第一篇：色譜方法學(xué)驗(yàn)證

色譜方法學(xué)驗(yàn)證

所謂方法驗(yàn)證(validation，又叫認(rèn)證)就是要證明所開發(fā)方法的實(shí)用性和可靠性。實(shí)用性一般指所用儀器配置是否全部可作為商品購(gòu)得(實(shí)驗(yàn)室自己制造的儀器部件就欠實(shí)用)，樣品處理方法是否簡(jiǎn)單易操作，分析時(shí)間是否合理，分析成本是否可被同行接受等。可靠性則包括定量的線性范圍、檢測(cè)限、方法回收率、重復(fù)性、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度等。下面就簡(jiǎn)單討論這幾個(gè)可靠性參數(shù)。

1．方法的線性范圍

即檢測(cè)器響應(yīng)值與樣品量(濃度)成正比的線性范圍，它主要由檢測(cè)器的特性所決定。原則上。這一線性范圍應(yīng)覆蓋樣品組分濃度整個(gè)變化范圍。線性范圍的確定通常是采用一系列(多于3個(gè))不同濃度的樣品進(jìn)行分析，以峰面積(或峰高)對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸。當(dāng)相關(guān)系數(shù)大于0．99時(shí)，就可認(rèn)為足線性的，小于0．99時(shí)，就超出了線性范圍。一個(gè)好的GC定量方法，其線性范圍(以FID檢測(cè)器為例)可達(dá)10；，線性相關(guān)系數(shù)等于或大于0．9999。

2．方法的檢測(cè)限

檢測(cè)限(DL)是指方法可檢測(cè)到的最小樣品量(濃度)。一般的原則是按照3倍信噪比計(jì)算，即氣樣品組分的響應(yīng)值等于基線噪聲的3倍時(shí)，該樣品的濃度就被作為最小檢測(cè)限，與此對(duì)應(yīng)的該組分的進(jìn)樣量就叫做最小檢測(cè)量-此外。憶驗(yàn)證定量方法時(shí)，還將10倍信噪比所對(duì)應(yīng)的樣品濃度叫做最小定量限，當(dāng)用于法規(guī)分析時(shí)，這一數(shù)據(jù)應(yīng)等于或低于法規(guī)方法所要求的實(shí)際樣品中待測(cè)組分的最低允許濃度。

檢測(cè)限的測(cè)定可用一個(gè)接近檢測(cè)限濃度的樣品進(jìn)行分析，據(jù)所得色譜峰的峰高來(lái)計(jì)算。設(shè)此時(shí)濃度為c、相應(yīng)的峰高為h(信號(hào)強(qiáng)度單位)、基線噪聲為N(與h的單位相同)，則檢測(cè)限可按下面公式計(jì)算：

c／h＝DL/3N；即DL＝3Nc／h 噪聲的大小與儀器的性能，特別是檢測(cè)器及其電子電路的穩(wěn)定性直接相關(guān)，也與載氣的純度、色譜柱的性能及操作條件有關(guān)。噪聲的測(cè)定是在正常操作條件下，儀器穩(wěn)定時(shí)，將信號(hào)放大(降低衰減或放大縱坐標(biāo))來(lái)測(cè)量，一般是測(cè)定樣品出峰前后1min的基線噪聲。

作為分析方法，檢測(cè)限無(wú)疑是越低越好。為此，應(yīng)選擇靈敏度高的檢測(cè)器，使用高純度的載氣和輔助氣，同時(shí)要定期維護(hù)儀器，保持進(jìn)樣口和檢測(cè)器的清潔，保持色譜柱的性能。此外，仔細(xì)優(yōu)化分離條件、適當(dāng)加大進(jìn)樣量(如采用大體積進(jìn)樣技術(shù))也是降低檢測(cè)限的常用方法。

3．方法回收率

即方法測(cè)得的樣品組分濃度與原來(lái)樣品中實(shí)有濃度的比率。如果樣品未經(jīng)任何預(yù)處理，則回收率一般可不考慮。只有當(dāng)某些樣品組分被儀器系統(tǒng)不可逆吸附時(shí)，回收率才是需要考慮的問(wèn)題。如果樣品經(jīng)過(guò)了預(yù)處理，如萃取工藝，那就必須考慮整個(gè)方法的回收率。一般要求回收串大于60％，越接近100％越好。

回收率可用下述簡(jiǎn)單方法測(cè)定：配置一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，將其兩等分，其中一份按方法步驟進(jìn)行預(yù)處理，然后用GC分析。另一份則不經(jīng)頸處理而直接用GC分析。兩份樣品所得待測(cè)組分峰面積的比率乘以100即是該組分的回收率。有時(shí)實(shí)際樣品很復(fù)雜，特別是樣品基質(zhì)對(duì)預(yù)處理的回收率影響較大時(shí)，就必須用空白樣品基質(zhì)(確信不含待測(cè)物)制備標(biāo)準(zhǔn)樣品，比如測(cè)定廢水中有機(jī)農(nóng)藥殘留量時(shí)，就要采用不含農(nóng)藥的水作空白基質(zhì)，在其中加入已知量的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，然后進(jìn)行處理和分析。處理后測(cè)得的組分含量與處理前加入量的比率乘以100就得到了回收率。

很顯然，回收率太低時(shí)會(huì)影響方法的檢測(cè)限。當(dāng)樣品處理過(guò)程較復(fù)雜時(shí)，應(yīng)分步測(cè)定回收率，最后針對(duì)回收率最低的步驟進(jìn)行方法改進(jìn)，以期提高整個(gè)方法的回收率。

4．方法重復(fù)性和重現(xiàn)性

重現(xiàn)性(reproducibility)足指同一方法在不同時(shí)間、地點(diǎn)、不同型號(hào)儀器、不同操作人員使用寸所得結(jié)果的一致性。與此近似的另一個(gè)術(shù)語(yǔ)是重復(fù)性(repeatability)，常指同一個(gè)人在同一臺(tái)儀器上重復(fù)進(jìn)樣所得結(jié)果的一致性。事實(shí)上，文獻(xiàn)中二者常常混用，多數(shù)人不做嚴(yán)格區(qū)分。但大多數(shù)歐洲學(xué)者會(huì)嚴(yán)格區(qū)分二者的不同。我們認(rèn)為對(duì)現(xiàn)代儀器來(lái)說(shuō)，分析重復(fù)性是容易實(shí)現(xiàn)的，而重現(xiàn)性則是更重要的，也是方法驗(yàn)證所必須考察的。重現(xiàn)性和重復(fù)性都用多次分析所得結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來(lái)表示。

方法的重現(xiàn)性應(yīng)包括多次連續(xù)進(jìn)樣分析的重復(fù)性、不同時(shí)間(天與天之間)分析的重復(fù)性、不同型號(hào)儀器之間的重現(xiàn)性和不同實(shí)驗(yàn)室之間的重現(xiàn)性。作為方法開發(fā)人員，首先應(yīng)測(cè)定重復(fù)性，即在相同條件下連續(xù)進(jìn)樣5—10次，統(tǒng)汁待測(cè)組分的保留時(shí)間和峰面積(或峰高)的RSD，一般要求保留時(shí)間的RSD不大于1％，峰面積的RSD不大于5%。文獻(xiàn)報(bào)道的最佳重復(fù)性數(shù)據(jù)為保留時(shí)間的RSD小于0.1%，峰面積的RSD小于1%。

如果樣品要經(jīng)過(guò)預(yù)處理，還應(yīng)測(cè)定同一樣品多次處理的重復(fù)性。即同一樣品取3—5份做平行處理，看最后測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性。這一RSD值應(yīng)不大于5％。當(dāng)然，有些工業(yè)分析要求不大于10％即可。至于天與天之間的重現(xiàn)性也不應(yīng)大于10%、當(dāng)上述重復(fù)性滿足要求后，說(shuō)明該方法在你的實(shí)驗(yàn)室是可靠的。要將此方法作為標(biāo)準(zhǔn)方法推廣使用，還必須測(cè)定不同儀器、不同實(shí)驗(yàn)室之間的重現(xiàn)性。當(dāng)這些重現(xiàn)性(RSD)都能滿足要求時(shí)。這一方法的可靠性就得到了較為滿意的驗(yàn)證。

方法的線性關(guān)系及檢測(cè)限

準(zhǔn)確稱取 7種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)品, 用甲醇稀釋配制成 7種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)溶液, 根據(jù)需要用甲醇分別稀釋配制成 5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液, 濃度范圍如表 3所示,在選定的色譜條件下,分別進(jìn)樣分析。以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)作回歸方程,結(jié)果見表 3 , 回歸方程的相關(guān)系數(shù) R2均大于 0.9999,線性關(guān)系良好。以最低濃度標(biāo)樣重復(fù)進(jìn)樣 5次, 取其 3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢測(cè)限, 10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為定量限, 根據(jù)樣品處理過(guò)程將結(jié)果換算為ug /g , 得到該方法的檢測(cè)限和定量限

方法的回收率和重復(fù)性

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定方法的回收率。取一種已知目標(biāo)物含量的樣品(7 #),加入與其含量相當(dāng)?shù)幕旌蠘?biāo)

準(zhǔn)溶液,重復(fù) 5次,測(cè)定其加標(biāo)回收率和重復(fù)性, 結(jié)果如表 5所示。5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 RSD范圍為 1.3 % ~3.1 %, 回收率范圍為 97.0 % ~ 99.6 %, 可以滿足定量需要。

——引自《RP-HPLC法測(cè)定煙用香精香料中的7種防腐劑》

內(nèi)標(biāo)法方法學(xué)注意事項(xiàng)（引自網(wǎng)頁(yè)論壇）

選一與欲測(cè)組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標(biāo)物（當(dāng)然是樣品中沒有的組分），然后配制欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣得相對(duì)校正因子。再將內(nèi)標(biāo)物加入欲測(cè)組分的樣品中，進(jìn)樣后測(cè)得欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的定量參數(shù)。用內(nèi)標(biāo)法公式計(jì)算即可。

內(nèi)標(biāo)法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物，加入到準(zhǔn)確稱量的試樣中，根據(jù)被測(cè)試樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色譜峰面積之比，來(lái)計(jì)算被測(cè)組分的含量。選擇內(nèi)標(biāo)物有4個(gè)要求：1.內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì)；2.它必須完全溶于試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離；3.加入內(nèi)標(biāo)物的量應(yīng)接近于被測(cè)組分；4.色譜峰的位置應(yīng)與被測(cè)組分的色譜峰的位置相近，或在幾個(gè)被測(cè)組分色譜峰中間。內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確，由于通過(guò)測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物及被測(cè)組分的峰面積的相對(duì)值來(lái)進(jìn)行計(jì)算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)是操作程序較為麻煩，每次分析時(shí)內(nèi)標(biāo)物和試樣都要準(zhǔn)確稱量，有時(shí)尋找合適的內(nèi)標(biāo)物也有困難。外標(biāo)法簡(jiǎn)便，但進(jìn)樣量要求十分準(zhǔn)確，要嚴(yán)格控制在與標(biāo)準(zhǔn)物相同的操作條件下進(jìn)行，否則造成分析誤差，得不到準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果。

那么內(nèi)標(biāo)法的方法學(xué)研究就是將過(guò)測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物及被測(cè)組分的峰面積的相對(duì)值，也就是一個(gè)比值，來(lái)進(jìn)行一些精密度、準(zhǔn)確度、線性之類的研究。

具體就是配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄樣品和內(nèi)標(biāo)峰面積，計(jì)算樣品/內(nèi)標(biāo)峰面積比值R樣品/內(nèi)標(biāo)，利用樣品濃度C對(duì)比值R樣品/內(nèi)標(biāo)作直線回歸，得回歸方程，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密度、準(zhǔn)確度也如此。

首先你要了解何為內(nèi)標(biāo)法

內(nèi)標(biāo)法是一種間接或相對(duì)的校準(zhǔn)方法。在分析測(cè)定樣品中某組分含量時(shí)，加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校誰(shuí)和消除出于操作條件的波動(dòng)而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學(xué)方面的、色譜方面的和儀器方面的三類。

由化學(xué)方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時(shí)出現(xiàn)。化學(xué)方面的因素包括：

1、內(nèi)標(biāo)物在樣品里混合不好；

2、內(nèi)標(biāo)物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng)，3、內(nèi)標(biāo)物純度可變等。

對(duì)于一個(gè)比較成熟的方法來(lái)說(shuō)，色譜方面的問(wèn)題發(fā)生的可能性更大一些，色譜上常見的一些問(wèn)題(如滲漏)對(duì)絕對(duì)面積的影響比較大，對(duì)面積比的影響則要小一些，但如果絕對(duì)面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個(gè)重要的色譜問(wèn)題存在，比如進(jìn)樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標(biāo)濃度之間有很大的差別，檢測(cè)器非線性等。進(jìn)樣量應(yīng)足夠小并保持不變，這樣才不致于造成檢測(cè)器和積分裝置飽和。如果認(rèn)為方法比較可靠，而色譜固看來(lái)也是正常的話，應(yīng)著重檢查積分裝置和設(shè)置、斜率和峰寬定位。對(duì)積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是：面積比可變，而峰高比保持相對(duì)恒定，在用內(nèi)標(biāo)法做色譜定量分析時(shí)，先配制一定重量比的被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)樣品的混合物做色譜分析，測(cè)量峰面積，做重量比和面積比的關(guān)系曲線，此曲線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)際樣品分析時(shí)所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所用的條件一致，因此，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，不僅要注明色譜條件(如固定相、柱溫、載氣流速等)，還應(yīng)注明進(jìn)樣體積和內(nèi)標(biāo)物濃度。在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，各點(diǎn)并不完全落在直線上，此時(shí)應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標(biāo)準(zhǔn)偏差，在使用過(guò)程中應(yīng)定期進(jìn)行單點(diǎn)校正，若所得值與平均值的偏差小于2，曲線仍可使用，若大于2，則應(yīng)重作曲線，如果曲線在鉸短時(shí)期內(nèi)即產(chǎn)生變動(dòng)，則不宜使用內(nèi)標(biāo)法定量。

所以，當(dāng)你確定應(yīng)用內(nèi)標(biāo)法之后，就不需要進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)的。因?yàn)槟阍诩觾?nèi)標(biāo)時(shí)它就是一個(gè)已知濃度了。做方法學(xué)的時(shí)候，內(nèi)標(biāo)和待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)品(比如你的白三烯待測(cè)物）要分別單獨(dú)進(jìn)樣，然后再做標(biāo)液的色譜圖（含有內(nèi)標(biāo)和樣品），然后再是提取或者回收后的樣品（如血漿或者一些細(xì)胞，組織提取物等等），最后比較兩者的封面積。

如果內(nèi)標(biāo)選擇用來(lái)做方法回收率的，在樣品前處理前進(jìn)行添加。如果你在做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)候則上機(jī)前添加，添加量不管外標(biāo)是否為梯度內(nèi)標(biāo)量是固定的。你看到有人做實(shí)際樣品時(shí)候只是在上機(jī)前添加內(nèi)標(biāo)，他這時(shí)候的內(nèi)標(biāo)不能指示回收率，只能用于校正儀器信號(hào)偏差，通俗的說(shuō)這種內(nèi)標(biāo)叫上機(jī)內(nèi)標(biāo)。而前處理時(shí)候加入的內(nèi)標(biāo)叫替代內(nèi)標(biāo)。（我這是個(gè)人稱呼，不是官方稱呼哈）。添加內(nèi)標(biāo)的量，一般要是樣品含量的兩倍，這個(gè)，其實(shí)很難把握吧，樣品含量我們也不知道，所以就大膽的去加就行了。嘿嘿，純個(gè)人觀點(diǎn)哈！

第二篇：方法學(xué)驗(yàn)證（精選）

主要驗(yàn)證分析方法的可行性 含量方法學(xué) 首先肯定要有系統(tǒng)適用性、溶液穩(wěn)定性、專屬性、精密度（重復(fù)性或中間精密度）、線性、耐用性、準(zhǔn)確度、檢測(cè)限、定量限

一般一個(gè)項(xiàng)目從小試開始、中試、放大 放大最少是三批作為驗(yàn)證批 驗(yàn)證批一般內(nèi)容一般有工藝驗(yàn)證、清潔驗(yàn)證、成品檢驗(yàn)、然后開始穩(wěn)定性的考察、到穩(wěn)定性第六個(gè)月就可以申報(bào)到省局 這個(gè)時(shí)候就要寫申報(bào)資料 質(zhì)量這塊主要負(fù)責(zé)10、11、14號(hào)資料（以前版本）現(xiàn)在一般是CTD資料 主要負(fù)責(zé)3.2.s部分。省局受理后一般一個(gè)月后來(lái)現(xiàn)考，主要檢查所有的檢驗(yàn)記錄、儀器使用臺(tái)賬、對(duì)照品使用臺(tái)賬。通過(guò)后有動(dòng)態(tài)批送檢，合格就送到國(guó)家局 等批件，這就要很久了 穩(wěn)定性考察還要繼續(xù)進(jìn)行一般長(zhǎng)期到36個(gè)月 上面是一個(gè)項(xiàng)目的主要流程、制劑還要進(jìn)行處方篩選，一般在小試、中試是進(jìn)行、方法學(xué)也在這個(gè)時(shí)候進(jìn)行（主要含量、有關(guān)物質(zhì)）固體還有釋放度，原料有殘留溶劑、其他已知雜質(zhì)都要有方法學(xué)的支持 針劑也要有處方的篩選、臨床稀釋液相容性、管道相容性固體分速釋、緩釋、口崩、混懸等這些都不同、從工藝到方法學(xué)都不同

實(shí)驗(yàn)室的所有儀器都必須通過(guò)驗(yàn)證、校準(zhǔn)才能用、外教一般是華南計(jì)量所的每隔一年一次

（液相兩年一次）這中間、每半年應(yīng)該有一次內(nèi)部校準(zhǔn)、每一年又一次驗(yàn)證（做了驗(yàn)證可不做內(nèi)角）

紫外、紅外也一樣

第三篇：定量分析方法的方法學(xué)驗(yàn)證

定量分析方法的方法學(xué)驗(yàn)證 定量分析方法的方法學(xué)驗(yàn)證

定量分析方法驗(yàn)證的目的是證明采用的含量測(cè)定方法適合于相應(yīng)分析要求，在進(jìn)行定量分析方法學(xué)研究或起草藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，分析方法需經(jīng)驗(yàn)證。

驗(yàn)證內(nèi)容有：線性、范圍、準(zhǔn)確度、精密度（包括重復(fù)性和重現(xiàn)性）、檢測(cè)限、定量限和耐用性等。

一，線性

線性是指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與試樣中被測(cè)物質(zhì)濃度直接呈正比關(guān)系的程度。

應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系。可用一貯備液經(jīng)精密稀釋，制備一系列供試品的方法進(jìn)行測(cè)定，至少制備五份供試樣品；以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)對(duì)被測(cè)物濃度作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。必要時(shí)，響應(yīng)信號(hào)可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線性回歸計(jì)算。回歸方程的相關(guān)系數(shù)(r)越接近于 1，表明線性關(guān)系越好。

用 UV 法測(cè)定時(shí)，以對(duì)照品配制一定濃度范圍的對(duì)照品系列溶液，吸光度 A 一般在 0.3 ～ 0.7，濃度點(diǎn) n ＝ 5，用濃度 C 對(duì) A 作線性回歸，得一直線方程，方程的截距應(yīng)接近于零，相關(guān)系數(shù) r 應(yīng)大于 0.9999。

用 HPLC 法測(cè)定時(shí)，以對(duì)照品配制一定濃度范圍的對(duì)照品系列溶液，濃度點(diǎn) n ＝ 5 ～ 7，用濃度 C 對(duì)峰高 h 或峰面積 A 或被測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)值之比進(jìn)行線性回歸或非線性擬合（如 HPLC-ELSD），建立方程，方程的截距應(yīng)趨于零，相關(guān)系數(shù) r 應(yīng)大于 0.999。

線性關(guān)系的數(shù)據(jù)包括相關(guān)系數(shù)、回歸方程和線性圖。

二，范圍

范圍系指能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性，測(cè)試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。

范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果及要求確定。對(duì)于有毒的、具特殊功效或藥理作用的成分，其范圍應(yīng)大于被限定含量的區(qū)間。

三，精確度

準(zhǔn)確度系指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，一般用回收率(％)表示。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測(cè)試。用于定量測(cè)定的分析方法均需做準(zhǔn)確度驗(yàn)證。

1.測(cè)定方法的準(zhǔn)確度

可用已知純度的對(duì)照品做加樣回收率測(cè)定，即于已知被測(cè)成分含量的供試品中再精密加入一定量的已知純度的被測(cè)成分對(duì)照品，依法測(cè)定。用實(shí)測(cè)值與供試品中含有量之差，除以加入對(duì)照品量計(jì)算回收率。

在加樣回率收試驗(yàn)中須注意對(duì)照品的加入量與供試品中被測(cè)成分含有量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)；加入的對(duì)照品的量要適當(dāng)，過(guò)小則引起較大的相對(duì)誤差，過(guò)大則干擾成分相對(duì)減少，真實(shí)性差。

回收率 % = [(C-A)/B]*100%

式中，A 為供試品所含被測(cè)成分量； B 為加入對(duì)照品量； C 為實(shí)測(cè)值。

2.數(shù)據(jù)要求

在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度的供試品，用 6 個(gè)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)；或設(shè)計(jì) 3 個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度各分別制備 3 份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，用 9 個(gè)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，一般中間濃度加入量與所取供試品含量之比控制在 l ∶ 1 左右，其他兩個(gè)濃度分別約為供試品含量的 80% 和 120%。應(yīng)報(bào)告供試品取樣量、供試品中含有量、對(duì)照品加入量、測(cè)定結(jié)果和回收率(％)計(jì)算值，以及回收率(％)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)或可信限。

四，精密度

精密度是指在規(guī)定的測(cè)試條件下，同一個(gè)均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間接近的程度。

1.精密度的表示方法

氣相色譜法和高效液相色譜法是對(duì)同一供試液進(jìn)行至少五次以上的測(cè)定；精密度一般用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)表示： RSD= 標(biāo)準(zhǔn)偏差 /平均值 ′ 100 ％

精密度報(bào)告的數(shù)據(jù)應(yīng)包括平均值、可信限及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

一般在一天之內(nèi)進(jìn)行的精密度考察稱為日內(nèi)精密度(inter-day variability)；在三天之內(nèi)進(jìn)行的精密度考察稱為日間精密度(intra-day variability)。

有時(shí)為了考察隨機(jī)變動(dòng)因素對(duì)精密度的影響，還需設(shè)計(jì)進(jìn)行中間精密度試驗(yàn)，變動(dòng)因素包括不同日期、不同分析人員和不同設(shè)備。

2.重復(fù)性（repeatability）

是指在同一條件下對(duì)同一批樣品，從樣品供試品液制備開始，制備至少六份以上供試品溶液(即 n>6), 或設(shè)計(jì) 3 個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度各分別制備 3 份供試溶液，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其含量的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。RSD 一般應(yīng)根據(jù)樣品含量高低、含量測(cè)定方法和繁簡(jiǎn)進(jìn)行制訂，如含量很低一般不大于 5 ％；如含量較高，則應(yīng)從嚴(yán)要求。

3.重現(xiàn)性（reproducibility）

是指在不同的實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度。當(dāng)分析方法將被法定標(biāo)準(zhǔn)采用時(shí)，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)。如建立藥典分析方法時(shí)，通過(guò)協(xié)同檢驗(yàn)得出重現(xiàn)性結(jié)果，協(xié)同檢驗(yàn)及重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說(shuō)明中。應(yīng)注意重現(xiàn)性試驗(yàn)樣品本身的質(zhì)量均勻性和儲(chǔ)存運(yùn)輸中的環(huán)境影響因素，以免影響重現(xiàn)性結(jié)果。

五，檢測(cè)限

檢測(cè)限是指試樣中被測(cè)物質(zhì)能被檢測(cè)出的最低濃度或量。檢測(cè)限是一種限度檢驗(yàn)效能指標(biāo)，即反映方法與儀器的靈敏度和噪音的大小，也表明樣品經(jīng)處理后空白(本底)值的高低。它無(wú)需定量測(cè)定，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可。根據(jù)所采用的分析方法來(lái)確定檢測(cè)限。

當(dāng)用 GC 和 HPLC 法時(shí)，可用已知低濃度樣品測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。一般以 S / N ＝ 2 或 S / N ＝ 3 時(shí)的相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限。檢測(cè)限的報(bào)告數(shù)據(jù)應(yīng)附圖譜，說(shuō)明測(cè)試過(guò)程和檢測(cè)限結(jié)果。

六，定量限

定量限是指樣品中被測(cè)物質(zhì)能被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精密度。常用信噪比法測(cè)定定量限。一般以 S / N ＝ 10 時(shí)相應(yīng)的濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定。

七，耐用性

耐用性系指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，為使方法用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。開始研究分析方法時(shí)，就應(yīng)考慮其耐用性。如果測(cè)試條件要求苛刻，則應(yīng)在方法中寫明。典型的變動(dòng)因素有：被測(cè)溶液的穩(wěn)定性，樣品提取次數(shù)、時(shí)間等。液相色譜法中典型的變動(dòng)因素有：流動(dòng)相的組成比例或 pH 值，不同廠牌或不同批號(hào)的同類型色譜柱，柱溫，流速及檢測(cè)波長(zhǎng)等。氣相色譜法變動(dòng)因素有：不同廠牌或批號(hào)的色譜柱、固定相，不同類型的擔(dān)體，柱溫，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度等。薄層色譜的變動(dòng)因素有：不同廠牌的薄層板，點(diǎn)樣方式及薄層展開時(shí)溫度及相對(duì)濕度的變化等。

經(jīng)試驗(yàn)，應(yīng)說(shuō)明小的變動(dòng)能否通過(guò)設(shè)計(jì)的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，以確保方法有效。

第四篇：分析方法的方法學(xué)驗(yàn)證

一、方法驗(yàn)證

1．準(zhǔn)確度 該指標(biāo)主要是通過(guò)回收率來(lái)反映。驗(yàn)證時(shí)一般要求分別配制濃度為80％、100％和120％的供試品溶液各三份，分別測(cè)定其含量，將實(shí)測(cè)值與理論值比較，計(jì)算回收率。可接受的標(biāo)準(zhǔn)為：各濃度下的平均回收率均應(yīng)在98.0%-102.0%之間，9個(gè)回收率數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）應(yīng)不大于2.0%。

2．線性 線性一般通過(guò)線性回歸方程的形式來(lái)表示。具體的驗(yàn)證方法為： 在80％至120％的濃度范圍內(nèi)配制6份濃度不同的供試液，分別測(cè)定其主峰的面積，計(jì)算相應(yīng)的含量。以含量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸分析。可接受的標(biāo)準(zhǔn)為：回歸線的相關(guān)系數(shù)（R）不得小于0.998，Y軸截距應(yīng)在100％響應(yīng)值的2％以內(nèi)，響應(yīng)因子的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%。

3．精密度 1）重復(fù)性 配制6份相同濃度的供試品溶液，由一個(gè)分析人員在盡可能相同的條件下進(jìn)行測(cè)試，所得6份供試液含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%。2）中間精密度 配制6份相同濃度的供試品溶液，分別由兩個(gè)分析人員使用不同的儀器與試劑進(jìn)行測(cè)試，所得12個(gè)含量數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%。

4．專屬性 可接受的標(biāo)準(zhǔn)為：空白對(duì)照應(yīng)無(wú)干擾，主成分與各有關(guān)物質(zhì)應(yīng)能完全分離，分離度不得小于2.0。以二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行純度分析時(shí)，主峰的純度因子應(yīng)大于980。

5．檢測(cè)限 主峰與噪音峰信號(hào)的強(qiáng)度比應(yīng)不得小于3。

6．定量限 主峰與噪音峰信號(hào)的強(qiáng)度比應(yīng)不得小于10。另外，配制6份最低定量限濃度的溶液，所測(cè)6份溶液主峰的保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%。

7．耐用性 分別考察流動(dòng)相比例變化±5％、流動(dòng)相pH值變化±0.2、柱溫變化±5℃、流速相對(duì)值變化±20％時(shí)，儀器色譜行為的變化，每個(gè)條件下各測(cè)試兩次。可接受的標(biāo)準(zhǔn)為：主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰與雜質(zhì)峰必須達(dá)到基線分離；各條件下的含量數(shù)據(jù)（n=6）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%。

8、系統(tǒng)適應(yīng)性 配制6份相同濃度的供試品溶液進(jìn)行分析，主峰峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于2.0%，主峰保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不大于1.0%。另外，主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰與雜質(zhì)峰必須達(dá)到基線分離，主峰的理論塔板數(shù)應(yīng)符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。

二、分 析 方 法 驗(yàn) 證（Validation）

進(jìn)行驗(yàn)證，以證明分析方法符合檢測(cè)的目的和要求，這就是分析方法驗(yàn)證。從本質(zhì)上講，方法驗(yàn)證就是根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的要求，預(yù)先設(shè)置一定的驗(yàn)證內(nèi)容，并通過(guò)設(shè)計(jì)合理的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證所采用的分析方法符合檢測(cè)項(xiàng)目的要求。方法驗(yàn)證在質(zhì)量控制上有重要的作用和意義，只有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的分析方法才能用于藥品生產(chǎn)的分析檢測(cè)，方法驗(yàn)證是制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)。方 法 驗(yàn) 證 內(nèi) 容 包括方法的專屬性、線性、范圍、準(zhǔn)確度、精密度、檢出限、定量限、耐用性和系統(tǒng)適用性等，檢測(cè)目的不同驗(yàn)證要求也不盡相同。1.專 屬 性（Speciality / Specificity）

專屬性是指分析方法能夠?qū)a(chǎn)品和雜質(zhì)分開的特性，也稱為“選擇性”。對(duì)于純度檢測(cè)，可在標(biāo)準(zhǔn)品中加入產(chǎn)品中的已知雜質(zhì)，或者直接用粗品，考察產(chǎn)品峰是否受到雜質(zhì)的干擾，對(duì)于過(guò)程跟蹤，可用反應(yīng)體系樣品來(lái)考察有沒有其它的雜質(zhì)干擾。必要時(shí)使用二極管陣列檢測(cè)器或者質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行色譜峰純度檢查。一般要求產(chǎn)品和雜質(zhì)之間的分離度大于2.0。2.線 性（Linearity）

線性是在設(shè)定的范圍內(nèi)，檢測(cè)結(jié)果與樣品中原料或產(chǎn)品的濃度呈線性關(guān)系的程度。線性是定量檢測(cè)的基礎(chǔ)，需要定量檢測(cè)的項(xiàng)目都需要驗(yàn)證線性。一般用貯備液經(jīng)過(guò)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備得到一系列被測(cè)物質(zhì)的濃度（5個(gè)以上），按濃度從小到大運(yùn)行序列，以峰面積和濃度的函數(shù)作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸計(jì)算，考察分析方法的線性。3.范 圍（Range）

范圍指在能夠達(dá)到一定的準(zhǔn)確度、精密度和線性時(shí)，樣品中被分析物的濃度區(qū)間。簡(jiǎn)單的說(shuō)，范圍就是分析方法適用的樣品中待測(cè)物的濃度最大值和最小值。需要定量檢測(cè)的分析方法都需要對(duì)范圍進(jìn)行驗(yàn)證，純度檢測(cè)時(shí)，范圍應(yīng)為測(cè)試濃度的80％～120％。4.準(zhǔn) 確 度（Accuracy）

準(zhǔn)確度是指測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值之間接近的程度，所以也叫做“真實(shí)度”，需要定量得分析方法均需要驗(yàn)證準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)建立，對(duì)于原料藥可用已知純度的標(biāo)準(zhǔn)品或符合要求的原料藥進(jìn)行測(cè)定，必要時(shí)可與另一個(gè)已建立準(zhǔn)確度的方法比較結(jié)果。5.精 密 度（Precision）

精密度是指在規(guī)定條件下，同一均勻樣品經(jīng)多次取樣進(jìn)行一系列檢測(cè)所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示，取樣檢測(cè)次數(shù)應(yīng)至少6次。精密度可以從三個(gè)層次考察：重復(fù)性、中間精密度、重現(xiàn)性。

a、重復(fù)性（Repeatability）：是在相同的操作條件下、較短時(shí)間間隔內(nèi)，由同一分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度。一般是用100％濃度水平的樣品測(cè)定6次的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

b、中間精密度（Intermediate precision）：同一實(shí)驗(yàn)室，在日期、分析人員、儀器等內(nèi)部條件改變時(shí)，測(cè)定結(jié)果的精密度。c、重現(xiàn)性（Reproducibility）：指不同實(shí)驗(yàn)室之間不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度。

6.檢 出 限（Limits of Detection；LOD）

檢出限是指樣品中的被分析物能夠被檢測(cè)到的最低量，不需要準(zhǔn)確定量。檢出限體現(xiàn)了分析方法的靈敏度。檢出限的測(cè)定可以通過(guò)對(duì)一系列已知濃度被測(cè)物的試樣進(jìn)行檢測(cè)，以能準(zhǔn)確、可靠檢出被測(cè)物的最小濃度來(lái)確定，也可把已知濃度樣品的信號(hào)與噪聲信號(hào)進(jìn)行比較，以信噪比為3：1時(shí)的濃度確定檢出限，一般要求能夠達(dá)到進(jìn)樣濃度的0.05%。

7.定 量 限（Limits of Quantitation / Quantification；LOQ）定量限是指樣品中的被分析物能夠被定量檢測(cè)的最低量，其測(cè)定結(jié)果需要一定的準(zhǔn)確度和精密度，定量限體現(xiàn)了分析方法靈敏定量檢測(cè)的能力。檢測(cè)需要嚴(yán)格控制含量的雜質(zhì)，必須考察方法的定量限，以保證雜質(zhì)能夠被準(zhǔn)確定量。一般以信噪比為10：1時(shí)相應(yīng)的濃度或進(jìn)樣量來(lái)確定定量限。

8.耐 用 性（Durability / Robustness）

耐用性是指測(cè)定條件發(fā)生小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，耐用性主要表明方法的抗干擾能力，主要的變動(dòng)因素包括：流動(dòng)相的組成、流速和pH值、色譜柱、柱溫等。經(jīng)試驗(yàn)，應(yīng)說(shuō)明小的變動(dòng)能否符合系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求，以確保方法有效。9.系 統(tǒng) 適 用 性 試 驗(yàn)（System Suitability）液相色譜分析方法主要依賴高效液相色譜儀和色譜柱，在做方法驗(yàn)證時(shí)，有必要將高效液相色譜儀、色譜柱、流動(dòng)相與實(shí)驗(yàn)操作、待測(cè)樣品等一起當(dāng)作完整的系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估，并將系統(tǒng)適用性作為分析方法的組成部分，系統(tǒng)適用性便是對(duì)整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估的指標(biāo)。一般系統(tǒng)適應(yīng)性的要求為：分析方法能夠達(dá)到0.05%的檢出限；主峰的拖尾因子（T）0.95

分析方法開發(fā)與驗(yàn)證是一個(gè)整體，在實(shí)際工作中，一般是先開發(fā)分析方法，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)膬?yōu)化以后再做方法驗(yàn)證，驗(yàn)證的部分內(nèi)容在分析方法開發(fā)時(shí)就要做，比如說(shuō)分析方法的專屬性驗(yàn)證。分析方法驗(yàn)證并非必須驗(yàn)證所有的內(nèi)容，只要注意驗(yàn)證內(nèi)容充分，足以證明分析方法的合理性就可以了，如雜質(zhì)限度檢測(cè)一般只需要驗(yàn)證專屬性和檢出限，而精密度、線性、定量限等涉及定量測(cè)定的項(xiàng)目，則不需要驗(yàn)證。有時(shí)需要對(duì)分析方法進(jìn)行全面或部分的再驗(yàn)證。當(dāng)原料藥合成工藝發(fā)生改變時(shí)，可能引入新的雜質(zhì)，雜質(zhì)檢查方法和含量測(cè)定方法的專屬性就需要再進(jìn)行驗(yàn)證，以證明有關(guān)物質(zhì)檢查方法能夠檢測(cè)新引入的雜質(zhì)，且新引入的雜質(zhì)對(duì)主成份的含量測(cè)定應(yīng)無(wú)干擾。當(dāng)分析方法發(fā)生部分改變時(shí)，如檢測(cè)波長(zhǎng)發(fā)生改變，則需要重新進(jìn)行檢測(cè)限、專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性等內(nèi)容的驗(yàn)證，以證明改變后的 分析方法的合理性、可行性

第五篇：藥物分析的方法學(xué)驗(yàn)證所要做到的事項(xiàng)

藥物分析的方法學(xué)驗(yàn)證所要做到的事項(xiàng)

（一）新藥申報(bào)時(shí)，藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中分析方法必須驗(yàn)證；藥物生產(chǎn)工藝變更、制劑的組分變更、原分析方法進(jìn)行修訂時(shí)，則質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法必須進(jìn)行驗(yàn)證；2005版藥典中分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則只規(guī)定了項(xiàng)目和基本方法而沒有合格標(biāo)準(zhǔn):附錄XIX A；中國(guó)GMP(98)非常關(guān)注驗(yàn)證的過(guò)程,分析方法驗(yàn)證不完善是常見的問(wèn)題

藥物分析檢驗(yàn)時(shí)藥品生產(chǎn)的GMP的藥物分析的方法學(xué)驗(yàn)證，是保證藥物分析結(jié)果準(zhǔn)確性的前提和基礎(chǔ)，也是實(shí)現(xiàn)藥物分析檢測(cè)GMP的必然要素。

構(gòu)成藥物分析中的檢測(cè)方法驗(yàn)證，這要涉及到以下些方面的內(nèi)容：

1、分析方法驗(yàn)證成功的前提條件：

（！）儀器已經(jīng)確認(rèn)、校正并在有效期內(nèi)（2）經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的人員（3）可靠穩(wěn)定的對(duì)照品

（4）可靠穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)試劑（5）確認(rèn)受試溶液的穩(wěn)定性，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)無(wú)降解。

2、分析方法學(xué)驗(yàn)證所要求驗(yàn)證的內(nèi)容：（1）含量的測(cè)定（2）雜質(zhì)的含量測(cè)定（3）藥物的定性鑒定（4）藥物的含量均勻度測(cè)定（5）藥物的微生物檢測(cè)（6）藥物的細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)

驗(yàn)證內(nèi)容：

準(zhǔn)確度：準(zhǔn)確度是指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，用百分回收率表示。

測(cè)定回收率R（recovery）的具體方法可采用加樣回收試驗(yàn)法來(lái)進(jìn)行測(cè)定。加樣回收試驗(yàn)已準(zhǔn)確測(cè)定藥物含量P的真實(shí)樣品+已知量A的對(duì)照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）測(cè)定，測(cè)定值為M。數(shù)據(jù)要求:規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測(cè)定結(jié)果評(píng)價(jià)，如制備高、中、低三個(gè)不同濃度樣品各測(cè)三次

精密度：（重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性精密度是指在規(guī)定條件下，同一個(gè)均勻樣品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。用偏差（d）、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)（變異系數(shù)，CV）表示。

（1）重復(fù)性(repeatability):在相同條件下，由同一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度；在規(guī)定的范圍內(nèi)，至少用9次測(cè)定結(jié)果評(píng)價(jià)，如制備三個(gè)不同濃度樣品各測(cè)三次或把被測(cè)物濃度當(dāng)作100%，至少測(cè)6次進(jìn)行評(píng)價(jià)

（2）中間精密度同一實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備

所得結(jié)果的精密度

（3）重現(xiàn)性(reproducibility)不同實(shí)驗(yàn)室，不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度

（4）數(shù)據(jù)要求：需報(bào)告SD，RSD和可信限。

專屬性： 指有其他成分（雜質(zhì)、降解物、輔料等）可能存在情況下采用的方法能準(zhǔn)確測(cè)定出被測(cè)物的特性，能反映該方法在有共存物時(shí)對(duì)供試物準(zhǔn)確而專屬的測(cè)定能力，是指該法用于復(fù)雜樣品分析時(shí)是否受到相互干擾程度的度量

? 通常通過(guò)分析含有加了雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、有關(guān)化學(xué)物質(zhì)或安慰劑成分的樣品，將所獲分析結(jié)果與未加前述成分之樣品的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行比較，兩組測(cè)試結(jié)果之差即專屬性

?鑒別反應(yīng)---應(yīng)能與可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似化合物區(qū)別，不含被分析的樣品，以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，均應(yīng)呈負(fù)反應(yīng) ?含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定---色譜法和其他方法，應(yīng)附代表性圖譜，亦說(shuō)明專屬性。圖中應(yīng)標(biāo)明各組份的位置，色譜法中的分離度應(yīng)符合要求 ?雜質(zhì)可獲得的情況下，對(duì)于含量測(cè)定，試樣中可加入雜質(zhì)或輔料，考察測(cè)試結(jié)果是否受干擾；對(duì)于雜質(zhì)測(cè)定，也可向試樣中加入一定量的雜質(zhì)，考察雜質(zhì)間是否得到分離

檢測(cè)限： 檢測(cè)限系指試樣在確定的實(shí)驗(yàn)條件下，被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低濃度或含量。它是限度檢驗(yàn)效能指標(biāo)，無(wú)需定量測(cè)定，只要指出高于或低于該規(guī)定濃度即可。

?非儀器分析目視法：用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量

?信噪比法:用于能顯示基線噪音的分析方法（儀器分析方法），是把已知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，算出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。一般以信噪比3∶1或2∶1時(shí)的相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限

?也可采用標(biāo)準(zhǔn)差法：空白值＝0時(shí)；①測(cè)定背景10次以上，求出標(biāo)準(zhǔn)差σ

②將σ乘以三倍；③在工作曲線上求出3σ相對(duì)應(yīng)的濃度X，即為方法的檢出值；空白值不等于0；①測(cè)定背景10次以上，求出標(biāo)準(zhǔn)差σ；②將σ乘以三倍；③在工作曲線上求出3σ相對(duì)應(yīng)的濃度X；④將求得的對(duì)應(yīng)濃度值加上空白值即得該方法的檢出限

定量限（1imit of quantitationLOQ）

?指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精密度要求

?常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比（S/N）為10∶1時(shí)相應(yīng)的濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定，也可用儀器所測(cè)空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的10倍為估計(jì)值，再經(jīng)試驗(yàn)確定方法的實(shí)際測(cè)定下限 定量限：

指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精密度要求

?常用信噪比法確定定量限，一般以信噪比（S/N）為10∶1時(shí)相應(yīng)的濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定，也可用儀器所測(cè)空白背景響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的10倍為估計(jì)值，再經(jīng)試驗(yàn)確定方法的實(shí)際測(cè)定下限

線性：在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與試樣中被測(cè)物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。線形通常用最小二乘法處理數(shù)據(jù)求得回歸曲線的斜率（Slope）來(lái)表示。數(shù)據(jù)要求：至少需要五個(gè)濃度考察線形，需提供相關(guān)系數(shù)、y截距（是檢定的可能偏差）、回歸斜率及方差等參數(shù)，應(yīng)列出回歸方程數(shù)和線性圖

注意：做線性時(shí)，應(yīng)注意盡量做的點(diǎn)多一點(diǎn)、線性濃度范圍寬一點(diǎn)，這樣做的好處是：當(dāng)你在準(zhǔn)確度考察時(shí)，你做的回收率考察的濃度就大些，配制溶液時(shí)就容易操作些，否者，在你做線性考察時(shí)，你做的線性濃度范圍不寬，那么你在考察回收率時(shí)，你采用加入法考察時(shí)的濃度變化范圍不寬，操作濃度很難控制，造成實(shí)際操作困難。我碰到一個(gè)在做方法學(xué)研究的人，由于她在考察線性時(shí)，做的線性濃度不大，在做回收率時(shí)，加入后的量造成回收率濃度超出線性考察范圍的濃度，我說(shuō)那樣是不行的。因?yàn)樵谧龇治鲇?jì)算時(shí)又恰恰用了線性關(guān)系來(lái)計(jì)算，結(jié)果肯定是值得懷疑，結(jié)果是不能令人肯定的！（這是

經(jīng)驗(yàn)總結(jié)）

范圍：指達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性的條件下，測(cè)試方法適用的高、低限濃度或量的區(qū)間。范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線

性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定。

?原料藥和制劑含量測(cè)定范圍為80%-120%；制劑含量均勻度范圍為70%-130%；雜質(zhì)測(cè)定應(yīng)為被測(cè)雜質(zhì)匯報(bào)值到限度的120%；溶出度應(yīng)為測(cè)定范圍的±20%，如規(guī)定了限度范圍，應(yīng)為下限的-20%至上限的+20%，例如緩釋片1h<20%,7h>70%,則驗(yàn)證范圍定為0-90%。耐用性：指測(cè)定條件稍有變動(dòng)時(shí)，結(jié)果不受影響的承受程度，為常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。是衡量實(shí)驗(yàn)室和工作人員之間在正常情況下實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性的尺度;如果方法易受到分析條件的影響，或要求苛刻，應(yīng)注明。典型的變動(dòng)包括：分析溶液的穩(wěn)定性，提取時(shí)間等。藥物分

析的方法學(xué)驗(yàn)證事項(xiàng)

（二）含量測(cè)定方法驗(yàn)證的接收標(biāo)準(zhǔn)

?容量分析法：用原料藥精制品(含量>99.5％)或?qū)φ掌房疾旆椒ǖ木芏龋鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)差一般應(yīng)不大于0.2％；進(jìn)行回收率試驗(yàn)。回收率一

般在99.7～100.3％之間

?UV法：用適當(dāng)濃度的精制品進(jìn)行測(cè)定，其RSD一般不大于1％。制劑的測(cè)定，回收率一般應(yīng)在98％～102％之間；線性：吸光度A一般在0.2～0.7，濃度點(diǎn)n＝5。用濃度c對(duì)A作線性回歸處理，得一直線方程，r應(yīng)達(dá)到0.9999(n＝5)，方程的截距應(yīng)近于零含量測(cè)定方法驗(yàn)證的接收標(biāo)準(zhǔn)

?HPLC法：

?要求RSD<2％，回收率98％～102％之間。

?線性范圍：用精制品配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度點(diǎn)n應(yīng)為5～7，用濃度c對(duì)峰高h(yuǎn)或被測(cè)物的響應(yīng)值之比進(jìn)行回歸處理，建立回歸方

程，r應(yīng)大于0.999，截距應(yīng)趨于零

分析方法驗(yàn)證步驟：

?驗(yàn)證方案的制訂

?驗(yàn)證目的、方法改進(jìn)背景、?提供的原料藥和產(chǎn)品、儀器概要、試劑、對(duì)照品

?待驗(yàn)證的方法，項(xiàng)目，合格標(biāo)準(zhǔn)

?實(shí)施人員的培訓(xùn)

?參考文獻(xiàn)

?驗(yàn)證的實(shí)施

?收集完整的驗(yàn)證過(guò)程記錄和原始圖譜

?復(fù)核

?驗(yàn)證報(bào)告

?評(píng)價(jià)該方法是否通過(guò)驗(yàn)證

方法確認(rèn)和方法轉(zhuǎn)移

?對(duì)新產(chǎn)品的方法驗(yàn)證通常在產(chǎn)品開發(fā)階段完成；大規(guī)模生產(chǎn)后的驗(yàn)證通常包括方法確認(rèn)和方法轉(zhuǎn)移

?分析方法確認(rèn)是指當(dāng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或藥典標(biāo)準(zhǔn)擬變化或已經(jīng)變化時(shí)在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的對(duì)所涉及產(chǎn)品是否適用的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)

?確認(rèn)之前應(yīng)對(duì)新舊方法進(jìn)行核對(duì)，標(biāo)明所有變更細(xì)節(jié)

?檢驗(yàn)樣品的信息（批號(hào)、規(guī)格),變更項(xiàng)目的接收標(biāo)準(zhǔn)

?確認(rèn)試驗(yàn)的樣品通常包括正常產(chǎn)品、穩(wěn)定性產(chǎn)品

?方法轉(zhuǎn)移指檢驗(yàn)方法由轉(zhuǎn)移方轉(zhuǎn)移至接收方時(shí)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。

?流動(dòng)相PH（±0.5)

?流動(dòng)相組成(有機(jī)相±5%）

?色譜柱（同一廠家的三個(gè)批號(hào)，或兩個(gè)不同廠家（同固定相和填

充物，尺寸）

?溫度（20-25C)和流速(±10%）

?檢測(cè)波長(zhǎng)(±5nm)

檢驗(yàn)項(xiàng)目和驗(yàn)證內(nèi)容總結(jié)

?鑒別試驗(yàn)除專屬性、耐用性外，其它都不要求。

?雜質(zhì)的限度檢查除專屬性、檢測(cè)限、耐用性外，其它都不要求

?雜質(zhì)的定量測(cè)定除檢測(cè)限外，其它都要求。

?含量測(cè)定及溶出量測(cè)定除檢測(cè)限、定量限外，其它都要求