第一篇：生物技術制藥考試題復習

一：選擇題

1、酶的主要來源是（C）

A、生物體中分離純化 B、化學合成 C、微生物生產 D、動/植物細胞與組織培養

2、所謂“第三代生物技術”是指(A)A、海洋生物技術 B、細胞融合技術 C、單克隆技術 D、干細胞技術

3、菌體生長所需能量與菌體有氧代謝所能提供的能量在什么情況下，菌體往往會產生代謝副產物乙酸：(A)A、大于 B、等于 C、小于 D、無關

4、促紅細胞生長素（EPO）基因能在大腸桿菌中表達，但卻不能用大腸桿菌的基因工程菌生產人的促紅細胞生長素，這是因為：（E）

A、人的促紅細胞生長素對大腸桿菌有毒性作用

B、人促紅細胞生長素基因在大腸桿菌中極不穩定

C、大腸桿菌內毒素與人的促紅細胞生長素特異性結合并使其滅活 D、人的促紅細胞生長素對大腸桿菌蛋白水解酶極為敏感 E、大腸桿菌不能使人的促紅細胞生長素糖基化

5、目前基因治療最常用的載體是：(B)A、腺病毒 B、反轉錄病毒 C、腺相關病毒 D、痘苗病毒 E、皰疹病毒

6、cDNA第一鏈合成所需的引物是：（D）

A、Poly A B、Poly C C、Poly G D、Poly T E、發夾結構

7、為了減輕工程菌的代謝負荷，提高外源基因的表達水平，可以采取的措施有：(A)A將宿主細胞生長和外源基因的表達分成兩個階段

B、在宿主細胞快速生長的同時誘導基因表達

C、當宿主細胞快速生長時抑制重組質粒的表達

D、當宿主細胞快速生長時誘導重組質粒的復制

8、基因工程制藥在選擇基因表達系統時，首先應考慮的是：(A)A、表達產物的功能 B、表達產物的產量 C.表達產物的穩定性

D.表達產物分離純化的難易

9、疫苗出產前需進行理化鑒定、效力鑒定和（安全性鑒定）。

10、基因工程藥物的化學本質屬于：(C)A.糖類 B.脂類 C.蛋白質和多肽類 D.氨基酸類

11、用聚二乙醇（PEG）誘導細胞融合時，下列錯誤的是：(C)A、PEG的相對分子量大，促進融合率高 B、PEG的濃度高，促進融合率高

C、PEG的相對分子量小，促進融合率高 D、PEG的最佳相對分子量為4000

12、以大腸桿菌為目的基因的表達體系，下列正確的是：(C)

A、表達產物為糖基化蛋白質 B、表達產物存在的部位是在菌體內

C、容易培養，產物提純簡單D、表達產物為天然產物

13、人類第一個基因工程藥物是：(A)

A、人胰島素 B、重組鏈激酶 C、促紅細胞生成素 D、乙型肝炎疫苗

14、下列不屬于加工改造后的抗體是：(C)A、人-鼠嵌合抗體 B、單鏈抗體C、鼠源性單克隆抗體 D、單域抗體

15、動物細胞培養的條件中，不正確的是：(D)A.最適pH為7.2-7.4 B.最適溫度為37±0.5C C.最理想的滲透壓為290-300mOsm/kg D.氧濃度為100%

16、第三代抗體是指：(D)A、B淋巴細胞合成和分泌的球蛋白 B、多發性骨髓瘤細胞產生的免疫球蛋白

C、融合細胞產生的單克隆抗體D、利用基因工程技術制備的基因工程抗體

17、現代生物技術的標志是：(C)A、DNA互補雙螺旋結構模型的提出 B、DNA測序技術的誕生 C、第一只克隆羊“多莉”的誕生 D、人類基因組草圖的完成18、獲得目的基因最常用的方法是：(B)A、化學合成法 B、PCR技術 C、逆轉錄法 D、DNA探針技術

19、疫苗組成是由抗原和（佐劑）組成

20、鳥槍法克隆目的基因的戰略適用于（A）

A、原核細菌B、酵母菌C、絲狀真菌D、植物E、人類

21、cDNA法獲得目的基因的優點是：（B）A.成功率高 B.不含內含子 C.操作簡便

D.表達產物可以分泌 E.能糾正密碼子的偏愛性

22、有機相酶反應的優點：

1．有利于疏水性底物的反應；2．可提高酶的熱穩定性；3．從低沸點的溶劑中易分離純化產物；4．熱力學平衡向產物方向移動如脂合成和肽合成；5．減少由水引起的副反應，如水解反應；6．酶易于實現固定化；7．酶和產物易于回收；8．可避免微生物污染。

23、抗體發展階段：抗血清、單克隆抗體、基因工程抗體。24、25、凝膠過濾層析進行分離的依據是：分子大小

26、質粒載體必備三要素：復制子、選擇標記、多克隆位點。

27、體外培養動物細胞三類型：貼壁依賴性細胞、非貼壁依賴性細胞、兼性貼壁細胞。

28、下列關于細胞凍存及復蘇過程的描述不正確的是（B）。A.凍存的細胞提前一天更換全部培養液 B.細胞凍存的原則為快速凍存

C.每只凍存管中以凍存（1～1.5）×106個細胞為宜 D.凍存液中含有8％二甲基亞砜

E.復蘇時將凍存細胞從液氮中取出迅速投入42℃溫水中速溶

29、能將IgG水解成兩個抗原片段和一個可結晶片段的是：（木瓜蛋白酶）。30、單克隆技術抗體是B細胞和（雜交瘤細胞）的結合。

31、所謂“第二代基因工程”是指(A)A、蛋白質工程 B、細胞工程 C、酶工程 D、抗體工程

32、酶和細胞固定化最常用、最有效的方法是：(A)A、載體結合法 B、交聯法 C、包埋法 D、選擇性熱變性法

33、真核基因在大腸桿菌中以融合蛋白形式表達，下列錯誤的是：(D)A、基因操作簡便 B、只能作抗原用

C、容易實現高效表達 D、易被細菌酶類水解

34、目前應用最廣泛的產酶菌是：(A)A.大腸桿菌 B.枯草桿菌 C.青霉菌 D.鏈霉菌

35、大腸桿菌的基因表達系統為(A)A、pBV220/pET B、YEp/YRp C、pUC/λgt11 D、pBR322/λgt10

36、用于生產α-干擾素的動物細胞是(A)A、Namalum Namalwa B、Vero C、WI-38 D、MIRC-5

37、外源基因在動物細胞與大腸桿菌中表達產物的主要區別是(A)A.糖基化 B.產量高 C.性質穩定 D.療效可靠

38、基因表達最常用的宿主菌是(A)A.大腸桿菌 B.枯草芽孢桿菌 C.鏈霉菌 D.酵母

39、篩選雜交瘤細胞（脾-瘤融合細胞）選用的培養基是(B)A、HT B、HAT C、RMP1640 D、BME

40、采用凝膠過濾法分離單克隆抗體，最高峰屬于(A)A、IgG B、IgM C、IgA D、IgE

41、改造鼠源性單克隆抗體的首要目的是(C)

A、降低相對分子量 B、增加組織通透性 C、降低免疫源性 D、延長半衰期

42、鼠源性單克隆抗體改造后得到小分子抗體，常用的是(B)A、單域抗體 B、單鏈抗體 C、Fab片段抗體 D、最小識別單位

43、最具有抗原活性的蛋白是：（丙種球蛋白）。

44、基因工程的單元操作順序是（A）

A．酶切，連接，轉化，篩選，驗證 B.酶切，轉化，連接，篩選，驗證 C．連接，轉化，篩選，驗證，酶切 D.驗證，酶切，連接，篩選，轉化 E.酶切，連接，篩選，轉化，驗證

45、CHO-K1細胞來源于：答案：中國倉鼠卵巢。

46、下列五個DNA片段含有回文結構的是（D）

A．GAAACTGCTTTGAC B.GAAACTGGAAACTG C.GAAACTGGTCAAAG D.GAAACTGCAGTTTC E.GAAACTGCAGAAAG47、48、T4-DNA連接酶是通過形成磷酸二酯鍵將兩段DNA片段連接在一起，其底物的關鍵基團是（D）

A．2’-OH和5’-P B.2’-OH和3’-P C.3’-OH和2’-P D.3’-OH和5’-P E.5’-OH和3’-P

49、目前工業上生產酶的方法大多數是（微生物發酵）。

50、若某質粒帶有lacZ標記基因，那么與之相匹配的篩選方法是在篩選培養基中加入（D）

A、半乳糖B、葡萄糖C、蔗糖

D、5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷（X-gal）E、異丙基巰基-b-半乳糖苷（IPTG）

51、對酶活性有影響的物理化學方法是（溫度，pH值，酶的濃度，底物濃度，激活劑，抑制劑）

52、分子雜交的化學原理是形成（E）

A.共價鍵 B.離子鍵 C.疏水鍵 D.配位鍵 E.氫鍵

二、填空題

1、人工化學合成DNA新形成的核苷酸的合成方向是(3’→5'),合成的DNA5’末端是（-P），3’末端是（-OH）。

2、理想載體應具備的條件：（至少有一個復制起點，有多克隆位點，具備轉化的功能，遺傳標記基因，具有較高的載裝能力）。

3、進行PCR擴增DNA時，反映體系應加入（DNA模板，DNA聚合酶，引物，dNTP的緩沖液）。

4、細胞培養基三大類：（天然培養基，合成培養基，無血清培養基）。

5、質粒DNA三種構型：（共價閉合環狀DNA（cccDNA),開環DNA(ocDNA),線狀DNA(1DNA)）。

6、微生物轉化中常用的微生物有：（細菌，真菌，放線菌）。

7、生物技術的核心與關鍵是（基因工程），生物技術的基礎是(生化工程)，生物技術的條件是(細胞工程)，生物技術獲得最終產物的手段是(發酵工程)。

8、PCR全稱是（聚合酶鏈反應），以（mRNA)為引物，基本反應步驟是（變性，退火，延伸）。

9、在翻譯過程中mRNA與核糖體的結合位點：（SD序列，SD序列與起始密碼子AUG之間的距離）。

10、克隆真核基因常用的方法：（逆轉錄法，化學合成法）。

11、將抗體轉變為酶的四種途徑：（誘導，拷貝，引入，化學修飾）。

12、酶固定法中包埋法有（網格型和微囊型）兩種。

13、噬菌體表達載體有（穿梭，插入，置換）三種。

14、鼠源性單克隆抗體改造后的小分子抗體類型（人-鼠聯合抗體，改形抗體，Fab抗體，單鏈抗體，單域抗體，分子識別單位）。

15、抗體藥物的特點：（多樣性，定向性，特異性）。

16、質粒載體結構包括：（復制子，選擇標記，多克隆位點）。

17、蛋白質藥物按分子大小提取方法：（透析，層析，離心，超濾）。

18、核酸類藥物分為：（反義核酸，核酶，脫氫核酶，抗基因寡核苷酸，裸DNA疫苗，基因藥物）。

19、動物細胞的培養條件：（培養溫度，pH值，通氧量，防止污染，基本營養物質，滲透壓）。

20、根據動物細胞對生長基質的依賴性可分為：（貼壁依賴性細胞，非貼壁依賴性細胞，兼性貼壁細胞）。

21、答案：感受態細胞。

22、三、簡答題

五、問答題

1、簡述生物藥物與生物技術藥物的內涵。

答：生物藥物是指運用生物學、醫學、生物化學等的研究成果，綜合利用物理學、化學、生物化學、生物技術和藥學等學科的原理和方法，利用生物體、生物組織、細胞、體液等制造的一類用于預防、治療和診斷的制品。生物藥物，包括生物技術藥物和原生物制藥。生物技術藥物：是指采用DNA重組技術或其他創新生物技術生產的治療藥物。細胞因子類藥物、激素類藥物、酶與輔酶類藥物、疫苗、單克隆抗體藥物、反義核酸藥物、RNA干擾(RNAi)藥物、基因治療藥物。

2、簡述生物技術藥物和生物技術制藥的概念。

答：生物技術藥物是指采用DNA重組技術或其他生物技術生產的用于預防、治療和診斷疾病的藥物；生物技術制藥是指利用基因工程、細胞工程、發酵工程、酶工程、蛋白質工程等生物技術，來研究、開發和生產用于預防、治療和診斷疾病的藥物。

3、比較基因工程疫苗與傳統疫苗？ 答：傳統疫苗是用人工變異或從自然界篩選獲得的減毒或無毒的活的病原微生物制成的制劑或用理化方法將病原微生物殺死制備的生物制劑。傳統疫苗受制作工藝的限制，其保存、使用和接種副反應等方面都容易出現一些問題。

基因工程疫苗指使用重組DNA技術克隆并表達保護性抗原基因，利用表達的抗原產物，或重組體本身制成的疫苗。

基因工程亞單位疫苗優點： ①純度高；產量高。②易制備。③安全性好。④這種疫苗穩定性好，免疫期長，便于保存和運輸。

4、如何控制基因工程藥物的質量？

答：①原材料：主要檢查目的基因、表達載體及宿主細胞（如細菌、酵母、人和動物的細胞），防止其產生我們不想要的遺傳變異。

②培養過程：無論是發酵還是細胞生產，關鍵是保證基因的穩定性和不被污染。主要控制生產用的細胞庫、有限代次的生產、連續培養過程。

③純化工藝過程：要求能保證去除微量DNA、糖類、殘余宿主蛋白質、純化過程帶入的有害化學物質、致熱原，或者將這類雜質減少至允許量。

④最終產品：主要表現在生物學效價測定、蛋白質純度檢查、蛋白質的比活性、蛋白質的性質鑒定幾個方面。

⑤雜質檢測：蛋白類，由于降解、聚合或者錯誤折疊而造成的目的蛋白變構體在體內往往會導致抗體的產生；非蛋白類，主要有細菌、病毒、熱原質和DNA幾種類型，往往在極低的水平就可產生嚴重的危害作用。

⑥安全性試驗：其中的無菌試驗、熱原試驗、安全性和毒性試驗按我國新頒布的《中國生物制品規程》進行。

5、簡述單克隆抗體的制備。

答：（1）．對動物注射特定的抗原蛋白，使其產生免疫反應；提取合成專一性抗體的單個B淋巴細胞，但這種B淋巴細胞不能在體外生長。

（2）．應用細胞雜交技術使骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合，得到雜交瘤細胞。這種細胞既具有B淋巴細胞合成專一抗體的特性，也有骨髓瘤細胞能在體外培養增殖永存的特性。

（3）．對雜交瘤細胞進行細胞培養，用特定的選擇培養基選出所需要的細胞群，體外或體內培養，從培養液或動物腹水中提取單克隆抗體。

6、簡述基因工程操作流程。答：1目的基因的獲取

2構建表達載體

3將重組DNA導入受體細胞 4重組DNA篩選與鑒定

4目的基因的檢測與表達。

7、動物大規模培養有哪些方式？

答：（1）懸浮培養法、（2）微載體培養法、（3）多孔載體培養法、（4）微囊化培養法、（5）中空纖維培養法。

8、生產用動物細胞的種類有哪些？各有什么特點？

答：（1）原代細胞,特點：不能直接獲得，需臨時制備，生長不旺盛；（2）傳代細胞系，特點：接觸抑制和貼壁依賴性，增值能力有限，無致瘤性；

（3）轉化細胞系，特點：無限增殖，倍增時間短，較低的營養條件要求，適用于大規模生產；

（4）工程細胞系（包括融合細胞系和基因工程細胞系），特點：穩定遺傳

9、獲得部分或全部人員化的質量抗體采用何種方法？

10、何為治療性疫苗？比較治療性疫苗和預防性疫苗的主要區別。（p129）.答：治療性疫苗：指在已感染病原生物或患某些疾病的機體中，通過誘生機體的特異性或非特異性免疫應答，以達到治療或防止疾病惡化的天然、人工修飾合成或用基因重組技術表達的產品或生物制品。

區別：a.使用對象不同：治療性疫苗的使用對象為已病者，而預防性疫苗的使用對象為未病者。

b.使用目的不同：治療性疫苗的目的是治療疾病，預防性疫苗的目的是預防疾病。

c.監測手段不同：預防性疫苗接種后產生保護性抗體，可通過實驗室進行監測，結果準確，可靠。而治療性疫苗接種后疾病是否改善，則需要結合臨床癥狀、體征、疾病相關的實驗指標進行綜合測試，較為復雜，且其準確性尚有爭議。

d.期望激發的免疫應答類型不同：預防性疫苗接種后，期望產生的是保護性抗體，即激發體液免疫反應；而治療性疫苗主要用于病毒感染和腫瘤疾病，病毒一旦進入宿主細胞內，抗體即失去作用，腫瘤細胞的殺滅也主要依賴細胞免疫效應，因此，治療性疫苗應以激發細胞免疫反應為主要目的，這是與預防性疫苗最大的區別。

第二篇：生物技術制藥復習要點與重點

復習要點

第一章 緒論

1．生物藥物的概念及21世紀生物藥物的分類

2．生物技術(Biotechnology)概念及現代生物技術的組成和特點

3．基因工程技術、細胞工程技術、酶工程技術、發酵工程技術定義

4．基因診斷、基因治療概念

5．生物技術在藥學應用中的兩類方式

6．生物藥物的兩大來源及生物藥物的特點

7.生物制藥的特點、生物制藥基本過程及生物制藥基本方法

第五章 發酵工程制藥

1．發酵定義及發酵類型

2．菌種的選育方法

3．培養基概念和培養基的配制原則

4．發酵的基本過程

5．微生物發酵方式

6．發酵過程影響因素及控制

7．代謝工程定義

8．簡述發酵工程下游加工過程的的特點和一般程序

第二章 基因工程制藥

1．基因的概念及基因的一般特性

2．基因工程藥物的概念

3．基因工程藥物制藥的主要流程

4．基因工程藥物建立分離純化工藝的根據

5．基因工程藥物分離純化的一般流程

6．基因工程產品的質量控制內容

7．基因工程藥物臨床前安全性評價的特殊性

8．蛋白質工程的概念

第三章動物細胞工程制藥

1．細胞定義、細胞的特征和細胞的化學組成2．細胞培養定義、細胞培養基本條件和基本過程

3．細胞融合技術定義和基本過程

4．細胞工程技術概念和動物細胞工程制藥的基本概念

5．動物細胞培養的基本技術和動物細胞培養特點

6．細胞株、細胞系、原代培養和傳代培養的概念

7．動物細胞的大規模培養方法

8．轉基因動物概念(transgenic animal)及轉基因的技術方法

9．轉基因動物在醫藥行業中的應用

10．動物乳腺生物反應器（mammary gland bioreactor）概念

第四章植物細胞工程制藥

1．植物細胞工程制藥的兩大內容

2．植物細胞的全能性定義和原理

3．植物細胞特點——外植體(explant)、脫分化（dedifferentiation）、再分化（redifferentiation）、愈傷組織（callus culture）概念

4．植物細胞的培養方法

5．轉基因植物概念及主要方法

6．植物細胞工程制藥應用于哪些方面

第六章 酶工程制藥

1．酶工程概念和現代酶工程研究的主要內容

2．酶固定化概念、方法和固定化酶的特點

3．細胞固定化概念和固定化細胞的特點

4．酶反應器(Enzyme reactor)的概念

第七 章 新型生物制藥技術

抗體工程制藥

1．概念——抗體(antibody)、多克隆抗體(Polyclonal antibody,PcAb)、單克隆抗體(monoclonal

antibody)、雜交瘤細胞(hybridoma)技術、抗體工程

2．單抗制備的基本流程

3．HAT培養基的選擇培養雜交瘤細胞的原理

4．單克隆抗體的鑒定與檢測項目

5．基因工程抗體概念和基因工程抗體的類型———嵌合抗體(Chimeric Antibodies)，改形抗

體(reshaped Antibodies),單鏈抗體(single chain antigen binding protein,ScFv)等

6．噬菌體抗體工程和轉基因動物表達抗體的優點

7．反義核酸(ribozyme)、核酶（antisense nucleic acide）、RNA干擾（RNA interference，RNAi）

概念

8．核酸疫苗（nucleic acid vaccine)又稱基因疫苗（gene caccine)或DNA疫苗（DNA vaccine）

概念和核酸疫苗的優點

9．基因治療概念、基因治療的必要條件和主要方式

10．干細胞、胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES細胞）的概念及應用生物芯片基因芯片，蛋白芯片

12．。。。

復習重點

基本概念

1．Biotechnology 以現代生命科學為基礎，結合先進的工程技術手段和其他基礎學科的科

學原理，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產出所

需產品或達到某種目的2．Fermentation Engineering 微生物工程是利用微生物制造工業原料與工業產品并提供服

務的技術.其特點: 發酵工程是以某種特定的產物為工藝的目

標,這就要求微生物細胞既能正常生長又能過量積累目的產物

3．Enzyme Engineering是酶學和工程學相互滲透結合發展而形成一門新的技術學科。它是

從應用的目的出發研究酶、應用酶的特異性催化功能，并通過工程

化將相應原料轉化成有用物質的技術。

4.Gene Engineering 是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉入新的宿主細胞，構建

成工程菌(或細胞），實現遺傳物質的重新組合，并使目的基因在工程

菌內進行復制和表達的技術。

5．蛋白質工程 以蛋白質分子的結構規律及其生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基

因合成，對現有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質。

6.抗體工程利用單克隆抗體技術和基因工程技術進行天然抗體的生產和抗體改造以及研

制新型抗體.7．Metabolic engineering 利用多基因重組技術有目的的對細胞代謝途徑進行修飾、改造，改變細胞特性，并與細胞基因調控、代謝調控及生化工程相結合，為實現構建新的代謝途徑，生產特定目的產物而發展起來的一個新的學科領域。

8．biopharmaceutics是指運用生物學、醫學、生物化學等的研究成果，從生物體、生物組

織、細胞、體液等中，綜合利用物理學、化學、生物化學、生物技術

和藥學等學科的原理和方法制造的一類用于預防、治療和診斷的制品

9．基因工程藥物 是指以DNA重組技術生產的蛋白質、多肽、酶、激素、疫苗、單克隆抗

體和細胞生長因子類藥物。

10．GeneDNA分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列,是遺傳物質的最小功能單位。

11．Cell 細胞是一切生物體進行生命活動的基本結構和功能單位.細胞是有膜包圍的能獨立

進行繁殖的原生質。

12．Culture medium 是人工配制的適合于不同細胞生長繁殖或積累代謝產物的營養基質.其主要成份碳源、氮源、無機鹽、生長因子、前體和水等幾大類.13．hybridoma技術：將含有特異免疫信息的淋巴細胞與具有無限增殖的腫瘤細胞在誘導

劑作用下使其融合,產生一個具有特異活性細胞及其產物技術.14.monoclonal antibody由一個克隆產生只針對一種抗原決定簇的結構與功能完全相同的抗體.15.Chimeric Antibodies將人抗體的恒定區(C區)替代鼠源單抗的可變區(C區)而得到的抗體

16．immobilized enzyme固定化酶是指限制或固定于特定空間位置的酶，具體來說，是指經

物理或化學方法處理，使酶變成不易隨水流失即運動受到限制，而

又能發揮催化作用的酶制劑。

17．Biosensors由生物識別物質(酶,微生物 動植物組織 抗體等)與換能器組成的分析系統,其基于酶(細胞)固定化技術

18．transgenic animal 采用基因工程技術把外源基因導入動物生殖細胞、胚胎干細胞和早

期胚胎,并在受體動物染色體上穩定整合,又經過各種發育途徑能把外

源基因穩定傳給子代的這種動物

19.gene knockout 用基因打靶技術定點滅活一個內源基因。

20．RNA interference（RNAi）是指對應于某種Mrna的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈

RNA（ds RNA）分子使mRNA發生特異性降解，導致其不能表達的轉錄后基因沉默現象

21．酶聯免疫法（ELISA）以酶代替放射同位素對抗原或抗體進行標記，使酶與抗原抗體共

價連接，稱之為酶聯免疫吸附法。

22基因治療 是指將正常的外基因導入生物體的靶細胞內，以彌補或糾正基因缺陷或異常表

達，從而達到治療目的。

23.原代培養：從機體取出后立即培養的細胞為原代細胞。培養的第1代細胞與傳10代以內的細胞稱為原代細胞培養。

24傳代培養：將原代細胞從培養瓶中取出，配制成細胞懸浮液，分裝到兩個或兩個以上的培養瓶中繼續培養，稱為傳代培養

25細胞株：原代細胞一般傳至10代左右細胞生長停滯，大部分細胞衰老死亡，少數細胞存

活到40~50代，這種傳代細胞為細胞株。

26細胞系：細胞株傳代至50代后又出現細胞生長停滯狀態，只有部分細胞由于遺傳物質的改變，使其在培養條件下可以無限制傳代，這種傳代細胞為細胞系。

27細胞株和細胞系的區別： 細胞系的遺傳物質改變，具有癌細胞的特點，失去接觸抑制，容易傳代培養。

基本方法：

1.生物大分子的分離純化主要方法 超濾和凝膠過濾、離子交換法、電泳和等電聚焦法，等電點沉淀法和有機溶媒分級沉淀法、親和色譜法等

2.生物制藥基本方法有提取法 發酵法 化學合成法 組織培養法 現代生物技術方法

3.測定蛋白質類藥物分子量方法超速離心、凝膠色譜法、SDS_PAGE 生物質譜法等

4.酶和細胞固定化方法有載體偶聯法、交聯法、包埋法、新型固定法。

5.常用的菌種保藏方法① 斜面低溫保藏法 ②石蠟油封存法 ③砂土管保藏法 ④ 麩皮保

藏法 ⑤甘油懸液保藏法 ⑥冷凍真空干燥保藏法 ⑦液氮超低溫保藏法 ⑧宿主保藏法

等

6.基因工程操作中獲得目的基因的方法 逆轉錄法、化學合成法、PCR等

7.基因診斷主要技術包括基因探針技術、PCR技術、單抗試劑等。

8.發酵工程制藥中微生物發酵方式固體發酵、液體發酵

9.基因治療中外源基因導入的方式。。

10.基本過程：

1．基因工程制藥的基本流程 獲得目的基因、組建重組質粒、構建工程菌（或細胞）、培養工程菌、產物分離純化、除菌過濾、半成品檢定、成品檢

定、包裝。

2．發酵的基本過程 菌種、種子制備、發酵、發酵液處理、提取精制。

3．單抗制備的基本流程抗原的制備、動物的免疫、抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合形成雜

交瘤細胞、雜交瘤細胞的選擇性培養、篩選能產生某一特異抗體的陽性克隆和克隆化、體外培養(動物腹腔接種培養)、大量制備單克隆抗體。

4．動物細胞培養的基本過程：取動物器官、和組織、剪碎組織、胰蛋白酶處理、單個細胞、細胞培養。

5．生物制藥的基本過程1.原料的選擇、預處理和保存 2.原料的粉碎3.提取4.分離純化5.濃縮6.結晶7.干燥

6． PCR三個基本步驟 變性--退火--延伸

基本原理、組成、分類和特點

1.單抗制備的基本原理 制備單克隆抗體通過B淋巴細胞雜交瘤技術把能產生單一抗體的淋

巴細胞與有增殖能力的骨髓瘤細胞進行融合形成雜交瘤細胞，通過

有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產

生的只針對一個抗原決定簇、結構和特異性完全相同的高純度抗體

2．植物細胞培養技術的理論基礎 植物細胞的全能性。

3現代生物藥物類型基因藥物 , 重組藥物，天然藥物，合成、半合成藥物。

4．現代生物技術主要組成基因工程、細胞工程、酶工程、發酵工程。

5．現代生物技術特點: 高效益、高智力、高投入、高競爭、高風險、高勢能。

6．生物藥物來源主要有兩大類 ①以天然生物材料為主,②有目的的人工制備生物原料。7 基因工程抗體的類型有嵌合抗體、改型抗體、小分子抗體、多功能化抗體。

8.生物藥物特點化學結構和組成比較復雜；相對分子量較大，一般不易化學合成；藥理作

用針對性強，不良反應小；療效確切，營養價值高；有的生物原料和生物

藥物不能代替.9.固定化酶的特點具有生物催化劑的功能，又有固相催化劑的功能。①可多次使用 ②反

應后，酶底物產物易分開，產物中無殘留酶，易純化，產品質量高。③

反應條件易控制。④酶的利用效率高。⑤比水溶性酶更適合于多酶反應

10固定化細胞的特點有細胞特性，生物催化劑功能，固相催化劑特點。優點： ①無須進行

酶的分離純化 ②保持酶的原始狀態，酶回收率高③比固定化酶穩定性

高④細胞內酶附助因子可再生⑤細胞本身含多酶體系⑥抗污染能力強

11.影響大腸桿菌中外源蛋白表達的主要因素①外源基因密碼子的使用,②mRNA結構,③表

達載體的構建,④培養條件

如何實現高表達…

12發酵工程制藥特點 是以某種特定的產物為工藝的目標,這就要求微生物細胞既能正常生

長又能過量積累目的產物。

13．生物制藥的特點（特殊性）1.生物原料組成成分非常復雜2.有效成分含量低3.易變性

及被破壞4.分離制備過程影響因素多相對“均一性”

13．發酵過程影響因素：溫度、pH、溶解氧、菌體濃度、泡沫、營養濃度。如何控制…

14．微生物發酵生產藥物主要種類抗生素類;氨基酸類;核苷酸類維生素類;甾體類激素;治

療酶及酶抑制劑等。

15．細胞的特征：在結構上具有自我裝配的能力, 在生理活動中具有自我調節的能力, 在增

殖上自我復制的能力。

16．生物技術在藥學研究中兩種基本作用方式 1作為生產工具----生物技術藥物

2.作為研究手段----合理藥物設計

17．單抗優點和局限性優點單克隆抗體的特性高度特異性高度的均一性和可重復性 高

度專一性：大量產生及穩定性：

局限性：固有的親和性和局限的生物活性限制了它的應用范圍反應

強度不如多克隆抗體、制備技術復雜、費時費工、價格較高

18生產用動物細胞類型貼壁依賴性細胞、非貼壁依賴性細胞、兼性貼壁細胞

19．動物細胞培養特點 無細胞壁,抗機械強度低,對剪切力敏感,適應環境差；倍增時間長,生

長緩慢,易污染,培養時必須加抗生素；培養過程需氧量少,有的需要

一定CO2；培養過程中細胞相互粘連以集群形式存在20．基因工程藥物制備全程質量控制理念包括

一、原材料的質量控制(1.目的基因2.表達載體3.宿主細胞),二、培養過程的質量控制(1.生產用細胞庫2.培養過程)

三、純化工藝中的質量控制;四.目標產品的質量控制

21.選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細胞培養材料的原理（目的）這些組織或

器官上的細胞生命力旺盛，分裂能力強

22．基因治療的必要條件1發病機制在DNA水平上已經清楚2要轉移的基因已經克隆分離，其表達產物有詳盡的了解 3該基因正常表達的組織可在體外進行

遺傳操作

23．PCR原理 是體外酶促合成特異DNA片段的方法 反應特點1.特異性強2.靈敏度高 3.簡便、快速。確保PCR獲得目的基因序列正確應注意:1.使用高保真的DNA

聚合酶,和相對保守的PCR擴增條件.2.凡經PCR擴真制備的目的基因片段,克隆后必須要測序.24基因工程產品的質量控制內容：產品的鑒別、純度、活性、安全性、穩定性、一致性。利用多學科的技術生物化學、免疫學、微生物學、細胞生物學和分子生物學。

25.基因工程藥物包含上游下游過程

上游技術主要是分離目的基因、構建工程菌(細胞)。主要技術涉及

1、基因克隆載體:質粒載體，2、重組DNA技術的有關工具酶及其應用

3、核酸制備技術； 下游階段：從工程菌的大量培養一直到產品的分離純化和質量控制。主要包括工程菌大規模發酵最佳參數的確立，新型生物反應器的研制，高效分離介質及裝置的開發，分離純化的優化控制，高純度產品的制備技術，生物傳感器等一系列儀器儀表的設計和制造，電子計算機的優化控制等.26.基因工程中影響外源蛋白表達的主要因素

①外源基因密碼子的使用,②mRNA結構,③表達載體的構建,④培養條件

如何實現高表達…

第三篇：生物技術制藥總結

生物技術：人們以現代生命科學為基礎，結合先進的工程技術手段和其他基礎科學的科學原理，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產出所需產品或達到某種目的的技術

1基因工程制藥：利用基因重組技術將外援基因導入宿主菌或細胞進行大規模培養，以獲得蛋白質藥物的過程。

2.載體：是攜帶外源目的基因或DNA進入宿主細胞，實現外援基因或DNA的無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些DNA分子。

細胞傳代passage：將細胞從一個培養器皿中消化、分散并接種至另一個培養器皿中的操作。細胞克隆培養（clonal culture）：即單細胞分離培養，是將動物組織分散后，將一個細胞從群體細胞中分離出來，由單個細胞培養成純系細胞集群。

動物細胞的復蘇：其原則是快速融化，必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

細胞融合（cell fusion）：是指在外力（誘導劑或促融劑）作用下，兩個或兩個以上的異源（種、屬間）細胞或原生質體相互接觸，從而發生膜融合、胞質融合和核融合并形成雜種細胞的現象，或稱細胞雜交。

轉基因動物（transgenic animal）：采用基因工程技術將外源目的基因導入動物生殖細胞、胚胎干細胞和早期胚胎，并在受體動物的染色體上穩定整合，在經過發育途徑將外源目的基因穩定地傳給子代，通過這項技術所獲得的動物即為轉基因動物。

胚胎干細胞（embryo stem cell）：簡稱ES細胞，是從早期胚胎細胞團分離出來并能在體外培養的一種高度未分化的、具有形成所有成年細胞類型能力的全能干細胞。它是正常二倍體型，像早期胚胎細胞一樣具有發育上的全能性。

抗體工程制藥（antibody engineering pharmaceutics）：利用基因工程、細胞工程（包括動物細胞工程和植物細胞工程）和轉基因動物及轉基因植物技術生產抗體藥物的過程。

單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）：簡稱單抗，將能大量擴增和永生的骨髓瘤細胞和能合成分泌特異性抗體的B細胞（僅識別一種抗原表位）進行融合得到雜交瘤細胞，經篩選和克隆化的雜交瘤細胞僅能合成及分泌抗單一抗原表位的特異性抗體。

雜交瘤細胞克隆化（cloning）：是指將陽性孔中分泌抗體的單個細胞分離出來。融合后的雜交瘤細胞一般要經過3次克隆化才能達到100%的陽性克隆。

雙特異性抗體（bispecific antibody，bsAb）：亦稱雙功能抗體，是含有兩個不同配體結合位點的抗體分子，它有兩個不同的抗原結合部位（兩個臂），可分別結合兩種不同的抗原表位。嵌合抗體（chimeric antibody）：是利用DNA重組技術，將異源單抗的輕、重鏈可變區基因插入含有人抗體恒定區的表達載體中，轉化哺乳動物細胞表達的抗體，表達的抗體分子中輕、重鏈的V區是異源的，而C區是人源的，即整個抗體分子的60%~70%是人源的。

人源化抗體（humanized antibody，hAb）：通過CDR移植即把鼠抗體的CDR（互補決定區）序列移植到人抗體的可變區內所得到的抗體，也稱CDR移植抗體或改型抗體。該抗體既具有鼠源性單抗的特異性又保持了人抗體的功能（C區的功能）。

免疫原性（immunogenicity）：抗原能刺激機體特異性免疫細胞，使其活化、增值、分化，最終產生免疫效應物質（抗體或致敏淋巴細胞）的特性。

免疫反應性（immunoreactivity）：抗原與相應免疫效應物質在體內或體外相遇時，可發生

特異性結合而產生免疫反應的特性。

減毒活疫苗（live attenuated vaccine）：是通過不同的方式手段使病原體的毒性即致病

性減弱或喪失后獲得的一種由完整的微生物組成的疫苗制品。

滅活疫苗（inactivated）：是將病原體經培養增殖、滅活純化處理，使其完全喪失感染性，但保留了病原體的幾乎全部組分因此滅活疫苗具有較好的免疫原性和安全性。

亞單位疫苗（subunit vaccine）：利用微生物的某種表面結構成分（抗原）制成、能誘發

機體產生抗體的疫苗。

分解代謝阻遏（catabolite repression）：在菌體的生長階段被菌體快速利用的碳源會產

生大量的分解產物，這些代謝產物阻遏次級代謝酶系的合成，只有當這類碳源被消耗完后，阻遏作用被消除，菌體才由生長階段轉入次級代謝產物合成階段，這種發酵過程中的次級代

謝產物在碳源被消耗盡時才產生和積累的現象稱為分解代謝阻遏。

生物技術：人們以現代生命科學為基礎，結合先進的工程技術手段和其他基礎科學的科學原

理，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產出所需產品或達到某種目的的技術。

種齡（inoculumage）：種子罐中培養的菌絲轉入下一級種子罐或發酵罐時得培養時間

生物技術藥物的特性？

（1）理化性質特性（1）相對分子量大（2）結構復雜：蛋白質和核酸均為生物大分子，蛋

白質含有四級結構（3）穩定性差（2）藥理學作用特性（1）活性與作用機制明確：活性物

質對生理功能的調節機制比較清楚（2）作用針對性強：有特定的靶分子、靶細胞或靶器官

（3）毒性低：生物技術藥物本身是體內天然存在的物質或它們的衍生物（4）體內半衰期短

（5）有種屬特異性（6）可產生免疫原抑制（3）生產制備特性（1）藥物分子在原料中的含量低（2）原料液中常存在降解目標產物的雜質：應采取快速分離純化的方法以除去影響

目標產物穩定性的物質（3）制備工藝條件溫和：目的產物不穩定（4）分離純化困難：需要

多種不同原理的層析單元操作才能達到要用的純度（5）產品易受有害物質（4）質量控制特

性

質粒的特點：（1）是指獨立于原核生物染色體之外具有自主復制能力的遺傳物質。（2）質粒

具有遺傳傳遞和遺傳交換的能力（3）質粒具有不相容性：兩種親緣關系密切的不同質粒不

能在同一宿主細胞中穩定共存。4..共價閉合環狀DNA(ccDNA)，開環DNA(ocDNA)，線狀

DNA(lDNA)在瓊脂糖凝膠電泳中

5.復制子松弛型復制子的復制和宿主蛋白的合成功能

無關，宿主染色體DNA復制受阻時，質粒仍可復制；嚴謹型復制子的復制與宿主蛋白質的合成相關，因此在每個宿主細胞中為低拷貝數，僅1~3個。

6.克隆表達的質粒載體涉及三個要素：

（1）復制子（2）選擇標記：由質粒攜帶的賦予宿主細胞新的表型的基因，用于鑒定和篩選

轉化有質粒的宿主細胞。常見的標記：氨芐西林（Amp），卡那霉素（Kan）（3）多克隆位點

（MCS）：質粒載體中由多個限制性內切酶識別序列密集排列形成的序列。

7.目的基因常用制備方法

(1)化學合成法（2）PCR法：在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的緩沖溶液中通

過下列步驟擴增DNA：a）變性：雙鏈DNA模板加熱變性，解離成單鏈模板；b）退火：降

低溫度，引物與單鏈模板結合；c）延伸：溫度調整至DNA聚合酶最適宜溫度，最終與單鏈

模板形成雙鏈，并開始下一個變性、退火、延伸循環。（3）基因文庫法（4）cDNA文庫法

8.影響目的基因與載體之間連接效率的主要因素：

9.（1）DNA片段之間的連接方式：粘性末端的連接效率高于平頭末端。（2）目的基因與載

體的濃度和比例：增加DNA濃度可以提高連接效率，目的基因與載體DNA的摩爾數比應大

于1.（3）連接溫度、時間、連接酶的活性及緩沖液。

9.重組DNA導入大腸桿菌，常用的感受態細胞制備方法：氯化鈣法

10.重組子的篩選與鑒定：

（1）載體遺傳標記法：a)抗生素抗性篩選法

b)互補篩選法：重組子轉化成宿主細胞，載體的表達產物與宿主細胞中營養缺陷性突變發生

互補作用，從而實現重組子的篩選。藍白斑篩選：lacZα基因可編碼β—半乳糖苷酶α氨基

端的α互補肽段，與宿主細胞編碼的缺陷型β—半乳糖苷酶α實現互補，可分解底物5-溴-4-

氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，形成藍色菌落。由于lacAα基因的插入失活而成白色，空載體的宿主細胞呈藍色。c)營養缺陷篩選法d噬菌斑篩選法(2)核酸分子雜交法

(3)限制性內切酶圖譜法(4)DNA序列測定法：雙脫氧終止法(5)目的基因表達產物測定法

12.外源基因在大腸桿菌中的表達形式：

(1)胞內表達：(a)非融合蛋白的胞內表達：形成包涵體（B）融合蛋白的胞內表達：在大腸桿

菌內較穩定（2）分泌表達：（a)分泌至周質（b）分泌至胞外

11.外源基因在原核生物中表達的重要調控元件

(1)啟動子：是DNA鏈上能與RNA聚合酶結合并起始mRNA合成的一段序列，是決定外源基

因在原核生物中表達效率的關鍵因素。(2)核糖體結合位點：SD序列(3)終止子

13.大腸桿菌中外源蛋白表達效率的影響因素：(1)外源基因密碼子：偏好密碼子（蛋白質合成迅速，錯配率低）和稀有密碼子(2)mRNA結構：減少G、C含量，增加A、T含量(3)表達

載體：高拷貝數、適用范圍廣、穩定性高、表達產物容易純化(4)外源蛋白穩定性

14.分離純化技術應滿足下列要求：(1)技術條件要溫和，能保持目的產物的生物活性；(2)選

擇性要好(3)回收率要高(4)兩個技術之間要能直接銜接(5)整個分離純化過程要快

15.基因重組蛋白的主要分離技術

(1)離心(2)沉淀(3)膜分離(4)雙水相萃取

16基因重組蛋白的主要純化技術:

(1)離子交換層析(2)親和層析(3)凝膠過濾層析(4)反相層析和疏水層析

17.選擇分離純化方法的依據：

（元，層析分離次序的選擇也同樣重要。(3)根據分離純化工藝的要求來選擇(a)具有良好的穩

定性、重復性和較高的安全性(b)盡可能減少組成工藝的步驟(c)分離純化工藝所用的時間要

盡可能的短(d)工藝和技術必須高效

18．基因工程藥物的質量控制要點

(1)蛋白質含量的測定(2)蛋白質純度檢測(3)蛋白質分子質量測定(4)蛋白質等電點測定(5)蛋

白質序列分析(6)內毒素分析、宿主蛋白與核酸殘留分析

19.蛋白質含量的測定

(1)紫外吸收法(2)BCA法(3)Lowry法(4)考馬斯亮藍法(5)SDS-PAGE掃描分析法

20.蛋白質純度的檢測：電泳法、層析法、質譜法、末端氨基酸殘基分析法

21.蛋白質Mr測定有SDS-PAGE法、凝膠層析法、質譜法

22.蛋白質等電點測定的常用方法：等電聚焦法。

23.蛋白質序列的分析:N-端氨基酸序列分析，C-端氨基酸序列分析

根據體外培養時動物細胞對生長基質的依賴性，可將動物細胞分為

(1)貼壁依賴性細胞(2)非貼壁依賴性細胞(3)兼性貼壁細胞

1.動物細胞培養的環境條件

(1)培養溫度（哺乳類37℃，昆蟲25~28℃）(2)pH值（大多數7.2~7.4）(3)通氧量（一定量的CO2）(4)防止污染(5)基本營養物質(6)滲透壓

3.動物細胞的培養特性

(1)比微生物細胞大得多，無細胞壁，抗機械強度低，對剪切力敏感，適應環境能力差；(2)

倍增時間長，生長緩慢，正常二倍體細胞的生長壽命是有限的；(3)對培養基要求高，易受

微生物污染，培養時需要添加抗生素；(4)生長大多需貼附于基質，相互粘連以集群形式存

在，并有接觸抑制現象；(5)多半將產物分泌在細胞外，便于收集和純化；(6)對蛋白質的合成條件和修飾功能與細菌不同，動物細胞可對蛋白質進行完善的翻譯后修飾，特別是糖基化，與天然產品更一致，更適合于臨床應用。

4.原代培養的主要步驟

(1)從健康動物體內無菌條件下取出適量組織，剪切成小薄片；(2)加入適宜濃度的胰蛋白酶

或膠原酶和EDTA等進行消化作用使細胞分散；(3)將分散的細胞進行洗滌并純化后，以2×

10^6~7×10^6 /ml的濃度加到培養基中，37℃下進行原代培養，并適時進行傳代培養。分為

組織塊培養和單層細胞培養兩種方法。

5.動物細胞深低溫保存的基本原理

在-70℃以下時，細胞內的酶活性均已停止，即代謝處于完全停滯狀態，故可以長期保存。

在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發

生機械損傷、電解質濃度升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白質變性等，能引起細胞

死亡。目前為了保存細胞，都采用液氮低溫（-196℃）凍存的方法。

6.動物細胞的復蘇

其原則是快速融化，必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍

存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

7.動物細胞營養要求特點

(1)碳源不能為無機物，大多為葡萄糖；(2)氮源不能為無機物，主要為各種氨基酸；(3)在很

多情況下尚需添加5%~20%的小牛血清或適量的動物胚胎浸出液。

8.動物細胞的大規模培養方法

(1)懸浮培養法(2)微載體培養法(3)多孔載體培養法(4)微囊化培養法(5)中空纖維培養法

9.誘導動物細胞融合的方法主要有:(1)病毒法(2)PEG法(3)電擊法(4)激光法

10.轉基因動物生物反應器（整體掌握？）

(1)轉基因動物乳腺生物反應器（藥用蛋白，如抗凝血Ⅲ、抗胰蛋白酶、葡萄糖苷酶、C蛋白）

(2)轉基因動物血液生物反應器（人血紅蛋白、抗體或非活性狀態的融合蛋白）(3)轉基因動

物尿液生物反應器（促性腺激素）(4)轉基因雞（蛋）生物反應器（人干擾素）

1.單克隆抗體技術的基本原理

基于動物細胞融合技術得以實現的，即骨髓瘤細胞和B細胞的融合。骨髓瘤細胞在體外

培養能大量無限增殖，但不能分泌特異性抗體；抗原免疫的B細胞能產生特異性抗體，但在體外不能無限增殖。將免疫B細胞和骨髓瘤細胞融合后形成的雜交瘤細胞，繼承了兩個親代

細胞的特性，既具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，又具有免疫B細胞合成和分泌特異性抗

體的能力。通常使用HAT（H為次黃嘌呤、A為氨基蝶呤、T為胸腺嘧啶核苷）選擇培養基

對雜交瘤細胞進行篩選。未融合的脾細胞因不能在體外長期存活而死亡，未融合的骨髓瘤細

胞合成DNA的從頭合成途徑被培養基中的A阻斷，又因缺乏HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸

核糖轉移酶）和TK（胸腺嘧啶核苷激酶），不能利用培養基中的H和T完成DNA的合成過

程而死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了HGPRT和TK，因此能在HAT培養基

中長期存活與繁殖并分泌抗體。

2.單克隆抗體的大量制備主要方法:（1）體內培養法（2）體外培養法

6.重組ScFv的應用:(1)用于構建和生產免疫毒素(2)用于腫瘤的影像分析和治療

7.噬菌體抗體庫技術的基本原理:用PCR技術從人免疫細胞中擴增出整套的VH和VL基因，克隆到噬菌體載體上并以融合蛋白的形式表達在其外殼表面。這樣一來噬菌體DNA中有抗

體基因的存在，同時在其表面又有抗體分子的表達，可以方便地利用抗原-抗體特異性結合而篩選出所需要的抗體，并進行克隆擴增。

7.噬菌體抗體庫構建過程

(1)從外周血或脾、淋巴結等組織中分離B細胞，提取mRNA并反轉錄為cDNA；

(2)應用抗體輕鏈和重鏈引物，根據建庫的需要通過PCR技術擴增不同的抗體基因片段；

(3)構建噬菌體載體；(4)用表達載體轉化細菌，構建全套抗體庫。

通過多輪的抗原親和吸附（結合）-洗脫-擴增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。其中，噬

菌體抗體庫的篩選是關鍵環節和步驟。

減毒活疫苗的優缺點：

優點：

（1）通過自然感染途徑接種，可以誘導包括體液免疫、細胞免疫和粘膜免疫在內的更全面的免疫應答，使機體獲得更廣泛的免疫保護；（2）由于使用的是活的微生物他們可以在體內

長時間起作用而誘導較強的免疫反應，且由于活的微生物有增殖的特性，理論上只需要接

種一次，即可達到滿意的免疫效果；（3）可能引起水平傳播擴大免疫效果，增強群體免疫屏

障；(4)一般不需要再疫苗中添加佐劑，生產工藝一般不需要濃縮純化，價格低廉。

缺點：

(1)一般減毒活疫苗均保留一定殘余毒力，對一些個體如免疫缺陷者可能誘發嚴重疾病，并

且由于種種原因如基因修飾等，減毒活疫苗可能出現毒力回復即“返祖”現象；(2)減毒活

疫苗是活的微生物制劑，可能造成環境污染而引發交叉感染等，并可能滯留在環境中形成傳

染源；(3)缺損顆粒可能干擾免疫效果，因此產品分析評估較為困難；(4)保存運輸等條件要

求較高，如需冷藏等。

1.滅活疫苗的特點：(1)滅活疫苗常需多次接種；(2)接種滅活疫苗產生的抗體滴度隨著時

間而下降；(3)滅活疫苗需要量大。

第七章 發酵工程制藥

1.發酵類型：(1)微生物菌體發酵(2)微生物的酶(3)微生物的代謝產物發酵(4)微生物轉化發

酵(5)生物工程菌發酵

2.微生物發酵生產藥物的分類：(1)抗生素類(2)氨基酸類(3)核苷酸類(4)維生素類(5)甾體類

激素(6)多糖類(6)治療酶及酶抑制劑

3.菌種保藏方法：(1)斜面低溫保藏法(2)石蠟油封存法(3)沙土管保藏法(4)麩皮保藏法(5)甘

油懸液保藏法(6)冷東真空干燥保藏法(7)液氮超低溫保藏法(8)宿主保藏法

4.種子液具備的條件：(1)菌種的生長活力強，轉種至發酵罐后能迅速生長，延遲期短；(2)

生理狀態穩定；(3)菌體總量及濃度能滿足大容量發酵罐的要求；(4)無雜菌污染，保證純種培養；()保持穩定的生產能力

5.微生物的發酵方式：（1）分批發酵（2）補料—分批發酵（3）半連續發酵（4）連續發酵

5.發酵過程的中間分析項目：（1）產物產量（2）PH值（3）糖（4）氨基氮（5）菌絲形

態

6.發酵過程的影響因素及控制：（1）菌體濃度的影響及控制（2）營養物質對發酵的影響

及控制（3）溫度的影響及控制（4）PH的影響及控制（5）溶氧的影響及控制（6）二氧化碳的影響及控制（7）泡沫的影響及控制（8）染菌對發酵的影響

第四篇：生物技術制藥教學大綱

第一章 緒論（2學時）第一節 生物技術概述 1 生物技術的概念 2 生物技術發展史 第二節 生物技術制藥 1 生物技術制藥的概念 2 生物技術在制藥中的應用 我國生物技術制藥現狀和發展前景 4 醫藥生物技術發展展望

第二章 生物藥物（10學時）

1．生物藥物的來源、特性、分類與制備。（2學時）

2．氨基酸類藥物：氨基酸類藥物研究概況；在醫藥中的應用；氨基酸生產。（2學時）3．多肽、蛋白質類藥物：多肽、蛋白質類藥物的特點、分離純化方法、工業生產制備過程。（2學時）

4．核酸類藥物：概述（分類、應用）；生產方法；核酸類藥物的制備。（2學時）5．糖類藥物：制備；純化。（2學時）

第三章 基因工程制藥（8學時）

通過本章學習，了解基因工程藥物研制的意義，掌握基因工程藥物的研制過程、研制方法。1概述。

2基因工程藥物生產的基本過程。(2)3目的基因的獲得：直接分離法；從基因文庫中篩選；逆轉錄法；人工合成法。4目的基因與運載體的體外重組：常用載體；目的基因與運載體的體外重組。5重組分子導入受體細胞；導入方法；影響轉化的因素；陽性重組體的篩選。(2)6基因表達：大腸桿菌中的基因表達；真核基因在原核生物中的表達方式；真核基因在真核生物中的表達；真核基因在動物細胞中的表達。(2)7基因工程下游技術；下游技術的要求；基因工程菌的穩定性；基因工程菌發酵。8基因工程藥物的分離、純化：分離純化的基本過程；分離純化的技術。

9基因工程藥物的質量控制:材料的質量控制;培養過程的質量控制;純化工藝工程的質量控制。(2)第四章 動物細胞工程制藥（8學時）1 概述： 形態及生理特性。（2）生產用的動物細胞：生產用動物細胞的要求；生產用動物細胞的獲取。4 基因工程細胞的構建和篩選；真核細胞基因表達載體的構建；基因載體的導入和高效表達工程細胞株的篩選。（2）動物細胞的培養條件和培養基 6 動物細胞培養的基本方法（2）7 動物細胞大量培養的方法和操作方式 動物細胞生物反應器及檢測控制系統：攪拌式生物反應器；氣升式生物反應器；流化床生物反應器。（2）

第五章 抗體制藥（4學時）1概述

2單克隆抗體：制備；細胞融合；雜交瘤的培養、篩選及克隆化。（2）

3鼠源性單克隆抗體的改造：Ig分子的結構模式圖；結構改造；基因工程抗體。4抗體的應用：臨床檢驗；層析介質；導向藥物。（2）

第五篇：生物技術制藥重點總結

1.生物藥物：又稱為生物工程，是指人們以現代生命科學為基礎，結合先進的工程技術手段和其它基礎學科的科學原

理，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產出所需產品或達到某種目的技術。

2.生物技術藥物： 采用DNA重組技術或其它生物技術生產的用于預防、治療和診斷疾病的藥物，主要是重組蛋白和

核酸類藥物，如細胞因子、纖溶酶原激活劑、血漿因子等。

3.質粒載體：質粒是指獨立于原核生物染色體之外具有自主復制能力的遺傳物質。分三種構型：共價閉合環狀

DNA(cccDNA)、開環DNA(ocDNA)、線狀DNA(IDDNA)。在瓊脂糖凝膠電泳中遷移率：cccDNA > IDDNA > ocDNA

4.目的基因的常用制備方法主要包括化學合成法、PCR法、基因文庫法和cDNA文庫法等。

5.PCR法是指聚合酶鏈反應，是根據生物體內DNA復制原理在DNA聚合酶催化和dNTP參與下，引物依賴DNA模

板特異性的擴增DNA。在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的緩沖溶液中通過三個循環步驟擴增DNA：：①變性—雙鏈DNA模板加熱變性，解離成單鏈模板；②退火—溫度下降，引物與單鏈模板結合（溫度下降，PCR特性下降，效率升高）；③延伸—溫度調整至DNA聚合酶最適宜溫度，DNA聚合酶催化dNTP加至引物3′-OH，引物以5′→3′方向延伸，最終與單鏈模板形成雙聯DNA, 并開始下一個循環。

6.cDNA文庫法：cDNA是指與mRNA互補的DNA。cDNA文庫法是指提取生物體總mRNA，并以mRNA作為模板，在逆轉錄酶的催化下合成cDNA的一條鏈，再在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈cDNA，將全部cDNA都克隆到宿主細胞而構建成cDNA文庫。

7.影響目的基因與載體之間連接效率的主要因素：

①DNA片段之間的連接方式；粘性末端的連接效率高于平頭末端。

②目的基因與載體的濃度和比例；增加DNA濃度可以提高連接效率，目的基因于載體DNA的摩爾數比應大于1。③連接溫度，時間，連接酶的活性及緩沖體系。

8.重組DNA導入宿主細胞的方法：轉化、轉染、顯微注射和電穿孔。

9.互補篩選法（最常見藍白班篩選法）需添加X–gal（X–Gal是β–半乳糖苷酶（β–galactosidase）的底物，水解后呈藍

色）和IPTG（是β–半乳糖苷酶的活性誘導物質）篩選物質進行篩選。

10.菌落原位雜交：又稱探針原位雜交法，制備與目的的基因某一區域同源的探針序列，根據核酸雜交原理，探針序列

特異性地雜交目的基因，并通過放射性同位素或熒光基團進行定位監測。

11.凝膠過濾層析：凝膠過濾層析(gel filtration chromatography)法又稱排阻層析或分子篩方法。基本原理是：根據生物

大分子的蛋白質的質量的大小來實現目的蛋白的分離純化。在凝膠過濾層析中所用的凝膠是一種惰性的不帶電荷具有三維空間結構的多孔網狀物質，凝膠的每個顆粒的微粒結構就如一個篩子，當樣品隨流動相經過凝膠柱時，較大的分子內不能進入凝膠網孔內而收到排阻，將與流動相一起首先被洗脫下來，而較小的分子進入部分凝膠網孔內，所以流出的速度相對較慢。

12.反相層析（RPC）和疏水層析（HIC）的比較：是根據蛋白質疏水性差異來實現分離純化。先比反相層析而言，疏

水層析回收率較高，蛋白質變性的可能性較小。反相層析和疏水層析的差異在于前者在有機相中進行，蛋白質經過反向流動相與固定相作用有時會發生部分變性，而后者通常在水溶液中進行，蛋白質在分離過程中一般仍保持其天然構象。

13.蛋白質含量測定方法：紫外吸收法、BCA法、福林—酚試劑法（lowry）、考馬斯亮藍法、ELISA法等。

14.蛋白質純度檢查的常見方法：SDS-PAGE法（最常用）、非變性PAGE法、層析法等。

15.蛋白質序列的分析方法：N-端氨基酸序列分析法（基本原理Edman法）、C-端氨基酸序列分析法。

16.體外培養動物細胞的類型：貼壁依賴性細胞，非貼壁依賴性細胞和兼性貼壁細胞。

17.動物細胞與微生物細胞，植物細胞相比較具有的特點：

①比微生物細胞大得多，無細胞壁，抗機械強度低，對剪切力敏感，適應環境能力差

②倍增時間長生長緩慢，正常二倍體細胞的生長壽命是有限的③對培養基的要求高，易受微生物污染，培養時常常需要添加抗生素

④生長大多需貼附于基質，相互黏連以集群形式存在，并有接觸抑制現象

⑤多半將產物分泌在細胞外，便于收集和純化。

18.動物細胞的營養要求是：1.碳源不能為無機物，大多為葡萄糖

2.氮源也不能為無機物，主要為各種氨基酸

3.在很多情況下尚需添加5%-20%的小牛血清或適量的動物胚胎浸出液

19.動物培養基可分為：天然培養基，合成培養基和無血清培養基三大類.20.原代細胞：直接將動物組織或器官經過粉碎，消化而制的的懸浮細胞稱為原代細胞.21.懸浮培養法：是細胞在培養液中呈懸浮狀態生長繁殖的培養方法，它適用于一切種類的非貼壁細胞，兼性貼壁細胞，可連續測定細胞濃度，連續收集部分細胞進行繼代培養，也無需消化分散，細胞收率高

22.木瓜蛋白酶水解IgG分子可產生兩個抗原結合片段（Fab）和一個可結晶片段（Fc）

23.胃蛋白酶水解IgG分子可產生一個F(ab’)2和若干裂解小分子片段（pFc’）

24..單克隆抗體技術的基本原理：基于動物細胞融合技術得以實現的，即骨髓瘤細胞與B細胞的融合。骨髓瘤細胞在體外培養能大量無限增殖，但不能分泌特異性抗體，而抗原免疫的B細胞能產生特異性抗體，但在體外不能無限增殖。將免疫B細胞與骨髓瘤細胞融合后形成的雜交瘤細胞，繼承了連個親代細胞的特性，既具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，又具有免疫B細胞合成和分泌特異性抗體的能力。

25.骨髓瘤細胞發生回復突變每3-6個月應用8-氮雜鳥嘌呤（8-AG）篩選一次，以便殺死突變細胞

26.細胞融合的方法：常用的有轉動法和離心法.27.雜交瘤細胞的克隆化的方法有：有限稀釋法和軟瓊脂平板法，顯微操作法

28.雙特異性抗體：是含有兩個不同配體結合位點的抗體分子，它有兩個不同的抗原結合部位（兩個臂），可分別結合兩種不同的抗原表位。其中一個可與靶細胞表面抗原結合，另一個則可與效應物（如藥物，效應細胞等）結合，從而將效應物直接導向靶組織細胞。

29.細胞內抗體：亦稱內抗體，主要是指細胞內合成并作用于細胞內組分的抗體。

30.如何構建噬菌體抗體庫？構建噬菌體抗體庫通常包括以下幾個過程：1.從外周血或脾，淋巴結等組織中分離B細胞，提取mRNA并反轉錄為cDNA2，應用抗體輕鏈和重鏈引物，根據建庫的需要通過PCR技術擴增不同的抗體基因片段3，構建噬菌體載體4，用表達載體轉化細菌，構建全套抗體庫。通過多倫的抗原親和吸附-洗脫-擴增，最終篩選出抗原特異性地抗體克隆。篩選為關鍵環節和步驟。

31.疫苗的組成：具有免疫保護性的抗原（Ag）如蛋白質，多肽，多糖或核酸等與免疫佐劑混合制備而成。

32.佐劑是指能非特異性的增強免疫應答或改變免疫應答類型的物質，可先于抗原或與抗原一起注入機體。

33.目前用于人體的佐劑只有兩種：1，鋁佐劑（氫氧化鋁或磷酸鋁）2，MF59

34.滅活疫苗和活疫苗的特點比較：（P122,表5-4）

35.聯合疫苗包括多聯疫苗和多價疫苗，多聯疫苗可用于預防由不同病原微生物引起的傳染病，而多價疫苗僅預防同一

種病原微生物的不同亞型引起的傳染病。

36.核酸疫苗是20世紀90年代發展起來的一種新型疫苗。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，由能引起機體保護性

免疫反應的抗原的編碼基因和載體組成。核酸疫苗又稱為基因疫苗，基因免疫或核酸免疫

37.酶的分離純化過程必須遵循以下原則：

1、全部操作一般在低溫（0-4攝氏度）進行。

2、在分離提純過程中，不能

劇烈攪拌。

3、在提純溶劑中加一些保護劑，如少量EDTA,少量 –巰基乙醇等

4、在分離提純過程中要不斷測定酶的的活力和蛋白質濃度，以對純化過程進行檢測。一般用兩個指標來衡量分離純化方法的好壞：總活力的回收率和比活力提高倍數。

38.傳統的酶固定化方法大致可分為載體聯合法，交聯法和包埋法

39.固定化對酶穩定性的影響：

1、熱穩定性提高

2、對有機試劑及酶抑制劑的穩定性提高

3、對PH，蛋白酶，儲存

盒操作條件的穩定性提高

40.目前常用的菌種保藏方法有：

1、斜面低溫保藏法，一般可保存1-6個月左右

2、石蠟油封存法，一般可保存1-2年左右

3、砂土管保藏法，保藏期約1-10年

4、麩皮保藏法，保藏期在一年以上

5、甘油懸液保藏法，-20度保藏期約為0.5-1年，-70度下保藏期可達10年

6、冷凍真空干燥保藏法，5-15年

7、液氮超低溫度保藏法，15年以上

8、宿主保藏法

41、產物產量的測定方法有：生物測定法和化學測定法，一般采用化學測定法，以求迅速躋身反應生產情況。中國微生物菌種保藏委員會CCCCM中國典型培養物保藏中心CCTCC

美國典型菌種保藏中心 ATCC美國的北部地區研究實驗室NRRL

英國的國家典型菌種保藏所NCTC日本的大阪發酵研究所IFO

德國菌種保藏中心DSM42、中間反應產量測定：產物產量、ph值、糖、氨基酸、菌絲形態。

43、PH對發酵的影響有哪些？

1.PH影響酶的活性，當PH值抑制菌體的某些酶的活性時使菌的新陳代謝受阻

2.PH影響微生物細胞膜所帶電荷的改變，從而改變細胞膜的通透性，影響微生物對營養物質的吸收和代謝物的排泄，因此影響新陳代謝的進行

3.PH影響培養基某些成分和中間代謝物的解離，從而影響微生物對這些物質的利用

4.PH影響代謝方向，PH不同，往往引起菌體代謝過程不同，是代謝產物的質量和比例發生改變。

44、基因工程菌發酵生產的特點？采用基因重組技術構建的基因工程菌與細胞，由于帶有外來基因，對其進行培養和

發酵的工藝技術通常與單純的微生物細胞的工藝技術有不同之處。基因工程菌發酵的目的主要是實現外源基因的高效表達，以獲取大量的外源基因產物。而外源基因的高技術表達不僅涉及宿主、載體與外源基因三者之間的相互關系，與所處環境條件密切相關。基因工程菌發酵一般分兩個階段：前期是菌體生長階段，后期是菌體生長階段。

45、基因工程菌不穩定性的原因？主要表現在質粒的不穩定性以及表達產物的不穩定性。而質粒的不穩定性又分結構的不穩定性以及分離不穩定。結構不穩定性是由于轉位作用和重組作用所引起的質粒DNA的重排與損失。分離的不穩定性是細胞分裂過程中發生的不平均分配，從而造成質粒的缺陷型分配，以致造成質粒丟失。引起質粒載體不穩定性的原因只要是宿主新陳代謝負荷的加重，大量外源蛋白的形成對宿主細胞的損害，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的細胞一般生長的快得多，從而能替代有生產能力的菌株，這就導致了基因工程菌的不穩定性。

46、突變生物合成：采用一些誘變劑，如紫外線，激光，高速電子流或一些化學藥物如亞硝基胍，溴化乙啶等對藥物的產生菌進行誘變，是他們喪失合成某種中間體的能力，因而不能合成原來結構的化合物，陳武阻斷突變株。在發酵培養這些阻斷突變株時添加某些天然或化學合成的化合物作為中間體，這些突變株能利用這些中間體合成一些新結構的最終化合物，這個過程稱為突變生物合成。

47、微生物轉化系酶促化學反應，具有與通常有機化學反應不一樣的特點：

1.以具有活性中心和特殊空間結構的酶作為催化劑

2、對作用的基質有嚴格的選擇性和專一性

3、酶催化反應的速度極高，非一般催化劑可比

4、一般在常溫常壓下進行，反應條件溫和

48、微生物對甾體轉化反應的特點：在微生物轉化過程中，專一，有效的菌體量的多少，以及甾體底物在水相的溶解

性等問題成為影響轉化率的重要因素，目前采用的兩階段發酵及兩相發酵方法很好的解決了這些甾體微生物轉化中的問題。

49、蛋白質藥物對化學修飾的意義：

50、最常用的修飾劑有：主要是水溶性高分子聚合物，如葡聚糖、右旋糖苷、肝素以及低分子肝素、多聚唾液酸、聚

乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、PEG、白蛋白等。目前以PEG最常用的。其毒性小、無抗原性、溶解性良好。

51、修飾策略有隨機修飾與定點修飾兩類。氨基修飾主要用隨機修飾，在利用特定的修飾劑可以實現定點修飾。巰基

修飾多為定點修飾。羧基修飾為定點修飾。

52、選擇PEG修飾劑應該考慮的因素：PEG的Mr，修飾位點，水解穩定性和反應活性。

53、核酶：核酶不是普通的蛋白質酶，而是一類具有催化活性的核酸分子。目前已知的具有核酶催化功能的RNA結

構至少可以分成5類：發夾狀核酶，錘頭狀核酶，I型內含子核酶，RNaseP核酶，丁型肝炎病毒核酶等

54、反義核酸：是指具有抑制基因表達作用。包括反義RNA、反義DNA分子，由部分RNA和部分DNA形成RNA-DNA

嵌合分子，以及經高度化學修飾的寡聚核酸類似物，這些分子統稱反義核酸類藥物。

55、褔米韋生經美國FDA批準上市成為第一個反義核酸類藥物。

56、RNAi:即RNA干擾現象，是近幾年發現的一種由雙鏈RNA誘導的基因表達調控和基因沉默過程。主要階段：

啟動階段和執行階段

57、小干擾RNA(siRNA)：在啟動階段，當細胞由于病毒感染等原因出現雙鏈RNA分子或帶有較長雙鏈的發卡結構

RNA時，細胞中的Dicer的核酸酶會識別其雙鏈RNA，將其降解成21~23bp長的小干擾RNA。主要參與RNA干擾（RNAi）現象，以帶有專一性的方式調節基因的表達。