第一篇：多糖的提取純化及分析鑒定方法研究（大全）

多糖的提取純化及分析鑒定方法研究

王霄

(合肥工業大學 生物與食品工程學院，安徽 合肥230009)

摘要：詳細介紹了動植物多糖的常見提取純化方法的最新研究進展，并比較了各種方法的優缺點。每種方法都有各自的優缺點，在提取時應根據所選材料的性質選用不同的方法，有些方法在一定的條件下可與別的方法協同作用，并對糖的含量測定及分析鑒定方法的研究進展作了概述。

關鍵詞：多糖；提取；純化；分析鑒定；研究進展 中圖分類號：TU 411.01文獻標識碼：A

Progress of Polysaccharides Extraction, Purification and Identification Methods

WANG Xiao

(School of Biological and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract: This paper reviews the extraction, purification and identification methods of animal and plantpolysaccharides, and compares the advantages and disadvantages of each mothed.Each mothed has its own advantages and disadvantages, appropriate mothed should be selected according to the nature of the chosen material, and some of these methods can be synergy with other methods under certain conditions.In addition, analysis and identification of polysaccharides are outlined.Key words: polysaccharides;extraction;purification;analysis and identification;research progress

菌來源的糖綴合物具有廣泛的藥理及生物活性

0多糖概述

多糖（polysaccharide）是由糖苷鍵結合的糖鏈，至少要超過10個以上的單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物。由相同的單糖組成的多糖稱為多糖，如淀粉、纖維素和糖原；以沒的單糖組成的多糖稱為雜多糖，如阿拉伯膠是由戊糖和半乳糖等組成。多糖不是一種純粹的化學物質，而是聚合程度不同的物質的混合物。多糖類一般不溶于水，無甜味，不能形成結晶，無還原性和變旋現象。多糖也是糖苷，所以可以水解，在水解過程中，往往產生一系列的中間產物，最終完全水解得到單糖。

近年來，國際上對糖及糖復合物的研究己成熱點，糖類結構測定和生物活性研究取得了明顯的進展。大量實驗事實揭示糖類是重要信息分子，參與許多生理和病理過程

[1-2]

[3]。

在對各種中藥材化學成分研究的過程中，人

們逐步提高了對植物多糖的關注。植物多糖研究比較深入的是茶多糖、菜籽多糖、南瓜多糖、苦瓜多糖、銀杏葉多糖、枸杞多糖等等，植物多糖在抗生素替代物及保健品領域已經取得很好的應用。多糖作為重要的生物活性物質具有調節免疫、抗腫瘤、降低糖脂、延緩衰老等活性，在醫療保健、食品、動物養殖等領域有著廣闊的應用前景

[4-7]。

1多糖的提取工藝

1.1 水提醇沉法

水提醇沉法是提取多糖最常用的一種方法。多糖是極性大分子化合物，提取時應選擇水、醇等極性強的溶劑。用水作溶劑來提取多糖時，可以用熱水浸煮提取，也可以用冷水浸提滲濾，然后將提取液濃縮后，在濃縮液中加乙醇，使其最

。到目前為止。己有

300余種多糖類化合物從天然產物中被分離出來，其中從中草藥、食藥用菌中提取的水溶性多糖最為重要。已發現有100多種中草藥、食藥用

終體積分數達到70 %左右，利用多糖不溶于乙醇的性質，使多糖從提取液中沉淀出來，室溫靜置5 h，多糖的質量分數和得率均較高。影響多糖提取率的因素有：提取溫度、浸提料液比、提取時間以及提取次數等。為此，研究者對影響多糖提取工藝的這些因素進行了大量研究。林娟[8]

等研究表明水提法提取甘薯多糖的優化工藝條件為：提取溫度85℃，加水比1：7，提取時間2.5h，提取率為26．71％。劉永[9]

等研究表明：最佳提取條件為95℃，料液比1：20(g：mL)，提取時間2h，提取3次，茶葉多糖含量為35.92 mg/g。

水提醇沉法提取多糖不需特殊設備，生產工藝成本低，安全，適合工業化大生產，是一種可取的提取方法。但由于水的極性大，容易把蛋白質、苷類等水溶性的成分浸提出來，從而使提取液存放時腐敗變質，為后續的分離帶來困難，且該法提取比較耗時，提取率也不高[10]。

1.2酶法提取

酶技術是近年來廣泛應用到有效成份提取中的一項生物技術，使用酶可降低提取條件，在比較溫和的條件下分解植物組織，加速有效成分的釋放或提取。此外，使用酶還可分解提取液中淀粉、果膠、蛋白質等非目的產物。此法可使后續的濃縮和脫蛋白工藝更簡易、省時，粗多糖的純度更高。但會提高生產成本，對提取條件要求較高。楊云

[11]

等人采用的單酶法和復合酶法提取大棗多糖，單酶法提取多糖含量最高可達44.69％，而復合酶法多糖最高含量可達68.13％。1.3超聲波提取

超聲法是利用超聲波對細胞組織的破碎作用來提高多糖浸出率的，具有快速、安全、簡便、成本低、多糖提取率高，成分又不被破壞等優點，但對提取設備要求較高。李進偉

[12]

等通過響應面

分析法考察超聲波功率、提取時間、提取溫度、料液比對棗多糖得率與純度的影響，得出棗多糖最佳的提取工藝條件為：超聲波功率86～96W，提取溫度45～53℃，提取時間20min，料液比1:20（g:ml），棗多糖得率7.63%，純度35.57%。與傳統的水浴浸提法相比，該方法不僅縮短了提取時間，且提高了棗多糖得率與純度。1.4微波提取

微波萃取是高頻電磁波穿透萃取媒質，到達被萃取物料的內部，能迅速轉化為熱能使細胞內部溫度快速上升，細胞內部壓力超過細胞壁承受力，細胞破裂，細胞內有效成分流出，在較低的溫度下溶解于萃取媒質，通過進一步過濾和分離，獲得萃取物料。趙怡紅

[13]

等研究表明北冬蟲夏草

多糖微波提取最佳條件：微波功率550W、固液比l：30、提取時間30s、提取1次，多糖收率3.67％。劉青梅

[14]

等研究結果表明:對于紫菜多糖

提取微波提取優于熱水提取,微波凍融提取效果最佳,提取率最高達7.45%,而熱水提取率為2.05%.影響微波浸提的主要因素為浸提時間,其次是微波功率和液固質量比。優選方案為微波功率200W、提取時間8 min、水與紫菜液固質量比40:1。

1.5超臨界流體提取

超臨界流體提取法根據某些氣體在超臨界狀態下具有特殊的液相性質，對一些組分有較好的溶解性，用來提取目的產物。一般采用CO2超臨界萃取多糖組分。朱俊玲

[15]

通過超臨界CO2流體

萃取處理蘆薈多糖，多糖得率為85.1％，是傳統方法的1.5倍。超臨界萃取的最佳工藝條件是乙醇用量為250 ml/100g蘆薈、萃取壓力為25 MPa、萃取溫度為35℃。1.6超濾法

超濾是一種膜分離技術。該技術應用于多糖的提取，具有不損害活性、分離效率高、能耗低、設備簡單、可連續生產、無污染等優點[16]。

1.7酸提法

有些多糖適合用稀酸提取，并且能夠得到更高的提取率。如趙宇等

[17]

對海蒿子多糖的提取方

法研究發現，從多糖提取得率來看，酸提法優于傳統的水提法。不過此方法只在一些特定的植物多糖提取中占優勢，目前報道的并不多。不過在操作上還是應該嚴格控制酸度，因為在酸性條件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂。1.8堿提法

與酸提法類似，有些多糖在堿液中有更高的提取率，尤其是含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。不過，也應控制堿的濃度，因為有些多糖在堿性較強時也會發生水解。

2多糖純化方法

2.1除蛋白

根據蛋白質在氯仿等有機溶劑中變性的特點，用V（氯仿）∶V（戊醇或正丁醇）為5∶1 或4∶1，混合物劇烈振搖20～30 min，蛋白質變性生成凝膠，離心分離，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質。此種只能除去少量蛋白質，效

率不高，須反復多次，多糖有損失。但此方法比較溫和，在避免多糖降解上效果較好，如配合加入一些蛋白質水解酶，用Sevage 法效果更佳。李婉婷

[18]

研究結果表明木瓜蛋白酶-Sevage法除

去款冬花多糖中的蛋白最為理想，該法的最佳工藝條件為：木瓜蛋白酶的酶底比為l％，pH值7.0，先在50℃水浴中酶解2h，再經Sevage法脫蛋白3次，其蛋白脫除率為88.95％，多糖保留率為92.63％。2.2透析法

透析法是利用一定孔目的膜，使無機鹽或小分子糖透過，而將大分子的多糖截留下來從而達到純化多糖的目的。此法的關鍵是要選擇孔目合適的透析膜。纖維膜孔徑為2～3nm，可使單糖分子通過，分離效果較好，透析時常需要多次換水，溶液的pH值維持在6.0～6.5范圍內。2.3凝膠柱層析法

凝膠柱層析法主要是根據多糖分子的大小和形狀不同而達到分離目的。但溶液流經多孔性凝膠柱時，小分子已擴散人孔中，各溶質依分子量大小順序依次流出。此方法快速、簡單、條件溫和。常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)和瓊脂糖凝膠(Sephamse)，以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑。此法還可進行多糖相對分子量的測定。王赫

[19]

采用Sephadex G-100凝膠色譜柱

分離純化，從龍膽水溶性多糖中分離純化得到2 種不同的均一多糖組分TP-

1、TP-2。2.4纖維素住層析法

纖維素陰離子交換劑柱層析對多糖的分離是利用pH 6時，酸性多糖能吸附于交換劑上，中性多糖不吸附，用pH相同離子強度不同的緩沖液將酸性強弱不同的酸性多糖分別洗脫出來。常用的陰離子交換纖維素有DEAE-纖維素和ECTEOLA纖維素。張蘭杰

[20]

等就采用DEAE-纖維素柱分離

北五味子多糖，分別得到了白色結晶和黃色粉末兩種多糖產物。

3多糖的分析

3.1含量的測定

測定方法：硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法、比色定量法、分光光度法、紙色譜法、離子交換色譜法、yaphe [21]

法、薄層色譜法、酶法、原子吸

收法

[22]、HPLC法、凝膠電泳法、親和電泳法連、續流動分析法檢測法

[23]、次亞碘酸鹽定量法、蒽

酮-硫酸法（總糖）、DNS法

[24]

（還原法）、磷鉬

比色法、鄰鉀苯胺比色法等。每種方法只對某些多糖的測量效果好。比色法分光光度法離子交換色譜法酶法和電泳法等可同時用于多糖的定性定量分析。3.2純度鑒定

多糖是高分子化合物，其純品微觀上是不均一的，通常所說的多糖純品實質上是一定分子量范圍的均一組分。多糖純度鑒定的常用方法：超離心、高壓電泳、凝膠層析、HPLC法等。現在應用較多的是HPLC法，旋光度測定[25]

也是純度

測定的一種方法。3.3分子量的測定

多糖分子量的測定是研究多糖性質的一項重要工作常用方法：滲透壓法、蒸氣壓滲透劑法、端基法、粘度法、光散射法、凝膠色譜法、超過率法、沉淀法、凝膠電泳法、HPLC法、超離心分析法、分子篩色譜法、GPC法

[26]。

4多糖的鑒定

4.1 多糖一級結構測定

多糖的一級結構分析，主要是分析組成多糖的單糖類型、數目連接方式及苷建構型。常用化學法和儀器分析法。多糖組分與分子比例測定法：部分酸解法、完全酶解法、色譜法；吡喃、呋喃環形式結構的分析：紅外光譜；連接次序：選擇性光譜法、糖苷鍵順序水解、核磁共振； α-β-異頭異構體：糖苷酶水解核磁共振；羥基被取代情況：甲基化反應、氣相色譜、過碘酸氧化、Smith降解法和測硫酸基法（terho法）、核磁共振、質譜法；糖鏈、肽鏈連接方式：單糖與氨基酸組成、稀堿水解法、肼解反應；多糖結構的分析方法很多，迄今沒有一種方法可以單獨完成多糖結構的分析。儀器分析與化學方法相結合是常用的多糖結構測定方法。4.2多糖高級結構測定

目前研究多糖的二級結構常用的手段是NMR技術，如2D-NMR，13C譜，通用的方法是將現代NMR技術與理論計算相結合通過一定的理論計算篩選構象，主要的理論計算方法有從頭計算、豐度經驗計算及經驗力場計算

[27]

。圓二色

譜法（CD）也可用于糖的構象分析,張麗萍等

[28]

應用譜測定了金頂側耳多鍺的水溶液構象近年來，以精確三維結構知識為基礎揭示重要生命活

動的規律已達到前所未有的深度和廣度[29]，多糖

作為一類重要的生物活性大分子其結構的研究勢

必推動對多糖的認識向深層次發展。多糖的應用展望

我國對多糖的研究起步較晚，但近年來的工作取得了較大的進展，愈來愈多的多糖被發現并證實它們具有復雜廣泛的生物活性和功能。隨著對多糖生物活性的深入研究，多糖的生物活性機理，功效因子會更加明確，它的應用領域也將會更加拓寬。然而，由于多糖本身結構比較復雜，種類繁多，其結構測定和分離純化有很大的難度；有些多糖在天然植物中的含量低且不易分離及多糖的藥理作用與諸多因素有關，給多糖的研究和應用帶來許多的挑戰，這需要相關行業的人士共同應對。

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第二篇：冬蟲夏草產多糖菌株的篩選鑒定及多糖提取

冬蟲夏草產多糖菌株的篩選鑒定及多糖提取

摘要：為了得到多糖收率較高的冬蟲夏草菌株，從西藏那曲地五高山草甸中采集的新鮮冬蟲夏草子實體初步分離得到50株菌株，并對其進行形態觀察和18S rDNA-ITS序列分析鑒定，采用超聲輔助熱水浸提法進行冬蟲夏草多糖的提取。結果表明，CC-3菌株Cladosporium sp.的模式菌株JN084020的18S rDNA-ITS同源相似性為100%，初步確定為冬蟲夏草的無性型，經過超聲輔助熱水浸提后多糖收率最高為6.619%。

關鍵詞：冬蟲夏草；真菌；篩選；rDNA-ITS序列；Cladosporium sp.中圖分類號： S182 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0240-03

冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）是中國傳統的名貴中藥材，系麥角菌科蟲草屬真菌寄生于蝙蝠蛾的幼蟲所形成的的菌蟲復合體[1]。2001年統計，全球冬蟲夏草種類已有400種，其中中國記載有105種左右[2]。

冬蟲夏草在中國傳統醫學里已經流傳1 300多年，最早記載冬蟲夏草的文獻始于唐朝前期公元710年的《月王藥診》，記載冬蟲夏草能治療肺部疾病。公元780年《藏本草》記載的冬蟲夏草具有潤肺、補腎的作用；1765年，趙學敏在《本草綱目拾遺》中記載冬蟲夏草的作用是潤肺、補腎、益精氣，理諸虛百損；1757年，吳儀洛所著《本草從新》中指出冬蟲夏草保肺益腎，止血化痰。其后，《黔囊》《文房肆考》《四川通志》《本草圖說》等100多部古書都記載了冬蟲夏草名貴藥材[3]。

目前，研究證實冬蟲夏草有降血糖、免疫調節、抗腫瘤、抗氧化、抗纖維化、抗炎等功效，對肺臟、腎臟、中樞神經系統、免疫系統、心臟、肝臟等均有較好的臨床保護作用[4]。由于冬蟲夏草的生長環境及人們過于采挖，冬蟲夏草已經遠遠不能滿足醫療的需求，人們開始研究冬蟲夏草成分與功能的關系，冬蟲夏草多糖作為冬蟲夏草的重要活性成分，具有抗疲勞、抗衰老、提高免疫力的作用[5-6]。表明冬蟲夏草多糖在新藥開發方面有廣闊的前景。

已報道的冬蟲夏草的無性型菌株涉及13個屬，22個種名[7]，包括細腳擬青霉（Paecilomyces tenuipes）、蟲草蚧霉屬（Lecanicilliuum sp.）、輪枝孢屬（Verticillium sp.）、被毛孢屬（Hirsutella）、頭孢屬（Cephalosporium sp.）等，其中部分冬蟲夏草的無性型還有待進一步確定[8]。冬蟲夏草的無性型研究已成為研究熱點。

本研究分離篩選了50株能夠產多糖的菌株，分子生物學鑒定分別為蟲草蚧霉屬、枝孢菌屬、黑粉菌屬。超聲輔助熱水浸提法提取冬蟲夏草多糖，CC-3菌株的多糖得率最高為6.619%。研究結果為應用發酵方法生產冬蟲夏草多糖替代冬蟲夏草應用于醫療，以及進一步確定冬蟲夏草多糖的功能奠定基礎。材料與方法

1.1 材料

新鮮冬蟲夏草采自西藏那曲地五高山草甸。

1.2 培養基及試劑

PDA加富培養基：土豆200 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母膏 1 g/L、蛋白胨1 g/L、KH2PO4 1g /L、瓊脂240 g/L、MgSO4 0.5 g/L、蠶蛹粉1 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽滅菌30 min。

種子瓶液體培養基：KH2PO4 3 g/L、MgSO4 1.5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖20 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽滅菌30 min。

發酵培養基：葡萄糖9 g/L、麥芽糖19 g/L、蛋白胨 10 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4 1 g/L、MnSO4 0.5 g/L。pH值6.7，121 ℃蒸汽滅菌30 min。

CTAB提取液：NaCl 1.4 mol/L、EDTA 20 mmol/L、CTAB 20 g/L、Tris-Cl 100 mmol/L、巰基乙醇2 g/L、pH值8.0。

苯酚 ∶氯仿 ∶異戊醇溶液=25 ∶24 ∶1。

RNA酶：1 mg/mL。

真菌通用引物：ITS1和ITS4。

1.3 試驗方法

1.3.1 冬蟲夏草菌株的分離純化

無菌條件下將新鮮的冬蟲夏草用1%HgCl2溶液消毒，用無菌水沖洗干凈，并用無菌的濾紙吸干表面的水分，分離冬蟲夏草的蛹體和子座部分，分別研磨成粉，用無菌濕棉簽蘸取粉末涂于加入氯霉素1 g/L 的PDA加富平板上，倒置于28 ℃培養箱中培養至單菌落出現。挑選菌絲色澤潔白、生長健壯、無雜菌污染的菌株，轉接加入氯霉素1 g/L 的PDA加富試管斜面中，28 ℃培養箱中培養7～10 d，直至整個斜面都長滿菌絲，選取生長健壯，無雜菌的菌株即為分離得到的菌株。

1.3.2 菌種的鑒定

1.3.2.1 菌體形態觀察

將分離得到的菌株梯度劃線接種于PDA平板中，用無菌鑷子取無菌蓋玻片，斜插入培養基中，每天觀察并記錄菌落生長情況，7 d后，拔出插片，顯微鏡下觀察菌絲形態及產孢形式。

1.3.2.2 菌株的ITS序列測定

（1）基因組DNA的提取。采用CTAB法[9]提取基因組DNA。

（2）ITS序列分析。

ITS序列引物為真菌通用引物，ITS1和ITS4[10]。ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；

ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR擴增反應體系（25 μL）：DNA 2 μL、TaqDNA聚合酶0.3 μL、10×TaqBuffer（含Mg2+）2.5 μL、ITS1 2 μL、ITS4 2 μL、dNTP 2 μL、ddH2O 14.2 μL。

PCR擴增程序：95 ℃預變性10 min，94 ℃變性30 s、55 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸50 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。

（3）瓊脂糖凝膠電泳及測序。

PCR產物擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳，條帶清晰，用蛋白核酸測定儀測定后無蛋白和核酸殘留，送北京寶銳通生物技術有限公司測序。

（4）ITS測序數據分析。

在NCBI中對菌株的ITS序列進行BLAST分析，然后用MEGA5進行系統發育樹的構建。

1.3.3 提取冬蟲夏草多糖

1.3.3.1 冬蟲夏草菌絲體的制備

在無菌條件下挖取1 cm2的分離菌株的培養菌苔接種于裝有100 mL種子培養基的三角瓶（容量500 mL）中，180 r/min、28 ℃搖床培養7 d。

按10%的接種量，接種于裝有100 mL發酵培養基的三角瓶（容量500 mL）中，180 r/min、28 ℃搖床培養7 d。

發酵液 8 000 r/min 離心10 min。收菌絲體、80 ℃烘干、粉碎、過80目篩，備用。

將烘干的冬蟲夏草菌絲體粉碎，過40目篩，備用。

1.3.3.2 超聲輔助熱水浸提法提取冬蟲夏草多糖

取干燥恒重的冬蟲夏草菌絲粉10 g，提取溶液為去離子水（首次加量料液比為1 g ∶20 mL，浸泡30 min之后，加水量料液比按前加量的75%遞減）。提取條件：溫度90 ℃、提取4次、每次浸提時間90 min，超聲功率150 W。

1.3.4 冬蟲夏草多糖含量測定

采用苯酚-硫酸比色法[11-12]測定。

1.3.4.1 繪制葡萄糖標準曲線

取烘干至恒重的葡萄糖標準品配置成最終濃度為0.1 mg/mL的標準液，取9支試管分別取葡萄糖標準液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL，各補加蒸餾水至1.0 mL，然后加入5%苯酚1.0 mL，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置10 min。于40 ℃水浴中加熱 30 min，以蒸餾水替代葡萄糖標準液為空白對照，于D490 nm波長處測吸光度。

1.3.4.2 冬蟲夏草多糖含量的測定

取冬蟲夏草多糖提取濾液，稀釋一定的倍數，取1 mL稀釋液，加入5%苯酚溶液 1 mL，搖勻、迅速加入5mL濃硫酸，搖勻、靜置10 min。于 40 ℃ 水浴中加熱30 min，以蒸餾水作空白對照，在D490 nm處測定吸光度。按回歸方程計算稀釋液多糖含量。按下式計算多糖含量：多糖含量（mg/g）=待測液中多糖濃度（mg/mL）×溶液體積（mL）×稀釋倍數/原料質量（g）。結果與分析

2.1 冬蟲夏草菌株的分離純化

對分離出的50株生長健壯、無雜菌、菌絲潔白的菌株進行多糖的提取，并測定多糖含量，根據葡萄糖標準曲線得到的回歸方程，計算蟲草多糖得率。回歸方程為y=10.399x-0019 5，r=0.998 7。根據計算得到，CC-3菌株的多糖得率最高，達6.619%。不同菌株的多糖含量結果見表1。討論與結論

冬蟲夏草的生活史分為有性型的子囊孢子階段和無性型的分生孢子階段。而人工培養、液體發酵菌絲體的冬蟲夏草均為無性型階段，因此，冬蟲夏草無性型及菌種的鑒定至關重要。

最早人們判定冬蟲夏草有性型和無性型的關系，依據假定無性型與蟲草有性型子實體有相關性，用人工誘導蟲草子實體的形成。人工誘導方法在人工誘發子實體長出子囊孢子非常困難，培養出的蟲草子實體寥寥無幾，人工誘導方法只能為蟲草有性型和無性型的鑒定提供依據。

劉作易等從云南收集的新鮮冬蟲夏草（Cordyceps sinensis），利用微循環對其子囊孢子的產孢結構進行了觀察，并與組織和子囊孢子分離的菌株的產孢結構進行比對，還與中國被毛孢（Hirsutella sinensis）的產孢結構進行比較。結果顯示微循環的產孢結構與分離菌株和中國被毛孢的產孢結構相似，由此確定冬蟲夏草的無性型為中國被毛孢[13]。該方法雖操作簡單，但必須要先明確此菌株的種屬關系，該方法在冬蟲夏草無性型的鑒定上也還是一種輔助手段。

隨著分子生物學的發展，RAPD-PCR技術為確定蟲草的無性型提供了可靠的分子生物學證據，但該方法不能很好地確定菌株的種和亞種。ITS序列分析的發展，為菌株無性型與有性型關系及菌株的近緣關系方面提供了可靠證據。Kang等報道，甘肅蟲草和冬蟲夏草具有相同的 ITS序列，并認為甘肅蟲草可能是冬蟲夏草的分類異名[14]。張澤文對古尼擬青霉菌種的完整的 rDNA的ITS 區進行序列測定并進行比對，結果表明，分離到菌種為古尼蟲草的無性型，即古尼擬青霉（Paecilomyces gunnii）[15]。

本研究從采摘的新鮮冬蟲夏草子實體中分離得到CC-3菌株，運用插片法對該菌株的菌絲形態和孢子結構進行顯微觀察，初步判斷菌株的菌屬關系，通過RAPD-PCR技術，用通用引物ITS1 和ITS4擴增出18S rDNA片段，進行序列比對，最后確定該菌株的種屬關系。

多糖提取方法很多，如水提醇沉方法提取多糖，在醇沉過程中會損失大量多糖；酶解法提取多糖，條件溫和、質量好，但是經濟價值高；熱水浸提法提取多糖，方法簡單易行，但效率較低。超聲波產生的強烈振動和空化效應，使細胞破碎程度增大，加速了多糖的溶出，有利于多糖的提取。本試驗采取超聲波輔助熱水浸提法提取蟲草多糖。

多糖測定方法也很多，通常采用硫酸-蒽酮法、苯酚-硫酸法測定多糖的含量。硫酸-蒽酮法由于糖與蒽酮試劑的顯色深度不同，糖混合時，常因不同糖類比例造成一定的誤差。而苯酚-硫酸法測定多糖，方法簡單、靈敏度高、不受蛋白質存在的影響，產生的顏色穩定。

從西藏新鮮的冬蟲夏草中初步分離得到50株菌株，經過多糖含量測定，CC-3菌株多糖得率最高，為6.619%，多糖含量高達6.619 mg/g。對CC-3菌株進行形態學觀察、分子生物學18S rDNA序列分析，初步鑒定CC-3菌株為Cladosporium sp.菌株。

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第三篇：菠蘿蛋白酶純化方法總結

菠蘿蛋白酶的提取方法：

（1）沉淀法

沉淀法是粗提酶蛋白的方法之一，主要用于前期酶的初步分離和濃縮，常用的方法有鹽析法，有機溶劑沉淀法，聚乙二醇沉淀法，等電點沉淀法等。用新型吸附洗滌沉淀法和單寧沉淀法也可以提取菠蘿蛋白酶，操作簡單，產率也較高，但酶的產量與單寧的用量密切相關，而且所含單寧有毒，導致這種方法逐漸被淘汰了。以酒精為沉淀劑提取菠蘿蛋白酶時，酒精的加入量會對菠蘿蛋白酶產生較大的影響，酒精的濃度太低時，不能使菠蘿蛋白酶沉淀下來，濃度太高容易使酶變性失活。酒精的濃度為80%時，酶的收率最高。從茶葉中提取的多酚類物質茶多酚也可用于菠蘿蛋白酶的分離，用0.5%的茶多酚提取物對菠蘿汁中菠蘿 蛋白酶進行沉淀最多可達78%，其最大沉淀率明顯比單寧法高。（2）離子交換色譜法

離子交換色譜層析法是蛋白質研究領域內比較高效的純化技術，目前國外用于分離菠蘿蛋白酶常用的離子交換劑有Sephacryl S-200柱、Mono S陽離子交換劑、S-Sepharose、弱酸性陽離子交換樹脂、CM-纖維素陽離子交換柱、Q陰離子交換柱。國內常用的有羧甲基纖維素（CMC）、二乙胺乙基纖維素（DEAE），酶的純化過程通常是將若干色譜純化技術聯合使用來實現的。Ota最早用SephadexG-75結合CM-SephadexC-25柱層析分離得到5種莖酶的組分。用DEAE-52離子交換柱層析結合Sephadex G-75分子篩柱層析色譜法純化果酶，能 獲得比活力為12.5U/mg的單一電泳純酶制劑。（3）固定化金屬離子親和色譜法

固定化金屬離子親和色譜法是以普通凝膠作為載體，連接上合適的螯合配體和足夠暴露的金屬離子，制成親和吸附劑，進行分離純化蛋白質的方法。此法介于高特異性的生物親和分離法和低特異性的離子交換色譜法之間，對組氨酸基團有特異性。Huali Nie 等（2008）首次應用固定化金屬親和膜（IMAM）—肽-尼龍膜，這是一種將七肽共價固定到復合膜上作為配體的新型尼龍膜，用其從菠蘿中分離和提純菠蘿蛋白酶，可使菠蘿蛋白酶純化 15.4 倍，回收率達 94.6%，而且不會造成任何變性。固定化金屬親和層析技術正逐漸被采用，Pawan Gupta等（2007）將菠蘿蛋白酶成功固定在亞氨基二乙酸載體瓊脂糖凝膠 6B 型中。Cu2+ 與亞氨基二乙酸（IDA）的絡合被用來作為螯合配體將單個組氨酸結合到菠蘿酶上。固定化高親和性載體的制備是試圖將可溶性交聯菠蘿蛋白酶制劑固定到銅-亞氨基二乙酸-瓊脂糖凝膠上。（4）超濾法

超濾法是在離心力或較高的壓力作用下，選擇適當孔徑的超濾膜，使水和其他小分子物質通過，而使所需酶蛋白截留的方法。利用超濾法提取酶蛋白，具有無相變、生物活性不易喪失、得率較高，不會改變溶液糖酸比等特點。用超濾法濃縮有機溶劑提取的菠蘿蛋白酶產品質量好，對環境污染少，可以實現清潔生產，酶粉得率比高嶺土工藝高出47%。超濾法分離提取的粗酶比活力較單寧沉淀法高2.7倍，也比酒精沉淀法高。用超濾法濃縮提取菠蘿蛋白酶需要對操作條件進行研究，盡最大可能提高超濾效果，促進工業化生產。楊輝等研究認為壓力差在300kPa，透過液通量為50L/m2·h時即能保持較大的流量，又不會對酶活造成損失。在對菠蘿汁進行超濾的過程中，料液透過通量隨壓力差增加和循環速度的增大逐漸上升并趨于穩定。用超濾法濃縮提取生物大分子時因不同膜材料的透過通量和截留率不同，而導致不同的分離特性。用聚丙烯腈膜（PAN）膜濃縮工藝較適合對菠蘿蛋白酶進行超濾濃縮，可使果菠蘿酶回收率達93.3%，截留率達97.8%。用PSA膜超濾菠蘿皮汁制得的菠蘿蛋白酶酶活總回收率為65.7%。李興，林哲甫用二氧化鈦吸附菠蘿果汁中的菠蘿蛋白酶再用截留值2萬和5萬的超濾膜超濾濃縮，能獲得較高比活的果酶。得到的果酶活力回收率為54%，比活力為911單位/mg。目前將納米氧化鋅吸附、陶瓷膜超濾濃縮和冷凍干燥法結合的綜合性技術已達到國際先進水平，創新性較好。(5)雙水相萃取法 利用兩種多聚物，或多聚物與鹽在水相中的不相容性，可以從細胞破碎后的細胞碎片中直接分離、純化并濃縮蛋白質。該方法的優點是比較溫和可在室溫下進行，一般不造成酶的變性失活，還可提高其穩定性。與其它分離純化方法相比，利用雙水相萃取法有很多優點，如易于放大、成本低、可以連續操作、并且是環境友好的。這就使其成為分離純化生物分子的誘人的替代方法，在國外進行了大量的應用。B.Ravindra Babu等（2008）首次使用該法從菠蘿中分離純化菠蘿蛋白酶和多酚氧化酶的混合物，結果使菠蘿蛋白酶的純度提高4.0倍，得到約228%的活性回收率。雙水相萃取法提供了一種有效的、經濟上可行的分離純化菠蘿蛋白酶的方法。在雙水相體系中用PEO–PPO–PEO 嵌段共聚物分離純化菠蘿蛋白酶，其活性回收范圍為7.5%~79.5%，純化倍數0.1~1.25倍。在雙水相體系中，各種參數如聚合物的分子質量、聚合物和形成相的鹽濃度和分離體系的pH對分離純化的結果影響較大。(6)反膠團萃取法

生物技術的發展為重要生物分子的生產開辟了一條新的途徑，在選擇性提取的生物分子中，逆膠束有機相很有潛力發展為液液萃取的生物分離技術。反膠團是表面活性劑，使水滴穩定分散在有機溶劑中，這種表面活性劑是雙親性的有機復合物，既親脂也親水。反膠團萃取法有如下一些優點：不會造成原有功能或活性的損失、界面張力較低、易于規模化、有連續運作的潛力。H.Umesh Hebbar等（2008）用溴化十六烷基三甲銨/異辛烷/正己醇/正丁醇和磺酸鈉/異辛烷的反膠束體系從菠蘿廢料的水提物中提取和初步純化菠蘿蛋白酶。用反向陽離子表面活性劑（CTAB）膠束體系能使菠蘿蛋白酶獲得一個較好的活性回收率可達106%，純化 5.2 倍，而采用陰離子表面活性劑（AOT）則沒有獲得較好的產率。(7)新型納米吸附劑法

隨著一種以氧化鐵納米粒子為核心，聚丙烯酸為離子交換組的新型磁性納米吸附劑的開發，其在生物分離和生物醫學領域已經被廣泛應用。它具有高的離子交換容量和快速的吸附/解吸率。這種納米粒子用于菠蘿蛋白酶的分離是很有效的。近年來，納米纖維膜由于其非常大的表面積和體積比、優越的機械性能引起人們的廣泛關注，Haitao Zhang 等（2010）通過一步靜電紡絲技術以二甲基乙酰胺為溶劑制備出超細聚丙烯腈（PAN）納米纖維膜，用化學的方法連接到殼聚糖的表面，共價連接到染料配體辛巴藍上制成染料固定化親和膜，而且可以重復使用，膜的再生顯示出良好的機械性和化學穩定性。這種新開發的染料親和膜首次用于菠蘿蛋白酶的吸附，批次試驗揭示出它具有一個很高的吸附菠蘿蛋白酶的能力，可以實現高效率的大規模的吸附，這種低非特異性結合的親和膜對于純化高純度的菠蘿蛋白酶是很有效的。

供試酶液的制備（納米二氧化鈦吸附法分離純化效果明顯好于高嶺土吸附法和超濾濃縮有機溶劑提取法，所得酶的比活力分別是后兩者的1.94倍和3.81倍）清洗后菠蘿莖在 4℃冷室中預冷 12h，組織搗碎機搗碎，加 1 倍 0.05mol/L，pH6.0 磷酸緩沖液（含 5 mmol/L 的 EDTA）浸提，緩慢攪拌，浸提 10min，4 層紗布過濾，離（4000rpm，15min），上清液即為供試酶液，蛋白質含量為 1.62 mg/mL。（菠蘿果、皮中酶供試液制備方法同上）操作要點：選取干凈的菠蘿莖，除雜，清水中漂洗三次，瀝干，放入 4℃冷室中 預冷備用。預冷后莖用高速組織搗碎機打漿，加 0.05 mol/L，pH6.0 磷酸緩沖液浸提 10min，4 層紗布過濾，濾液在 4000 rpm 條件下，離心 15min，取上清液，放入 4℃冷室中備用。1.納米 TiO2吸附法

（納米 TiO2的用量直接影響吸附效果。用量不足，對酶的吸附不完全；用量過多，增加處理和洗脫難度，浪費資源）（超濾過程中會發生濃差極化現象，導致菠蘿蛋白酶的損失。在壓力較低時，隨壓力增大，通量呈直線上升，但隨壓力增大，膜逐漸被壓實，濃差極化（膜分離過程中的一種現象，會降低透水率，是一個可逆過程。是指在超濾過程中，濃差極化由于水透過膜而使膜表面的溶質濃度增加，在濃度梯度作用下，溶質與水以相反方向向本體溶液擴散，在達到平衡狀態時，膜表面形成一溶質濃度分布邊界層，它對水的透過起著阻礙作用。）現象增加，膜通量增幅變緩。）

供試酶液中加納米 TiO2攪拌均勻→離心（4000 rpm，15min）→取沉淀用檸檬酸緩沖液洗脫→攪拌（30min）→離心（4000 rpm，15min）→取上清液→超濾濃縮→冷凍干燥→酶制品。操作要點： ① 吸附、洗脫：供試酶液置于玻璃或不銹鋼容器中，加入納米 TiO2攪拌均勻，吸20~30min，離心棄上清，沉淀用檸檬酸緩沖液洗脫，離心取上清。② 超濾：洗脫液先用截留分子量為 40KD 的超濾膜除去較大分子量的雜蛋白，再用截留分子量為 20KD 的超濾膜除去較小分子量的雜蛋白及其它小分子雜質，采用加去離子水多次超濾。③ 冷凍干燥：據共晶點確定干燥參數。④ 納米 TiO2吸附能力再生：納米二氧化鈦吸附洗脫后，采用 0.1mol/LNaOH 溶液浸泡，再用去離子水洗滌至中性，干燥后進行重吸附實驗，吸附效果可恢復 90%以上。通過正交試驗得影響實驗效果的因素主次為：納米 TiO2用量＞吸附液 pH＞吸附時間＞吸附溫度 高嶺土吸附法（高嶺土吸附法生產工藝和操作都比較復雜，原材料消耗多，所需設備也多，酶活總回收率及純化倍數都較低，投資較大。）

供試酶液→加 4%高嶺土，攪 20min，10℃吸附 30~60min→靜置→吸出上清→沉淀用 16%NaOH 調 pH6.5~7.0→加 7%~9%NaCl，攪 30min→壓濾，濾液用 1:3（體積比）鹽酸調 pH5.0→攪拌→加濾液量 25%（NH4）2SO4→溶解→4℃靜置過夜→離心→沉淀→干燥（王平諸等，2002）。操作要點：

①吸附：將供試酶液加入吸附槽中攪拌，同時加入 4%的高嶺土，攪拌約 20min，在 10℃吸附 30~60min，用虹吸排掉上清液，收集高嶺土吸附物。

②洗脫：用 16%的 NaOH 溶液調節吸附物的 pH 至 7.0 左右，再加入吸附質量為 7%~9%的工業食鹽，攪拌 30min 進行洗脫，然后迅速壓濾，收集濾液。

③鹽析：將壓濾液收集在鹽析槽中，用 1:3 的鹽酸調節 pH 至 5.0 左右，攪拌加入壓濾液質量 25%的硫酸銨，待完全溶解后，4℃過夜；然后離心，收集沉淀鹽析物，干燥即為粗酶。

3.超濾濃縮有機溶劑沉淀提取

供試酶液→超濾濃縮→有機溶劑沉淀→干燥→酶制品。

操作要點：①超濾：供試酶液先用截留分子量為 40KD 的超濾膜除去較大分子量 的雜蛋白，再用截留分子量為 20KD 的超濾膜除去較小分子量的雜蛋白及 其它小分子雜質。

②有機溶劑沉淀：將濃縮液降溫至 0~4℃，邊攪拌邊加入-20℃的 95% 乙醇，直至混合液中乙醇濃度為 50%，靜置，使酶沉淀，移出上清液，即 為濕酶。

③干燥：將濕酶在 0℃下減壓干燥即得菠蘿蛋白酶制品。2.4.4.5 離子交換層析條件的確定（D.R.馬歇克等，1999.）

pH：配制pH5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 的0.01 mol/L Tris-磷酸鹽緩沖液（含0.01 mol/LNaCl及1 mmol/LEDTA）。量取離子交換樹脂 1mL，用蒸餾水充分沖洗，定量到 10mL 懸漿。取 7 個 2mL 離心管，每管加入 1mL 離子樹脂懸漿，分別用上述緩沖液平衡。去掉多余緩沖液。按納米二氧化鈦吸附法最佳條件制得供試酶樣品，配成一定濃度酶液。取 1mL 樣品與相應緩沖液等量加入離子樹脂中，混勻，離心取上清液，測酶活性。離子強度：取 4 支 2mL 離心管各加入 1mL 離子樹脂懸漿，分別用含0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L NaCl 的初始 pH6.0 的 0.01 mol/LTris 緩沖液充分潤洗 1~4 號試管，使離子樹脂與相應緩沖液平衡，去掉多余緩沖液，向各管中加入 1mL 樣品及等量緩沖液。混勻，靜置 10min，離心取上清，測酶活性。吸附容量：取4支2mL離心管加入同初始緩沖液平衡后的離子交換樹脂0.2mL。用離心管處理樣品，于1、2、3、4號管中各加入1mL、2mL、3mL、4mL的樣品。混勻，離心取上清液，測酶活性。離子交換層析：（1）PH的確定pH6.0的0.01mol/LTris-磷酸鹽緩沖液（2）洗脫液的濃度采用 1.5mol/L 的 NaCl 溶液作為梯度洗脫的上限濃度。（3）吸附容量的測定為保證柱層析效率和菠蘿蛋白酶的回收率擬選擇 1mL 為最佳吸附容量。

離子交換法的詳細步驟.1 離子交換介質處理與轉型

用初始緩沖液替換傾倒澄清掉 20%乙醇，并用初始緩沖液配成凝膠勻漿（凝膠占 75%，緩沖液占 25%），作真空脫氣處理備用。2 裝柱與平衡

將所有材料和試劑平衡至室溫，配制初始緩沖液為 20mM pH4.0 的醋酸緩沖液（含 0.01%的 EDTA）和洗脫液為 1M NaCl~20mM pH4.0 醋酸緩沖液（含 0.01%EDTA）。根據試驗中柱子（1.1cm×30.0cm）的類型取所需量的凝膠，打開層析柱頂部，關閉出口，用 20mM pH4.0 的醋酸緩沖液潤濕層析柱柱內及柱子底端并保持一小段液位，略高出濾膜，仔細驅除底端氣泡。將凝膠勻漿用玻璃棒引導邊攪拌邊沿著柱內壁按同一方向連續傾倒入柱內，防止空氣泡的產生，同時用緩沖液填充柱子的剩余部分。打開柱下口出水口夾子，使凝膠在柱內自由沉降，裝上層析柱頂端柱頭，連接好洗脫液。打開蠕動泵，調節流速，讓緩沖液按一定的流速 通過，穩定柱子。用 3~4 倍柱體積的緩沖液平衡柱子，直至流出的平衡液和初始平衡液 pH 相等時表示已達到平衡。同時連接紫外檢測儀，等流出液在檢測儀上繪出的基線穩定后平直即可。3 加樣

略微增大層析柱出口的流速，排除凝膠床表面緩沖液。打開層析柱頂塞，用移液管將透析至無 SO42-的酶蛋白溶液沿管壁從凝膠床表面上數毫米處緩慢流下。加樣時應先沿柱內壁轉動一周，然后移至中心緩慢小心地將樣品溶液加到凝膠表面，最好避免破壞凝膠，以保持凝膠表面平坦。打開層析柱出口，讓蛋白質樣品溶液進入凝膠柱床內，待液面重合時，可用少許起始緩沖液洗柱內壁和床表面，關上層析柱出口。.4 洗脫

加樣后用足夠量的起始緩沖液淋洗，使未吸附的物質被洗出，并達到充分平衡，在凝膠表面緩慢滴加洗脫液，加至洗脫液表面與柱口形成凸面，加入 1MNaCl~20mM pH4.0 醋酸緩沖液（含 0.01%EDTA）以 1mL/min 流速，開始洗脫，同時連接紫外檢測儀，調整橫流泵為 1mL/min，同時以自動部分收集器收集，每5min 收集一管，分別測定每管的蛋白濃度及酶活。

二．蛋白含量測定方法

采用考馬斯亮蘭 G-250 法（George R，1973）測定蛋白質含量：①標準蛋白溶液的配制：稱取 10mg 牛血清白蛋白溶于去離子水并定容至 100mL，配成 0.1mg/mL 的標準蛋白溶液。②考馬斯亮蘭 G-250 染料試劑：稱 100mg 考馬斯亮蘭 G-250，溶于50mL 95%的乙醇后，再加入 120mL 85%的磷酸，用水稀釋至 1L，過濾后貯于棕色瓶中。③標準曲線的繪制：取 7 支試管，編號后如表 1，混勻，放置 2min后，在 595nm 波長下比色測定（應在 1h 內完成），以牛血清白蛋白含量（μg）為橫坐標，以吸光度為縱坐標。根據表 1 不同蛋白質濃度樣品液分別測定吸光度，以蛋白含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線：：y＝0.0028x+0.0743；R2=0.9996；式中：y 為吸光度，x 為蛋白質濃度 μg/mL。

酶的活力測定：精密移取PH7.0的干酪酸溶液5ml與15ml的具塞試管中，置于37攝氏度恒溫水浴中保溫十分鐘，準確取一定量的的供試菠蘿蛋白酶液，用酶液激活液（ph4.5L-cys胱氨酸和EDTA-2Na配置）稀釋至1ml，加入上述底物溶液中，搖勻，立即置入37攝氏度的恒溫水浴中，準確反應10min，加入5ml三氯乙酸溶液中，終止反應，用力混勻，在37攝氏度恒溫水浴中靜置保溫30min，待蛋白凝聚沉淀，然后冷卻至室溫于3500rpm離心10min，取上清液于275nm波長下測為其吸光度A。另取等體積的供試酶液，按上述步驟操作，對換酶液和三氯乙酸的加入順序，測得吸光度A0。

菠蘿蛋白酶活性的單位定義：一個酶活力單位（U）定義為特定條件下（PH7.0 ,37加減1攝氏度）酶作用于干酪素底物1min產生1ug酪氨酸所需酶量。

第四篇：財務分析方法研究

財務分析方法研究

選題的背景及意義

財務分析是財務管理的基礎工作之一。財務報表分析是以企業的各項基本活動為對象、以財務報表為主要信息來源、從報表中獲取符合報表使用者分析目的的信息，以分析和綜合為主要方法，系統認識企業活動的特點，從而評價其業績，發現其問題，目的是了解過去、評價現在和預測未來，以幫助報表使用者改善決策。

研究的價值

挖掘運營過程中存在的關鍵問題，需求解決措施，監督反饋落實情況，以支持更好的業績表現。目的是獲得更大的市場份額、更佳的品牌美譽度、更合理的利潤，最終更好的滿足股東的要求。

論文的框架與結構

第一章導論。本章主要闡述論文選題的背景、研究的目的和現實意義。

第二章財務報表分析方法的介紹。

第三章以四川長虹、深康佳財務狀況分析為案例詳細闡述

第六章總結與探討。

第五篇：萬能保險持續獎金準備金提取方法分析

壽險精算

精算通訊第六卷第一期

萬能保險持續獎金準備金提取方法分析與比較

趙曉京 梁永華

安永華明會計師事務所

【摘要】萬能保險持續獎金是保險公司對持續有效的保單或持續交費的保單在滿足合同約定條件時給予的獎金。由于保監會未明確規定萬能保險持續獎金準備金的評估方法，目前各保險公司的具體做法不一。本文對持續獎金準備金的評估方法進行了研究，并結合公司自身的經驗，對市場上各保險公司采用的主要評估方法進行分析和比較。

【關鍵詞】萬能保險 持續獎金 準備金方法

一、引言

我國壽險市場上銷售的三大類投資型產品：投連、分紅、萬能保險中，萬能保險出現的最晚，但卻是2006年保險市場上風頭最勁的產品。與其他兩類產品相比，萬能保險的保證利率與分紅保險產品相當，而投連產品無保證利率；萬能保險投資賬戶的結算頻率為每月一次，雖然低于投連產品每周一次的結算頻率，但明顯高于分紅保險，因而能及時反映市場投資收益率的變化情況。正是由于萬能保險兼具保證利率高、結算頻率快的優點，自2004年10月29日中國人民銀行宣布上調人民幣基準利率后，萬能保險就受到了保險公司和消費者的追捧。各公司紛紛推出形態各異的萬能險產品，許多保險公司萬能保險的保費收入都占到個銀渠道保費收入的50%以上，最高達到80%以上。

由于萬能保險保證的最低結算利率仍然受到保監會2.5%的最高定價利率的限制，為了提高產品競爭力，許多公司都在產品條款中加入了額外的持續獎金。主要形態有以下兩種:

1、持續交費獎勵，適用于期交的萬能險產品，目的是鼓勵投保人交納續期保費。由于萬能保險與傳統壽險不同，只要保單的賬戶價值能滿足保單管理費和風險管理費等要求，即使投保人停止交納保險費，保單仍然有效。為了鼓勵客戶如期交納保險-24壽險精算

精算通訊第六卷第一期

之間。也有公司以最低保證利率為折現利率。

（2）賬戶結算利率的確定。對應于折現利率，各公司一般以保險公司預計投資回報率減去預計利差來確定未來的賬戶結算利率。目前的《萬能保險精算規定》取消了對預計利差不超過2%的規定。

（3）持續獎金是否應該視為賬戶外的現金流？一種觀點是保險公司兌現持續獎金時用于增加保單賬戶價值但并沒有支付給客戶，所以持續獎金不應該在持續獎金給付時刻視為賬戶外的現金流，而應包含在保險公司將來對客戶的給付或理賠中；另一種觀點是持續獎金相當于保險公司將股東的利益轉移給客戶，所以在保險公司兌現持續獎金時就視為現金流支出。容易看出，前一種觀點下的準備金比后面一種低。

由于萬能保險的投資賬戶也是獨立賬戶，與投連產品有類似之處，而且保監會未作明確規定，所以不少公司都采用了這種方法。

流按照精算模型預測，再將現金流的現值作為一種準備金，用來和當前賬戶價值比較，差額即為非賬戶準備金，其中也包括了持續獎金準備金。賬戶預測和折現率的假設通常為最低保證利率，為保守起見，該方法往往會忽略退保的假設。

三、萬能保險持續獎金準備金的方法比較

下面以一款萬能型兩全保險為例，按以上四種方法評估各保單的持續獎金準備金。

險種：十年期躉交兩全保險（萬能型）最低結算利率： 2.0% 實際投資回報率假設：5.0% 實際利差假設：1.5%

實際結算利率假設：5%-1.5%=3.5% 保單管理費假設：0.5%

初始賬戶價值：人民幣10,000元

持續獎金為從第六保單起每年賬戶價值的2%

不考慮死亡率和費用率（方法三假設營業費用等于保單管理費），下表為各方法提取的實際持續獎金準備金的走勢圖。

4、貼現預測現金流和當前賬戶價值進行比較 該方法類似于毛保費評估方法，把將來賬戶價值和非賬戶價值(如持續獎金和死亡給付等)的現金

各方法持續獎金準備金走勢方法一方法二方法三方法四1,4001,2001,***-1