皮的一面接觸酶液，輔滿一層，在25-28℃下酶解60-90分鐘。可鏡檢有較 多原生質體后停止。

2、收集純化

①用300目網過濾除去未完全消化的殘渣。

②酶解液轉移至10mL離心管中，配平，以800rpm離心5分鐘以上，使原生質體沉降。移液管吸上清，剩下原生質體及殘渣于管底。

③加入3ml CPW洗滌液，輕輕吹打均勻，相同條件下離心2-5分鐘，棄上清，以徹底去除酶液。

④加入少量CPW洗滌液，輕輕吹打均勻，用注射器向離心管底部緩緩注入20%蔗糖約2—3mL，出現下部蔗糖液，上部原生質體懸浮液。

⑤以600rpm離心10分鐘，在兩液相之間出現一條綠色帶，便是純凈的原生質體，注射器針頭輕輕插入離心管底部吸取碎片和蔗糖溶液，再吸去上清。

3、制備效果檢測（1）血球計數板計數（2）原生質體活力測定

形態識別（完整、飽滿、顏色鮮艷）

中性紅染色（液泡變紅）

臺盼藍染色（不能顯色）

觀察10個視野計算：

存活率=（活性原生質體/原生質體總數）×100%

4、原生質體融合

（1）取原生質體液兩滴，間隔5mm滴于載玻片上，靜置8—10分鐘，使原生質體沉降。

（2）在兩液滴之間滴加一滴40％的PEG溶液，使三液滴相連（可轉動載玻片使其混勻）室溫下（15-20 ℃）靜置5-10分鐘，觀察原生質體聚集（粘連）現象。

（3）滴加高鈣高PH洗液，轉動載玻片使其混勻，觀察原生質體融合過程。

五、作業

1.按鏡下觀察繪制2-3個原生質體。2.計算原生質體濃度和存活率。

3.描述原生質體融合過程。

實驗九 蠶豆根尖微核檢測技術

一、實驗目的

1、了解細胞微核形成的機理及其形態特點，2、學習植物根尖細胞的微核檢測技術。

二、實驗原理

微核試驗(The micronucleus test，MNT)是以動植物為材料，采用細胞生物學手段，觀測其出現的微核率來表示材料受遺傳損傷程度的一種檢測遺傳毒物的方法。微核是指位于細胞質中獨立于主核、直徑小于主核，完全與主核分開的圓形或橢圓形的微小核。是真核生物細胞中的一種異常結構，它是由于細胞受到損傷后，由細胞分裂過程中喪失著絲粒的染色體斷片或落后染色體產生的。這些斷片或染色體在分裂過程中行動滯后，在分裂末期不能進入主核，便形成了主核之外的核塊。

蠶豆根尖細胞微核技術已發展的相當成熟，具有較高的靈敏性，作為檢測化學品遺傳毒性的方法，得到了廣泛應用。而且在測定監測淡水污染物和檢測化學誘變劑的研究已列入國家生物監測技術規范（水環境部分），并推廣應用于大氣、廢水、土壤等的致突變活性檢測。

三、實驗用品 1.材料：蠶豆 2.器材

顯微鏡、恒溫培養箱、紗布、鑷子、載玻片及蓋玻片等。3.藥品

鹽酸（5mol/L）、70%乙醇、卡諾固定液（用乙醇和冰醋酸以3:1（v/v)混合配制）、石炭酸品紅、硫酸銅、待測液。

四、實驗步驟

1、浸種催芽

將實驗用蠶豆按需要量放入盛水燒杯中，在25℃下浸泡24～48小時，此間至少換水兩次，所換水應25℃預溫。

種子吸脹后，用紗布松散包裹置瓷盤中，保持溫度，在25℃溫箱中催芽12～24小時。

待初生根長出2～3mm時，再取發芽良好的種子，放入鋪滿濾紙的瓷盤中，25℃繼續催芽，經約36-48小時，大部分初生根長至1～2cm左右，此時可用來進行實驗。

2、根尖染毒：

選取初生根生長良好，根長一致的6～8粒種子，放入盛有待測液的培養皿中，陽性檢測采用200mg/L硫酸銅,對照用蒸餾水處理，處理時間6-24h，處理液浸沒根尖。

3、恢復培養：處理后的根尖用自來水浸洗3次，每次2～3min，洗凈后在蒸餾水中恢復培養24h。

4、固定：切取1cm左右的根尖，用卡諾氏固定液固定24h后棄去固定液，固定后的根如不及時制，可換入70%的乙醇溶液中置4℃冰箱中保存備用。

5、酸解：用蒸餾水浸洗固定好的幼根2～3次，每次5分鐘，吸凈蒸餾水，加入5mol/L鹽酸將幼根浸沒，室溫下酸解10min，幼根軟化即可，棄去鹽酸，漂洗根尖2～3次，每次1～2分鐘，徹底洗凈鹽酸。

6、染色：截下1-2mm長的根尖，滴加適量的石炭酸品紅染液，染色10min，加蓋玻片，壓片觀 15

察。

五、注意事項

1、培養蠶豆時需勤換水

2、處理蠶豆時要將根部浸沒于處理液中

3、固定液要現配現用

六、實驗結果

污染指數PI值評價水質標準表

污染指數PI值 水質污染等級

基本無污染 0 ～ 1.5 輕污染 1.5 ～ 2.0 中污染 2.0 ～ 3.5 重污染 3.5以上

七、作業

繪圖、計算微核千分率和污染指標。

實驗十 細胞膜的滲透性

一、實驗目的

1.了解溶血現象及其發生機制。

2.了解細胞膜的滲透性及各種物質進入細胞的速度。

二、實驗原理

細胞膜是細胞與環境進行物質交換的選擇通透性屏障，是一種半透膜，可選擇性控制物質進出細胞。小的、親脂性的、非極性分子（如O2、CO2、N2、苯）容易溶解于脂雙層，可迅速透過脂雙層。小的、不帶電荷的極性分子（如水、脲、甘油等）如果足夠小時，也能很快透過脂雙層；大的、不帶電荷的極性分子（如葡萄糖，蔗糖等）以協助擴散或主動運輸進入細胞；對于帶電荷的分子或離子，由于這些分子的電荷及高的水化度，因此不管多小，都很難透過脂雙層的疏水區，它們要通過載體介導的主動運輸方式跨膜運輸。

將紅細胞放在低滲鹽溶液中，水分子大量滲到細胞內，可使細胞脹破，血紅蛋白釋放到介質中，由不透明的紅細胞懸液變為紅色透明的血紅蛋白溶液，這種現象稱為溶血。將紅細胞放在某些等滲鹽溶液中，由于紅細胞膜對各種溶質的通透性不同，有的溶質可進入，有的溶質不能進入，進入紅細胞的溶質能提高紅細胞的滲透壓，使水進入紅細胞，引起溶血。由于不同溶質透入速度不同，溶血時間也不同，因此，發生溶血現象所需時間長短可作為測量物質進入紅細胞速度的一種指標。本實驗選用紅細胞作為細胞膜透性的實驗材料，將其放入不同的介質溶液中，觀察紅細胞的變化。

三、實驗用品

1．材料: 雞血溶于含有抗凝劑的等滲液中（肝素鈉0.2mg/mL,一般范圍在 0.01-0.2mg/mL；等滲液為0.85% NaCl）2．器材：

試管，試管架，滴管，載玻片，蓋玻片，光學顯微鏡。3．試劑：

低滲溶液：0.0085% NaCl和0.032mol/L葡萄糖；

等滲溶液：0.85% NaCl、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇。10% TritonX-100、2%TritonX-100。

四、實驗步驟

1、制備血液稀釋液

①抗凝劑的制備：首先稱取1克肝素鈉粉末，然后加入0.17 M NaCl溶液ml（1∶10的比例），混合均勻，制成肝素抗凝劑。

②血液稀釋液的制備：雞翼下靜脈取新鮮血液，按比例（肝素抗凝劑:血液=1∶10）混合均勻，配制成經肝素抗凝的血液。

③按比例（經肝素抗凝的血液∶0.17 M NaCl 溶液=1∶10）混合均勻，形成一種不透明的紅色液體。

2、低滲溶液溶血現象觀察：

取試管一支加蒸餾水3ml和稀釋的雞血1滴或2滴輕混一下，然后靜止注意觀察溶液的顏色變化。結果：由于紅細胞發生破裂，造成100%紅細胞溶 血，使光線比較容易透過溶液，溶液顏色由渾濁的紅色逐漸變透明，此即為溶血現象。記錄下這個過程所要的時間。

3、雞紅細胞的滲透性記時比較

1）分別取2只試管，各加入3ml的0.85% NaCl、0.0085% NaCl和0.032mol/L葡萄糖 加入2-3滴血紅細胞懸液；

2）分別取3只試管，各加入3ml的 0.32 mol／L葡萄糖，0.32 mol／L甘油，0.32 mol／L乙醇，加入2-3滴血紅細胞懸液；

3）分別取2只試管，各加入3ml的10% TritonX-100、2%TritonX-100；加入2-3滴血紅細胞懸液，觀察反應現象。記下時間（自加入稀釋血液到溶液逐漸由紅色變為透明澄清，紅血球全部溶血所需時間），填入表一的空格中。

4、溶血結果的判斷

不溶血：液體分2層，上層淺黃色透明，下層紅色不透明，鏡檢紅細胞完好。不完全溶血：溶液混濁，上層變紅色，鏡檢有部分紅細胞破裂。完全溶血：液體變紅而且透明，鏡檢發現細胞全成碎片。

5、顯微觀察

血液紅細胞的觀察滴一滴稀釋的血液于載玻片上，蓋上蓋玻片。用光學顯微鏡觀察細胞的種類、形狀和顏色。

細胞破碎的觀察在上一步的載玻片的一端滴加清水，在另一端吸水，并在顯微鏡下觀察細胞的破裂。

五、實驗結果

將觀察到的現象記錄，并進行分析。

編號

試

劑

是否溶血

時間

分析原因 2 3 4 5 6

0.85% NaCl 0.0085% NaCl 0.32 M葡萄糖 0.32 M 甘油 0.32 M 乙醇 10% TritonX-100

六、注意事項

1.試管中有紅細胞和測試溶液時，不應強力搖晃，以免造成人為的紅細胞破裂。

2.取雞血動作要非常迅速，否則雞血會凝固。或者先把抗凝劑加入到燒杯中，再加入新鮮的雞血，邊加邊震蕩即可。

3.長時間在等滲溶液中，由于活細胞會產生代謝產物積累，也會產生溶血，試驗時間不宜超過1h。

4.裝不同試劑試管注意編號，吸管也要專用切勿混淆，以保證實驗結果的準確性。補充：

一、細胞膜的功能

分隔形成細胞和細胞器，為細胞的生命活動提供相對穩定的內環境，膜的面積大大增加，提高了發生在膜上的生物功能；

屏障作用，膜兩側的水溶性物質不能自由通過； 選擇性物質運輸，伴隨著能量的傳遞；

生物功能：激素作用、酶促反應、細胞識別、電子傳遞等；

物質轉運功能：細胞與周圍環境之間的物質交換，是通過細胞膜的轉運功能實現的，其主要轉運方式有四種，即單純擴散、易化擴散、主動轉運、入胞和出胞作用。

細胞膜的受體功能：受體是細胞識別和結合化學信息的特殊結構，其本質是蛋白質。

二、常用抗凝血劑包括：

1.非腸道用藥抗凝血劑：如肝素；

2.香豆素抗凝血劑類：常用的有雙香豆素、華法令和新抗凝等，通過拮抗維生素K使肝臟合成凝血酶原及因子Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ減少而抗凝；

3.抗血小板凝集藥物：如阿司匹林，對血小板環氧化酶有抑制作用；

4.蛇毒溶栓劑：如去纖酶、抗栓酶和清栓酶，可溶解已形成的血栓使血管再通，從而起到抗凝血作用。

肝素的作用機理

肝素在體內、體外均有強大抗凝作用。與其帶大量負電荷有關，可使多種凝血因子滅活。這一作用依賴于抗凝血酶III（antithrombin

III，AT

III）。At

III是凝血酶及因子Ⅻα、Ⅺα、Ⅸα、Ⅹα等含絲氨酸的蛋白酶的抑制劑。它與凝血酶通過精氨酸-絲氨酸肽鍵相結合，形成At

III凝血酶復合物而使酶滅活，肝素可加速這一反應達千倍以上。

實驗十一 血細胞的分化和不同類型血細胞的觀察

一、實驗目的

1、學習掌握人血涂片和染色的方法。

2、了解各種血細胞的形態特征。

二、實驗原理

瑞氏染色液主要染料由堿性美藍和酸性伊紅兩種成分組成, 它們與細胞內的嗜酸性和嗜堿性的各種物質既有物理的吸附作用，又有化學的親和作用, 各種細胞成分化學性質不同，對各種染料的親和力也不一樣，因此使細胞呈現出不同的色彩.伊紅和美藍只能溶解在有機溶劑中，而滴在水中很快形成沉淀，所以染色液必須配成甲醇等有機溶液，臨用時加到水或緩沖液中，才能在一定的環境下離解成有色的陰離子伊紅和陽離子美藍，而與細胞中的不同物質相親和被染色。如滴加到水中很快發生沉淀，容易形成沉渣。

甲醇兼溶劑和起固定細胞兩種作用。甲醇具有強大的脫水力，可將細胞固定在一定形態及增加細胞結構的表面積，提高細胞對染料吸收作用，同時由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升溫，加速染色反應。緩沖液作用：

染色對氫離子濃度是十分敏感的，據觀察pH值的改變，可使蛋白質與染料形成的化合物重新離解。緩沖液須保持一定的pH使染色穩定，PBS的pH 一般在6.8，偏堿性染料可與緩沖液中酸基起中和作用，偏酸性染料則與緩沖液中的堿基起中和作用，使pH恒定。緩沖液配制（pH6.4-6.8，弱酸性）。

A：紅細胞，B：嗜酸性粒細胞，C：單核細胞，D：中性粒細胞，E：嗜堿性粒細胞，F：淋巴細胞

三、實驗用品

顯微鏡、載玻片、采血針、75%酒精、消毒棉球、瑞氏染液、PBS、吸耳球。

四、實驗方法

1.消毒 先按摩取血部位，使血流通暢；再用酒精消毒取血部位（如無名指指尖、耳垂）。2.取血 待酒精干后，刺破皮膚，使血自然流出，或擠壓出血。取干凈載片，讓血滴在離載片一端中4～5毫米處，注意手指持握載片的邊緣，勿觸及其表面。不能使載片接觸取血部位的皮膚。必須兩人密切配合，抓緊時間，一人取血，另一人迅速推片。

3.推片 這步最重要，但又不易推均勻。以左手拿該片的兩端，迅速用右手取一塊邊緣光滑的載片做推片。將其一端置于血滴前方，向后移動到接觸血滴，使血液均勻分散在推片與載片的接觸處，成一直線。然后使推片與載片呈30°～40°角，輕輕移動，然后由前向后推為一均勻的薄片。涂片推好后，迅速在空氣中搖，使之自然干燥。

4.染色 將瑞氏染液(伊紅-亞甲基藍)滴在血膜上，至染液淹沒全部血膜，染半分鐘。加等量蒸餾水(或緩沖液)與染液，加好后，立即用嘴將兩液吹勻?；旌显偃?分鐘。最后用蒸餾水把染液沖掉，用吸水紙吸干，自然干燥后，即可觀察。5.觀察

五、注意事項

1.染色時間與染液濃度,室溫高低,細胞多少有關。染液越淡,室溫越低, 細胞越多,所需染色時間越長或應適當增加染液量,因此染色時間應視具體情況而定。特別是更換新染料時必須經試染,摸索最佳染色條件。

2.染液不可過少,以防蒸發干燥染料沉著于血片上難沖洗干凈。沖洗時應用流水將染液沖去,不能先倒掉染液,以免染料沉著于血片上。

3.判斷染液是否起到了染色的作用，可在沖洗染色液前觀察染液有無一層黃色的金屬光澤，如果沒有，則表示染色失敗。

4.如染色太淺，可按照原來步驟重染。

六、作業

1.繪制自制血涂片中的各種血細胞（至少一種白細胞）。2.用簡練的語言概括血液的主要成分和作用。