附件2

食品中辛基酚等5種酚類物質的測定

BJS

201913

范圍

本標準規定了食品中辛基酚、正辛基酚、壬基酚、正壬基酚、雙酚A的液相色譜-串聯質譜測定方法。

本標準適用于嬰兒配方食品、畜肉、禽蛋、水產品、罐頭食品、植物油中辛基酚、正辛基酚、壬基酚、正壬基酚、雙酚A的測定。

2原理

試樣中加入同位素內標后，經乙腈提取，離心，取上清液經固相萃取柱凈化，采用液相色譜-串聯質譜儀測定，內標法定量。

3試劑和材料

除另行規定外，本實驗所用試劑均為分析純，水為GB/T

6682規定的一級水。

3.1

試劑

3.1.1

甲醇（CH3OH）：質譜級。

3.1.2

乙腈（CH3CN）：質譜級。

3.1.3

氨水（NH4OH）：色譜級。

3.2

試劑配制

0.05%

氨水溶液（V/V）：取氨水（3.1.3）0.5mL用水稀釋至1000

mL。

3.3

標準品

辛基酚、正辛基酚、壬基酚、正壬基酚、雙酚A標準物質和辛基酚-13C6、正辛基酚-D17、壬基酚-13C6、正壬基酚-D4、雙酚A

-D4同位素內標的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量見附錄A表A.1，純度≥98%。

3.4

標準溶液配制

3.4.1標準儲備溶液（100

mg/L）：分別稱取辛基酚、正辛基酚、壬基酚、正壬基酚和雙酚A標準物質（3.3）10

mg（精確至0.000

g），用甲醇（3.1.1）溶解，并轉移至100

mL容量瓶中，定容至刻度，標準儲備液濃度為100

mg/L。溶液轉移至試劑瓶中，貯存于-20

℃冰箱中，有效期12個月。

3.4.2混合標準中間溶液（1

mg/L）：分別準確吸取辛基酚、正辛基酚、壬基酚、正壬基酚和雙酚A標準儲備液(100

mg/L)(3.4.1)

mL至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，制成1

mg/L的混合標準中間溶液，溶液轉移至試劑瓶中，置于4

℃冰箱中保存，有效期3個月。

3.4.3同位素內標標準儲備溶液（100

mg/L）：分別稱取辛基酚-13C6、正辛基酚-D17、壬基酚-13C6、正壬基酚-D4、雙酚A

-D4同位素內標（3.3）10

mg（精確至0.000

g），用甲醇（3.1.1）溶解，并轉移至100

mL容量瓶中，定容至刻度，標準儲備液濃度為100

mg/L。溶液轉移至試劑瓶中，貯存于-20

℃冰箱中，有效期12個月。

3.4.4同位素內標混合標準中間溶液（1

mg/L）：分別準確吸取辛基酚-13C6、正辛基酚-D17、壬基酚-13C6、正壬基酚-D4、雙酚A

-D4同位素內標標準儲備液(100

mg/L)(3.4.3)各1

mL至100

mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，制成1

mg/L的混合標準中間溶液，溶液轉移至試劑瓶中，置于4

℃冰箱中保存，有效期3個月。

3.4.5

同位素內標混合標準工作液（100

μg/L）：分別準確吸取同位素內標標準儲備液(1

mg/L)(3.4.4)各1

mL至10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，制成100

μg

/L的混合標準工作液。臨用時配制。

3.4.6混合標準工作溶液：分別準確吸取混合標準中間液

(1

mg/L)(3.4.2)適量，加入同位素內標混合標準中間溶液（1

mg/L）(3.4.4)，使辛基酚、正辛基酚、壬基酚、正壬基酚和雙酚A濃度分別為0.5

μg/L、1

μg/L、5

μg/L、10

μg/L、20

μg/L和50

μg/L的混合標準系列工作溶液。臨用時配制。

3.5

材料

固相萃取小柱（官能化聚苯乙烯/二乙烯苯萃取柱）：200

mg，6

mL。

儀器和設備

4.1高效液相色譜-串聯質譜儀，配電噴霧（ESI）離子源。

4.2天平：感量分別為0.001g和0.000

g。

4.3渦旋混合器。

4.4

離心機：轉速≥8000

r/min。

4.5

超聲波清洗器。

分析步驟

5.1

試樣制備

5.1.1

乳粉、米粉：試樣混合均勻，密封并標明標記，于-20℃冰箱冷藏保存。

5.1.2

禽蛋：取代表性試樣約200

g，去殼后用組織勻漿機攪拌均勻，裝入潔凈容器中，密封并標明標記，于-20

℃冰箱中冷藏保存。

5.1.3水產品、畜肉：取代表性試樣約200

g，用勻漿機勻漿均勻，裝入潔凈容器中，密封并標明標記，于-20

℃冰箱中冷藏保存。

5.1.4

植物油：試樣混合均勻，裝入潔凈容器中，密封并標明標記，于-20

℃冰箱中冷藏保存。

5.1.5

罐頭食品：取罐頭中固形物試樣約50

g,用勻漿機勻漿均勻，裝入潔凈容器中，密封并標明標記，于-20

℃冰箱中冷藏保存。

冷藏保存后的樣品解凍后需再次經勻漿機均質后使用。

5.2

提取

準確稱取1

g（精確至0.001

g）樣品于15

mL具塞玻璃試管中，加入0.1mL同位素內標混合標準工作液（100

μg/L）(3.4.5)

和5

mL乙腈（3.1.2），渦旋混勻，超聲提取15

min，8000

r/min離心5

min，取上層乙腈相；殘留部分再用5

mL

乙腈重復提取一次，合并乙腈相，置冰箱-20℃冷凍2h，取出于8000

r/min離心5

min，取上清液待凈化。

5.3

凈化

取固相萃取柱（3.5），使用前用18

mL甲醇活化，6mL水平衡。將5.2項所得上清液加30

mL水稀釋,充分搖勻后以1

mL/min~2

mL/min的速度上樣，棄去濾液，用12

mL60

%甲醇水溶液（V/V）淋洗，棄去淋洗液，再用6

mL乙腈洗脫，洗脫液于50℃用氮氣吹至近干。用1

mL甲醇溶解殘渣，待測。

5.4

空白試驗

除不加樣品外，采用相同的分析步驟進行操作。

5.5儀器參考條件

5.5.1色譜條件

a)

分析柱：

C18

柱（3

μm，50

mm

×

mm），或性能相當者；捕集柱：

C18

柱（5

μm，50

mm

×

4.6

mm），或性能相當者；捕集柱位于進樣閥之前。

b）流動相：A為0.05%氨水溶液（3.2），B為甲醇（3.1.1），洗脫梯度見表1。

c）流速：400

μL/min。

d)

柱溫：30℃。

e)

進樣量：10

μL。

表1

梯度洗脫程序表

時間（min）

A(%)

B(%)

0

14.5

14.51

5.5.2

質譜條件

a)

離子源：電噴霧離子源（ESI源）。

b)

檢測方式：多反應離子監測（MRM）。

c)

碰撞氣為高純氮氣，干燥氣、霧化氣、鞘氣等均為氮氣或其他合適氣體，使用前應調節相應參數使質譜靈敏度達到檢測要求，毛細管電壓、干燥氣溫度、鞘氣溫度、鞘氣流量、噴嘴電壓、碰撞能量、碎裂電壓等參數應優化至最佳靈敏度，監測離子對和定量離子對等信息詳見附錄B。

5.6

定性測定

按照超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜條件測定試樣和標準工作溶液，記錄試樣和標準溶液中各化合物的色譜保留時間，當試樣中檢出與某標準品色譜峰保留時間一致的色譜峰（變化范圍在±2.5%之內），并且試樣色譜圖中所選擇的監測離子對的相對豐度比與相當濃度標準溶液的離子相對豐度比（k）的偏差不超過表2規定的范圍，可以確定試樣中檢出相應化合物。

表2

定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差

相對離子豐度（%）

k＞50%

50%≥k＞20%

20%≥k＞10%

k≤10%

允許的最大偏差（%）

±

±

±

±

5.7定量測定

5.7.1標準曲線的制作

將混合標準工作溶液（3.4.6）分別按儀器參考條件（5.5）進行測定，得到目標化合物峰面積與內標峰面積的比值，根據標準曲線得到待測液中目標化合物的濃度。

對照品色譜圖參見附錄C。

5.7.2試樣溶液的測定

將試樣溶液（5.3）按儀器參考條件（5.5）進行測定，得到相應的樣品溶液的色譜峰面積。根據標準曲線得到待測液中組分的濃度，平行測定次數不少于兩次；樣品中各待測組分的響應值應在標準曲線的線性響應范圍內，若超出標準曲線線性范圍，應用甲醇（3.1.1）稀釋后進行分析。

結果計算

結果按式（1）計算：

…………………………………………（1）

式中：

X—試樣中某種組分的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；

c—由標準曲線得出的樣液中某種組分的濃度，單位為納克每毫升（μg/L）；

co——由標準曲線計算得到的過程空白樣品中某種組分的濃度，單位為微克每升（μg/L）

V—試樣溶液定容體積，單位為毫升（mL）；

m—試樣稱取的質量，單位為克（g）；

f—稀釋因子。

計算結果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示,結果保留三位有效數字。

精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的20%。

8檢出限和定量限

當稱樣量為1

g，定容體積為1

mL時，本方法中辛基酚、正辛基酚、壬基酚、正壬基酚和雙酚A的檢出限均為1.0μg/kg，定量限均為2.0μg/kg。

9其他

9.1實驗中所用的器具均為玻璃材質，液相色譜-串聯質譜儀的管線均為不銹鋼或聚四氟乙烯材質。

9.2

嚴格控制試劑空白，空白值應不得對檢測結果產生明顯影響，否則扣除空白時會引起較大的誤差。

附錄A

辛基酚等5種酚類物質相關信息

表A.1

辛基酚等5種酚類物質英文名稱、中文名稱、分子式、CAS號、相對分子質量

序號

中文名稱

英文名稱

CAS登錄號

分子式

相對分子量

辛基酚

4-tert-Octyl

phenol

140-66-9

C14H22O

206.33

正辛基酚

4-n-Octyl

phenol

1806-26-4

C14H22O

206.33

壬基酚

Nonylphenol

25154-52-3

C15H24O

220.35

正壬基酚

4-n-Nonylphenol

104-40-5

C15H24O

220.35

雙酚A

Bisphenol

A

80-05-7

C15H16O2

228.29

辛基酚-13C6

4-tert-Octylphenol-13C6

1173020-24-0

C14H22O

212.28

正辛基酚-D17

4-n-Octyl

phenol-D17

1219794-55-4

CD3(CD2)7C6H4OH

223.43

壬基酚-13C6

3,6,3-Nonylphenol-13C6

1173020-38-6

C15H24O

226.40

正壬基酚-D4

4-n-Nonylphenol

-2,3,5,6-D4,OD

358730-95-7

C15H19D5O

225.38

雙酚A-D4

Bisphenol

A

-3,3’,5,5’-D4

347841-41-2

C15H12

D4O2

232.31

附錄B

超高效液相-三重四極桿串聯質譜參考條件

質譜參考條件

a）電離方式：電噴霧負離子模式；

b）檢測方式：多反應監測（MRM）；

c）離子源溫度(TEM):650℃;

d）霧化氣(Gas1):

55;

e）輔助氣(Gas2):

65；

f）氣簾氣(Gurtain

Gas):

20;

g）電噴霧電壓：-4500V；

h）干燥氣流速：11

L/min；

i）定性離子、定量離子、碎裂電壓和碰撞能量見表B.1。

表B.1

化合物定性、定量離子和質譜分析參數

化合物

Q1

Q3

DP/V

CE/V

辛基酚

205

133*

-80

205

117

-80

-80

正辛基酚

205

106*

-80

205

119

-80

-54

4-壬基酚

219

133*

-80

219

147

-80

4-正壬基酚

219

106*

-80

219

119

-80

雙酚A

227

212*

-80

227

133

-80

辛基酚-13C6

211

139*

-73

正辛基酚-D17

222

108*

-80

壬基酚-13C6

225.1

138.9*

-90

正壬基酚-D4

223

110*

-80

雙酚A-D4

231

216*

-80

*

定量離子。

附錄C

超高效液相-三重四極桿串聯質譜標準品色譜圖

雙酚A

雙酚A-D4

B.2

B.1

壬基酚-13C6

4-壬基酚

B.4

B.3

4-正壬基酚

壬基酚-D4

B.6

B.5

對辛基酚-13C6

4-辛基酚

B.8

B.7

4-正辛基酚

辛基酚-D17

B.10

B.9

0.01

μg/mL混合標準溶液中各化合物MRM色譜圖

圖C.1

雙酚A；圖C.2

雙酚A-D4；圖C.壬基酚；圖C.4壬基酚-13C6；圖C.5正壬基酚；圖C.6

正壬基酚-D4；圖C.7辛基酚；圖C.8

辛基酚-13C6；圖C.9正辛基酚；圖C.10

正辛基酚-D17

本方法負責起草單位：中國食品藥品檢定研究院。

方法驗證單位：北京市疾病預防控制中心、國家食品安全風險評估中心、陜西省食品藥品監督檢驗研究院、中國肉類食品綜合研究中心、遼寧省食品檢驗檢測院、湖北省食品質量安全監督檢驗研究院。

方法主要起草人：寧霄、金紹明、邵兵、黃傳峰、曹進、丁宏、張爍。