第一篇：生化實驗心得

生化實驗心得

劉欣怡

201100140057 2011級生物基地班

我很喜歡做實驗，并且樂于鍛煉自己的動手能力。

本學期的生化實驗，雖然只從第二周上到第十五周，但是我收獲了很多并且留下了深刻的印象。對于本次實驗心得的撰寫，我將分為以下3個部分來進行：本學期實驗回顧、本學期實驗總結以及對于生化實驗課的支持和建議。

一、本學期實驗回顧：

本學期的生化實驗課上，我們一共進行了11次實驗，分別是Folin-酚試劑法測定血清蛋白質含量、酵母RNA的提取、醋酸纖維薄膜電泳、紫外吸收法測定RNA含量、聚酰胺薄膜層析、纖維素酶活力的測定（三硝基水楊酸法）、還原糖和總糖含量的測定（三硝基水楊酸法）、酶最適PH的測定、費林試劑熱滴定糖、肌糖原酵解作用、微量凱氏定氮法。這些實驗具有代表性，是典型的生化實驗。在這些實驗中，涵蓋了以前無機實驗和有機實驗的基礎實驗操作，還有全新的實驗操作以及實驗儀器。

在這學期的生化實驗課上，我既復習并熟練了大一無機實驗和有機實驗的基本實驗操作和儀器（比如移液管、滴定管、蒸餾等），又學習并掌握了許多新操作以及新儀器的使用，比如紫外分光光度計、離心機、聚酰胺薄膜、熱滴定、凱氏定氮儀器等。最重要的是，我學習并掌握了一些重要的實驗方法和原理，比如Folin-酚試劑法、紫外吸收法、三硝基水楊酸法、費林試劑與糖的反應、微量凱氏定氮法等。掌握了這些實驗原理以及方法，有利于我們在以后中靈活運用設計實驗。

總體來說，本學期生化實驗教會了我測定蛋白質、糖、核酸的方法，電泳和層析分離物質、如何測定酶的相關特性、驗證肌糖原酵解作用、如何提取RNA。

二、本學期實驗總結

通過這學期的生化實驗，我的實驗技能的到了大大地提升，同時，實驗中的細節、注意事項以及老師拓展的知識令我獲益匪淺，也讓我深深地認識到科學是非常嚴謹的，尤其是在做實驗的時候，要全神貫注，井井有條，否則很容易出差錯，而這個小小的差錯很有可能就使實驗前功盡棄，既耽誤時間又浪費試劑。

回顧這一學期我的實驗課程，每一次我都能完成實驗任務。大多數都比較順利，小組內兩人也大多配合默契，但是有一些美中不足的地方。有的一些實驗比較麻煩，實驗步驟較為繁瑣，我們在做實驗時偶爾會產生不耐煩的思想，只想著抓緊結束，但是在這種時候往往更容易出差錯。我有兩次記憶很深，一次是在測定纖維素酶活力（三硝基水楊酸法）時，沒能及時貼上空白標簽，導致又重新制作空白，拜拜浪費了時間；另一次是在鑒定肌糖原酵解作用時，實驗步驟較為繁瑣，并且老師對黑板上的簡易實驗步驟進行了多個補充，其中一點是要在水浴后取出大塊肉再加下一步驟的試劑，結果我們當時產生了不耐煩情緒，就直接加了試劑而沒有取出大肉塊。對于這兩次情況，雖然對最終的實驗結果沒有產生什么明顯的影響，但是，它實實在在體現了自己的操作并不是很嚴謹，需要注意和努力。

在本學期生化實驗報告的撰寫中，我重點注意老師強調的實驗分析部分。上課認真聽老師的實驗講解并認真記錄有關的可能實驗結果的分析。在課后撰寫實驗報告時對這些點重點分析和總結，有時甚至是查找相關資料然后再進行分析。通過這一些列的做法，我的實驗分析能力得到了提升，我能在討論實驗結果或者實驗操作時找到更好、更精確的切入點，能得出更好的結論。

同時，本學期老師將我們分為兩人一組來進行實驗，兩人之間的磨合和合作是一種鍛煉，對今后很有幫助。

三、對于生化實驗課的支持和建議

我非常感謝老師在這一學期中的辛勤勞動。老師在課前為我們做好實驗準備很不容易，配試劑等都很辛苦。謝謝老師您了。

我覺得咱們的額生化實驗課設計的挺好的。兩人一組可以分工合作，加快實驗效率，同時又避免了因為同組同學人數多而有的同學無事可做的現象。老師在課上講解實驗時，有關實驗步驟、實驗可能結果、實驗注意事項的分析、講解和拓展令我獲益匪淺，有利于培養我的實驗思維并且拓寬了知識視野。

建議方面，我想和老師提的一點建議其實是有關實驗器材方面的。對于老師所提到的有關節約試劑、減少材料浪費等事項我非常贊同，并且大多數時候器材和試劑都很全（這和大一的無機實驗和有機實驗相比條件進步了很多），只是希望咱們的一些其他實驗儀器能更全面一點，舉一個例子，可以使用的紫外分光光度計只有3臺，有些過少，實驗中要等待的時間較長，并且有的儀器還不是很準確，對于我們的實驗造成了一定的困擾，希望老師能將實驗室內有些問題的儀器同一修一修。

總之，我很喜歡咱們的生化實驗課，并且從中學到了很多知識、實驗方法和應用，鍛煉了實驗操作，形成了實驗要耐心、細心、恒心的觀念。同時還培養了團隊意識和合作觀念。我獲益匪淺。

第二篇：生化實驗

1．火

（1）酒精及其它可溶于水的液體著火時，可用水滅火

（2）汽油、乙醚、甲苯等有機溶劑著火時，應用石棉布或砂土撲滅，絕對不能用水，否則反而會擴大燃燒面積。

（3）電起火，不能用水和二氧化碳滅火器，應切斷電源或用四氯化碳滅火器。2．燒傷

（1）強堿燒傷：先用大量水沖洗，再用5%的硼酸溶液和2%的乙酸溶液沖洗。（2）強酸燒傷：先用大量水沖洗，再用5%的碳酸氫鈉或5%的氫氧化銨沖洗。

氨基酸的分離鑒定紙層析法

紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。層析溶劑由有機溶劑和水組成。物質被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值（比移）來表示的：

在一定的條件下某種物質的Rf值是常數。Rf值的大小與物質的結構、性質、溶劑系統；層析濾紙的質量和層析溫度等因素有關。本實驗利用紙層析法分離氨基酸。

在操作過程中，手不要摸濾紙。點樣直徑不超過3mm。

點樣的一端朝下, 擴展劑的液面需低于點樣線1cm。

即時取出濾紙, 以免出現氨基酸層析跑到濾紙的外面不能檢測。

蛋白質及氨基酸的呈色反應 雙縮脲反應

紫紅色

肽鍵 可用于蛋白質的定性或定量測定 一切蛋白質或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應，但有雙縮脲反應的物質不一定都是蛋白質或多肽。茚三酮反應

除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應產生黃色物質外，所有α—氨基酸及一切蛋白質都能和茚三酮反應生成藍紫色物質。此反應的適宜pH為5~7，同一濃度的蛋白質或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色。

與茚三酮呈陽性反應的不一定就是蛋白質或氨基酸。在定性、定量測定中，應嚴防干擾物存在。該反應十分靈敏，1∶1 500 000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應，是一種常用的氨基酸定量測定方法。茚三酮反應分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質。黃色反應

含有苯環結構的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質，該化合物在堿性溶液中進一步形成橙黃色的硝醌酸鈉。苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應。

坂口反應

與精氨酸反應呈紅色，精氨酸是唯一呈此反應的氨基酸，反應極為靈敏 醋酸鉛反應

蛋白質分子中常含有半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白質在強堿條件下，可分解形成硫化鈉。硫化鈉和醋酸鉛反應生成黑色的硫化鉛沉淀。若加入濃鹽酸，就生成有臭味的硫化氫氣體。

蛋白質分子中常含有半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白質在強堿條件下，可分解形成硫化鈉。硫化鈉和醋酸鉛反應生成黑色的硫化鉛沉淀。若加入濃鹽酸，就生成有臭味的硫化氫氣體。

蛋白質的等電點測定和沉淀反應

當溶液的pH達到一定數值時，蛋白質顆粒上正負電荷的數目相等，在電場中，蛋白質既不向陰極移動，也不向陽極移動，此時溶液pH值稱為此種蛋白質的等電點。

用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制成各種不同pH值的緩沖液。向緩沖液溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點 蛋白質的沉淀反應

在水溶液中的蛋白質分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質顆粒可因失去電荷和脫水而沉淀。蛋白質的沉淀反應可分為兩類。

（1）可逆的沉淀的反應

此時蛋白質分子的結構尚未發生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質的沉淀仍能溶解于原來的溶劑中，并保持其天然性質而不變性。如大多數蛋白質的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時間作用于蛋白質。提純蛋白質時，常利用此類反應。

（2）不可逆沉淀反應

此時蛋白質分子內部結構發生重大改變，蛋白質常變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。加熱引起的蛋白質沉淀與凝固，蛋白質與重金屬離子或某些有機酸的反應都屬于此類。

蛋白質變性后，有時由于維持溶液穩定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質并不一定都表現為沉淀，而沉淀的蛋白質也未必都已變性。

考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度

考馬斯亮藍G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰(max)位置由465 nm變為595 nm，溶液顏色也由棕黑色變為藍色。通過測定595 nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。吸光度與蛋白質含量成正比。靈敏度高，測定快速簡便，干擾物質少。

微量凱氏定氮法

有機物與濃硫酸共熱，有機氮轉變為無機氮（氨），氨與硫酸作用生成硫酸氨，后者與強堿作用釋放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此過量酸液被中和的程度，即可計算出樣品的含氮量。

中和程度用滴定法來判斷，分回滴法和直接法兩種。

（1）回滴法：用過量的標準酸吸收氨，其剩余的酸可用標準NaOH滴定，由鹽酸量減去滴定所耗NaOH的量即為被吸收的氨之量。此法采用甲基紅做指示劑。

（2）直接法：用硼酸作為氨的吸收溶液，結果使溶液中[H+]降低，混合指示劑（PH4.3－5.4），黑紫色變為綠色。再用標準酸來滴定，使硼酸恢復到原來的氫離子濃度為止，指示劑出來淡紫色為終點，此時所耗的鹽酸量即為氨的量。

樣液：1g卵清蛋白溶于0.9%NaCl液，并稀釋至100ml。如有不溶物，離心取上清液備用。

醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白質

本實驗是以醋酸纖維素薄膜作為支持體的區帶電泳。

方法是將少量新鮮血清用點樣器點在浸有緩沖液的乙酸纖維素薄膜上，薄膜兩端經過濾紙與電泳槽中緩沖液相連，所用緩沖液pH值為8.6，血清蛋白質在此緩沖液中均帶負電荷，在電場中向正極泳動。

由于血清中不同蛋白質帶有的電荷數量及分子量不同而泳動速度不同。帶電荷多及分子量小者泳動速度快；帶電荷少及分子量大者泳動速度慢，從而彼此分離。

電泳后，將薄膜取出，經染色和漂洗，薄膜上顯示出五條藍色區帶，每條帶代表一種蛋白質，按泳動快慢順序，一般經漂洗后，薄膜上可呈現清晰的5條區帶，由正極端起，依次為清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。

經洗脫比色觀察不同蛋白質的區帶。

1、醋酸纖維素薄膜一定要充分浸透后才能點樣。點樣后電泳槽一定要密閉。電流不宜過大，以防止薄膜干燥，電泳圖譜出現條痕。

2、緩沖溶液離子強度不應小于0.05或大于0.07。因為過小可使區帶拖尾，過大則使區帶過于緊密。

3、電泳槽中緩沖液要保持清潔(數天過濾)兩極溶液要交替使用；最好將連接正、負極的線路調換使用。

4、通電過程中，不準取出或放入薄膜。通電完畢后，應先斷開電源后再取薄膜，以免觸電。

酶的特性

溫度對酶活力的影響

大多數動物酶的最適溫度為37－40℃，植物酶的最適溫度為50－60℃。高溫失活，低溫能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。pH對酶活性的影響

唾液淀粉酶的最適pH約為6.8。唾液淀粉酶的活化和抑制

酶的活性受活化劑或抑制劑的影響。氯離子為唾液淀粉酶的活化劑，銅離子為其抑制劑。

血糖的定量測定

動物血液中的糖主要是葡萄糖，其含量較恒定。用硫酸鋅和氫氧化鈉除去被檢測血中的蛋白質制成無蛋白血濾液。當將血濾液與標準鐵氰化鉀溶液共熱時,一部分鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，并與鋅離子生成不溶性化合物。

向混合物中加入碘化物后，用硫代硫酸鈉溶液滴定所釋放的碘。即可知剩余的鐵氰化鉀量。血糖越多，剩余的鐵氰化鉀越少，所消耗的硫代硫酸鈉也越少。硫代硫酸鈉溶液用量與血糖的關系可以由經驗確定下來的數字表查出。對照組要多一些，且要先查表再相減

脂肪酸的β－氧化

樣品中丙酮的含量=(V1-V2)x C Na2S2O3 x 1/6 V1—滴定對照所消耗的Na2S2O3 的體積 V2—滴定樣品所消耗的Na2S2O3 的體積 C—Na2S2O3 的濃度

維生素C的定量測定

2，6-二氯酚靛酚滴定法

用藍色的堿性染料標準溶液,對含維生素 C的酸性浸出液進行氧化還原滴定,染料被還原為無色,當到達滴定終點時,多余的染料在酸性介質中則表現為淺紅色,如無其他干擾物質存在，樣品提取液所還原的標準染料量與樣品中所含的還原性抗壞血酸量成正比。

過氧化物酶的作用 過氧化物酶能催化過氧化氫釋出新生氧以氧化某些酚類和胺類物質，例如氧化溶于水中的焦性沒食子酸生成不溶于水的焦性沒食子橙（橙紅色）；氧化愈創木脂中的愈創木酸成為藍色的愈創木酸的臭氧化物。

目前測定蛋白質含量的方法有很多種，下面列出根據蛋白質不同性質建立的一些蛋白質測定方法：

物理性質：紫外分光光度法。

化學性質：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法等。染色性質：考馬斯亮藍染色法、銀染法。其他性質：熒光法。

一、凱氏定氮法： 根據蛋白質的含氮量來測定蛋白質的含量

公式:每g樣品中含氮克數 × 6.25 ×100

二、比色法：利用蛋白質與不同試劑的呈色反應，測定蛋白質的含量，如雙縮尿法和酚試劑法（lowry’s method）。

三、紫外分光光度法：利用蛋白質對280nm紫外光有最大的吸光度而采用

第三篇：生化實驗計劃

2016-2017學年第一學期生物化學教研室實驗室工作計劃

一、指導思想

堅持以鄧小平理論和“三個代表”的重要思想及科學發展觀為指導，踐行社會主義核心價值觀,開展教育教學改革，全力推進以高等衛生職業教育為核心的素質教育，抓好教育教學管理工作。

二、工作計劃

（一）實驗室日常管理計劃

1、牢固樹立“教學中心”意識，對實驗室的儀器耗材進行精確登記備案，以便為《生物化學》實驗做好后勤服務。

2、嚴格執行儀器使用人使用儀器必須登記的規章制度。

3、嚴格執行及時更新實驗耗材的規章制度。

4、嚴格執行實驗安全條例，做好實驗室安全意識宣講，做到實驗室安全零事故。

5、嚴格執行實驗室值日制度。

6、嚴格執行實驗室衛生制度，保持實驗室衛生整潔，給學生提供一個良好的實驗環境。

7、嚴格執行學院規定及時批改實驗報告。

8、切實做好實驗課的示教工作。

（二）實驗室師資隊伍建設

1、開展政治學習和業務學習，特別是學習社會主義核心價值體系和人才培養水平評估標準，提高教師的政治品德和業務素養，組織教師開展高等衛生職業教育理念討論，切實轉變教學理念，改變教學方式，提高教學水平。

2、加強實驗指導教師的管理和培養，提高實驗實訓的準備能力和指導水平。

3、加強實驗指導教師的安全責任意識。

生物化學教研室 2016年9月

第四篇：生化實驗總結

一、實驗技術

1.關于糖：本學期我們學習了兩種總糖樣品處理方法（面粉總糖酸水解以及肌糖原無氧酵解）以及兩種測定還原糖含量的方法（斐林試劑熱滴定及3，5-二硝基水楊酸法）。還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計）。

一種是費林試劑熱滴定定糖法：在沸熱條件下,用還原糖溶液滴定一定量的費林試劑時, 將費林試劑中的銅離子還原為氧化亞銅, 以亞甲基藍為指示劑, 稍過量的還原糖立即將藍色的氧化型亞甲基藍還原為無色的還原型亞甲基藍, 指示滴定終點。

另一個是3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖：還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內，還原糖的量與棕紅色物質顏色的深淺成正比關系，利用分光光度計，在540nm波長下測定光密度值，查對標準曲線并計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。

關于肌糖元酵解

2.關于蛋白質含量測定：本學期我們學習了醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白、氨基酸聚酰胺薄膜層析，以及利用溶解度差異提取血清中不同蛋白，并通過 BCA法、Folin酚法、凱氏定氮法測定蛋白質含量

3.關于酶活性學習了纖維素酶活力測定以及酶最適PH測定 4.關于稀堿法酵母核糖核酸提取以及紫外吸收法測定濃度

二、關于感悟 經過半年的生化實驗的學習讓我受益菲淺。在生化實驗課即將結束之時，總結這學期的收獲與不足。取之長、補之短，在今后的學習和工作中有所受用。

三、這半年的生化實驗主要有菲林試劑熱滴定定糖法、folin-酚法測蛋白、稀堿法提取酵母RNA、醋酸纖維薄膜電泳、RNA定量測定-UV吸收法、纖維素酶活力的測定、最適PH選取、肌糖元的酵解作用、N-末端氨基酸殘基的測定--DNS-CL法柱層析分離色素、凱式定氮法等實驗。

在這些實驗中，凱式定氮法是給我印象最深的一個實驗，因為這個實驗使我認識了改良式凱式蒸餾儀的基本結構，同樣的也讓我透過這次實驗掌握了凱式定氮法的操作技術。在這次實驗中，我和我的同組者-韓文志犯了一些錯誤，而且是很不就應犯的錯誤，我們都忘了在做實驗時要加入新的沸石，這是個很低級的錯誤，差點引起溶液的暴沸。透過這次錯誤我認識到，很多知識，即使是老師在怎樣說，它也只是理論，當我們不能把它應用到實踐中去時，它對我們都是毫無好處的。此刻更深的認識到了理論結合實際的觀點。在這次實驗中我們損壞了改良式凱式蒸餾儀，并且賠了錢，錢不是問題，重要的是操作的問題，我覺得我們在做實驗時還是對儀器不是很熟悉，做實驗時不認真。

還有一個是柱層析分離色素，這個實驗主要是掌握吸附層析的原理和操作技術，我記得這次實驗我是第二個到的實驗室，當時還很有成就感，進來后就稱菠菜，還有研磨，這是很累人的活，我覺得，因為想把它研磨的好些，又想

快點做實驗，于是就一向磨一向磨，直到做下一步時才覺得手腕有點累。我記得在加棉花時，由于不明白就應加多厚，提取色素時還很是膽戰心驚的。我覺得在這個實驗中，裝柱這一步是很重要的，于是我們很留意的裝，直到柱面很平。直到最后，分離色素后，看到我們的色帶分離的很好，很是高興。

半年實驗做下來，最“苦”的要數“菲林試劑熱滴定定糖法”這個實驗了。這個實驗要求我們正確掌握滴定管的使用方法和熱滴定的終點。由于全部滴定過程務必在沸騰狀態下快速進行，而且終點不容易把握，我們滴了好幾十次才確定了終點。當時我的同組者-韓文志已經被火烤的不行了。

在這半年的十幾次的實驗的學習中，我受益頗多。毫無疑問，它培養了我的動手潛力。每個實驗我都會親自去做，不放下每次鍛煉的機會。經過這半年，我的動手潛力有了明顯的提高；它讓我養成了課前預習的好習慣。一向以來就沒能養成課前預習的好習慣（雖然一向明白課前預習是很重要的），但經過這半年，讓我不僅僅深深的懂得課前預習的重要，更領會了課前預習的好處。只有在課前進行了認真的預習，在做實驗時效率才會更高，才能收獲的更多、掌握的更多；它還提高了我處理數據的潛力；做實驗就會有數據，有數據就要處理，數據處理的是否得當將直接影響實驗成功與否。

半年實驗雖然收獲很多，但在這中間，我也發現了我存在的很多不足。我的動手潛力還不夠強，當有些實驗需要很強的動手潛力時我還不能從容應對；我的探索方式還有待改善，當應對一些復雜的實驗時我還不能很快很好的完成；我的數據處理潛力還得提高，當眼前擺著一大堆復雜數據時我處理的方式及潛力還不足，不能用最佳的處理手段使實驗誤差減小到最小程度……總之，生化實驗課讓我收獲頗豐，同時也讓我發現了自身的不足。在實驗課上學得的，我將發揮到其它中去，也將在今后的學習和工作中不斷提高、完善；在此間發現的不足，我將努力改善，透過學習、實踐等方式不斷提高，克服那些不應成為學習、獲得知識的障礙。在今后的學習、工作中有更大的收獲，在不斷地探索中、在無私的學習、奉獻中實現自己的人身價值！

第五篇：生化實驗教案

生命科學與技術學院生化實驗（下）

生 物 化 學 實 驗（下）

實驗三 離子交換柱層析法分離氨基酸

生命科學與技術學院生化實驗（下）

華中科技大學生命科學與技術學院 2012級生物化學小老師

第三組

離子交換柱層析法分離氨基酸

【實驗目的】

1.學習離子交換樹脂分離氨基酸的基本原理。2.掌握離子交換柱層析的基本操作。3.掌握氨基酸和茚三酮顯色機理。

【實驗原理】

1.離子交換層析原理

離子交換法是通過帶電的溶質分子與離子交換劑中可交換的離子進行交換而達到分離目的的方法。

有些高分子物質含有一些可以解離的基團，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的離子產生交換反應，如：

或

這類高分子物質統稱為離子交換劑，離子交換劑是一類具有離子交換功能的高分子材料。功能基團由固定在骨架上的帶電基團與可進行交換的能移動離子兩部分組成，二者所帶電荷相反，以靜電作用結合。可進行交換的離子稱為反離子或抗衡離子，這種反離子可與溶液中帶

生命科學與技術學院生化實驗（下）

同種電荷的離子進行交換反應。因離子交換反應是可逆的，在一定條件下被交換的離子也可以“解吸”，使離子交換劑又恢復到原來的離子形式，所以離子交換劑通過交換和再生可以反復使用。其中使用的最普遍的是離子交換樹脂。由于一定離子交換劑對于不同離子的靜電引力不同，因此在洗脫過程中，不同的離子在離子交換柱上的遷移速度也不同，最后完全分離。

選擇適當的條件，可使一些溶質分子變成離子態，通過靜電作用結合到離子交換劑上，而另一些物質則不能被交換，這兩類物質即被分離。帶同種電荷的不同離子都可以結合到同一介質上，但由于各自所帶電量不同，與介質的結合牢度不同，可改變洗脫條件使它們依次先后被洗脫，從而達到分離目的。

離子交換層析是一種基于氨基酸電荷行為的層析方法。本實驗采用磺酸型陽離子交換樹脂（732型）分離酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI2.97）和堿性氨基酸賴氨酸（Lys，pI9.74）的混合液。氨基酸是兩性電解質，分子上所帶的凈電荷取決于氨基酸的等電點和溶液的pH值。在pH5.3條件下，因為pH值低于Lys的PI值，Lys可解離成陽離子結合在樹脂上；Asp可解離成陰離子，不被樹脂吸附而流出層析柱。在pH12條件下，因pH值高于Lys的pI值Lys可解離成陰離子從樹脂上被交換下來。這樣通過改變洗脫液的pH值可使它們被分別洗脫而達到分離的目的。2.茚三酮反應機理

茚三酮反應是指在加熱條件下，氨基酸或肽與茚三酮反應生成紫色（與羥脯氨酸或脯氨酸反應生成（亮黃色）化合物的反應。

該紫色化合物在570nm處有最大光吸收，所以可以利用分光光度計測量其含量。

由于該反應靈敏度高，目前已經廣泛應用于氨基酸定性和定量的分析，國內的大部分教材認為其反應機理為：

生命科學與技術學院生化實驗（下）

但是大量實驗表明而且大部分的學者認為茚三酮顯色反應生成的有色物質是混合物而不是單一組分。

茚三酮顯色反應受pH，茚三酮試劑的配制方法和濃度，氨基酸種類和濃度，反應溫度，反應時間，冷卻時間，離子強度等都有較大影響。特別要注意的是pH對顯色反應的影響特別大，且該反應在一個小時內穩定。

【實驗器材和試劑】

一、實驗器材

層析柱（20cm*1cm）；鐵架臺；恒流泵；部分收集器；分光光度計；移液槍；恒溫水浴鍋；試管；玻璃棒；燒杯；試管架。

二、實驗試劑

①732型陽離子交換樹脂（100-200目）

生命科學與技術學院生化實驗（下）

②2mol/L氫氧化鈉溶液，1mol/L氫氧化鈉溶液； ③2mol/L鹽酸溶液，0.1mol/L鹽酸溶液； ④標準氨基酸溶液

天冬氨酸、賴氨酸均配制成2mg/mL的0.1mol/L鹽酸溶液； ⑤洗脫液

檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖溶液（pH5.3）

取檸檬酸14.25g，氫氧化鈉9.30g和濃鹽酸5.25mL溶于少量水后，定容至500mL，冰箱保存

注：在檸檬酸緩沖液中加入0.1%酚溶液可防止長霉。在室溫較高的夏季，配制緩沖溶液用的蒸餾水必須是新鮮蒸餾水，配前煮沸，配好后在4℃保存。0.01mol/LNaOH溶液（pH12）

取0.4gNaOH固體用適量蒸餾水溶解后，定容至1L ⑥顯色劑

取0.5g茚三酮溶于75mL乙二醇單甲醚中，加水定容至100mL。待測樣品

混合氨基酸溶液：將2mg/mL天冬氨酸、賴氨酸溶液按1:2.5的比例混合，混合后再以1:1的比例用0.1mol/L鹽酸溶液稀釋。

【操作步驟】

1.樹脂的處理

對于市售干樹脂，先是經水充分溶脹后，經浮選得到顆粒大小合適的樹脂，然后加4倍量的2mol/LHCl溶液浸泡1小時，傾去酸液，用蒸餾水洗至中性，然后用2mol/LNaOH溶液處理，做法同上。以1mol/LNaOH溶液浸泡樹脂一小時轉化為鈉型，用蒸餾水洗至中性，最后用欲使用的檸檬酸緩沖液浸泡，過剩的樹脂浸入1mol/LNaOH溶液中保存，以防細菌生長。2 裝柱

取層析柱一支，垂直固定在鐵架臺上，(實驗前需進行檢漏，小老師會在實驗過程中進行演示)用夾子夾緊柱底出口處橡膠管，在柱內加2~3cm高的檸檬酸緩沖液。將攪拌成懸浮狀的樹脂沿柱內壁緩慢倒入。待樹脂在柱底部逐漸沉降時，慢慢打開柱底出口處鐵夾，繼續加入樹脂懸浮液，直至樹脂高度到層析柱高度的3/4處。

生命科學與技術學院生化實驗（下）

注意：要注意裝柱過程的連續性，裝好的層析柱應均勻，防止產生氣泡，節痕或界面，否則會對實驗有較大的影響，必須重新裝柱。3平衡

層析柱裝好后，再緩慢沿管壁加入 適量緩沖液至樹脂床面以上2~3cm處，接上橫流泵，用檸檬酸緩沖液以0.5mL/min的流速進行平衡，用pH試紙測量流出液pH，直至流出液的pH與緩沖液的pH相等。

注意：調節流速前要排除恒流泵與柱間連接管內所有氣泡，以免影響流速，影響實驗效果。調節流速時統一將流速調節為10滴/min,平衡時間一般為15分鐘。4加樣

關閉恒流泵，打開層析柱上端管口，緩慢打開柱底出口，小心放出層析柱內的液體至柱內液體的凹液面恰好與樹脂上液面相齊，立即關閉下端出口（注意：不要使液面下降至樹脂表面以下）。用移液槍吸取氨基酸混合樣品0.5ml，沿靠近樹脂表面的管壁緩慢加入，注意不要沖壞樹脂表面。加樣后打開柱底止水夾，使液體盡可能緩慢地流下至液體凹液面恰與樹脂表面相平，立即關閉止水夾。再用膠頭滴管吸取0.5ml緩沖液清洗柱內壁，打開止水夾放出液體，使液體下表面與樹脂表面相平，按照此法清洗2次。然后小心加入緩沖液離柱頂部1cm為止，并將層析柱與恒流泵和部分收集器相連。

注意：樣品體積不要過大，樣品的含量不能超過層析柱內離子交換能力，否則影響分離效果。5.洗脫

① 緩沖液洗脫：用檸檬酸緩沖液（pH5.3）以6s/滴的流速開始洗脫，用試管收集洗脫液，每管收集1ml，收集1-10號管。(② 0.01mol/L NaOH溶液（pH12）洗脫：關閉恒流泵和止水夾，將檸檬酸緩沖液更換為0.01mol/L的NaOH溶液，打開止水夾進行洗脫，同法收集11-40管。收集完畢后，關閉止水夾和恒流泵。

注意：在整個實驗過程中要多注意層析柱，避免使柱內液體流干，否則實驗即為失敗。6.測定

分別向60管收集液中加入1.5ml檸檬酸緩沖液，混勻后再加入1ml茚三酮顯色劑，混勻。沸水浴15min后取出，冷卻至室溫，在1h內用分光光度計在570nm下以蒸餾水為空白管進行比色，測定各管的吸光度值。

注意：比色時盡量避免將液體沾在手上或衣服上。7.樹脂再生

生命科學與技術學院生化實驗（下）

層析柱使用幾次后，需將樹脂取出用1mol/LNaOH溶液洗滌，再用蒸餾水洗至中性后可反復使用。

注意：在本次實驗結束之后需將樹脂倒至指定燒杯中。

【結果與分析】

以吸光度值為縱坐標，收集的管數為橫坐標，繪制出洗脫曲線。以已知兩種氨基酸的純溶液樣品，按上述方法和條件分別操作，將得到的洗脫曲線與混合氨基酸的洗脫曲線對照，可確定2個峰的大致位置及各峰為何種氨基酸。

【思考題】

1.對于新樹脂我們做的處理是先用2mol/LHCl攪拌半小時，然后用蒸餾水洗至中性，再用2mol/LNaOH攪拌半小時，用蒸餾水洗至中性，最后用1mol/LHCl攪拌半小時，還用蒸餾水洗至中性。請分析原因。

2.所加樹脂的高度為層析柱高度的3/4，請思考樹脂過高或過低對實驗結果有何影響，試分析原因。

3.本實驗加的樣品為天冬氨酸和賴氨酸，若再加一個組氨酸，請估計其峰值的位置，說明理由。