第一篇：生物技術制藥總結

生物技術：人們以現代生命科學為基礎，結合先進的工程技術手段和其他基礎科學的科學原理，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產出所需產品或達到某種目的的技術

1基因工程制藥：利用基因重組技術將外援基因導入宿主菌或細胞進行大規模培養，以獲得蛋白質藥物的過程。

2.載體：是攜帶外源目的基因或DNA進入宿主細胞，實現外援基因或DNA的無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些DNA分子。

細胞傳代passage：將細胞從一個培養器皿中消化、分散并接種至另一個培養器皿中的操作。細胞克隆培養（clonal culture）：即單細胞分離培養，是將動物組織分散后，將一個細胞從群體細胞中分離出來，由單個細胞培養成純系細胞集群。

動物細胞的復蘇：其原則是快速融化，必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

細胞融合（cell fusion）：是指在外力（誘導劑或促融劑）作用下，兩個或兩個以上的異源（種、屬間）細胞或原生質體相互接觸，從而發生膜融合、胞質融合和核融合并形成雜種細胞的現象，或稱細胞雜交。

轉基因動物（transgenic animal）：采用基因工程技術將外源目的基因導入動物生殖細胞、胚胎干細胞和早期胚胎，并在受體動物的染色體上穩定整合，在經過發育途徑將外源目的基因穩定地傳給子代，通過這項技術所獲得的動物即為轉基因動物。

胚胎干細胞（embryo stem cell）：簡稱ES細胞，是從早期胚胎細胞團分離出來并能在體外培養的一種高度未分化的、具有形成所有成年細胞類型能力的全能干細胞。它是正常二倍體型，像早期胚胎細胞一樣具有發育上的全能性。

抗體工程制藥（antibody engineering pharmaceutics）：利用基因工程、細胞工程（包括動物細胞工程和植物細胞工程）和轉基因動物及轉基因植物技術生產抗體藥物的過程。

單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）：簡稱單抗，將能大量擴增和永生的骨髓瘤細胞和能合成分泌特異性抗體的B細胞（僅識別一種抗原表位）進行融合得到雜交瘤細胞，經篩選和克隆化的雜交瘤細胞僅能合成及分泌抗單一抗原表位的特異性抗體。

雜交瘤細胞克隆化（cloning）：是指將陽性孔中分泌抗體的單個細胞分離出來。融合后的雜交瘤細胞一般要經過3次克隆化才能達到100%的陽性克隆。

雙特異性抗體（bispecific antibody，bsAb）：亦稱雙功能抗體，是含有兩個不同配體結合位點的抗體分子，它有兩個不同的抗原結合部位（兩個臂），可分別結合兩種不同的抗原表位。嵌合抗體（chimeric antibody）：是利用DNA重組技術，將異源單抗的輕、重鏈可變區基因插入含有人抗體恒定區的表達載體中，轉化哺乳動物細胞表達的抗體，表達的抗體分子中輕、重鏈的V區是異源的，而C區是人源的，即整個抗體分子的60%~70%是人源的。

人源化抗體（humanized antibody，hAb）：通過CDR移植即把鼠抗體的CDR（互補決定區）序列移植到人抗體的可變區內所得到的抗體，也稱CDR移植抗體或改型抗體。該抗體既具有鼠源性單抗的特異性又保持了人抗體的功能（C區的功能）。

免疫原性（immunogenicity）：抗原能刺激機體特異性免疫細胞，使其活化、增值、分化，最終產生免疫效應物質（抗體或致敏淋巴細胞）的特性。

免疫反應性（immunoreactivity）：抗原與相應免疫效應物質在體內或體外相遇時，可發生

特異性結合而產生免疫反應的特性。

減毒活疫苗（live attenuated vaccine）：是通過不同的方式手段使病原體的毒性即致病

性減弱或喪失后獲得的一種由完整的微生物組成的疫苗制品。

滅活疫苗（inactivated）：是將病原體經培養增殖、滅活純化處理，使其完全喪失感染性，但保留了病原體的幾乎全部組分因此滅活疫苗具有較好的免疫原性和安全性。

亞單位疫苗（subunit vaccine）：利用微生物的某種表面結構成分（抗原）制成、能誘發

機體產生抗體的疫苗。

分解代謝阻遏（catabolite repression）：在菌體的生長階段被菌體快速利用的碳源會產

生大量的分解產物，這些代謝產物阻遏次級代謝酶系的合成，只有當這類碳源被消耗完后，阻遏作用被消除，菌體才由生長階段轉入次級代謝產物合成階段，這種發酵過程中的次級代

謝產物在碳源被消耗盡時才產生和積累的現象稱為分解代謝阻遏。

生物技術：人們以現代生命科學為基礎，結合先進的工程技術手段和其他基礎科學的科學原

理，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產出所需產品或達到某種目的的技術。

種齡（inoculumage）：種子罐中培養的菌絲轉入下一級種子罐或發酵罐時得培養時間

生物技術藥物的特性？

（1）理化性質特性（1）相對分子量大（2）結構復雜：蛋白質和核酸均為生物大分子，蛋

白質含有四級結構（3）穩定性差（2）藥理學作用特性（1）活性與作用機制明確：活性物

質對生理功能的調節機制比較清楚（2）作用針對性強：有特定的靶分子、靶細胞或靶器官

（3）毒性低：生物技術藥物本身是體內天然存在的物質或它們的衍生物（4）體內半衰期短

（5）有種屬特異性（6）可產生免疫原抑制（3）生產制備特性（1）藥物分子在原料中的含量低（2）原料液中常存在降解目標產物的雜質：應采取快速分離純化的方法以除去影響

目標產物穩定性的物質（3）制備工藝條件溫和：目的產物不穩定（4）分離純化困難：需要

多種不同原理的層析單元操作才能達到要用的純度（5）產品易受有害物質（4）質量控制特

性

質粒的特點：（1）是指獨立于原核生物染色體之外具有自主復制能力的遺傳物質。（2）質粒

具有遺傳傳遞和遺傳交換的能力（3）質粒具有不相容性：兩種親緣關系密切的不同質粒不

能在同一宿主細胞中穩定共存。4..共價閉合環狀DNA(ccDNA)，開環DNA(ocDNA)，線狀

DNA(lDNA)在瓊脂糖凝膠電泳中

5.復制子松弛型復制子的復制和宿主蛋白的合成功能

無關，宿主染色體DNA復制受阻時，質粒仍可復制；嚴謹型復制子的復制與宿主蛋白質的合成相關，因此在每個宿主細胞中為低拷貝數，僅1~3個。

6.克隆表達的質粒載體涉及三個要素：

（1）復制子（2）選擇標記：由質粒攜帶的賦予宿主細胞新的表型的基因，用于鑒定和篩選

轉化有質粒的宿主細胞。常見的標記：氨芐西林（Amp），卡那霉素（Kan）（3）多克隆位點

（MCS）：質粒載體中由多個限制性內切酶識別序列密集排列形成的序列。

7.目的基因常用制備方法

(1)化學合成法（2）PCR法：在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的緩沖溶液中通

過下列步驟擴增DNA：a）變性：雙鏈DNA模板加熱變性，解離成單鏈模板；b）退火：降

低溫度，引物與單鏈模板結合；c）延伸：溫度調整至DNA聚合酶最適宜溫度，最終與單鏈

模板形成雙鏈，并開始下一個變性、退火、延伸循環。（3）基因文庫法（4）cDNA文庫法

8.影響目的基因與載體之間連接效率的主要因素：

9.（1）DNA片段之間的連接方式：粘性末端的連接效率高于平頭末端。（2）目的基因與載

體的濃度和比例：增加DNA濃度可以提高連接效率，目的基因與載體DNA的摩爾數比應大

于1.（3）連接溫度、時間、連接酶的活性及緩沖液。

9.重組DNA導入大腸桿菌，常用的感受態細胞制備方法：氯化鈣法

10.重組子的篩選與鑒定：

（1）載體遺傳標記法：a)抗生素抗性篩選法

b)互補篩選法：重組子轉化成宿主細胞，載體的表達產物與宿主細胞中營養缺陷性突變發生

互補作用，從而實現重組子的篩選。藍白斑篩選：lacZα基因可編碼β—半乳糖苷酶α氨基

端的α互補肽段，與宿主細胞編碼的缺陷型β—半乳糖苷酶α實現互補，可分解底物5-溴-4-

氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，形成藍色菌落。由于lacAα基因的插入失活而成白色，空載體的宿主細胞呈藍色。c)營養缺陷篩選法d噬菌斑篩選法(2)核酸分子雜交法

(3)限制性內切酶圖譜法(4)DNA序列測定法：雙脫氧終止法(5)目的基因表達產物測定法

12.外源基因在大腸桿菌中的表達形式：

(1)胞內表達：(a)非融合蛋白的胞內表達：形成包涵體（B）融合蛋白的胞內表達：在大腸桿

菌內較穩定（2）分泌表達：（a)分泌至周質（b）分泌至胞外

11.外源基因在原核生物中表達的重要調控元件

(1)啟動子：是DNA鏈上能與RNA聚合酶結合并起始mRNA合成的一段序列，是決定外源基

因在原核生物中表達效率的關鍵因素。(2)核糖體結合位點：SD序列(3)終止子

13.大腸桿菌中外源蛋白表達效率的影響因素：(1)外源基因密碼子：偏好密碼子（蛋白質合成迅速，錯配率低）和稀有密碼子(2)mRNA結構：減少G、C含量，增加A、T含量(3)表達

載體：高拷貝數、適用范圍廣、穩定性高、表達產物容易純化(4)外源蛋白穩定性

14.分離純化技術應滿足下列要求：(1)技術條件要溫和，能保持目的產物的生物活性；(2)選

擇性要好(3)回收率要高(4)兩個技術之間要能直接銜接(5)整個分離純化過程要快

15.基因重組蛋白的主要分離技術

(1)離心(2)沉淀(3)膜分離(4)雙水相萃取

16基因重組蛋白的主要純化技術:

(1)離子交換層析(2)親和層析(3)凝膠過濾層析(4)反相層析和疏水層析

17.選擇分離純化方法的依據：

（元，層析分離次序的選擇也同樣重要。(3)根據分離純化工藝的要求來選擇(a)具有良好的穩

定性、重復性和較高的安全性(b)盡可能減少組成工藝的步驟(c)分離純化工藝所用的時間要

盡可能的短(d)工藝和技術必須高效

18．基因工程藥物的質量控制要點

(1)蛋白質含量的測定(2)蛋白質純度檢測(3)蛋白質分子質量測定(4)蛋白質等電點測定(5)蛋

白質序列分析(6)內毒素分析、宿主蛋白與核酸殘留分析

19.蛋白質含量的測定

(1)紫外吸收法(2)BCA法(3)Lowry法(4)考馬斯亮藍法(5)SDS-PAGE掃描分析法

20.蛋白質純度的檢測：電泳法、層析法、質譜法、末端氨基酸殘基分析法

21.蛋白質Mr測定有SDS-PAGE法、凝膠層析法、質譜法

22.蛋白質等電點測定的常用方法：等電聚焦法。

23.蛋白質序列的分析:N-端氨基酸序列分析，C-端氨基酸序列分析

根據體外培養時動物細胞對生長基質的依賴性，可將動物細胞分為

(1)貼壁依賴性細胞(2)非貼壁依賴性細胞(3)兼性貼壁細胞

1.動物細胞培養的環境條件

(1)培養溫度（哺乳類37℃，昆蟲25~28℃）(2)pH值（大多數7.2~7.4）(3)通氧量（一定量的CO2）(4)防止污染(5)基本營養物質(6)滲透壓

3.動物細胞的培養特性

(1)比微生物細胞大得多，無細胞壁，抗機械強度低，對剪切力敏感，適應環境能力差；(2)

倍增時間長，生長緩慢，正常二倍體細胞的生長壽命是有限的；(3)對培養基要求高，易受

微生物污染，培養時需要添加抗生素；(4)生長大多需貼附于基質，相互粘連以集群形式存

在，并有接觸抑制現象；(5)多半將產物分泌在細胞外，便于收集和純化；(6)對蛋白質的合成條件和修飾功能與細菌不同，動物細胞可對蛋白質進行完善的翻譯后修飾，特別是糖基化，與天然產品更一致，更適合于臨床應用。

4.原代培養的主要步驟

(1)從健康動物體內無菌條件下取出適量組織，剪切成小薄片；(2)加入適宜濃度的胰蛋白酶

或膠原酶和EDTA等進行消化作用使細胞分散；(3)將分散的細胞進行洗滌并純化后，以2×

10^6~7×10^6 /ml的濃度加到培養基中，37℃下進行原代培養，并適時進行傳代培養。分為

組織塊培養和單層細胞培養兩種方法。

5.動物細胞深低溫保存的基本原理

在-70℃以下時，細胞內的酶活性均已停止，即代謝處于完全停滯狀態，故可以長期保存。

在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發

生機械損傷、電解質濃度升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白質變性等，能引起細胞

死亡。目前為了保存細胞，都采用液氮低溫（-196℃）凍存的方法。

6.動物細胞的復蘇

其原則是快速融化，必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍

存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

7.動物細胞營養要求特點

(1)碳源不能為無機物，大多為葡萄糖；(2)氮源不能為無機物，主要為各種氨基酸；(3)在很

多情況下尚需添加5%~20%的小牛血清或適量的動物胚胎浸出液。

8.動物細胞的大規模培養方法

(1)懸浮培養法(2)微載體培養法(3)多孔載體培養法(4)微囊化培養法(5)中空纖維培養法

9.誘導動物細胞融合的方法主要有:(1)病毒法(2)PEG法(3)電擊法(4)激光法

10.轉基因動物生物反應器（整體掌握？）

(1)轉基因動物乳腺生物反應器（藥用蛋白，如抗凝血Ⅲ、抗胰蛋白酶、葡萄糖苷酶、C蛋白）

(2)轉基因動物血液生物反應器（人血紅蛋白、抗體或非活性狀態的融合蛋白）(3)轉基因動

物尿液生物反應器（促性腺激素）(4)轉基因雞（蛋）生物反應器（人干擾素）

1.單克隆抗體技術的基本原理

基于動物細胞融合技術得以實現的，即骨髓瘤細胞和B細胞的融合。骨髓瘤細胞在體外

培養能大量無限增殖，但不能分泌特異性抗體；抗原免疫的B細胞能產生特異性抗體，但在體外不能無限增殖。將免疫B細胞和骨髓瘤細胞融合后形成的雜交瘤細胞，繼承了兩個親代

細胞的特性，既具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，又具有免疫B細胞合成和分泌特異性抗

體的能力。通常使用HAT（H為次黃嘌呤、A為氨基蝶呤、T為胸腺嘧啶核苷）選擇培養基

對雜交瘤細胞進行篩選。未融合的脾細胞因不能在體外長期存活而死亡，未融合的骨髓瘤細

胞合成DNA的從頭合成途徑被培養基中的A阻斷，又因缺乏HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸

核糖轉移酶）和TK（胸腺嘧啶核苷激酶），不能利用培養基中的H和T完成DNA的合成過

程而死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了HGPRT和TK，因此能在HAT培養基

中長期存活與繁殖并分泌抗體。

2.單克隆抗體的大量制備主要方法:（1）體內培養法（2）體外培養法

6.重組ScFv的應用:(1)用于構建和生產免疫毒素(2)用于腫瘤的影像分析和治療

7.噬菌體抗體庫技術的基本原理:用PCR技術從人免疫細胞中擴增出整套的VH和VL基因，克隆到噬菌體載體上并以融合蛋白的形式表達在其外殼表面。這樣一來噬菌體DNA中有抗

體基因的存在，同時在其表面又有抗體分子的表達，可以方便地利用抗原-抗體特異性結合而篩選出所需要的抗體，并進行克隆擴增。

7.噬菌體抗體庫構建過程

(1)從外周血或脾、淋巴結等組織中分離B細胞，提取mRNA并反轉錄為cDNA；

(2)應用抗體輕鏈和重鏈引物，根據建庫的需要通過PCR技術擴增不同的抗體基因片段；

(3)構建噬菌體載體；(4)用表達載體轉化細菌，構建全套抗體庫。

通過多輪的抗原親和吸附（結合）-洗脫-擴增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。其中，噬

菌體抗體庫的篩選是關鍵環節和步驟。

減毒活疫苗的優缺點：

優點：

（1）通過自然感染途徑接種，可以誘導包括體液免疫、細胞免疫和粘膜免疫在內的更全面的免疫應答，使機體獲得更廣泛的免疫保護；（2）由于使用的是活的微生物他們可以在體內

長時間起作用而誘導較強的免疫反應，且由于活的微生物有增殖的特性，理論上只需要接

種一次，即可達到滿意的免疫效果；（3）可能引起水平傳播擴大免疫效果，增強群體免疫屏

障；(4)一般不需要再疫苗中添加佐劑，生產工藝一般不需要濃縮純化，價格低廉。

缺點：

(1)一般減毒活疫苗均保留一定殘余毒力，對一些個體如免疫缺陷者可能誘發嚴重疾病，并

且由于種種原因如基因修飾等，減毒活疫苗可能出現毒力回復即“返祖”現象；(2)減毒活

疫苗是活的微生物制劑，可能造成環境污染而引發交叉感染等，并可能滯留在環境中形成傳

染源；(3)缺損顆粒可能干擾免疫效果，因此產品分析評估較為困難；(4)保存運輸等條件要

求較高，如需冷藏等。

1.滅活疫苗的特點：(1)滅活疫苗常需多次接種；(2)接種滅活疫苗產生的抗體滴度隨著時

間而下降；(3)滅活疫苗需要量大。

第七章 發酵工程制藥

1.發酵類型：(1)微生物菌體發酵(2)微生物的酶(3)微生物的代謝產物發酵(4)微生物轉化發

酵(5)生物工程菌發酵

2.微生物發酵生產藥物的分類：(1)抗生素類(2)氨基酸類(3)核苷酸類(4)維生素類(5)甾體類

激素(6)多糖類(6)治療酶及酶抑制劑

3.菌種保藏方法：(1)斜面低溫保藏法(2)石蠟油封存法(3)沙土管保藏法(4)麩皮保藏法(5)甘

油懸液保藏法(6)冷東真空干燥保藏法(7)液氮超低溫保藏法(8)宿主保藏法

4.種子液具備的條件：(1)菌種的生長活力強，轉種至發酵罐后能迅速生長，延遲期短；(2)

生理狀態穩定；(3)菌體總量及濃度能滿足大容量發酵罐的要求；(4)無雜菌污染，保證純種培養；()保持穩定的生產能力

5.微生物的發酵方式：（1）分批發酵（2）補料—分批發酵（3）半連續發酵（4）連續發酵

5.發酵過程的中間分析項目：（1）產物產量（2）PH值（3）糖（4）氨基氮（5）菌絲形

態

6.發酵過程的影響因素及控制：（1）菌體濃度的影響及控制（2）營養物質對發酵的影響

及控制（3）溫度的影響及控制（4）PH的影響及控制（5）溶氧的影響及控制（6）二氧化碳的影響及控制（7）泡沫的影響及控制（8）染菌對發酵的影響

第二篇：生物技術制藥重點總結

1.生物藥物：又稱為生物工程，是指人們以現代生命科學為基礎，結合先進的工程技術手段和其它基礎學科的科學原

理，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產出所需產品或達到某種目的技術。

2.生物技術藥物： 采用DNA重組技術或其它生物技術生產的用于預防、治療和診斷疾病的藥物，主要是重組蛋白和

核酸類藥物，如細胞因子、纖溶酶原激活劑、血漿因子等。

3.質粒載體：質粒是指獨立于原核生物染色體之外具有自主復制能力的遺傳物質。分三種構型：共價閉合環狀

DNA(cccDNA)、開環DNA(ocDNA)、線狀DNA(IDDNA)。在瓊脂糖凝膠電泳中遷移率：cccDNA > IDDNA > ocDNA

4.目的基因的常用制備方法主要包括化學合成法、PCR法、基因文庫法和cDNA文庫法等。

5.PCR法是指聚合酶鏈反應，是根據生物體內DNA復制原理在DNA聚合酶催化和dNTP參與下，引物依賴DNA模

板特異性的擴增DNA。在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的緩沖溶液中通過三個循環步驟擴增DNA：：①變性—雙鏈DNA模板加熱變性，解離成單鏈模板；②退火—溫度下降，引物與單鏈模板結合（溫度下降，PCR特性下降，效率升高）；③延伸—溫度調整至DNA聚合酶最適宜溫度，DNA聚合酶催化dNTP加至引物3′-OH，引物以5′→3′方向延伸，最終與單鏈模板形成雙聯DNA, 并開始下一個循環。

6.cDNA文庫法：cDNA是指與mRNA互補的DNA。cDNA文庫法是指提取生物體總mRNA，并以mRNA作為模板，在逆轉錄酶的催化下合成cDNA的一條鏈，再在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈cDNA，將全部cDNA都克隆到宿主細胞而構建成cDNA文庫。

7.影響目的基因與載體之間連接效率的主要因素：

①DNA片段之間的連接方式；粘性末端的連接效率高于平頭末端。

②目的基因與載體的濃度和比例；增加DNA濃度可以提高連接效率，目的基因于載體DNA的摩爾數比應大于1。③連接溫度，時間，連接酶的活性及緩沖體系。

8.重組DNA導入宿主細胞的方法：轉化、轉染、顯微注射和電穿孔。

9.互補篩選法（最常見藍白班篩選法）需添加X–gal（X–Gal是β–半乳糖苷酶（β–galactosidase）的底物，水解后呈藍

色）和IPTG（是β–半乳糖苷酶的活性誘導物質）篩選物質進行篩選。

10.菌落原位雜交：又稱探針原位雜交法，制備與目的的基因某一區域同源的探針序列，根據核酸雜交原理，探針序列

特異性地雜交目的基因，并通過放射性同位素或熒光基團進行定位監測。

11.凝膠過濾層析：凝膠過濾層析(gel filtration chromatography)法又稱排阻層析或分子篩方法?；驹硎牵焊鶕?/p>

大分子的蛋白質的質量的大小來實現目的蛋白的分離純化。在凝膠過濾層析中所用的凝膠是一種惰性的不帶電荷具有三維空間結構的多孔網狀物質，凝膠的每個顆粒的微粒結構就如一個篩子，當樣品隨流動相經過凝膠柱時，較大的分子內不能進入凝膠網孔內而收到排阻，將與流動相一起首先被洗脫下來，而較小的分子進入部分凝膠網孔內，所以流出的速度相對較慢。

12.反相層析（RPC）和疏水層析（HIC）的比較：是根據蛋白質疏水性差異來實現分離純化。先比反相層析而言，疏

水層析回收率較高，蛋白質變性的可能性較小。反相層析和疏水層析的差異在于前者在有機相中進行，蛋白質經過反向流動相與固定相作用有時會發生部分變性，而后者通常在水溶液中進行，蛋白質在分離過程中一般仍保持其天然構象。

13.蛋白質含量測定方法：紫外吸收法、BCA法、福林—酚試劑法（lowry）、考馬斯亮藍法、ELISA法等。

14.蛋白質純度檢查的常見方法：SDS-PAGE法（最常用）、非變性PAGE法、層析法等。

15.蛋白質序列的分析方法：N-端氨基酸序列分析法（基本原理Edman法）、C-端氨基酸序列分析法。

16.體外培養動物細胞的類型：貼壁依賴性細胞，非貼壁依賴性細胞和兼性貼壁細胞。

17.動物細胞與微生物細胞，植物細胞相比較具有的特點：

①比微生物細胞大得多，無細胞壁，抗機械強度低，對剪切力敏感，適應環境能力差

②倍增時間長生長緩慢，正常二倍體細胞的生長壽命是有限的③對培養基的要求高，易受微生物污染，培養時常常需要添加抗生素

④生長大多需貼附于基質，相互黏連以集群形式存在，并有接觸抑制現象

⑤多半將產物分泌在細胞外，便于收集和純化。

18.動物細胞的營養要求是：1.碳源不能為無機物，大多為葡萄糖

2.氮源也不能為無機物，主要為各種氨基酸

3.在很多情況下尚需添加5%-20%的小牛血清或適量的動物胚胎浸出液

19.動物培養基可分為：天然培養基，合成培養基和無血清培養基三大類.20.原代細胞：直接將動物組織或器官經過粉碎，消化而制的的懸浮細胞稱為原代細胞.21.懸浮培養法：是細胞在培養液中呈懸浮狀態生長繁殖的培養方法，它適用于一切種類的非貼壁細胞，兼性貼壁細胞，可連續測定細胞濃度，連續收集部分細胞進行繼代培養，也無需消化分散，細胞收率高

22.木瓜蛋白酶水解IgG分子可產生兩個抗原結合片段（Fab）和一個可結晶片段（Fc）

23.胃蛋白酶水解IgG分子可產生一個F(ab’)2和若干裂解小分子片段（pFc’）

24..單克隆抗體技術的基本原理：基于動物細胞融合技術得以實現的，即骨髓瘤細胞與B細胞的融合。骨髓瘤細胞在體外培養能大量無限增殖，但不能分泌特異性抗體，而抗原免疫的B細胞能產生特異性抗體，但在體外不能無限增殖。將免疫B細胞與骨髓瘤細胞融合后形成的雜交瘤細胞，繼承了連個親代細胞的特性，既具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，又具有免疫B細胞合成和分泌特異性抗體的能力。

25.骨髓瘤細胞發生回復突變每3-6個月應用8-氮雜鳥嘌呤（8-AG）篩選一次，以便殺死突變細胞

26.細胞融合的方法：常用的有轉動法和離心法.27.雜交瘤細胞的克隆化的方法有：有限稀釋法和軟瓊脂平板法，顯微操作法

28.雙特異性抗體：是含有兩個不同配體結合位點的抗體分子，它有兩個不同的抗原結合部位（兩個臂），可分別結合兩種不同的抗原表位。其中一個可與靶細胞表面抗原結合，另一個則可與效應物（如藥物，效應細胞等）結合，從而將效應物直接導向靶組織細胞。

29.細胞內抗體：亦稱內抗體，主要是指細胞內合成并作用于細胞內組分的抗體。

30.如何構建噬菌體抗體庫？構建噬菌體抗體庫通常包括以下幾個過程：1.從外周血或脾，淋巴結等組織中分離B細胞，提取mRNA并反轉錄為cDNA2，應用抗體輕鏈和重鏈引物，根據建庫的需要通過PCR技術擴增不同的抗體基因片段3，構建噬菌體載體4，用表達載體轉化細菌，構建全套抗體庫。通過多倫的抗原親和吸附-洗脫-擴增，最終篩選出抗原特異性地抗體克隆。篩選為關鍵環節和步驟。

31.疫苗的組成：具有免疫保護性的抗原（Ag）如蛋白質，多肽，多糖或核酸等與免疫佐劑混合制備而成。

32.佐劑是指能非特異性的增強免疫應答或改變免疫應答類型的物質，可先于抗原或與抗原一起注入機體。

33.目前用于人體的佐劑只有兩種：1，鋁佐劑（氫氧化鋁或磷酸鋁）2，MF59

34.滅活疫苗和活疫苗的特點比較：（P122,表5-4）

35.聯合疫苗包括多聯疫苗和多價疫苗，多聯疫苗可用于預防由不同病原微生物引起的傳染病，而多價疫苗僅預防同一

種病原微生物的不同亞型引起的傳染病。

36.核酸疫苗是20世紀90年代發展起來的一種新型疫苗。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，由能引起機體保護性

免疫反應的抗原的編碼基因和載體組成。核酸疫苗又稱為基因疫苗，基因免疫或核酸免疫

37.酶的分離純化過程必須遵循以下原則：

1、全部操作一般在低溫（0-4攝氏度）進行。

2、在分離提純過程中，不能

劇烈攪拌。

3、在提純溶劑中加一些保護劑，如少量EDTA,少量 –巰基乙醇等

4、在分離提純過程中要不斷測定酶的的活力和蛋白質濃度，以對純化過程進行檢測。一般用兩個指標來衡量分離純化方法的好壞：總活力的回收率和比活力提高倍數。

38.傳統的酶固定化方法大致可分為載體聯合法，交聯法和包埋法

39.固定化對酶穩定性的影響：

1、熱穩定性提高

2、對有機試劑及酶抑制劑的穩定性提高

3、對PH，蛋白酶，儲存

盒操作條件的穩定性提高

40.目前常用的菌種保藏方法有：

1、斜面低溫保藏法，一般可保存1-6個月左右

2、石蠟油封存法，一般可保存1-2年左右

3、砂土管保藏法，保藏期約1-10年

4、麩皮保藏法，保藏期在一年以上

5、甘油懸液保藏法，-20度保藏期約為0.5-1年，-70度下保藏期可達10年

6、冷凍真空干燥保藏法，5-15年

7、液氮超低溫度保藏法，15年以上

8、宿主保藏法

41、產物產量的測定方法有：生物測定法和化學測定法，一般采用化學測定法，以求迅速躋身反應生產情況。中國微生物菌種保藏委員會CCCCM中國典型培養物保藏中心CCTCC

美國典型菌種保藏中心 ATCC美國的北部地區研究實驗室NRRL

英國的國家典型菌種保藏所NCTC日本的大阪發酵研究所IFO

德國菌種保藏中心DSM42、中間反應產量測定：產物產量、ph值、糖、氨基酸、菌絲形態。

43、PH對發酵的影響有哪些？

1.PH影響酶的活性，當PH值抑制菌體的某些酶的活性時使菌的新陳代謝受阻

2.PH影響微生物細胞膜所帶電荷的改變，從而改變細胞膜的通透性，影響微生物對營養物質的吸收和代謝物的排泄，因此影響新陳代謝的進行

3.PH影響培養基某些成分和中間代謝物的解離，從而影響微生物對這些物質的利用

4.PH影響代謝方向，PH不同，往往引起菌體代謝過程不同，是代謝產物的質量和比例發生改變。

44、基因工程菌發酵生產的特點？采用基因重組技術構建的基因工程菌與細胞，由于帶有外來基因，對其進行培養和

發酵的工藝技術通常與單純的微生物細胞的工藝技術有不同之處?；蚬こ叹l酵的目的主要是實現外源基因的高效表達，以獲取大量的外源基因產物。而外源基因的高技術表達不僅涉及宿主、載體與外源基因三者之間的相互關系，與所處環境條件密切相關?；蚬こ叹l酵一般分兩個階段：前期是菌體生長階段，后期是菌體生長階段。

45、基因工程菌不穩定性的原因？主要表現在質粒的不穩定性以及表達產物的不穩定性。而質粒的不穩定性又分結構的不穩定性以及分離不穩定。結構不穩定性是由于轉位作用和重組作用所引起的質粒DNA的重排與損失。分離的不穩定性是細胞分裂過程中發生的不平均分配，從而造成質粒的缺陷型分配，以致造成質粒丟失。引起質粒載體不穩定性的原因只要是宿主新陳代謝負荷的加重，大量外源蛋白的形成對宿主細胞的損害，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的細胞一般生長的快得多，從而能替代有生產能力的菌株，這就導致了基因工程菌的不穩定性。

46、突變生物合成：采用一些誘變劑，如紫外線，激光，高速電子流或一些化學藥物如亞硝基胍，溴化乙啶等對藥物的產生菌進行誘變，是他們喪失合成某種中間體的能力，因而不能合成原來結構的化合物，陳武阻斷突變株。在發酵培養這些阻斷突變株時添加某些天然或化學合成的化合物作為中間體，這些突變株能利用這些中間體合成一些新結構的最終化合物，這個過程稱為突變生物合成。

47、微生物轉化系酶促化學反應，具有與通常有機化學反應不一樣的特點：

1.以具有活性中心和特殊空間結構的酶作為催化劑

2、對作用的基質有嚴格的選擇性和專一性

3、酶催化反應的速度極高，非一般催化劑可比

4、一般在常溫常壓下進行，反應條件溫和

48、微生物對甾體轉化反應的特點：在微生物轉化過程中，專一，有效的菌體量的多少，以及甾體底物在水相的溶解

性等問題成為影響轉化率的重要因素，目前采用的兩階段發酵及兩相發酵方法很好的解決了這些甾體微生物轉化中的問題。

49、蛋白質藥物對化學修飾的意義：

50、最常用的修飾劑有：主要是水溶性高分子聚合物，如葡聚糖、右旋糖苷、肝素以及低分子肝素、多聚唾液酸、聚

乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、PEG、白蛋白等。目前以PEG最常用的。其毒性小、無抗原性、溶解性良好。

51、修飾策略有隨機修飾與定點修飾兩類。氨基修飾主要用隨機修飾，在利用特定的修飾劑可以實現定點修飾。巰基

修飾多為定點修飾。羧基修飾為定點修飾。

52、選擇PEG修飾劑應該考慮的因素：PEG的Mr，修飾位點，水解穩定性和反應活性。

53、核酶：核酶不是普通的蛋白質酶，而是一類具有催化活性的核酸分子。目前已知的具有核酶催化功能的RNA結

構至少可以分成5類：發夾狀核酶，錘頭狀核酶，I型內含子核酶，RNaseP核酶，丁型肝炎病毒核酶等

54、反義核酸：是指具有抑制基因表達作用。包括反義RNA、反義DNA分子，由部分RNA和部分DNA形成RNA-DNA

嵌合分子，以及經高度化學修飾的寡聚核酸類似物，這些分子統稱反義核酸類藥物。

55、褔米韋生經美國FDA批準上市成為第一個反義核酸類藥物。

56、RNAi:即RNA干擾現象，是近幾年發現的一種由雙鏈RNA誘導的基因表達調控和基因沉默過程。主要階段：

啟動階段和執行階段

57、小干擾RNA(siRNA)：在啟動階段，當細胞由于病毒感染等原因出現雙鏈RNA分子或帶有較長雙鏈的發卡結構

RNA時，細胞中的Dicer的核酸酶會識別其雙鏈RNA，將其降解成21~23bp長的小干擾RNA。主要參與RNA干擾（RNAi）現象，以帶有專一性的方式調節基因的表達。

第三篇：生物技術制藥第二版總結

生物技術制藥 第一章

緒論 要求：

1、熟悉生物技術制藥的基本概念

2、熟悉生物技術藥物的特點

3、了解生物技術領域及生物制藥產業的發展現狀

1、生物技術制藥:就是利用基因工程、細胞工程、發酵工程、酶工程、蛋白質工程技術、等來研究和開發藥物，用來診斷、治療和預防疾病的發生。

2、生物技術藥物（biopharmaceutics）是利用生物體、生物組織、細胞或其他組分，綜合應用生物學與醫學、生物化學與分子生物學、微生物學與免疫學、物理化學與工程學和藥學的基本原理與方法加工制造而成的一大類用于預防、診斷、治療和康復保健的制品。

特性 藥理學特性

1、藥理活性高

2、治療的針對性強，治療的生理、生化機制合理，療效可靠

3、毒副作用小，營養價值高

4、生理副作用常有發生 理化與生物學特性

1、生物材料中含量低，雜質多，分離提取工藝復雜

2、生物活性物質結構復雜、穩定性差

3、生物材料易染菌、腐敗

4、生物技術藥物制劑有特殊要求

3、傳統生物技術的技術特征是釀造技術

4、近代生物技術的技術特點是微生物發酵技術

5、現代生物技術的技術特征是以基因工程為首要標志

6、生物醫藥產業的特點：生物醫藥產業投資大、風險高、周期長。收益高

第二章

基因工程制藥 基因工程的概念。

基因工程的原理和技術?；蚬こ讨扑帯?大步驟

掌握：基因工程、載體的概念；基因工程的原理；常用載體和表達系統的類型。

2、熟悉：基因工程制藥的基本流程；目的基因制備、鏈接的方法；重組基因導入宿主的方法；重組子篩選和鑒定的方法；質粒不穩定的原因、分析方法和提高穩定性的方法。

3、了解：生物技術藥物的下游分離和純化技術。復習

1.基因工程藥物制備的一般過程。2.基因工程常用的載體有哪些？各有什么特點？ 3.獲得目的基因常用的四種方法是（）、（）、（）和（）。

?

1、基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用與工程設計十分類似的方法，按照人類的需要進行設計，然后按設計方案創建出具有某種新的性狀的生物新品系，并能使之穩定地遺傳給后代 ?

2、原理：

1、提高外源基因的劑量——分子遺傳學原理

2、篩選修飾重組基因表達的轉錄調控元件，如：啟動子、增強子、操作子、終止子、上游調控序列等——分子生物學原理

3、修飾構建蛋白質生物合成的翻譯調控元件，如：SD序列、mRNA非編碼區、密碼子等——分子生物學原理

4、基因工程菌（微型生物反應器）的增殖及穩定生產——生化工程學原理

3、理論方面的三個重要的發現

1、生物遺傳物質—DNA的發現

2、DNA雙螺旋結構和半保留復制機理的建立

3、遺傳信息傳遞方式的確立

4、技術上三個重要成果

1、基因工程的工具酶 DNA連接酶 限制性內切酶 逆轉錄酶

思考：被同一種限制酶切斷的幾個DNA是否具有相同的黏性末端？

一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切點上切割DNA分子。逆轉錄酶是以RNA為模板指導三磷酸脫氧核苷酸合成互補DNA（cDNA）的酶 特點：逆轉錄酶是一個多功能性酶，至少具有以下3種酶 活性：

⑴

以單鏈RNA為模板，催化合成cDNA單鏈

⑵

具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA雜交鏈中的 RNA ⑶

以DNA為模板，催化合成cDNA雙鏈。2.基因工程載體

3.基因的體外重組技術

5、重組子轉化的成功標志著基因工程的誕生。

6、基因工程的操作流程

1、分：分離目的基因

2、切：對目的基因和載體適當切割

3、接：目的基因與載體連接

4、轉：重組DNA轉入受體細胞

5、篩：篩選出含有重組體的受體細胞

6、表：目的基因在受體細胞中表達，受體細胞成長為基因改造生物

?

7、基因工程制藥的基本過程

獲得目的基因 構建運輸載體 組建表達系統 表達系統培養

產物分離純化

?

8、目的基因的獲得

（一）從基因組中直接分離目的基因

1、密度梯度離心法

2、單鏈酶法

3、分子雜交法

4、酶切法直接分離目的基因

（二）PCR直接擴增目的基因 聚合酶鏈式反應 高溫變性 低溫退火 適溫延伸

（三）反轉錄法合成目的基因 構建cDNA文庫 調取基因

（四）化學合成目的基因

從反應機理上分為：

1、磷酸二酯法

2、磷酸三酯法

3、亞磷酸三酯法

4、自動化合成法

9、—運載體的構建

? 載體（Vector）:將外源目的DNA導入受體細胞，并能自我復制和增殖的工具。? 常用載體

來源分類：

1、質粒載體

質粒（plasmid）:是附加到細胞中的非細胞的染色體或核區DNA原有的能夠自主復制的較小的DNA分子。人工質粒載體必須包括三部分：一個DNA復制起始區，兩個遺傳標記基因和一些限制性內切酶位點。

2、噬菌體載體

λ噬菌體：（1）λ噬菌體宿主為E.coli 2）有溶原、溶菌兩種生活方式：

溶原方式：λDNA整合到宿主DNA進行復制；

溶菌方式：可釋放出λDNA進行殼蛋白包裝增殖。

優點

1）對外源基因的容量較大（可達20多個kb）

（2）重組體DNA可在體外包裹成噬菌體顆粒，具有更高的侵染宿主能力，要比質粒轉化細菌的效率高得多，所以λ噬菌體載體常用于構建cDNA文庫或基因組文庫。（3）宿主范圍窄，更安全

（4）可利用包裝限制性（對DNA分子大小的限制）對重組子分子進行正選擇，利于重組子的篩選

3、病毒載體

4、人工染色體載體

用途分類：

1、克隆載體

能使插入的外源DNA序列被復制、擴增而不能表達，這樣的載體為克隆載體。常見:質粒、噬菌體

2、表達載體

使插入的外源DNA序列轉錄翻譯，表達出多肽鏈，這樣的載體稱為表達載體。具有復制子，篩選標記，位于多克隆位點的上下游具有轉錄效率較高的啟動子，起始密碼子和核糖體結合位點，轉錄終止子結構．

3、穿梭載體 這類載體中含有來源不同的復制子結構，既具備原核細胞復制所需的序列結構，又具有能使外源片段在真核細胞表達所需的結構元件和相應的選擇標記基因,故能在兩種受體細胞中復制并檢測，克隆的外源基因在此類載體直接從一種受體轉入另一種受體中進行復制和表達．

10、基因表達載體的構建

1、用一定的_限制酶___切割質粒，使其出現一個切口，露出_黏性末端 2.用__同一種限制酶___切斷目的基因，使其產生__相同的黏性末端

3..將切下的目的基因片段插入質粒的___切口___處，再加入適量DNA連接酶_，形成了一個重組DNA分子（重組質粒）

11、重組工程菌的構建、篩選與鑒定 ?

1、目的基因與載體DNA的鏈接 1）黏性末端連接法 2）鈍性末端連接法

3）鈍性末端連接人工合成的接頭 4）同聚物末端連接法

?

2、將重組體導入宿主細胞（1）轉化2）轉導3）轉染 ?

3、重組子的篩選與鑒定

（1）抗藥性檢測篩選法

（2）顯色檢測

異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）可誘導LacZ基因片段編碼β-半乳糖苷酶氨基端片段,與宿主細胞所編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶實現基因內互補，又稱α互補。當培養基中有IPTG時，使含此質粒的菌在X-gal培養基上形成藍色菌落。（3）限制酶切圖譜檢測（4）PCR擴增檢測（5）原位雜交檢測（6）外源蛋白質功能檢測

12、表達系統的構建與基因表達

1、最佳的基因表達體系：生物活性高、表達產量高、表達產物穩定、表達產物容易分離純化。

2、宿主細胞常用兩大類：

原核細胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈霉菌等；

真核細胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。

? 質粒的不穩定性原因

1）分裂不穩定：指工程菌分裂時出現一定比例不含質粒的子代菌的現象。

（2）結構不穩定：指外源基因從質粒上丟失或堿基重排、缺失而導致工程菌性能的改變。? 質粒穩定性的分析方法

1）將工程菌培養液樣品適當稀釋，均勻涂于不含抗生素標記的平板培養基上，培養10-12小時，統計所長出的菌落數A；

（2）然后隨機挑選100個菌落，接種到含有抗生素標記的平板培養基上，培養10-12小時，統計所長出的菌落數B；

（3）計算出B/A的比值。該比值能夠反映出質粒的穩定性。提高質粒穩定性的方法

1）分階段培養法（2）在培養基中加入抗生素，形成選擇性壓力（3）通過溫度、PH值、培養基組分、溶解氧的綜合調節措施

第三章

動物細胞工程制藥

1、動物細胞培養技術

培養方法和培養條件 細胞的凍存與復蘇

2、動物細胞融合技術

動物細胞融合的過程和方法

3、單克隆抗體技術 單克隆抗體的概念；單抗制備的原理和方法

4、動物細胞的大規模培養

1、培養的方法

1、原代培養

2、傳代培養

2、營養條件

1、動物細胞的培養基的種類和組成 ：培養基的基本要求 促生長因子 激素 營養成分 滲透壓pH 無毒、無污染

培養基的基本要求

1）營養成分： 氨基酸

單糖 維生素 無機離子與微量元素

2）促生長因子及激素各種激素、生長因子的功能：①維持細胞的功能②保持細胞的狀態（分化或未分化）

3）滲透壓

4）pH大多數細胞適宜 pH為7.2～7.4，培養基應具一定的緩沖能力 5）無毒、無污染

3、血清的主要成分和作用

主要成分 ：血清是由血漿去除纖維蛋白而形成的，血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等

主要作用：

1、提供基本營養物質

2、提供激素和各種生長因子

3、提供結合蛋白

4、對培養中的細胞起到某些保護作用

4、動物細胞合成培養基種類：

1、MEM ： 僅含12 種必需氨基酸、谷氨酰胺，8 種維生素及必要的無機鹽，由于成分簡單，易于添加某種特殊成分適于某些特殊細胞培養。

2、DMEM： 在 MEM 培養基的基礎上研制的。與 MEM 比較增加了各種成分用量，分高糖型（低于4500g/L）和低糖型（低于1000g/L）

高糖型有利于細胞停泊于一個位置生長，適于生長較快、附著較困難低腫瘤細胞。

3、IMDM： 含有 42 種成分，與 DMEM 比較增加了許多非必須氨基酸及一些維生素，增加了羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES），葡萄糖含量為高糖型。

適合細胞密度較低、細胞生長困難的情況，如細胞融合之后雜交細胞的篩選培養，DNA 轉染后轉化細胞的篩選培養。

4、RPMI1640：

其組分較為簡單，適合許多種細胞生長，如腫瘤細胞、正常細胞、原代培養、傳代培養等。是目前應用最為廣泛的培養基之一。

5、動物細胞的種質保存

細胞的凍存與復蘇 冷凍速率、復溫速率、冷凍保護劑，冷凍保存溫度。

1.細胞凍存

2.細胞復蘇 ：在體外培養工作中，常要將體外培養物進行冷凍保存，在需要時再復溫融解進行體外培養（復蘇）

? 凍存和復蘇的原則：慢凍快融

原因：

當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶，冰晶導致細胞損傷甚至死亡。

甘油或二甲基亞砜可使冰點降低，在緩慢凍結條件下，可使細胞內水分逐步透出，避免大的冰晶；相反，結晶就大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。融化速度快，還可使迅速通過最易受損的-5－0度

冷凍速率：慢凍（？）復蘇速率：快融（？）

冷凍保護劑：5－15％甘油或二甲基亞砜（DMSO）（？）冷凍保存溫度：－196 ℃（液氮）

? 為什么要加冷凍保護劑

對大多數有核哺乳類動物細胞來說，在不加冷凍保護劑的情況下，無最適冷凍速率可言，也不能獲得活的凍存物。目前冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類。具有滲透性的冷凍保護劑可以滲透到細胞內，一般是一些小分子的物質，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是些大分子物質，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉等。

6、動物細胞融合技術 基本過程

1）細胞準備，分貼壁和懸浮細胞兩種。前者可直接將兩親本細胞混合培養，后者需制成一定濃度的細胞懸浮液。

（2）細胞融合，加促融因子于將行融合的細胞之中，誘導融合。

（3）雜種細胞選擇，利用選擇性培養基等，使親本細胞死亡，而讓雜種細胞存活。（4）雜種細胞克隆，對選出的雜種細胞進行克?。ㄟx擇與純化），經過培養，就能獲得所需要的無性繁殖系。

促融劑：

1、病毒誘導：某些病毒如：仙臺病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介導病毒同宿主細胞融合，2、PEG誘導

3、物理學方法－電誘導細胞融合

7、單克隆抗體（monoclonal Antibody，McAb）通過B細胞雜交瘤技術，獲得特異性針對某一種抗原決定簇的細胞克隆，產生均一性的抗體。單克隆抗體的大量制備：（1）體外培養法：（2）動物體內誘生法：

單克隆抗體的特性：

1、高度均一性：純度很高的均一性抗體

2、高度專一性： 只對抗原分子上某一抗原決定簇起反應

3、大量產生及穩定性： 雜交瘤細胞能在體內外無限繁殖傳代

8、動物細胞大規模培養：懸浮培養、貼壁培養、假懸浮培養（微載體培養、微囊化培養）等

第四章

植物細胞工程制藥

基本概念：植物細胞工程；植物細胞的全能性；細胞融合

植物細胞培養技術：培養材料、培養方法；植物細胞培養的影響因素 植物原生質體培養技術：原生質體獲得、純化和培養的方法 植物細胞融合技術：細胞融合的過程、方法和雜種細胞的篩選

1、植物細胞工程：以植物細胞為基本單位，應用細胞生物學、分子生物學等理論和技術，在離休條件下進行培養、繁殖或人為的精細操作，使細胞的某些生物學特性按人們的意愿發生改變，從而改良品種、制造新品種，加速繁育植物個體或獲得有用物質的一門科學或技術。

2、植物細胞的全能性：植物體中任何一個具有完整細胞核（完整染色體組）的細胞，在一定條件下都有直接發育成一個完整植株的能力。

3、全能性最早在植物細胞中發現。

4、植物細胞培養技術：植物細胞培養從植物組織培養而來，植物組織培養主要用于形成組織和再生成植株 植物細胞培養主要生成次生代謝產物

基本技術：

1、植物材料的準備

2、培養基制備

3、培養方法的選擇

5、植物細胞的獲得

（1）外植體直接分離法:機械切割、組織破碎直接從植物外植體中分離 外植體：如根、莖、葉、花、花粉等

（2）原生質體再生法：纖維素和果膠酶混合處理外植體或愈傷組織，分離原生質體，再生培養基中培養，原生質體細胞壁再生獲得植物細胞。

3）愈傷組織分離法：從愈傷組織制備小細胞團或單細胞懸液

愈傷組織：在一定條件下，從外植體的切口部位長出的脫分化的薄壁細胞團。

6、常用培養基

MS培養基是目前應用最多最普遍的培養基。無機鹽的濃度較高，KM-8p主要用于原生質體培養，其特點是有機成分較復雜 White的無機鹽含量較低，適于生根培養

7、生長素：用來誘導細胞的分裂、愈傷組織形成和根的分化

8、組織培養中常用的有：吲哚乙酸(IAA)：第一個被發現和人工合成的的激素

二氯苯氧乙酸(2,4-D)；萘乙酸(NAA)；吲哚-3-丁酸(IBA)；萘氧乙酸(NOA)；對氯苯氧乙酸(P-CPA)NAA、IAA、IBA易引起生根，2,4-D有利于愈傷組織的誘導和生長

培養影響

9、植物細胞生長代謝特點：（1）需大量無機鹽（2）需多種維生素和植物生長激素（3）無機氮源，硝酸鹽、銨鹽為主（4）以蔗糖為碳源

10、無機元素的功能：

①參與調節胞內外的pH、滲透壓、氧化還原電位等

②參與多種酶的輔酶和激活因子的合成

③P是DNA、RNA、ATP等生物活性物質的組成部分，也影響多種次級代謝產物的合成

11、植物生長物質

1、植物生長調節劑

2、植物生長激素：生長素，細胞分裂素，赤霉素，脫落酸，乙烯。借生長激素調控生長分化，以及細胞培養時，獲得最大量的次生代謝產物

12、植物培養物的生長取決于生長素和分裂素的比例：

高濃度生長素和低濃度分裂素——刺激細胞分裂，低濃度生長素和高濃度分裂素——刺激細胞生長

13、誘導子：刺激植物細胞合成防御性次生代謝產物的物質, 可以通過改變次生代謝途徑中催化酶的酶活力,引起代謝通量和反應速率的改變, 提高次生代謝產物的產量。

非生物誘導子：水楊酸，茉莉酸等,稀土及重金屬鹽類

生物誘導子：微生物類，如真菌孢子，菌絲體、真菌培養物濾液等

14、碳源：細胞培養過程中不進行光合作用，需提供糖做碳源（2-5%）。

15、維生素：肌醇（胚狀體和芽的生長），B族維生素（B1—根的生長）

16、有機物：甘氨酸或水解絡蛋白，酵母提取物等。

17、植物細胞的培養方法 1.單細胞的培養：（1）看護培養法：2）微室培養法 3）平板培養法 4）條件培養法

條件培養基指培養過細胞的培養基上清，有植物生長激素等殘留，用于制備成固體培養基 2.單倍體細胞的培養（花藥培養）

指將植物單倍體細胞培養成單倍體植株的過程。一般采取花藥作為單倍體細胞的培養對象 3.愈傷組織培養 4.毛狀根誘導和培養

毛狀根具有如下特點：激素自養，不必加外源激素；次級代謝產物含量高且穩定；增殖速度快。

18、植物原生質體培養技術

除去植物細胞壁的裸露細胞，稱為原生質體。

1、原生質體材料來源：

1、植物葉片－取材容易－比較容易用酶解法分離

2、植物根尖組織－可由各種植物的種子萌發后取得

3、植物花粉－產生單倍體原生質體

4、愈傷組織、懸浮培養的細胞－細胞壁容易解離

2、分離

1、機械法

先將細胞放在高滲溶液中預處理，待細胞發生輕微質壁分離，原體質體收縮成球形，再用機械法磨碎細胞，從傷口處可以釋放出完整的原生質體。

2、酶解法

細胞壁降解酶種類：纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、果酸酶等

3、純化

1）離心沉淀法

原理：原生質體的比重比較大，離心后原生質體沉于底部。2）漂浮法

原理：利用比重大于原生質體的高滲蔗糖溶液，離心后使原生質體漂浮其上，殘渣碎屑沉到管底。3）界面法

原理：選兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液密度大于原生質體的密度，另一種溶液小于原生質體的密度，形成不連續密度梯度，通過離心使原生質體和破損細胞處于不同液相中。

4、培養

1）液體淺層培養

將含有原生質體的培養液在培養皿底部鋪一薄層，封口后進行培養。2）液體－固體雙層培養

在培養皿的底部鋪一層瓊脂糖固體培養基，再將原生質體懸浮液滴于固體培養基表面。3）固體平板培養

瓊脂糖包埋培養。低融點的瓊脂糖可在約30℃融化與原生質體混合而不影響原生質體的生命活動?；旌虾蠛性|體的培養基鋪于培養皿底部，封口后進行培養。4）瓊脂糖珠培養

將含有原生質體的液態瓊脂糖培養基用吸管以大約50ul一滴的量滴于直徑6cm的培養皿，待其固化后向其中添加3ml液體培養基并于搖床上低速旋轉培養。

培養過程中，通過調整液體培養基的滲透壓來調節培養物的滲透壓以利于其進一步的生長和發育。

19、植物細胞融合技術

細胞融合(cell fusion)概念：又稱細胞雜交：離體條件下用人工的方法把不同的細胞通過無性方式融合成一個雜合細胞的技術。

1、融合的程序：

1、原生質體分離的分離、純化

2、融合方法選擇

3、雜種細胞的篩選

4、愈傷組織形成器官分化植株再生

5、雜種植物的鑒定

2、融合的方法：

1、鹽類融合法

2、高Ca2+和高pH值融合3、聚乙二醇（PEG）融合法

4、PEG與高Ca2+和高pH值結合融合法

5、電融合法

3、原生質體的融合過程包括3個主要階段：1)兩個或多個原生質體的質膜彼此靠近； 2)局部區域質膜緊密粘連，彼此融合；3)融合完成，形成球形的異核體或同核體。

20、雜種細胞的選擇和鑒定 1）融合體的類型

自體融合：發生在親本原生質體自身 異體融合：

1、諧和的細胞雜種：具有雙親全套染色體組的異源兩倍體

2、部分諧和的細胞雜種：雙親的染色體經逐步排斥，便發生少量染色體的重組，然后進入同步分裂，最后形成帶有部分重組染色體的植株

3、異胞質體細胞雜種：胞質是雙親的，一親本細胞核被排斥

4、嵌合細胞雜種：不同種的雙親原生質體，發生了膜融合和胞質融合，尚未發生核融合。雙親的細胞核各自發生核分裂，接著形成細胞壁，最終形成嵌合體植物

2、選擇的方法

1、互補選擇法(遺傳或抗性)

2、可見標記法

3、生長特性選擇法

4、物理特性選擇法

5、其他方法

6、熒光染料法：異硫氰酸熒光素（FITC）和異硫氰酸羅丹明（RITC）分別發出綠色和紅色 3）細胞雜種的鑒定：

①雜種植物形態特征、特性鑒定②雜種植物的核型分析③同工酶分析④分子標記鑒定

第五章

發酵工程制藥 發酵工程的概念

2、菌種的獲得與選育

3、發酵的基本過程和工藝控制

發酵工程的概念 菌種及其選育、自然育種、誘變育種、原生質體融合、基因工程育種

發酵的基本過程、發酵的工藝控制、發酵產物的提取

1、發酵工程(fermentation engineering)：

微生物工程利用微生物制造工業原料與工業產品并提供服務的技術，是生物技術的基礎工程。

2、生產菌種的選育：

1、自然選育：自然狀態下，堿基對發生自然突變的機率為10-8～10-9

2、自發突變與定向育種

3、誘變育種：用各種物理、化學的因素人工誘發基因突變進行的篩選，稱為誘變育種。物理誘變劑：紫外線

化學誘變劑 使用最多、最有效的是烷化劑。

4、原生質體融合5、DNA重組

3、發酵產物提取的方法：

1、吸附法

2、沉淀法

3、溶劑萃取法

4、離子交換法

4、菌種保藏

1、斜面低溫法：短期保存

2、石蠟油封存法：中期保存

3、沙土管：產孢子和芽孢的

4、麩皮保存法：產孢子的霉菌和放線菌，工廠用

5、甘油懸液法：基因工程菌

6、凍干保藏 ：最廣泛使用的方法。大部分菌種可以在凍干狀態下保藏10年之久。且經凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸

7、液氮法：最為有效，保藏15年以上，8、宿主保藏法：活細胞內寄生的微生物

5、發酵過程的影響因素及控制 一）菌體濃度的影響及控制

菌體濃度反應菌體細胞數和勝利特性 結構越復雜的生物，分裂所需時間越長

發酵中菌液需控制在合理濃度中，過高，營養消耗過快，有毒廢物積累，改變菌體代謝途徑，影響溶氧；過低，產率下降

二）培養基的影響及其控制

1.碳源：葡萄糖速效碳源，生長菌體，淀粉等遲效碳源，發酵次級代謝產物

2.氮源：氨基酸，玉米漿等速效氮源，生長菌體，豆餅等遲效氮源，發酵次級代謝產物

氮源太多會促使菌體大量生長。有些產物合成受到過量銨離子的抑制，因此必須控制適量的氮。

3.磷酸鹽和微量元素：微生物體內磷含量較高，培養基中以磷酸鹽為主，發酵中用來計算磷含量的是磷酸根 抗生素對磷酸鹽濃度很敏感，生長濃度：0.32-300 mol/L，生產濃度：1.0 mol/L 4.補料：補基質和前體，中途補料，豐富培養基，避免菌體過早衰老，控制PH，改善通氣等 通常在生長旺盛期后期，發酵液泡沫位下降，這時耗氧大，溶氧水平接近臨界點，補料少量多次

6、影響發酵溫度變化的因素

(1)生物熱：

微生物進行有氧呼吸產生的熱比厭氧發酵產生的熱多。

(2)攪拌熱(3)蒸發熱：通氣時，引起發酵液的水分蒸發，水分蒸發所需的熱量叫蒸發熱(4)輻射熱：發酵罐內溫度與環境溫度不同，發酵液中有部分熱通過罐體向外輻射。

7、.溫度的選擇與控制

(1)最適溫度的選擇：嗜冷菌適應于0～26℃生長，嗜溫菌適應于15～43 ℃生長，嗜熱菌適應于37～65 ℃生長，嗜高溫菌適應于65 ℃以上生長 最適生長溫度，最適生產（發酵）溫度

發酵前期 要盡快達到大量的菌體，取稍高的溫度

中期菌量 已達到合成產物的最適量，發酵需要延長中期，從而提高產量，因此中期溫度要稍低一些，發酵后期，產物合成能力降低，提高溫度，刺激產物合成到放罐。

8、pH的影響及其控制

菌體自溶，pH上升，發酵后期，pH上升

9、發酵過程pH變化的原因

1）糖代謝：特別是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是補料的標志之一（2）氮代謝：當氨基酸中的-NH2被利用后pH會下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，當碳源不足時氮源當碳源利用pH上升。（3）生理酸堿性物質利用后pH會上升或下降

10、發酵過程pH的調節

1、調節好基礎料的pH?；A料中若含有玉米漿，pH呈酸性，必須調節pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要調到6.5－6.8 ２.在基礎料中加入維持pH的物質，如CaCO3，或具有緩沖能力的試劑，如磷酸緩沖液等 ３.通過補料調節pH ４.當補料與調pH發生矛盾時，加酸堿調pH

11、溶氧的影響及其控制

溶氧(DO)是需氧微生物生長所必需。在發酵過程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成為控制因素。供氧不足，代謝異常，通氣，攪拌

12、發酵過程的溶氧變化

發酵初期，生產菌大量繁殖，需氧，溶氧下降 過了生長階段，需氧減少，溶氧上升 發酵中后期，分批發酵的溶氧不變 生產后期，菌體衰老，溶氧上升

13、CO2的影響及控制：降低通氣攪拌，則增加CO2在發酵液中溶解度

14、發酵過程泡沫的形成與控制

發酵過程起泡的利弊：氣體分散、增加氣液接觸面積，但過多的泡沫是有害的 消泡：機械消泡，消泡劑消泡：天然油脂，聚醚類消泡劑，高碳醇，硅酮類

15、染菌的防治

發酵前期最易染菌，且危害最大。

原因 ： 發酵前期菌量不很多，與雜菌沒有競爭優勢；且還未合成產物（抗生素）或產生很少，抵御雜菌能力弱。染菌措施 ： 可以用降低培養溫度，調整補料量，用酸堿調pH值，縮短培養周期等措施予以補救。如果前期染菌，且培養基養料消耗不多，可以重新滅菌，補加一些營養，重新接種再用。

第六章

酶工程制藥 酶與酶工程的概念 固定化酶和細胞的制備 酶工程技術

酶分子的定點改造、酶分子的定向進化、酶的化學修飾、抗體酶技術

1、酶工程是酶學和工程學相互滲透結合、發展而形成的一門新的技術學科。它是從應用的目的出發研究酶、應用酶的特異催化性能，并通過工程化將相應原料轉化成有用物質的技術。酶是生物細胞產生的、具有催化能力的生物催化劑。

2、固定化酶（immobilized enzyme）的定義:指限制或固定于特定空間位置的酶。具體講是指經物理或化學方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而又能發揮催化作用的酶制劑。制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是純化的酶，也可以是結合在菌體（死細胞）或細胞碎片上的酶或酶系

3、固定化酶的特點

（1）可以多次使用，酶的穩定性提高；（2）反應后，酶與底物和產物易于分開，產物中無殘留酶，易于純化。（3）反應條件易于控制，可實現轉化反應的連續化和自動控制；（4）酶的利用率高，單位酶催化的底物量增加，用酶量少；（5）比水溶性酶更適合于多酶反應。

4、固定化酶的制備原則：

（1）不改變酶的性質（2）酶結合牢固，性質穩定，易于與底物分離（3）能夠實現生產的自動化，成本合理

5、固定化酶載體材料：

A.高分子載體.天然高分子材料 殼聚糖，海藻酸鈉

合成有機高分子材 聚苯乙烯 B.無機載體 玻璃，硅凝膠，鋁等

C.復合載體：磁性高分子微球:內部含有磁性金屬或金屬氧化物的超細粉末。

6、固定化方法的選擇

①固定化酶應用的安全性 ②固定化酶在操作中的穩定性 ③固定化的成本

7、新型的酶固定化方法：光偶聯法，等離子體法，無載體固定化酶

8、固定化細胞的方法：將細胞限制或定位于特定空間位置的方法.9、固定化酶的性質

1）酶活力的變化：酶經過固定化之后活力大都下降。

2）酶穩定性的變化：包括對溫度、pH、蛋白酶變性劑和抑制劑的耐受程度。固定化后，穩定性提高，有效壽命延長。①熱穩定性提高：熱穩定性越高，工業化意義越大。熱穩定性高可以提高反應溫度和反應速度，提高效率。②對有機試劑及酶抑制劑的穩定性提高③PH，蛋白酶等穩定性提高

3）酶學特性的變化：A、底物專一性：對底物的專一性下降。

B、最適pH：最適pH可能變大，也可能變小；pH-酶活曲線可能發生變化，其變化與酶蛋白和載體的帶電性質有關。

C、最適溫度：一般升高。原因是固定化后空間結構更為穩定。

D、米氏常數(Km)：Km值均發生變化，有的增加很小，有的增加很大，但不會變小。

E、最大反應速度（Vm）：變化很小或不變。

10、酶工程研究新技術

一、酶分子的定點改造：有目的的改變酶的特定活性位點或基因，產生具有新性狀的酶。定點突變是酶分子定點改造的常規手段，廣泛用于改善酶的性能。

定點突變是有目的的在已知DNA序列中取代、插入或刪除特定的核苷酸。定點突變的方法：

（1）引物介導的定點突變（2）PCR介導的定點突變（3）盒式突變

二、酶分子的定向進化

酶分子的定向進化（directed evolution）：模擬自然進化過程（隨機突變和自然選擇），在體外進行酶基因的人工隨機突變，建立突變基因文庫，在人工控制條件的特殊環境下，定向選擇得到具有優良催化特性的酶的突變體的技術過程。特點：適應面廣；目的性強；效果顯著。定向進化的基本規則是“獲取你所篩選的突變體”。定向進化=隨機突變+定向選擇。

三、酶的化學修飾：

通過主鏈的切割、剪接和側鏈基團的化學修飾對酶蛋白進行分子改造，以改變其理化性質及生物活性。

目的：① 提高酶的生物活性

② 增強在不良環境中的穩定性

③ 降低或消除其免疫原性 方法：（1）酶的表面化學修飾

： 可降低酶的免疫原性，提高酶的穩定性；或使酶固定到某一載體上。（2）酶分子內部修飾（3）結合定點突變的化學修飾 ：制備化學修飾突變酶，從而得到一些新穎的酶制劑。

修飾酶的特性：⑴熱穩定性提高 ⑵抗各類失活因子能力提高

⑶抗原性消除 ⑷體內半衰期延長 ⑸最適pH改變 ⑹酶學性質變化（Vmax不變，Km變大 ⑺對組織分布能力改變

11、抗體酶技術：能與過渡態結合的抗體也具有酶的性質 抗體酶是酶還是抗體 ？

抗體——是B細胞識別抗原后增殖分化為漿細胞所產生的一種蛋白質，主要存在于血清等體液中,能與相應抗原特異性地結合，具有免疫功能。其本質是一類免疫球蛋白。抗體酶是酶的高效催化能力和抗體的高度選擇性巧妙結的產物，本質上是一類具有催化活力的免疫球蛋（Ig）其實抗體酶是一種特殊的抗體，它有著催化特性，可謂是酶和抗體性質的兼得。所以又被稱為催化抗體?？贵w酶的制備：誘導法，基因工程法，拷貝法，化學修飾法

酶傳感器：它將活性物質酶覆蓋在電極表面,酶與被測的有機物或無機物反應,形成一種能被電極響應的物質 第七章 藥物生物技術新進展 新產品

新疫苗

1、多肽疫苗

2、基因疫苗

核酸藥物1.核酶2.反義核酸藥物3.RNAi藥物

1、抗體工程制藥

主體：細胞工程技術和基因工程技術

2、理想的抗體藥物的性質：

1、高特異性和高親和力

2、對人沒有免疫原性，不誘導機體對抗體的排斥反應 游離抗體不激活補體

3、一旦結合到靶抗原上，能誘導效應功能細胞系穩定，適合在無血清培養基中進行大規模培養

4、抗體符合生物制品標準

3、抗體治療存在的問題：

1、異源蛋白導致產生抗抗體，影響靶向性和效果

2、靶部位攝取的量太低

3、效應功能弱

4、在體內被清除速度快

4、基因工程抗體的概念：利用DNA重組技術和蛋白質工程技術對編碼抗體分子的基因按照不同需要進行加工改造和重新裝配，再轉染到合適的受體細胞中所表達的抗體分子。

特點：

1、減少或消除排斥反應

2、分子小，穿透力強，易到達病灶核心部位

3、抗體功能多樣化

4、可采用多種表達系統，成本低

研究內容 ①抗體人源化：②構建抗體庫從中篩選新的單抗

種類： 人一鼠嵌合抗體：一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(V區）與人抗體的恒定區（C區）融合而得到的抗體。第一代 鼠單抗可變區的人源化－改型抗體 第二代 小分子抗體 1)Fab 完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。2)Fv 或 ScFv Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。

單鏈抗體（ScFv）的構建在已知親本DNA序列時可用完全人工合成法;如果從雜交瘤細胞系構建單鏈抗體，可用PCR方法擴增可變區基因，再組裝到適當的表達載體上。單鏈抗體最常用的表達體系是大腸桿菌

3)單域抗體 即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結構域構成，故稱單域抗體。

4)最小識別單位 約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構成，它也保持著抗體的特異性。4 雙特異抗體和多價抗體 雙鏈抗體（Diabody）乃是一種小分子的雙價雙特異性抗體片段。

特異性抗體(bispecific antibody,BSAb)是指能同時識別2種抗原的抗體。1種為對應腫瘤相關抗原。另1種為對應效應成分。即能結合靶腫瘤細胞又能結合高細胞毒性的效應細胞, 抗體融合蛋白主要分兩種形式： Fc融合蛋白

抗原結合融合蛋白 1)免疫粘附素

2、免疫毒素

噬菌體抗體庫技術

定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉染工程細菌進行表達，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。

特點 模擬天然全套抗體庫 避開了人工免疫和雜交瘤技術 可獲得高親和力的人源化抗體

轉基因技術制藥

轉基因動物（transgenic animal）是指借助基因工程技術將外源基因導入受體動物染色體內，外源基因與動物基因整合后隨細胞的分裂而擴增，在體內表達并能穩定地遺傳給后代的動物。

培育1 目標基因克隆和體外重組 2 外源基因的導入3 外源DNA整合、轉錄及表達的分子檢測轉基因動物品系或品種的建立

轉基因動物技術路線 ：

1、外源目的基因的制備

2、外源目的基因有效導入生殖細胞或胚胎干細胞

3、選擇獲得攜有目的基因的細胞

4、選擇合適的體外培養系統和宿主動物

4、轉基因細胞胚胎發育及鑒定

5、篩選所得的轉基因動物品系

外源基因的轉移：

1、顯微注射法

2、逆轉錄病毒載體感染

3、胚胎干細胞介導法

4、精子載體介導法

5、YAC介導的基因轉移

6、細胞核移植

胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）是從早期胚胎內細胞團（ICM）分離出來的，能在體外培養的一種高度未分化的多能干細胞。

精子與外源DNA結合的機理：

精子直接與外源DNA混合培養，外源基因可以直接進入精子頭部，受精后就可發育成轉基因動物。后來Rottman對此方法進行了改進，將外源DNA在與精子共孵育之前用脂質體包埋，使脂質體與DNA相互作用形成脂質體——DNA復合物。這種復合體比較容易和精子細胞融合，從而進入細胞內。

轉基因動物的應用：1）生物制藥(乳腺生物反應器)；（2）建立人類疾病的動物模型；（3）生產可移植用的動物器官。

動物乳腺生物反應器

一般把目的片段在器官或組織中表達的轉基因動物叫動物生物反應器（bioreactor），幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經過人為馴化為生物反應器,從生產的角度考慮，生物反應器選擇的組織和器官要方便產物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發展了動物乳腺生物反應器,動物血液生物反應器和動物膀胱生物反應器等。其中，轉基因動物乳腺生物反應器的研究最為引人注目。

基因芯片

基因芯片(gene chip)又稱DNA芯片(DNA chip)或DNA微陣列(DNA micro-array)。基因是載有生物體遺傳信息的基本單位，存在于細胞的染色體上；將大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上，稱之為基因芯片。

原理：基因芯片技術是建立在基因探針和雜交測序技術上的一種高效、快速的核酸序列分析手段?；蛐酒夹g主要包括四個主要步驟：芯片制備、樣品制備、雜交反應和信號檢測以及結果分析。

1、芯片制備

1）合成探針

2）探針在載體表面的固定

探針在載體表面的固定可分為兩大類方法：

合成后點樣，多用于大片段DNA，有時也用于寡核苷酸，甚至mRNA。原位合成（即在支持物表面原位合成寡核苷酸探針），適用于寡核苷酸。原位合成（在片合成）有三種途徑：，原位光刻合成，點樣法，分子印章原位合成法（東南大學發明）。

3、雜交反應 雜交反應是熒光標記的樣品與芯片上的探針進行的反應產生一系列信息的過程。

蛋白質芯片（protein chip），又稱蛋白質微陣列(protein microarray)，是用于蛋白質功能研究及相互作用分析的生物芯片，采用原位合成、機械點樣或共價結合的等方法將多肽、蛋白、酶、抗原、抗體固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝膠、尼龍膜等固相介質上形成的生物分子點陣。

芯片實驗室是將樣品制備、生化反應和檢測分析的全過程集約化，并縮微到一張芯片上自動完成，形成的所謂微型全分析系統（micro total analysis systen,μ-TAS）,或稱“縮微芯片實驗室”（lab-on-a-chip）。

生物芯片的應用：

1、尋找和發現新基因

2、基因表達分析

3、DNA序列測定與序列間比較

4、突變體和多態性的檢測

基因治療

基因治療：指應用DNA重組技術，將外源正?；驅氚屑毎?，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病,以達到治療的目的。

基因療法：

1、重建基因調控系統

2、替代異常基因

3、封閉致病基因

4、剪去致病基因

5、修復受損基因

6、增強基因效能

基因干預

基因干預(gene interference)：指采用特定的方式抑制某個基因的表達，或者通過破壞某個基因而使之不表達，以達到治療疾病的目的。

基因干預的種類：1核酶： 裂解特異的靶mRNA 2反義RNA： 封閉基因表達 3 RNA干涉技術

腫瘤治療中基因的選擇：

1.能改變腫瘤細胞的惡性表型的基因

腫瘤細胞主要有癌基因的突變、擴增、過度表達，對此可采用反義核酸或核酶；抑癌基因的突變、失活等，可采用野生型的正?；蜃鳛橹委熁颍谜；蛱蕹蛱鎿Q缺陷基因。2.能提高腫瘤細胞的免疫原性的基因

3.腫瘤藥物增敏基因 常用的自殺基因有單純皰疹病毒胸苷激酶（HSK-TK）基因，基因載體的選擇 ：有病毒載體和非病毒體兩類，多用病毒載體，如逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒載體。

基因治療中體細胞的選擇：

1、免疫細胞

2、骨骼肌細胞

3、血管平滑肌細胞

1、成纖維細胞： 成纖維細胞位于全身并具有較強的自我更新能力。優點有：①易于獲得；②容易體外培養和擴增；③分裂中的成纖維細胞易與逆轉錄病毒一起穩定轉導，并能較穩定的表達外源目的基因；④攜帶外源基因后能穩定地回植體內并進行表達等。

主要缺點是在體內由于細胞凋亡而引起的基因表達失活。

2、造血干細胞

造血干細胞是基因治療遺傳病、自身免疫性疾病及癌癥常用的靶細胞。

理想載體應具備下列條件：安全無毒害；不引起免疫反應；高濃度或高滴度；能高效轉移外源基因 ,持續有效表達外源基因；可靶向特定組織細胞；可調控；容納外源基因可大可??；可供體內注射（包括全身性靜脈注射）；便于規模生產供臨床應用，可惜目前所應用的載體尚沒有一個能符合上述全部的條件。這是今后努力研究的方向?；蚪M學與新藥研究 基因組（genome）：生物體單倍體細胞所有基因的總和?；蚪M學（genomics）：DNA測序、基因及非編碼區定位及繪圖。

人類基因組計劃（human genome project）人類基因組測序、基因定位、破譯人類全部遺傳信息。世紀90年代初期, 美國生物學家提出并實施了人類基因組計劃(human genome project, HGP),2003年4月14日,美國人類基因組研究項目首席科學家Collins F 博士在華盛頓隆重宣布: 人類基因組序列圖繪制成功。

藥物基因組學

概念：藥物基因組學是以提高藥物療效及安全性為目標，研究遺傳變異與藥物反應相互關系的一門學科。藥物效應個體差異：不同個體對同一藥物同一劑量的反應存在量與質的差異

藥物基因組學的目的是通過基因分型指導個體化治療，研究的主要策略包括選擇藥物起效、活化、排泄等相關過程的候選基因進行研究，鑒定基因序列的變異。

一）候選基因分析 候選基因分析（candidate gene approach）通過對已知候選基因與性狀表型值的關聯分析判斷其是否就是主基因（藥代動力學和藥效動力學相關基因）或是否與主基因緊密連鎖。候選基因”策略

給定某一藥物的條件下，比較有反應者及無反應者靶基因多態性出現的頻率。

局限性：

須明確給定藥物的作用機制、所治療疾病的病理生理學；

不能鑒定那些根據藥物作用或疾病生物學難以預測的新基因。

二）全基因組關聯分析 全基因組關聯分析（Genome-wide association study，GWAS）是一種在全基因組范圍內尋找與藥物應答相關遺傳變異的方法。

GWAS為人們打開了一扇通往研究復雜疾病的大門，將在患者全基因組范圍內檢測出的SNP位點與對照組進行比較，找出所有的變異等位基因頻率，從而避免了像候選基因策略一樣需要預先假設致病基因。

藥物基因組學的根本目的

運用遺傳信息進行個性化用藥，將正確藥物、正確劑量在恰當的時間給予合適的患者。

后基因組時代

在后基因組時代, 研究的重心已從揭示生命的所有遺傳信息轉移到在整體水平上對生物功能的研究。

轉向的第一個標志——產生了功能基因組學的新學科。另一個標志——產生了一門在整體水平上研究細胞內全部蛋白質組成及其活動規律的新興學科—蛋白質組學。生命現象的主要體現者是蛋白質

而蛋白質有其自身的特定活動規律,僅僅從基因的角度來研究是遠遠不夠的

必須研究由基因轉錄和翻譯出蛋白質的過程,才能真正揭示生命現象的本質和規律。蛋白質組學的研究策略：

采用高通量的蛋白質組研究技術，分析生物體內盡可能多乃至接近所有的蛋白質。（結構、相互作用）研究不同時期細胞蛋白質組成的變化，如蛋白質在不同環境下的差異表達，以發現有差異的蛋白質種類為主要目標。（疾病研究——診斷、藥物靶點）

新型疫苗，多肽疫苗：基因工程疫苗，基因疫苗

核酶——一種具有核酸內切酶活性的RNA分子，可特異性地切割靶RNA序列，具有解離后重復切割相同靶分子的能力，應用前景：抗腫瘤，抗抗藥性，抗AIDS，抗白血病，抗病毒病 靶向腫瘤細胞是以 RNA 干擾為基礎的腫瘤治療的重要發展方向。

第八章 藥物制劑的設計

【掌握】藥物制劑設計的基本原則；【熟悉】藥物制劑設計的內容，制劑處方設計前工作； 【了解】制劑處方的優化設計；新藥制劑的研究與申報。

藥物制劑設計的程序：

1）對處方前工作包括理化性質、藥理學、藥動學有一個較全面的認識。如果某些參數尚未具備，而又是劑型設計所必須得，應先進行試驗，獲得足夠的數據以后，再進行處方設計 2）根據藥物的理化性質和治療需要，結合各項臨床前研究工作，確定給藥的最佳途徑，并綜合各方面因素，選擇合適的劑型；（3）根據所確定的劑型的特點，選擇合適于劑型的輔料或添加劑，通過各種測定方法考察制劑的各項指標，采用實驗設計優化法對處方和制備工藝進行優選。

藥物制劑的設計的五個基本原則 1.安全性 2.有效性 3.可控性 4.穩定性 5.順應性

藥物制劑設計的目的是根據：

疾病的性質；臨床用藥的需要；藥物的理化性質；合適的輔料；制備工藝；制劑的最佳處方和工藝條件；確定包裝

處方前研究

一、化合物的物理化學性質測定 解離常數 溶解度

對于易溶于水的藥物，可以制成各種固體或液體劑型，適合于各種給藥途徑

油水分配系數

油/水分配系數是分子親脂特性的度量，在藥劑學研究中主要用于預見藥物對在體組織的滲透或吸收難易程度。固有溶出速率

二、原料藥的固態性質 鹽型 多晶型 吸濕性

水溶性藥物在大于其臨界相對濕度的環境中吸濕量突然增加，而水不溶性藥物隨空氣中的RH的增加緩緩吸濕。粉體學性質

三、穩定性和配伍研究 藥用化合物的穩定性 輔料的配伍研究

四、處方前生物藥劑學研究 藥物的吸收

在有效期內保持穩定 生物藥劑學分類系統 侯選化合物的藥代動力學

固體制劑的配伍研究

輔料的添加對固態藥物的物理穩定性和化學穩定性都有影響。用dsc

液體制劑的配伍研究

第四篇：生物技術制藥教學大綱

第一章 緒論（2學時）第一節 生物技術概述 1 生物技術的概念 2 生物技術發展史 第二節 生物技術制藥 1 生物技術制藥的概念 2 生物技術在制藥中的應用 我國生物技術制藥現狀和發展前景 4 醫藥生物技術發展展望

第二章 生物藥物（10學時）

1．生物藥物的來源、特性、分類與制備。（2學時）

2．氨基酸類藥物：氨基酸類藥物研究概況；在醫藥中的應用；氨基酸生產。（2學時）3．多肽、蛋白質類藥物：多肽、蛋白質類藥物的特點、分離純化方法、工業生產制備過程。（2學時）

4．核酸類藥物：概述（分類、應用）；生產方法；核酸類藥物的制備。（2學時）5．糖類藥物：制備；純化。（2學時）

第三章 基因工程制藥（8學時）

通過本章學習，了解基因工程藥物研制的意義，掌握基因工程藥物的研制過程、研制方法。1概述。

2基因工程藥物生產的基本過程。(2)3目的基因的獲得：直接分離法；從基因文庫中篩選；逆轉錄法；人工合成法。4目的基因與運載體的體外重組：常用載體；目的基因與運載體的體外重組。5重組分子導入受體細胞；導入方法；影響轉化的因素；陽性重組體的篩選。(2)6基因表達：大腸桿菌中的基因表達；真核基因在原核生物中的表達方式；真核基因在真核生物中的表達；真核基因在動物細胞中的表達。(2)7基因工程下游技術；下游技術的要求；基因工程菌的穩定性；基因工程菌發酵。8基因工程藥物的分離、純化：分離純化的基本過程；分離純化的技術。

9基因工程藥物的質量控制:材料的質量控制;培養過程的質量控制;純化工藝工程的質量控制。(2)第四章 動物細胞工程制藥（8學時）1 概述： 形態及生理特性。（2）生產用的動物細胞：生產用動物細胞的要求；生產用動物細胞的獲取。4 基因工程細胞的構建和篩選；真核細胞基因表達載體的構建；基因載體的導入和高效表達工程細胞株的篩選。（2）動物細胞的培養條件和培養基 6 動物細胞培養的基本方法（2）7 動物細胞大量培養的方法和操作方式 動物細胞生物反應器及檢測控制系統：攪拌式生物反應器；氣升式生物反應器；流化床生物反應器。（2）

第五章 抗體制藥（4學時）1概述

2單克隆抗體：制備；細胞融合；雜交瘤的培養、篩選及克隆化。（2）

3鼠源性單克隆抗體的改造：Ig分子的結構模式圖；結構改造；基因工程抗體。4抗體的應用：臨床檢驗；層析介質；導向藥物。（2）

第五篇：生物技術制藥現狀及發展前景

新疆農業大學

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指導教師: 文獻綜述生物技術制藥現狀及發展前景劉元元農學院生物技術082班083135210張華 職稱 教授

2011 年 11 月 21日

生物技術制藥現狀及發展前景

作者：劉元元指導老師：張華

摘要：生物技術制藥是以基因工程為基礎的現代生物工程，即利用基因工程技術、細胞工程技術、微生物工程技術、酶工程技術、蛋白質工程技術、分子生物學技術等來研究和開發生產出傳統制藥技術難以獲得的生物藥品。生物制藥業是目前生物技術發展最活躍，進展最快的產業之一，21世紀是生物制藥行業飛速發展的時代。關鍵字：生物技術制藥；研究進展；現代生物技術；新技術

Biotechnology pharmaceutical situation and development prospect

Abstract: Biotechnology-based pharmaceuticals is based on modern genetic engineering, biological engineering, namely the use of genetic engineering, cell engineering, microbial engineering, enzyme engineering, protein engineering, molecular biology technology to research and development and production of the traditional system Difficult to obtain bio-medicine technology medicine.Biopharmaceutical industry is currently the most active in the development of biotechnology, one of the industries most advanced, 21st century is the rapid development of bio-pharmaceutical industry of the time.Keywords: Biotechnology Pharmaceutical;Research;Modern biotechnology;New Technology生物技術制藥現狀

現代生物技術是以基因為源頭，基因工程和基因組工程為主導技術，與其他高技術相互交叉、滲透的高新技術。比爾·蓋茨預言：下一個首富可能是從事生物技術的投資者。生物技術制藥可以分為二類：一類是生化藥物，主要是運用生物化學方法從生物體中分離．純化得到的一些生物活性物質，如維生素、酶、核酸、激素等；另一類是生物醫藥，主要是以微生物、生物組織、人或動物的血液等原料采用物理方法和生物化學工藝制得的生物活性制劑、血液制品、抗血清、抗毒素等。

1.1 非基因工程生化物

此類藥物有腦蛋白水解物注射液、玻璃酸鈉、分子肝素鈣、分子肝素鈉、促肝細胞生長素、蚓激酶、甘糖酯等共97種。

1.2 先導化合物

以天然產物為先導化合物，通過組合化學技術合成大量結構相關的物質，建立有序變化的化合物庫，供藥物篩選和藥效關系研究用。

1.3 生化制藥中先進分離分析技術的運用

多種層析（如親和層析、高效液相層析）、超速離心等技術的運用，可成功地制得高純度的生化藥物。如尿激酶、胰島素、重組人胰島素、激肽釋放酶、輔酶A、肝素鈉等都是通過這種技術使藥效得到較大的提高。

1.4 應用生物技術、化學合成、結構后修飾研究開發新藥

應用上述技術系統綜合研制開發的新藥，主要有以下各類藥物：1）多糖類，如玻璃酸鈉、香菇多糖、低分子肝素等；2）酶及酶抑制劑類，如門冬酚胺酶、葡激酶、人胰蛋白酶抑制劑、膠原酶、降纖酶等；3）多肽類，如人降鈣素、鮭魚降鈣素等；4）細胞因子類，如白介素-

6、腫瘤壞死因子、神經生長因子、血小板生成素等；5）結構后修飾類，如修飾門冬酚胺酶、修飾超氧化物歧化酶等。

1.5 應用生物技術改造傳統制藥工藝

微生物發酵是制藥工業生產微生物藥品的重要手段。微生物轉化是利用微生物產生的特異酶完成特定的生化反應，使有機物轉變成工業產品。由于生物藥品具有療效好、副作用小、且可大規模生產、利潤極高、無環境污染等優點，受到各國政府重視，行業前景十分廣闊。

2生物制藥研究新進展

2.1 計算機輔助藥物設計技術發展

計算機技術的發展和向藥物化學學科的滲透，促進了藥物設計的發展。20 世紀90年代計算機輔助藥物設計取得突破性進展，現已成為藥物研究和開發的重要方法和工具。

計算機輔助藥物設計利用了計算機快速、全方位的邏輯推理功能、圖形顯示控制功能，并將量子化學、分子力學、藥物化學、生物化學和信息科學結合起來，研究受體生物分子與藥物結合部位的結構與性質、藥物與受體復合物的構型和立體化學特征、藥物與受體結合的模式和選擇性、特異性、、藥物分子的活性基團和藥效構象關系等，從藥物機理出發，改進現有生物活性物質的結構，快速發現并優化先導化合物，使其盡早進入臨床前研究，減少傳統的新藥研究的盲目性，縮短新藥研制的時間。

計算機輔助藥物設計有兩類方法，一類是基于機理的藥物設計（MBDD），另一類是基于結構的藥物設計（SBDD），基于機理的藥物設計要針對藥物作用機理，從靶點出發，考慮藥物與受體的作用過程，并要模擬藥物在體內的吸收、轉運、代謝等動態過程，比基于結構的藥物設計更合理，但該法還不成熟。目前的計算機輔助藥物設計主要還是基于結構的藥物設計，今后的計算機輔助藥物設計的目標是向基于機理的藥物設計方向發展。相信隨著生命科學和計算機科學的發展，考慮藥物不同作用機理和全部作用過程的計算機輔助藥物設計技術將逐步建立并不斷完善。

2.2 組合化學與高通量篩選技術發展

組合化學是近20年發展起來的一種合成大量化合物的新方法，它是建立在高效平行的合成之上，在同一個反應器內使用相同條件同時制備出多種化合物，建立各類化合物庫的策略。組合化學通常采用操作、分離簡便的固相化學合成。液相化學合成技術也在快速發展和完善中。

在藥物研究過程中，通過化合物活性篩選而獲得具有藥物活性的先導化合物是新藥研究的基礎。隨著分子水平的藥物篩選模型的建立，篩選方法和技術都發生了根本性的變化，出現了高通量篩選的新技術，大大加快了先導化合物的尋找和發現，并促進了高通量有機合成。近年來，組合化學與高通量篩選結合，使組合化學的化合物庫種類、數量不斷擴大，篩選的先導化合物數量和種類也在不斷地增多，使新藥的種類和數量也在不斷地增加。組合化學實現的自動化合成僅20世紀90年代后得到的各類化合物總和已超過了人類有史以來所發現化合物的總和，故有人把組合化學與高通量篩選結合技術稱為“新藥發現的高速公路”，據文獻記載，1992年～1998年的幾年，經過組合化學化合物庫與高通量篩選，確定的候選藥物已有46個，并已進入人體測試階段。顯然，組合化學與高質量篩選的結合技術，大大地加快了新藥研制的步伐。雖然如此，組合化學建立的大型化合物庫，為篩選也帶來了困難，因此，利用組合化學設計，構建具有結構多樣性的小型而便于篩選的組合化合物庫，結合化學信息學和高通量篩選，將是組合化學與高通量篩選結合的一項重要課題。

2.3 藥物手性合成技術發展

化學合成技術在新藥發現過程中發揮著十分重要的作用。近年來由于有機化學學科新理論、新反應、新技術不斷發現，使得合成反應具有化學選擇性成為現實，并促進了藥物合成技術的快速發展，其中手性合成技術使新藥研制的領域不斷擴大。

手性是自然界的本質屬性。在生物體手性環境，如酶、受體、離子通道、蛋白質、載體中，分子之間手性匹配是分子識別的基礎，受體與配體的專一作用，酶與底物的高度、區域、位點和立體催化專一性，抗原與抗體的免疫識別都與手性有關，同時藥物的生物應答常受到手性影響，包括藥物在體內的吸收、轉運、分配、位點活性的作用以及代謝和消除。所以，手性藥物的開發是當前醫藥界重點研究的熱點之一，并取得了令人注目的成就。目前已上市的藥物中手性藥物約占1/3，如2000年全球手性藥物銷售額達1233億美元。

手性藥物的制備技術主要有拆分法、化學合成法和生物合成等三大類，發展較快的是后二類?；瘜W合成法是在不對稱催化劑存在下，利用化學反應的動力學和熱力學不對稱性，進行單一對映體合成。在已上市的手性藥物中，其手性中間體均可通過現有的重（雙）鍵不對稱還原技術，特別是不對稱氫化和不對稱轉移氫化來合成。至今為止在不對稱催化合成中，昂貴的手性配體和貴金屬的使用，以及手性催化劑的催化效率仍是制約其在手性技術上應用的關鍵。因而，手性催化劑的設計和合成，以及催化劑的回收循環使用是當今不對稱催化合成研究的方向。

生物合成法則利用催化劑, 酶-催化反應的高度、底物、區域、位點和立體選擇性來合成手性藥物。生物合成法具有選擇性高、產率高、反應條件溫和等特點，隨著科學技術的發展，生物合成法將成為手性制備的高效手段。

2.4 藥物生物技術發展

生物技術藥物是指利用DNA重組技術或單克隆抗體技術或其它生物技術研制的蛋白質、抗體或核酸類藥物，它是目前生物技術研究最為活躍的領域，給生命科學的研究和生物制藥工業帶來了革命性變化。未來生物技術的展望

研究和發展方向：我國生物制藥產業的研發方向要結合傳統醫藥的優勢，發展重點應針對神經系統、腫瘤、心血管系統、艾滋病及免疫缺陷等重大疾病的多肽、蛋白質和核酸。乙肝基因疫苗與單克隆抗體的研究開發、血液替代品的研究與開發、生物技術在醫藥領域的應用，如基因治療、生物人基因芯片、干細胞等。目前，我國已經制定了明確的生物制藥產業發展規劃和產業技術政策，政府從上到下對生物技術研究開發的支持和政策扶持；國內各大企業（包括民營企業）對生物技術的關注和資金投入；我國金融界積極參與生物技術產業的發展，尤其是許多有實力的公司都參與了生物技術的開發；而我國生物技術產業領域目前已經匯集了一批自己培養和從國外歸來的具有高學歷、高素質的科學家和企業家，這四方面的因素對于我國生物技術產業的快速發展起到了很重要的作用。由于生物醫藥產業投資回報周期為5 年至8 年，而我國進人生物工程領域的時間尚短，回報的周期尚未到來。預計到二十一世紀的前幾年將是我國生物制藥產業的收獲季節。

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