第一篇：真菌的分子鑒定

真菌的分子鑒定

內生真菌(Endophyticfungi)是指那些在其生活史中的某一段時期生活在植物組織內，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌，真菌的分子鑒定。近年來的研究表明，內生真菌可以產生與宿主相同或相似的代謝產物，對相應的內生真菌及其代謝產物的研究已經成為尋找藥物來源的一種新途經。本文以我國特有藥用植物——喜樹(CamptothecaacuminataDecne.)為實驗材料，對喜樹內生真菌的組織分布及分離方法進行初步研究。實驗結果表明，內生真菌分離的表面消毒以75%酒精和0.1%升汞結合的方法較好。對喜樹的根部和莖部的升汞消毒時間以4～5min為宜，喜樹葉子的升汞消毒時間應控制在2min左右。在所試條件下共計分離得到70株內生真菌，主要分布在樹葉(42.9%)和皮部(35.7%)，根部(14.3%)和種子(7.1%)中的內生真菌數目較少，在木質部未分離到內生真菌。采用形態學和分子生物學結合的方法對所得菌株進行鑒定。應用形態學方法共鑒定出6株內生真菌，分布于6屬。按照培養特征，把所得內生真菌歸為27個形態類群。選取不同形態類群中的代表菌株，擴增并測定其rDNAITS區段的DNA序列，結合內生真菌與GenBank中參考菌株堿基序列相似性和系統發育關系分析，確定其分類地位，鑒定材料《真菌的分子鑒定》。共獲得18株內生真菌的ITS序列，分析結果表明，這18株內生真菌分屬于2個亞門，4綱，8目，8科，14屬;形態學鑒定與分子生物學鑒定結果一致。鑒定結果在一定程度上反應了喜樹生態系內生真菌的生物多樣性。在本研究中，共分離得到18株擬莖點霉屬(phomopsis)菌株，占25.7%，為優勢菌群，對其進行了基于ITS區段的系統發育分析。本文采用薄層層析TLC方法與高效液相色譜HpLC法，從3株內生真菌CZ-

14、CZ-

17、CZ-18的發酵產物中檢出喜樹堿，含量為0.03-0.04mg/g。發酵產物是以喜樹種子煎汁液體培養基培養。

內生真菌(Endophyticfungi)是指那些在其生活史中的某一段時期生活在植物組織內，對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的真菌。近年來的研究表明，內生真菌可以產生與宿主相同或相似的代謝產物，對相應的內生真菌及其代謝產物的研究已經成為尋找藥物來源的一種新途經。本文以我國特有藥用植物——喜樹(CamptothecaacuminataDecne.)為實驗材料，對喜樹內生真菌的組織分布及分離方法進行初步研究。實驗結果表明，內生真菌分離的表面消毒以75%酒精和0.1%升汞結合的方法較好。對喜樹的根部和莖部的升汞消毒時間以4～5min為宜，喜樹葉子的升汞消毒時間應控制在2min左右。在所試條件下共計分離得到70株內生真菌，主要分布在樹葉(42.9%)和皮部(35.7%)，根部(14.3%)和種子(7.1%)中的內生真菌數目較少，在木質部未分離到內生真菌。采用形態學和分子生物學結合的方法對所得菌株進行鑒定。應用形態學方法共鑒定出6株內生真菌，分布于6屬。按照培養特征，把所得內生真菌歸為27個形態類群。選取不同形態類群中的代表菌株，擴增并測定其rDNAITS區段的DNA序列，結合內生真菌與GenBank中參考菌株堿基序列相似性和系統發育關系分析，確定其分類地位。共獲得18株內生真菌的ITS序列，分析結果表明，這18株內生真菌分屬于2個亞門，4綱，8目，8科，14屬;形態學鑒定與分子生物學鑒定結果一致。鑒定結果在一定程度上反應了喜樹生態系內生真菌的生物多樣性。在本研究中，共分離得到18株擬莖點霉屬(phomopsis)菌株，占25.7%，為優勢菌群，對其進行了基于ITS區段的系統發育分析。本文采用薄層層析TLC方法與高效液相色譜HpLC法，從3株內生真菌CZ-

14、CZ-

17、CZ-18的發酵產物中檢出喜樹堿，含量為0.03-0.04mg/g。發酵產物是以喜樹種子煎汁液體培養基培養。

第二篇：真菌鑒定方法

真菌鑒定方法

一般常用的有：

1、直接鑒定法

2、通過篩子檢驗

3、比重檢驗法

4、染色檢驗法

5、洗滌檢驗法

6、保濕萌芽檢驗

7、分離培養檢驗

真菌主要是酵母，霉菌和大型真菌三種，最常用的鑒定方法就是表形觀察，霉菌和大型真菌可以通過菌絲的顏色，孢子的形態進行區分，輔以23srRNA就基本ok，酵母可以通過發酵代謝觀察輔以23rRNA進行鑒定，真菌鑒定方法。

真菌是細菌的一種嗎?

隨著生活水平的逐漸提高，人們的衛生防病意識也在不斷加強。大多數人知道細菌可以導致疾病，并習慣用“有病菌”或“有細菌”來形容一個臟的環境或物品。那么，真菌又是怎么回事，是細菌的一種嗎?的確，真菌也很微小，也能使人生病，但它和細菌有著本質的區別。

我們知道，植物和動物都是由細胞組成的，細胞內都有細胞核，鑒定材料《真菌鑒定方法》。而微生物中只有真菌具有真正的細胞核和完整的細胞器，故又稱真核細胞型微生物;細菌僅有原始核結構，無核膜和核仁，細胞器很少，屬于原核細胞型微生物;而病毒則沒有細胞結構，屬于原生微生物。

真菌在自然界中分布極廣，有十萬多種，其中能引起人或動物感染的僅占極少部分，約300種。很多真菌對人類是有益的，如面粉發酵，做醬油、醋、酒和霉豆腐等都要用真菌來發酵。工業上許多酶制劑、農業上的飼料發酵都離不開真菌。許多真菌還可食用，如蘑菇、銀耳、香菇、木耳等。真菌還是醫藥事業中的寶貴資源，有的可以用于生產抗生素和維生素以及酶類;有的本身就可以入藥用于醫治疾病，如中藥馬勃、茯苓、冬蟲夏草等。

真菌還可引起動、植物和人類的多種疾病，在人類主要有三種類型：①真菌感染;②變-態反應性疾病;③中毒性疾玻

霉菌

亦稱“絲狀菌”。屬真菌。體呈絲狀，叢生，可產生多種形式的孢子。多腐生。種類很多，常見的有根霉、毛霉、曲霉和青霉等。霉菌可用以生產工業原料(檸檬酸、甲烯琥珀酸等)，進行食品加工(釀造醬油等)，制造抗菌素(如青霉素、灰黃霉素)和生產農藥(如“920”、白僵菌)等。但也能引起工業原料和產品以及農林產品發霉變質。另有一小部分霉菌可引起人與動植物的病害，如頭癬、腳癬及番薯腐爛病等。

酵母菌

屬真菌。體呈圓形、卵形或橢圓形，內有細胞核、液泡和顆粒體物質。通常以出芽繁殖;有的能進行二等分分-裂;有的種類能產生子囊孢子。廣泛分布于自然界，尤其在葡萄及其他各種果品和蔬菜上更多。是重要的發酵素，能分解碳水化合物產生酒精和二氧化碳等。生產上常用的有面包酵母、飼料酵母、酒精酵母和葡萄酒酵母等。有些能合成纖維素供醫藥使用，也有用于石油發酵的。

啤酒酵母(Saccharomyces)

屬酵母菌屬。細胞呈圓形、卵形或橢圓形。以出芽繁殖，能形成子囊孢子。在發酵工業上，可用來發酵生產酒精或藥用酵母，也可通過菌體的綜合利用提取凝血質、麥角固醇、卵磷脂、輔酶甲與細胞色素丙等產品。

紅曲霉素(Monascuspurpureus)屬于囊菌綱，曲霉科。菌絲體紫紅色。無性生殖時，茵絲分枝頂端形成單獨的或一小串球形或梨形的分生抱子。有性生殖時，產生球形、橙紅色的閉囊果，內生含有八個子囊孢子的子囊。紅曲霉可制紅曲、釀制紅乳腐和生產糖化酶等

第三篇：真菌培養及鑒定

真菌培養及鑒定

、真菌培養及鑒定

1.采集標本 體表真菌的標本有毛發、皮屑、甲屑、痂等，標本在分離前常先用75%的乙醇消毒，真菌培養及鑒定。深部真菌的標本可根據情況取痰、尿液、糞便、膿液、口腔或陰-道分泌物、血液、腦脊液、各種穿刺液和活檢組織，采集標本應注意無菌操作。

2.培養檢查：可提高真菌檢出率，并能確定菌種。標本接種于葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基(Sabouraud agar)上，置室溫或37℃培養1～3周。必要時可行小培養協助鑒定。菌種鑒定常根據菌落的形態及顯微鏡下形態判斷。對某些真菌，有時尚需配合其他鑒別培養基、生化反應、分子生物學方法確定。

真菌培養的方法與直接鏡檢法相比較而言，更能對大部分真菌感染的灰指甲作出準確的鑒定，也是診斷灰指甲的一個很重要的手段。下面我們就從培養基的選擇、培養時間、菌種鑒定三方面來了解一下灰指甲的真菌培養法。

1.培養基的選擇

通常培養真菌會同時選用兩種培養基，如果單用一種培養基，則容易忽略其它種類的真菌診斷。常見的兩種培養基，一種為沙氏葡萄糖瓊脂培養基中加抗菌劑，常為氯霉素和放線菌酮;另一種是沙氏葡萄糖瓊脂培養基中僅加氯霉素，不加放線菌酮。

2.培養時間

各種真菌的生長速度不同，所以報告的時間也不同。一般皮膚癬菌生長較緩慢，在26℃-28℃的環境下需要培養2-4周才能發報告，但是，皮膚癬菌含蓋的菌種較多也需要區別對待;酵母菌生長較快，通常2-3就可以發報告，如果為陰性則需要觀察1周;霉菌生長也比較快，一般2-4天就可以發報告。

3.菌種鑒定

(1)絲狀真菌：包括皮膚癬菌和霉菌，根據菌落形成所需要的時間，在不同條件下生長的情況，菌落表面及背面的形態、色素，培養基中有無色素，培養物用乳酚棉藍染色后鏡檢找特征性標志結構。(2)酵母菌：分為形態學鑒定及生化試驗，鑒定材料《真菌培養及鑒定》。形態學鑒定主要觀察有無假菌絲產生，如有則為念珠菌屬，如無則為念珠菌以外的酵母菌;生化試驗最為常用的是ApI系統，用此法鑒定準確，但價格較貴。)絲狀真菌：主要是形態學的鑒定，如直接涂片觀察，小培養顯微鏡鑒定，誘導形態觀察(25℃與35℃下雙相型真菌的特征孢子及菌絲的產生和兩種菌落的形成及腦心浸液瓊脂培養基，KT培養基，KelleyAgar培養基轉相誘導，另外常用的還有皮膚癬菌VB1生長刺激，吳氏熒光檢查，毛發穿孔試驗及在特殊情況下進行的一些生化鑒定等。其中，小培養顯微鏡檢對于絲狀真菌的鑒定，特點是動態直觀，易于觀察，且節約材料。解放軍總醫院第一附屬醫院皮膚科馬天

(2)酵母菌鑒定：形態學鑒定主要是玉米吐溫誘導下特征菌絲及特征孢子的檢驗，血清芽管形成，而在形態學基礎上還必須進行生化鑒定：有標準鑒定，自動儀器鑒定，顯色鑒定，其中，自動儀器鑒定(如ApI20C，ID32C等)，顯色鑒定對于酵母樣真菌的鑒定，特點是快速簡便;標準鑒定是按傳統雙歧表流程鑒定(包括糖同化試驗，糖發酵試驗，CAFC酚氧化酶試驗，尿酶試驗，KNO3同化試驗，脂肪酸需求試驗)，是真菌鑒定的金標準，系統準確，缺點是程序繁瑣，耗時長，與臨床治療不太適應。此外，還有血清學玻片凝集試驗，動物致病性實驗，分子生物學鑒定：如核酸雜交，DNA探針雜交，pCR擴增序列分析，pCR-SSCp單鏈構象多態性分析，pCR-RFLp限制性片段長度多態性分析，pCR-RApD隨機擴增多態性分析，pFCG脈沖電泳核型分析等。

對于酵母樣真菌首選CHROMagar念珠菌顯色培養基，而顯色培養基不能鑒定的酵母樣真菌可采用自動儀器YBC卡進行鑒定或ApI板;條件較差的實驗室可采用傳統標準鑒定法中鑒定值較高的試驗，如酚氧化酶鑒定新型隱球菌(+)，尿素區分毛孢子菌屬(+)，地絲菌屬(-)，念珠菌屬(-)(克柔念珠菌/溶脂念珠菌+)，球擬酵母屬(-)，隱球菌屬(+)，玉米-土溫培養基上產菌絲區分念珠菌屬(+)與球擬酵母屬(-)，隱球菌屬(-)與毛孢子菌屬(+)，地絲菌屬(+)。而同化試驗推薦平皿法，一個平皿內可觀察多種糖類的同化情況，且結果易于觀察，重復性好。對于絲狀真菌及雙相型真菌，可采用小培養法，快速簡便易于觀察。而對于雙相型真菌還須經過腦心浸液培養基轉相試驗后確證。而血清學及分子生物學則主要用于流行病學和一些難培養難鑒定真菌的檢驗，由于成本高或要求技術難度較高，故而不適合在常規工作中采

第四篇：分子鑒定

分子鑒定

現代真菌鑒定分型方法

北京大學第一醫院(100434)王端禮

真菌 的 鑒 定不僅是臨床的需要，在植物病理學、生物退化、生物技術和環境的研究都很重要，分子鑒定。許多真菌已經鑒定到種，但是分類學家仍在忙于新種的描述和其分類的研究。有些菌種由于經濟學的關系或是病理學的重要性，有深人的研究，其他則需要現代手段來進行研究。

一、形 態學

用表 型 特 征來進行分類鑒定，是過去和現在都普遍應用的方法。致病真菌的鑒定，需要光鏡，現在更加上熒光顯微鏡和細胞化學，還有各種染色法，如子囊泡子染色法。真菌在宿主體內鑒定比較困難，如菌絲只能看到有無分隔，有無色素。需要培養來鑒定菌種。某些病例用種特異性抗體探針非常有用，但此種技術尚未在醫真菌學領域內作為常規技術使用。合適的培養基培養鑒定菌種，是常用的方法。

醫學 真 菌 學家常見到的是半知菌，要看抱子形態和抱子發生，看產抱細胞，即分生抱子梗。有兩種型，一是芽生抱子發生，在產抱細胞上有一小點產生分生抱子，另一是葉狀抱子發生，整個細胞是產抱細胞，分成一至數個細胞。基于超微結構觀察，有許多詞語，但未能普遍應用。有的真菌沒有分生抱子，但仍有一些特征，如菌核(sclerotia)、厚壁抱子和一些特殊的菌絲結構，如皮膚癬菌。在少數情況下，一些機會真菌產生有性結構，有許多特點用于菌種鑒定，如子囊菌、擔子菌和結合菌。

電鏡，T EM是觀察菌的斷面，子囊菌酵母和擔子菌酵母的橫隔不同，SEM在實際應用有許多發現，如子囊菌的表面結構可以鑒定到種。

現 代 形 態學技術，如自動成像分析、電子顆粒體積、分數幾何學分析形態學的特點。

由于 表 型 各種詞語沒有一定的標準，有很大的主觀性，某些表型特征也不穩定，受環境影響，有的不能在人工培養基上生長，有一些真菌尚未分類，分類概念有待近一步建立，鑒定材料《分子鑒定》。

二、分 子 生物學

表型 分 類 受限，生理生化技術在絲狀真菌鑒定方面，或是費時費事或是結果不準。分子生物學非常適用。有兩種技術，第一，pCR技術，可以分析少量真菌細胞，甚至單個真菌抱子。第二，選擇通用寡核昔酸對真菌種特異性引物，測定其核昔酸序列。分子生物學的研究目的由于生物多樣性有四個目的。I)系統發生研究。2)分類學的研究，在屬、種水平。3)鑒定應用，即決定明確的分類名稱。4)流行病學和群體的遺傳學研究。具體方法不再詳述。

三、其 他 :

I，生 理 學 和生物化學

在純 培 養 上真菌生長比較快，可以使用生理、生化方法來鑒定菌種。如黑酵母的鑒定。不同的生長溫度也用于鑒定。有性和無性是一個輔助工具。在一定的培養基上，有對照，其生長速度也可用于鑒定，如青霉。Ap[系統也用于絲狀真菌的鑒定。

2.次 級 代謝產物

次級 代 謝 產物既不是為了生長需要，也不是介導基本代謝，常常發現它是一個與分了有關的混合物，有特殊的和極罕見的化學結構。常見的是固醇、菇、類堿、香豆素等，某些是真菌毒素。將小量從培養皿切下來的標本，直接進行層析色譜法檢查，比傳統濃縮抽取提純法簡單易行。此法用于地衣的鑒定較好。很少用于真菌分類，由于對環境有一定影響，而且比較難，較少應用，但有人用于子囊菌的分類。

3.泛 酉昆 系統

是一 種 初 級代謝產物，起重要作用。泛釀即輔酶Q，是呼吸系統電子傳播鏈的攜帶者。一些異戊二烯(isoprene)接觸醒核各有不同，對鑒定到屬或屬以下水平很有幫助。主要鑒定細菌和酵母，也用于黑酵母和絲狀真菌。

(Ya ma da Y ,e tal.In t.J.Genet 1989;5 6:309 Y ag uchiJ > e tal.M ycoscience 1996;3 7:55)0

4.脂 肪 酸組成此法 在 細 菌學方面是常規應用的。一是成分，二是相對濃度。極少用于真菌分類。使用熱解氣相色譜法、熱解塊狀光譜儀、氣相色譜儀、隔膜水相聚合物雙相系統等，主要應用這些方法。近來應用氣相色譜法合并多變量統計分析方法，成功地用于絲狀真菌，包括卵菌、擔子菌、結合菌、甚至只有菌絲的真菌。用于種間水平。應注意許多變化，如培養狀態和溫度是最主要的。

5.細 胞 壁組成子 囊 菌 和擔子菌含有幾丁質和葡萄糖，結合菌含有脫乙酞幾丁質(chitosen)和葡聚糖醛酸。不同的皮膚癬菌含有不同的糖分，醉母細胞壁或是缺乏或是含有少量其他多糖(如巖藻搪、乳糖、鼠李糖、木搪等)。

6.蛋 白 質組成用 電 泳 方法可以產生同工酶，可鑒定到屬或種。電泳、免疫學方法、蛋白質分析等可解決種間特性。同工酶分析是一個經濟和實用技術。等位基因酶(allozyme)通常用于系統發生的研究。

第五篇：真菌的鑒定

真菌的鑒定

麥曲在黃酒釀造中起著重要的作用，真菌的鑒定。分析微生物在麥曲中的區系分布和其中微生物菌群的系統發育，對于理順麥曲中的微生物與產地環境的相互關系、建立麥曲微生物生態數據庫和麥曲品質的分子評價指標，具有重要的指導意義。

不同培養基進行真菌平板分離的結果

文章來源華夏酒報

為了最大限度地分離出麥曲中的真菌，采用了三種培養基，其中pDA和CpK培養基是用來分離真菌的常用培養基，此外還使用了麥曲浸提液培養基(WQE)，因為它的營養成份近似于微生物最原始的生存環境。對于三種培養基進行平板菌落計數，pDA和WQE培養基上的菌落數在48小時后達到最大，菌落數分別達到4.7×104cfu/g干曲和8.4×104cfu/g干曲。而在CpK培養基上，由于本身是合成培養基，營養不夠豐富，所以24小時后開始慢慢形成菌落，56小時后達到最大值，僅為1.4×104 cfu/g干曲。

不同培養基的麥曲真菌分布

根據菌落大孝形態和顏色等表型特征進行初步區分，共得到24株純種菌株。各個純株在3種分離培養基上的分布情況見表1。從pDA，CpK和WQE三種培養基上分離得到的純種真菌分別為8種、18種和11種。pDA是營養豐富的培養基，但分離出來的真菌數目最少。而近似于微生物最原始生存環境的WQE培養基分離得到的真菌種類，要比預期的少。在合成培養基CpK上分離獲得的真菌種類最多，暗示在低營養長時間的培養條件下，能夠較多地回收得到麥曲樣品中的真菌。

將10—5稀釋度以上檢測到的真菌認為是麥曲樣品中的優勢菌。從表中可以看出，不同的培養基分離出來的優勢菌是不一樣的，且每一種培養基都能檢測到其它培養基所不能檢測到的優勢菌株，所以必須聯合使用多種分離培養基，才能準確解析麥曲中的真菌多樣性。另外，在分離培養基中有必要加入去氧膽酸鈉來抑制菌絲的蔓延。

純種真菌的鑒定

對分離獲得的24株真菌純株進行形態初步鑒定和基于ITS序列的分子鑒定，具體測序結果見表 綜合平板分離和測序的結果可以看出，通過大規模的系統分離培養方法確定麥曲中的優勢真菌為：傘枝犁頭霉(Absidia corymbifera—like)，米曲霉(Aspergillus oryzae)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillus.niger)、小孢根霉(Rhizopus microsporus)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、季氏畢赤氏酵母(pichia guilliermondii)和異常畢赤酵母(pichia anomala)，鑒定材料《真菌的鑒定》。

本研究分離鑒定出的焦曲霉(Aspergillus ustus)、土曲霉(Aspergillus terreus—like)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、桔青霉(penicillium citrimum)、季氏畢赤酵母、異常畢赤酵母，小孢根霉，多變根毛霉(Rhizomucor variabilis)、球毛殼霉(Chaetomium globasum)、阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)和phaeosphaeria fu-ckelii等菌株在以前的研究結果中均未出現。所用的麥曲是人工腳踏成型，此前公司采用培養法對機制麥曲中的真菌進行過研究，機制麥曲中的優勢真菌為傘枝犁頭霉(Absidia corymbifera)、米根霉(Rhizopus oryzae)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)。除了米根霉以外，其余優勢真菌與本文的研究結果一致。

人工腳踏成型麥曲中的真菌種類比機械壓制成型麥曲豐富，其原因是人工踩制曲坯能起到提漿作用，賦予曲坯表面較豐富的營養和較好的保溫功能，因而比機械壓制成型的曲坯更適合微生物的生長繁殖。

對分離獲得的真菌純株序列進行系統發育分析發現，所分離得到的純種菌株大致分為11個屬，分別是曲霉屬(Aspergillus)、犁頭霉屬(Absidia)、根霉屬(Rhizopusmucor)、毛霉屬(Rhizopus)、青霉屬(penicillium)、散囊菌屬(Eurotium)、枝孢屬(Cladosporium)、畢赤酵母屬(pichia)、球毛殼屬(Chaetomium)、念珠屬(Candida)和伊薩酵母屬(Issatchenkia)，反映出紹興黃酒成品麥曲中真菌的資源非常豐富。從屬的分類水平來看，在腳踏曲中出現的屬除了散囊菌屬(Eurotium)、畢赤酵母屬(pichia)和球毛殼屬(Chaetomium)外，其它的屬在機制曲中均有出現。

本文所得到的序列用菌名加代號表示，來自于GenBank數據庫的序列用菌名加登錄號表示。比例尺代表5%的核酸序列差異性。