豆制品、火鍋、麻辣燙等食品中喹諾酮類化合物的測定

BJS

201909

范圍

本標準規定了豆腐、豆干、火鍋底料、麻辣燙底料及火鍋和麻辣燙的食材中諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星的高效液相色譜-串聯質譜檢測法。

本標準適用于豆腐、豆干、火鍋底料、麻辣燙底料及火鍋和麻辣燙的食材中諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星的測定和確證。

原理

采用0.1

mol/L

EDTA-Mcllvaine

緩沖溶液提取樣品中的喹諾酮類化合物，經離心和過濾后，上清液經HLB固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜-串聯質譜儀檢測和確證，內標法定量。

試劑和材料

以下所用的試劑，除特別注明外均為分析純，水為GB/T

6682規定的一級水。

3.1

乙腈（CH3CN）：色譜純。

3.2

甲醇（CH3OH）：色譜純。

3.3

甲酸（CHOOH）：色譜純。

3.4

甲醇（CH3OH）。

3.5

氨水（NH4OH）：濃度25%～28%。

3.6

乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2Na2O8·2H2O）。

3.7

檸檬酸（C6H8O7·H2O）。

3.8

磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）。

3.9

氫氧化鈉（NaOH）。

3.10

鹽酸（HCl）：含HCI

38%。

3.11

乙酸銨（CH3COONH4）：色譜純。

3.12

磷酸氫二鈉溶液（0.2

mol/L）：稱取71.63

g磷酸氫二鈉（3.8），用水溶解并定容至1000

mL。

3.13

檸檬酸溶液（0.1

mol/L）：稱取21.01

g檸檬酸（3.7），用水溶解并定容至1000

mL。

3.14

Mcllvaine緩沖溶液：將1000

mL

0.1

mol/L檸檬酸溶液（3.13）與625

mL

0.2

mol/L磷酸氫二鈉溶液（3.12）混合，用鹽酸或氫氧化鈉調節pH至4.0±0.1。

3.15

EDTA-Mcllvaine

緩沖溶液（0.1

mol/L）：稱取60.5g乙二胺四乙酸二鈉（3.6）至1625mL

Mcllvaine緩沖溶液（3.14）中，超聲使其溶解。

3.16

5%甲醇水溶液：取5

mL甲醇（3.4），用水稀釋至100

mL。

3.17

25%氨水甲醇溶液：取25

mL氨水（3.5），用甲醇（3.4）稀釋至100

mL。

3.18

標準品：標準品中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質量見附錄A表A.1，純度≥99%。

3.19

標準儲備液配制：分別精密稱取標準品（3.18）約10

mg，置10

mL容量瓶中，加入0.2

mL甲酸（3.3），超聲使溶解，用乙腈（3.1）定容至刻度，搖勻，配制成濃度為1.0

mg/mL的標準儲備液，轉移至溶劑瓶中于-18℃以下避光保存，有效期6個月。

3.20

混合標準溶液的配制：準確吸取標準儲備液（3.19）1

mL于100

mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成濃度為0.01

mg/mL的混合標準溶液（環丙沙星、沙拉沙星濃度約0.015mg/mL），于4℃以下避光保存，有效期3個月。

3.21

混合標準中間溶液的配制：準確吸取混合標準溶液（3.20）1

mL至10

mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成濃度為1.0

μg/mL的混合標準中間溶液（環丙沙星、沙拉沙星濃度約1.5

μg/mL），于4℃以下避光保存，臨用新配。

3.22

內標標準儲備液配制：分別稱取氘代同位素標準品（3.18）約10

mg，至10

mL容量瓶中，加入0.2

mL甲酸（3.3），超聲溶解，用乙腈（3.1）稀釋至刻度，配制成濃度為1.0

mg/mL的標準儲備液，于-18℃以下避光保存，有效期6個月。

3.23

混合內標標準中間溶液的配制：準確吸取內標標準儲備液（3.22）0.01mL于10

mL容量瓶中，用甲醇（3.2）定容至刻度，配制成濃度為1.0

μg/mL的混合內標標準中間溶液，于4℃以下避光保存，臨用新配。

3.24

固相萃取小柱（500

mg，6

mL）：HLB柱或相當者。使用前依次以6

mL甲醇、6mL水活化，保持柱體濕潤。

儀器和設備

4.1

液相色譜-串聯質譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）。

4.2

分析天平：感量0.001g和0.00001

g。

4.3

渦旋振蕩器

4.4超聲儀

4.5離心機：轉速≥8000

r/min

4.6

均質器

4.7

氮氣濃縮儀

測定步驟

5.1

試樣制備與保存

豆制品、火鍋和麻辣燙的食材

從待檢樣品中取出樣品約500g，用組織搗碎機充分搗碎混勻，裝入潔凈容器中，密封，并標明標記，于-18℃冷凍存放。

火鍋底料、麻辣燙底料

固體狀：從待檢樣品中取出樣品約500g，用組織搗碎機充分搗碎混勻，裝入潔凈容器中，密封，并標明標記，于4℃冷藏存放。

半固體狀：從待檢樣品中取出樣品約500g，放入研缽中，迅速研磨均勻，裝入潔凈容器中，密封，并標明標記于4℃冷藏存放。

液體狀：從待檢樣品中取出樣品約500g，攪拌均勻后裝入潔凈容器中，密封，并標明標記，于4℃冷藏存放。

5.2

樣品溶液制備

提取：稱取5.0

g均勻樣品（精確至0.001g），置50

mL離心管中，精密加入混合內標標準中間溶液（3.23）0.1mL，加入20

mL

0.1

mol/L

EDTA-Mcllvaine

緩沖溶液（3.15），渦旋混勻1min，超聲提取15

min，8000

r/min離心5

min，上清液轉移至50

mL容量瓶中，殘渣用EDTA-Mcllvaine

緩沖溶液（3.15）同法重復提取兩次，每次10

mL，合并上清液至同一容量瓶中，用EDTA-Mcllvaine

緩沖溶液（3.15）定容至刻度，混勻。用濾紙過濾（必要時10000

r/min離心5

min后過濾），續濾液待凈化。

凈化：精密吸取上述待凈化液25.0

mL，以約1

mL/min的流速全部通過固相小柱（3.24），用3

mL

5%甲醇水溶液（3.16）淋洗，抽干，先后以6

mL甲醇、3

mL氨水甲醇（3.17）洗脫，合并甲醇及氨水甲醇洗脫液，45

℃氮吹至近干，準確加入2.0

mL流動相初始比例復溶液溶解殘渣，過0.22

μm濾膜，續濾液供液相色譜-串聯質譜儀分析。

5.3

基質標準工作溶液的制備

稱取5.0

g空白試樣（精確至0.001g），置50

mL離心管中，除不加入混合內標標準中間溶液外，其余同5.2操作處理后得到空白基質，共制備6份。

分別精密吸取混合標準中間溶液（3.21）0

mL、0.010

mL、0.020

mL、0.050

mL、0.100

mL、0.200

mL及混合內標標準中間溶液（3.23）0.025

mL于試管中，氮吹至近干，精密加入1.0

mL空白基質復溶，過0.22

μm濾膜，制成濃度為0

ng/mL、10

ng/mL、20

ng/mL、50

ng/mL、100

ng/mL、200

ng/mL的基質標準工作溶液（環丙沙星、沙拉沙星濃度為0

ng/mL、15

ng/mL、30

ng/mL、75

ng/mL、150

ng/mL、300

ng/mL，同位素內標濃度約25ng/mL）。

5.4

測定

5.4.1

液相色譜參考條件

1）

色譜柱：C18色譜柱，2.1

mm×50

mm×1.7

μm，或性能相當者。

2）

柱溫：40℃。

3）

流速：0.25

mL/min。

4）

進樣量：2

μL。

5）

流動相：A-5

mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸），B-乙腈。梯度洗脫條件見表1。

表1

梯度洗脫條件

時間（min）

A(%)

B(%)

0

10.5

13.1

5.4.2

質譜參考條件

1）

電離方式：電噴霧電離（ESI）；

2）

掃描方式：正離子掃描；

3）

檢測方式：多反應監測MRM；

4）

離子源參數參考條件：

離子源接口電壓，4000

V；離子源接口溫度，350

℃；脫溶劑溫度，250

℃；離子源加熱溫度，400

℃；霧化氣流速，2.9

L/min；干燥氣流速，10.0

L/min；加熱氣流速，10.0

L/min。

5）定性離子對、定量離子對參見表2。

表2

喹諾酮類藥物主要質譜參數

序號

組分

母離子

子離子

Q1

預四極桿電壓

碰撞電壓

Q3

預四極桿電壓

（m/z）

（m/z）

（V）

(V)

（eV）

諾氟沙星

320.2

*302.0

231.1

氧氟沙星

362.2

*318.2

261.1

洛美沙星

352.0

*265.0

308.0

培氟沙星

334.0

290.1

*316.2

氟羅沙星

370.0

*326.0

269.0

沙拉沙星

386.2

342.0

299.1

*368.1

雙氟沙星

400.0

*356.0

299.0

司帕沙星

393.0

*349.0

292.0

環丙沙星

332.1

*314.1

287.8

231.0

達氟沙星

358.0

*340.1

283.2

82.1

恩諾沙星

360.0

*342.1

316.0

245.2

D8-環丙沙星

340.3

322.1

D5-恩諾沙星

365.1

321.1

D5-諾氟沙星

325.3

307.2

注：1.“*”表示定量離子；2.所列質譜參考條件是在島津（LC/MS-8050）質譜儀上完成的，此處所列試驗用儀器型號僅供參考，不涉及商業目的，鼓勵方法使用者嘗試不同廠家或型號的儀器；3.對不同質譜儀，儀器參數可能存在差異，測定前應將質譜參數優化到最佳；4.由于喹諾酮類化合物離子化受基質干擾較為

顯著，方法使用者可根據實際情況選擇表中所列離子對進行定性定量測定。

5.4.3

標準曲線繪制

取基質標準工作溶液（5.3）按濃度由低到高依次進樣檢測，內標法繪制標準曲線。

5.5

定性

在相同實驗條件下，試樣中待測物質的保留時間與標準工作溶液中對應的保留時間偏差應在±2.5%之內；且試樣譜圖中各組分定性離子的相對豐度與標準工作溶液定性離子的相對豐度，其允許偏差不超過表3規定的范圍時，則可確定為樣品中存在此種待測物。基質標準溶液多反應監測（MRM）典型圖譜見附錄B。

表3

定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差

相對離子豐度，%

＞50%

＞20%～50%

＞10%～20%

≤10%

允許的相對偏差，%

±20%

±25%

±30%

±50%

5.6

定量

待測樣液中喹諾酮藥物的響應值應在標準曲線線性范圍內，諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、氟羅沙星以氘代諾氟沙星為內標，洛美沙星、雙氟沙星、環丙沙星、達氟沙星以氘代環丙沙星為內標，司帕沙星、沙拉沙星、恩諾沙星以氘代恩諾沙星為內標，內標法定量。本方法中所列內標能基本滿足方法要求，如條件允許，可采用各化合物的對應同位素化合物作為內標。

結果計算

試樣測定結果按公式（1）計算目標物的含量：

………….(1)

式中：

X——試樣中被測組分的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；

m——試樣的稱樣量，單位為克（g）；

C——由工作曲線計算得到的試樣中被測組分的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；

V——定容體積，單位為毫升（mL）。

F——稀釋倍數

計算結果需扣除空白值（空白基質），并保留三位有效數字。

檢測方法靈敏度、準確度、精密度

7.1

靈敏度

諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、雙氟沙星、司帕沙星、達氟沙星、恩諾沙星檢出限均為5

μg/kg，環丙沙星檢出限為7.5

μg/kg，沙拉沙星檢出限為7.5

μg/kg。

諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、雙氟沙星、司帕沙星、達氟沙星、恩諾沙星定量限均為15

μg/kg，環丙沙星定量限為22.5

μg/kg，沙拉沙星定量限為22.5

μg/kg。

7.2

準確度

本方法在15.0～100.0

μg/kg的添加水平上的回收率范圍為65.0%～120.0%。

7.3

精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。

附錄A

標準品信息

表A.1

標準品中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質量

序號

化合物名稱

英文名

CAS登錄號

分子式

相對分子質量

諾氟沙星

Norfloxacin

70458-96-7

C16H18FN3O3

319.33

氧氟沙星

Ofloxacin

82419-36-1

C18H20FN3O4

361.37

洛美沙星

Lomefloxacin

98079-51-7

C17H19F2N3O3

351.35

培氟沙星

Pefloxacin

70458-92-3

C17H20FN3O3

333.36

氟羅沙星

Fleroxacin

79660-72-3

C17H18F3N3O3

369.34

鹽酸沙拉沙星

Sarafloxacin

Hydrochloride

91296-87-6

C20H18ClF2N3O3

421.81

鹽酸雙氟沙星

Difloxacin

Hydrochloride

91296-86-5

C21H20ClF2N3O3

435.85

司帕沙星

Sparfloxacin

110871-86-8

C19H22F2N4O3

392.40

環丙沙星

Ciprofloxacin

85721-33-1

C17H18FN3O3

331.34

甲磺酸達氟沙星

Danofloxacin

mesylate

119478-55-6

C20H24

FN3O6S

453.48

恩諾沙星

Enrofloxacin

93106-60-6

C19H22FN3O3

359.39

D8-環丙沙星

Ciprofloxacin-d8

/

C17H10D8FN3O3

339.39

D5-恩諾沙星

Enrofloxacin-d5

/

C19H17D5FN3O3

364.37

D5-諾氟沙星

Norfloxacin-d5

/

C16H13D5FN3O3

324.37

注：市售標準品中部分為其鹽酸鹽或甲磺酸鹽。

附錄B

14種喹諾酮類化合物多反應監測（MRM）譜圖

14種喹諾酮類化合物火鍋底料基質標準溶液(100

ng/mL，氘代內標為25

ng/mL)多反應監測（MRM）譜圖

本方法負責起草單位：四川省食品藥品檢驗檢測院

方法的參與驗證單位：上海市食品藥品檢驗所、遼寧省食品藥品檢驗檢測院、深圳出入境檢驗檢疫局食品檢驗檢疫技術中心、山東省食品藥品檢驗研究院、湖北省食品藥品監督檢驗研究院。

主要起草人：余曉琴，李道霞，黃麗娟，成長玉，李澍才，唐昌云