第一篇：變性高效液相色譜技術及其在植物檢疫工作中的應用前景

變性高效液相色譜技術及其在植物檢疫工作中的應用前景 摘要：本文介紹了變性高效液相色譜(DHPLC)技術的基本原理及影響因素，并結合植物病原鑒定技術的特點，分析了DHPLC技術在植物檢疫工作中的應用前景，證明了DHPLC技術將成為一種快速、準確、高效的新型植物病原檢測技術。

關鍵詞： DHPLC 植物檢疫 核酸分析技術

DHPLC是變性高效液相色譜(denaturing higperformance liquid chromatography)的英文縮寫，是近幾年才逐漸發展成熟的核酸分析技術，目前在生命科學領域中已得到廣泛的應用。是一種基于異源雙鏈分析(heteroduplex analysis)的基因突變、單核苷酸多態性(SNP)、DNA片段長度多態性的高精度、高通量的新型檢測技術。

植物檢疫工作中，由于植物病原特殊的生物學特點，而具有原理、步驟程序各不相同、種類繁多的鑒定技術。大多數病原如病原細菌、病毒、類病毒在傳統的目測法、培養基篩選、免疫電鏡、血清學鑒定等步驟后，還需進行指示植物鑒別及致病力檢測。其步驟繁雜，時間冗長甚至超出苗木存活容許的時間范疇等缺陷給檢驗檢疫工作的順利實施造成了一定的困難。變性高效液相色譜技術(DHPLC)的出現為解決以上問題提供了極大的可能，這種技術利用基因的物理化學性質，將先進的高精度大型儀器分析技術與核酸提取、體外擴增等經典分子生物學技術相結合，實現了生物學、物理學、分析化學等多學科交匯互融，既發揮了化學儀器的高精密度的優勢，又體現了物理學和生物技術的成果，是當今學科交叉領域又一杰出科研碩果，可為未來植物檢疫技術發展提供了新的前進方向。

一、DHPLC的基本原理及影響因素長度多態性分析原理

DNA分子帶負電荷，通過一種充當‘橋梁’作用的分子一使TEAA(三乙錢醋酸鹽)的陽性按離子與DNA相互作用，與柱子固相填料表面分子結合，DNA分子本身得以吸附到柱子上。這樣DNA分子結合的TEAA越多，與固相結合得越牢固。經基鏈與固相結合的強度會隨著流動相中乙睛濃度的增加而減，DNA片段越長，結合的TEAA越多，越不易被洗脫。因此DNA片段大小分析是長度依賴性分離，而非序列依賴性分離。變性溫度是影響DNA片段分析的一個重要因素。而在不變性溫度條件下，可分離長度不同的雙鏈DNA分子?；蛐投鄳B性分析原理

DHPLC的基本原理是異源雙鏈分析(heteroduplex analysis)。異源雙鏈(heteroduplex)指由不完全互補的兩條DNA單鏈形成的雙鏈DNA，同源雙鏈(homoduplex)指由完全互補的兩條DNA單鏈形成的雙鏈DNA簡略來說，異源雙鏈和同源雙鏈對介質有不同的親和力，因此，它們從介質中被洗脫下來的條件有差別。如果PCR產物源自純合子或者發生了純合突變的個體，那么只有在與另外一種純合野生型序列的PCR產物混合，再變性復性，才能夠形成上述雜合和純合雙鏈。雜合雙鏈存在錯配堿基，其變性溫度低于純合雙鏈，當溫度升高到一定程度，先于純合雙鏈在錯配堿基周圍解鏈變性，導致雙鏈減少和單鏈增

多。由于單鏈比雙鏈所帶的負電荷少，雜合雙鏈比純合雙鏈更容易形成單鏈，其保留時間短于純合雙鏈，在圖譜上先于未解鏈的純合雙鏈出現。隨著變性溫度升高，純合雙鏈也會部分變性，A=T含有2個氫鍵，C=G含有3個氫鍵，前者變性程度比后者低，因此先出現的峰為含有AT的雙鏈，后出現的為含CG的雙鏈。利用這種雜合和純合雙鏈在保留時間上的差異，可以快速分析單個核苷酸的突變，從而進行基因型的判定。DHPLC的影響因素

（1）PCR產物的影響

PCR擴增為高通量基因型檢測提供了標本源。DHPLC對PCR中的引物、試劑雖無特殊要求，而且也不必對PCR產物進行預處理，但是要盡量保證PCR擴增產物的忠實性，避免人為引入錯配堿基。

（2）洗脫溫度

溫度是影響DHPLC檢測基因型成功與否的至關重要因素。如將檢測溫度提高2℃后，就可在RET基因中發現兩個漏檢的突變基因型。有些基因突變對溫度不敏感，在較寬的溫度范圍內(懸殊8℃左右)都可對其進行有效篩檢；但有的突變對溫度要求嚴格一些，如BRCA1基因的56134C/T與 2640C/T，只有分別在59℃與57℃下，才能被檢測到。

（3）固定相

目前，有幾種不同的分離介質被用于突變分析中。如美國Transgenomic公司應用大小為2 m的無孔聚苯乙烯顆粒作為分離柱的材料，惠普公司則使用孔徑為3.5 m的硅膠作為分離柱介質。這兩種柱的分辨率似乎相似，但壽命卻大不相同，前者通?？煞治?000個左右的樣品，而后者僅可分析1000~2000個樣品。最近，瓦里安公司(WalnutCreek,CA)開發出多聚物包被的堿性化硅膠柱。也有嘗試將無孔聚苯乙烯與有孔硅膠結合，制成單片集成毛細管柱，可使柱效提高40%。

（4）流動相

流動相中離子配對劑的TEAA濃度對DHPLC分析的溫度有顯著影響。如果TEAA的濃度從lommol/L升高至200mmol/L，那么對應的最佳檢測溫度就要提高4-4.5℃。流動相的pH值(6-9)對檢測效果幾乎沒有任何影響，但pH值太高，將會使雙鏈DNA完全變性，達不到檢測目的；pH值太低，又會干擾DNA與TEAA的相互作用，影響檢測

效果。．

二、DHPLC在植物檢疫工作中的應用前景DHPLC在有害生物鑒定中的應用

（1）DHPLC在原核有害生物鑒定中的應用

植物檢疫工作中，檢疫性原核有害生物主要包括細菌、植原體、病毒、類病毒等。關于原核有害生物相關的DHPLC檢測技術報道主要集中在醫學領域。2004年Bode E等以保守基因ITS(16S～23Sintergenic spacer region)和功能基因gyrA為鑒定依據，在42種待測細菌中準確地檢測出Bacillus cereus菌和Bacillus thuringiensis菌。Hurtle W等利用DHPLC對較廣范圍的細菌種類

進行基因鑒定，幾個屬的39種細菌用來檢驗DHPLC的準確性和可靠性。大多數(36/39)種的細菌擁有可作為分子指紋圖譜的特異表達曲線圖，而且在70余種細菌樣品中，Yersinia pestis(10/70)和Bacillus anthracis(12/74)樣品都被準確地鑒定出來。實驗結果表明，DHPLC的檢測特異性為100％，敏感度為97.7％，predictive值為96.9％，這些數據證明DHPLC可以用于細菌鑒定。Domann E等進行了以16S rRNA基因的V6至V8區序列為靶序列，通過DHPLC區分致病菌多樣性的研究。羅陽等對用變性高效液相色譜(DHPLC)技術篩查了SARS冠狀病毒(SARS.CoV)S蛋白的受體的正常無關個體中氨基肽酶N編碼基因ANPEP的全部外顯子及其兩側部分內含子序列，發現SARS-CoV感染和SARS發病的易感基因或抗病基因。

(2)DHPLC在真核有害生物鑒定中的應用

真核有害生物結構較原核生物更為復雜，基因組構成和基因功能分化更為精細，更多的致病基因和保守基因可作為生物基因型鑒定的依據，這些特點促成了DHPLC在真核生物的研究領域擁有更加寬廣的用武之地，并發揮了更為強大的功能。Kota等通過DHPLC進行了大麥(Hordeum vulgare L.)的基因結構及基因分型的研究工作。陳瑤生等用DHPLC對豬肌肉組織差異表達EST的進行鑒定。Wulfert M、蔣瓊橙等認為人類線粒體DNA(mtDNA)的16024~16365nt，73-340nt及438—574nt 3個區域為多態性高發區，這3個區域的高度多態性使得個體間具有高度的差異性，因而可以用來作個人識別。他們通過DHPLC和PCR對人類線粒體的異質性進行技術檢測。沈靖等采用DHPLC直接測序和PCR．RFLP方法發現與初步證實了中國人的iNOs基因TsP多態性。以上例子有力地證明了DHPLC在真核生物生命科學領域的實用性和通用性，昭示了這種檢測技術在真核有害生物鑒定工作中的廣泛應用前景。

檢疫性植物病原以其危害性大、破壞力強、癥狀復雜多變而成為一類重要的檢疫對象。植物病原生物在分類學中跨度很大，現發現有真菌、細菌、植原體、病毒、類病毒和線蟲等。這些病原生物從致病性這一點講是相同的，但致病機理及基因結構、調節、控制等特點卻大相徑庭?？傮w來說，植物病原不僅種類多，而且近似種多，表現為檢疫性病原之間易混淆、檢疫性與非檢疫性病原之間難區分、同種病原在不同寄主上表現的癥狀不同、不同種病原在相同寄主上卻可能表現相似的癥狀等具體形式。目前，DHPLC技術在醫學、保健學、環保、生態學領域已得到廣泛的應用，檢測范圍幾乎涵蓋從原核生物到真核生物、從微生物到植物、動物、從低等生物到高等生物的各種生命形式。DHPLC是一套經過反復摸索、改進、總結所得到的較為成熟穩定、準確快速的基因型檢測分類鑒定技術，是一種能夠滿足植物檢疫-工作需要、解決上述難題的行之有效的新型檢測方法。DHPLC在雜交作物品系鑒定方面的應用

從標準的角度而言，我國現行的GB/T3543.3-1995《農作物種子檢驗規程真實性和品種純度鑒定》及其實施指南中列入的對雜交水稻品種的鑒定方法，應是當前世界上較全面的方法，而且也完全與國際接軌。同時，世界上近20多年來，對雜交水稻品種鑒定技術的研究，在理論方面、技術方面都取得了很大的成就，特別是近年將DNA分子檢測技術用于品種鑒定的研究取得了可喜的進展。DNA指紋圖譜技術主要包括限制性片段長度多態性(RFLP)、隨機擴增多態性(RAPD)、擴增酶切片段長度多態性(AFLP)、簡單重復序列或微衛星重復序列(SSR)DNA指紋技術具有多態性豐富、靈敏度高、區分鑒別效果好等優點，但是，主要存在重演性差、技術難度大、成本高、費時等缺陷，目前用于品種真實性和純度鑒定的方法還很不成熟。DHPLC的基本原理是異源雙鏈分析，其技術特點正適用于雜交水稻的鑒定，純和體基因組可作為(野生型)同源雙鏈模板，而雜交體則視為突變型(異源雙鏈)。利用異源雙鏈和同源雙鏈洗脫順序、時間上的差異，可準確地進行雜交水稻的鑒定。Kota等通過DHPLC成功地繪制了大麥(Hordettm vulgare L.)的SNP圖譜，Rupe MA等利用nrp基因通過DHPLC對雜交玉米品系及基因表達等進行了研究。DHPLC在轉基因植物鑒定方面的應用

轉基因技術是將外源基因轉入生物體或細胞內使之表達的技術。在人們構建的外源轉基因載體中，人們設計裟入了基因表達所需的啟動子、終止子序列。為了方便轉基因植物的篩選，人們還整合了報告基因和抗性基因。因此針對這個特點，當我們對轉入的目的基因并不了解的情況下，通過檢測這些基因序列就可對轉基因作物進行鑒定。轉基因作物DHPLC檢測方法可以以目前通用的報告基因(Gus和Gfp基因)、抗性基因(Kan和Lif抗性基因)、啟動子(CaMV35S)和終止子(CaMV35S和Nos等)等具有代表性的特異片段為擴增靶序列(或雜交探針)，將從待檢樣品中提取的DNA，利用特異性引物擴增，與以上基因的標準品混合，利用變性高效液相色譜儀進行溫度變性，復性形成異源雙鏈或同源雙鏈，并先后從色譜柱洗脫，收集信號形成不同吸收峰后再經計算機軟件進行分析判斷。目前利用常規PCR、核酸雜交、熒光PCR、基因芯片檢測轉基因生物的技術日臻成熟，但關于DHPLC檢測轉基兇成分國內外都尚無相關文獻報道，可作為一個全新的研究方向去探索。DHPLC與傳統分子生物學方法

經典分子生物學方法的引人，在縮短植物檢疫鑒定工作的檢測周期、提高檢測靈敏度、提升檢測效率的同時，極大地豐富了植物病原檢測鑒定的技術手段，為實驗室具體的檢測T作提供了更為廣闊的選擇。但其自身的缺陷也逐漸暴露出來，常規PCR檢測步驟簡單，操作方便，假陽性結果m現頻率過高的問題卻無法避免。熒光PCR及基因芯片技術靈敏度高、結果可靠，但熒光定量PCR儀及基因芯片裝置價值昂貴，大多數部門無力購置。Southern、Northern等由于雜交技術耗時長、步驟多，對于檢測人員技術能力要求較高等缺點不適合在檢驗檢疫部門推廣應用。許多研究表明與傳統分子生物學方法相比，DHPLC作為植物病原的新型檢測鑒定技術在準確度和節約成本、高通量、簡捷快速等各個方面都具有天然的優勢。施錦繡等比較DHPLC與直接測序法在單核苷酸多態性檢測中的應用，發現在41個樣本的SERT-E9A/G基因檢測中，DHPLC的檢出率達到了100％。在大規模樣本的雜合子篩檢中，檢測的錯誤率幾乎為0。結論是DHPLC技術是一項可用于未知序列的檢測、尤其是在人群中大規模篩查已知序列的有效手段。Arnold等在BRCA1基因中，DHPLC檢出了所有直接測序找到的變異體，但DHPLC比直接測序的成本至少降低了10倍左右。與基于熒光PCR、DNA芯片的再測序相比，DHPLC不僅成本低，而且靈敏度與特異性也比較高。Kwok等認為，對于頻率高于20％ 的變異，DHPLC的檢出率為100％，而直接測序的檢出率為80％。Choy等通過比較構象敏感凝膠電泳(PCRCSGE)、PCR．SSCA和DHPLC檢測結節性硬化癥基因 C2突變的能力，發現對于TSC2單核苷酸變異的檢出率PCR—CSGE和PCR-SSCA分別為69％和54％，而DHPLC為100％，提示DHPLC優于CSGE和SSCA，特別是在檢出單核苷酸變異方面。這些研究表明，DHPLC是檢測基因組DNA更為敏感而且準確的手段。

DHPLC技術操作步驟簡單，具有自動化程度高、檢測快速、靈敏度高的特點，并可以對樣品進行自動化回收。該技術允許在完全變性、部分變性或非變性條件下分析核苷酸片段，已被廣泛用于核酸片段分離、突變檢測、基因型分析、PCR引物純度分析和純化、SNP分析等方法，單核苷酸突變檢測準確率穩定在96％以上。在最佳條件下，該技術甚至可以對有些雜和體的兩個等位基因進行分離。又由于整個過程無需對DNA產物進行后期無害化處理，可以有效地解決溴化乙錠的環境污染問題。

由于工作和職責的特殊性質，檢驗檢疫的工作對象包含了各類產品，涉及到農業工業等方方面面，實驗儀器的配置、資料種類有較高較寬的要求。高效液相色譜儀作為分析化學常規儀器，被廣泛使用于各地方局的常規檢驗工作中，具有良好的普及率。DHPLC利用交叉科學的優勢，跨領域的發揮高精度化學分析儀器的潛能，挖掘高效液相色譜儀潛在價值，不儀節省了二次購買儀器的昂貴費用，也無形提高了其自身價值。同時，植物病原新型尖端高效液相色譜檢測技術(DHPLC)的研制與檢驗檢疫系統一貫實施科技創新、保持與國際接軌戰略相符，將有助于加速植物病原檢疫技術的革新，確立我國在國際相關研究領域的領先和權威地位。

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第二篇：高效液相色譜技術在食品安全領域中的應用

高效液相色譜技術在食品安全領域中的應用 摘要：本文綜述高效液相色譜在食品安全檢測中的應用。詳述食品添加劑、非食品添加劑、農藥殘留量、抗生素藥物殘留量、毒素的檢測等的檢測技術。對于保證食品質量、維護人民健康安全有著重要意義。關鍵詞：高效液相色譜技術；食品安全；食品添加劑；非添加劑；農藥殘留量；藥物殘留量；毒素

Research on the food safety of High Performance Liquid

Chromatography

LIU Wen-duo

(Zhongkai University of Agriculture and EngineeringCollege of light industry and food science, Guangdong

Guangzhou 510225)

Abstract: High Performance Liquid Chromatography was applied in food safety monitoring,Mainly on food additives, no allowed additives, pesticide residues, antibiotic residues, toxin and so on.It has important significance to ensure food quality and people's health.Key words: HPLC;food safey;food additives;non additivies;pesticide residues;antibiotic residue;toxin

高效液相色譜(HPLC)是 60年代后期發展起來的分離分析技術，是現代分離測定的重要手段[1]。問世以來，因其具有分離效能高、分析速度快、檢測靈敏度好、能分析高沸點但不能氣化的熱不穩定生理活性物質的特點而被廣泛應用于生物化學、藥物及臨床分析[2]。近年來，隨著色譜技術的不斷發展，各種工作站軟件的開發，以及與質譜等儀器的聯用，大大拓寬了 HPLC的應用范圍。目前很多新型專用的 HPLC儀不斷出現，如氨基酸分析儀、糖分析儀、離子色譜儀等相繼出現[3]。

近年來常有食品安全事故發生，例如食品添加劑超標；一些食品農藥殘留和有害物質超標，蘇丹紅事件、三鹿奶粉事件就是先例。這些產品不合格，嚴重影響我國的聲譽和人民的安全。此時，精密的高效液相色譜儀器就發揮重要作用。本文僅就高效液相色譜質譜在食品檢測中的應用進行綜述，以供參考。食品添加劑的分析

1.1 甜味劑

天然甜味劑有蔗糖、葡萄糖、甘草酸鈉鹽等，人工甜味劑有糖精及其鈉鹽，環已基氨基磺酸鈉和甘精。甘精毒性大 , 各國都禁止使用, 我國準許使用糖精鈉、環已基氨基磺酸鈉、天門冬酰丙氨酸甲脂、麥芽糖酸、D-山梨糖酸、甘草和甜味菊等。糖精鈉是使用歷史最長的人工合成甜味劑之一，WHO制訂的ADI為 0～2.5 mg/ kg。單獨測定食物中的糖精鈉方法較簡單，使用反相色譜柱，以甲酸： 0.02 mol / L乙酸銨（5：95）為流動相，紫外檢測器，波長選擇 230 nm，可以很容易地獲得結果，這是國家標準檢驗方法[4]。

甘草苷系天然甜味劑，溶于水、乙醇中，不溶于乙醚、氯仿。采用反相離子對分配型 HPLC法可同時測定食品中甘草苷和糖精鈉，操作簡便、迅速。其條件為Chrosorb RP-18(5μm)柱，流動相為乙醇：0.05 M磷酸二氫鈉（2 ：3）溶液中含 0.02MCTA，用磷酸調pH為 3，紫外檢測器，波長選擇 245 nm[5]。

1.2 著色劑

為了改善食品的感官性狀，允許在食品中添加一定限量的食用色素。食用色素可分為食用天然色素和合成色素，天然色素來源于植物色素和動物色素，一般較為安全。合成色素常以苯、甲苯、萘等化工產品為原料合成。由于合成色素大都有慢性毒性或致癌性，必須嚴格

控制使用種類及含量。我國允許使用的 8種合成色素,都是水溶酸性色素。采用徑向加壓柱 u Bondapak C18反相柱，以甲醇：0.02 M乙酸銨為流動相，可將除新紅外的 7種合成色素同時分離定量。用液體陰離子交換樹脂 Amberlite LA乙晴（50：50），流速為 1.5mL/mL，檢測波長 243nm，結果三聚氰胺的保留時間為6.9 min，空白無干擾。檢出限為1.0ug（行標為2.0μg），有實用意義。

李延志等[10]采用 HPLC-DAD 法快速篩查蛋白質食品非法添加三聚氰胺。其方法是樣品以 1% 三氯乙酸提取，用 2% 乙酸鉛沉淀蛋白，離心后，上清液荊 0.45μm 濾膜過濾，直接上機進行HPLC分析。本法檢出限為 0.28mg/kg，線性范圍： 0.05~1.6mg/L，該法靈敏、準確，可推廣使用。

張俊燕等[11]報道飼料中三聚氰胺的檢測方法。采用 Agilent 1100 HPLC-DAD 檢測器，波長 240 nm 和北京Agela 離子交換固相萃取柱。樣品經0.1%三氯乙酸提取，離心，上清液過 PCX 小柱，凈化后做 HPLC 分析或衍生后做 HPLC-MS 分析。結果按照2007 年美國 FDA的 HPLC-UV 方法測定三聚氰胺，用國產 AgelaANB 親水色譜柱，分離效果良好。最低檢出限：HPLC-UV 法為 2μg、HPLC-MS法為 0.5μg，大大提高靈敏度，而 FDA 原法由于流動相中加入離子對試劑而不能直接用 HPLC-MS分析。

WC Andersen 等[12]采用超高效液相色譜串聯四級桿質譜法測定鮎魚組織中的三聚氰胺，結果滿意。陳曉東等[13]亦曾建立乳及乳制品中三聚氰胺的HPLC-MS-MS測定方法。樣品用三氯乙酸和乙晴提取，經陽離子交換固相萃取柱（SPE）凈化后，HPLC-MS-MS 法確證和測定。外標法定量。結果在 0.01~0.5μg/mL 范圍內呈線性關系。r=0.9999，檢出限（LOQ）為 0.01μg/kg，本法加樣回收率為80.4%~107.4%。RSD=9.4%?？蓾M足檢測要求。

此外，由于大量使用的三聚氰胺大部分以原形直接或是隨著糞便排入海洋中，對海洋生物造成潛在威脅，對生態環境造成破壞，已成為新的重要污染物。XU Ying-jiang等[14]建立固相萃取-超高效液相色譜串聯質譜測定海水及沉積物中的三聚氰胺的方法。檢出量為

0.5μg /kg，適合海水及沉積物中痕量三聚氰胺的測定。

2.2食品中蘇丹紅的檢測

蘇丹紅屬偶氮染料，系化工合成染色劑。主要用于蠟染、油彩等產品。蘇丹紅進入人體后分解還原成致癌芳香胺，對健康造成很大危害。

溫憶敏等[15]參照歐盟和我國國家標準方法經研究和改進，建立食品中蘇丹紅系列化合物和對位紅的 HPLC 測定法。樣品經有機溶劑提取、氧化鉬吸附、梯度洗脫等進行測定，并采用光譜-色譜法，重點對洗脫劑強度與萃取活性關系、色譜優化條件等進行研究。該方法可同時測定食品中蘇丹紅 1、2、3、4 及紅 7B、黑 B、對位紅等。最低檢出限均可達到 0.01mg/g，符合有關法規的要求。

劉志權等[16]應用超高效液相色譜質譜聯用（UPLC-ESI-MS-MS）法建立快速測定蘇丹紅 1~4的含量。實驗采用UPLC-ESI-MS-MS 串聯四級桿質譜儀，多粒子反應監測（MRM）定量法。通過對樣品預處理、色譜條件和質譜參數的優化選擇，建立的同步測定食品蘇丹紅 1~4 含量方法，重復性好、靈敏度高、準確可靠。本法蘇丹紅 1~4 的最低檢出限分別為0.1μg/kg、0.1μg/kg、0.2μg/kg、1.0μg/kg，線性范圍在 1.0~100ng/mL，r=0.9900，加樣回收率為 87.0%~109%，可用于樣平的實際檢測。

寧肅駿等[17]建立食品中對位紅、蘇丹紅 1~4的 UPLC-ESI-MS-MS 測定方法，以氘代蘇丹紅為內標進行定量。試樣經提取，再經液液萃取和固相萃?。╓aters Oasis MAX）凈化，上機進樣測定。本法線性范圍在 0~100μg/kg，r=0.9900，定性定量檢出限均為 1.0μg/kg，加樣回收率為 78%~112.4%。經辣椒醬等 7 種食品檢測，結果滿意。本法靈敏度高，特別適合于低含量復雜樣品中蘇丹紅的分析。食品中農藥物殘留量的檢測

3.1 食品中農藥殘留量的檢測

為防治病蟲害，農業上廣泛使用各種農藥，其殘留量超標將嚴重影響人們的健康。林子掩等[18]采用自制硅藻土固相萃取柱，建立固相萃取-高效液相色譜（SPE-HPLC）法，同時測定蔬菜中甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯等農藥的殘留方法。4 中蔬菜樣品測定的回收率分別為卷心菜 80.7%~106.2%、花菜80.5%~102.6%、紅蘿卜63.0%~109.3%、青椒 74.9%~109.0%。RSD 均為 14.5。對于控制蔬菜質量有實用意義。

WEN Yuyun 等[19]應用高效液相熒光檢測器（HPLC-FL）測定茶葉中甲氰菊酯等 5 種菊酯類農藥的殘留量。實驗以乙晴-水(74：26)為流動相，流速為 1.2mL/min，梯度洗脫，柱后衍生化，FLD 檢測，激發波長：221 nm，發射波長：320 nm，本法線性范圍在 0.04~8.0μg/g，RSD為3.4%~6.4%，檢出限為0.012~ 0.048μg/g（重）。結果完全符合歐盟標準的要求，為出口茶葉質量提供保證。

徐遠金等[20]應用 SPE-HPLC-ESI-MS法同時測定疏菜中痕量甲胺磷、敵百蟲、馬拉硫磷、對硫磷等7種有機磷農藥殘留量。并根據測得的二級質譜離子碎片，研究7種有機磷農藥的裂解規律。樣品提取液經固相萃取后，采用用C18 柱分離。以0.1%甲酸乙酯-0.1% 甲酸水溶液為流定量動相，線性梯度洗脫，以保留時間和質荷比對分離出的組分予以定性確證，以峰面積進行定量。結果表明7種農藥的濃度與其峰面積在一定范圍內呈良好的線性關系。檢出限為0.002~0.090μg/kg，RSD=3.1%~5.2%。此法簡便、快速、靈敏，適于蔬菜中 7 種有機磷農藥殘留量的測定。

3.2 食品中藥物殘留量的檢測

我國一些水產養殖地區由于放養密度高、環境污染嚴重等原因，致使水生動植物發病率增加，有的漁民為追求經濟效益最大化，常在飼料中添加四環素類抗生素藥物，致使水產品中這些抗生素殘留增加，目前其殘留危害已引起世界范圍內的廣泛關注。

程雪梅等[21]采用 HPLC-MS-MS 法分析海產品中的四環素類藥物殘留。由于濃度很低，樣品經 2% 高氯酸提取，固相柱萃取，以乙晴-水-三氯乙酸體系為流動相，采用電噴霧離子檢測器進行質譜分析。結果金霉素、四環素、土霉素、強力霉素的檢出限分別為 0.008 mg/kg 和 0.062mg/kg。可以滿足海產中四環素類抗生素殘留測定的要求。

周艷明等[22]指出，有些抗生素如赤霉素，目前我國尚無標準測定方法，出于實際需要，并為國標提供方法，建立草莓中赤霉素殘留量的 HPLC 測定方法。樣品采用 80% 甲醇提取，經液液萃取，凈化，以紫外檢測器測定。結果表明，本法最低檢出限為0.017 mg/kg，加樣回收率為 82.8%~106.6%，RSD為3.2%~4.1%。方法準確可靠、簡便可行。亦可用于其它水果中赤霉素的檢測。

孫志剛等[23]應用 HPLC-SEI-MS 法測定水產品中甲羥孕酮殘留量。實驗樣品先用乙酸乙酯提取，氮氣吹干，乙晴溶解，正己烷除脂，中性氧化鋁小柱凈化，流動相為乙晴 c-0.1% 甲酸（70：30），RP18 柱分離，通過MS-MS測定。本法檢出限為0.03μg/kg，定量檢出限為 0.1μg/kg，可滿足我國出口檢測要求。

XIAX X 等[24]采用液相色譜質譜聯用測定家禽和豬肉、雞蛋中甲硝唑、替硝唑、洛硝唑和異丙硝唑的含量；DAESELEIRE E 等[25]應用液相色譜質譜聯用法，快速同時鑒定和測定雞蛋中洛硝唑、甲硝唑和地美硝唑的含量，結果滿意。YINJu-can等[26]采用固相萃取柱凈化處理后進行液相色譜-大氣壓化學電離源串聯四級桿質譜，在正離子模式下(HPLC-APCI(+)-MS/MS)對動物源性食品雞肉、豬肉、牛肉中甲硝唑等 9 種硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留量進行分析。最低檢測量為 0.5μg /kg。上述方法簡便快速、靈敏可靠、專屬性好，為質量控制提供可靠的方法。

杜振霞等[27]應用超高效液相色譜-串聯四級桿質譜（UPLC-MS/MS）同時測定牛肉組織中環丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星等 3 種氟喹諾酮類獸藥殘留。樣品經萃取后測定，檢出限均為0.05μg/L，定量限為0.1μg/L。

ZHANGJian-li 等[28,29]采用 LC-MS/MS 法同時檢測保健品中非法添加的阿卡波糖、二甲雙胍等10種降糖藥和安定、硝基安定等 8 種鎮靜催眠藥。前者檢出限為 20mg/kg，后者檢出限為 1mg/kg。方法簡便快速、準確可靠，適于保健品中非法添加的化學類降糖類藥的常規檢測。

3.3 食品中毒素的檢測

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉的代謝產物，其基本結構都有二呋喃環和氧雜萘鄰酮,如毒素B1、G1和 M1等。日常 HPLC檢測這些物質時采用 C18柱，流動相為甲醇：0.01M KH2PO4(1：1),熒光檢測器，λEx360 nm，λEm245 nm。柳潔等[30]采用ODS Hy 2persil 5μm，125 mm×4 mm柱，流動相為甲醇：乙腈：水 = 15 ：13 ：72，熒光檢測器λEx 360 nm，λEm 440 nm，檢測出黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和 M1，檢測限達到 0.02 μg。

海產品貝毒大田軟海綿酸（OA）是一種小分子海洋聚醚類腹瀉性貝毒素。多由海洋甲藻產生。常蓄積于貝、螺等海洋生物體內，食用后易引起腹瀉性為主的食物中毒，且 OA 為強烈的致癌因子，對人類健康構成嚴重威脅。盧士英等[31]建立 ELSIA和HPLC-MS/MS同時測定花蛤和扇貝等 OA 的 2 種方法。前者檢測線性范圍在0.4~2.5μg /L，后者為10~800μg /L。前者靈敏度為 0.18μg /L，后者為μg /L。經 10 種海產品樣品檢驗，結果 ELISA 法檢出蛤蜊樣品的含量為3.82μg/100g，扇貝的含量為 2.32μg /100g； HPLC-MS/MS 法檢出蛤蜊樣品的含量為 3.42μg /100g。所建立的 2 種方法皆可用于海產品腹瀉性貝毒 OA限量標準檢測。小結

HPLC作為一種十分有效的分析分離手段，已廣泛地用于食品安全等領域，其技術也在不斷改進與發展，發展具有專家系統的智能多模式多柱的色譜系統是當今色譜發展的重點，即色譜專家系統將是一個必然趨勢。

HPLC另一個發展趨勢是聯用技術的發展。目前人們所面臨的問題, 往往很難再用單相分析分離方法解決, 而常需用色譜、質譜、光譜、核磁等多種方法綜合加以解決。隨著計算機技術的發展。多儀器聯用形式已成為現實，如 GC-LC、MS串聯質譜法分析海產品中四環素類藥物殘留

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第三篇：高效液相色譜基本概念和術語

高壓液相色譜HPLC培訓教程(一)I．概論

一、液相色譜理論發展簡況

色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobile phase)中的各組分經過固定相時，由于與固定相(stationary phase)發生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。又稱為色層法、層析法。

色譜法最早是由俄國植物學家茨維特（Tswett）在1906年研究用碳酸鈣分離植物色素時發現的，色譜法(Chromatography)因之得名。后來在此基礎上發展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。

液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經典液相色譜法的基礎上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也稱現代液相色譜。

二、HPLC的特點和優點 HPLC有以下特點：

高壓-壓力可達150~300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 Kg/cm2以上。高速-流速為0.1~10.0 ml/min。

高效-可達5000塔板每米。在一根柱中同時分離成份可達100種。高靈敏度-紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。HPLC與經典液相色譜相比有以下優點：

速度快-通常分析一個樣品在15~30 min，有些樣品甚至在5 min內即可完成。分辨率高-可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果。

靈敏度高-紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。柱子可反復使用-用一根色譜柱可分離不同的化合物。

樣品量少，容易回收-樣品經過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

三、色譜法分類

按兩相的物理狀態可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。氣相色譜法適用于分離揮發性化合物。GC根據固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發性或非揮發性、熱穩定性差的物質。LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨

為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。

正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜法 反相色譜法 固定相極性 高～中 中～低 流動相極性 低～中 中～高 組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出

從上表可看出，當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。3．離子交換色譜法

固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。

緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外，它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利于樣品的解離，導致樣品較快流出。離子交換色譜法主要用于分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。4．離子對色譜法

又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強度大的酸堿物質。

分析堿性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強的離子對。

分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。

離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內進行分離。被測組分保時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關。5．排阻色譜法

固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。

第四篇：氣相色譜技術在白酒分析中的應用

氣相色譜技術以其特有的三高一快（高靈敏度、高分離效能、高選擇性、快速分析）優點，已廣泛應用于食品和釀酒發酵工業，其中四川省品酒多、質量好，推廣應用氣相色譜技術也較普遍。氣相色譜技術在白酒分析中的應用主要有以下幾方面：

1、對白酒衛生指標的監控：

白酒中甲醇、雜醇油有酒類衛生監測的兩項重要指標。氣相色譜可直接進行分析成品中甲醇、雜醇油的含量，方法簡便快速，精密度好，象對偏差均小于5%，又能同時使白酒中正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正戊醇等高級醇得到單獨測定。

2、對酒廠的基礎酒三項指標的測定：

基礎酒的好壞決定成品酒能否達到質量標準的關鍵。對基礎酒的分析驗收和對主要微量成份的測定，是指導微機勾兌、保證產品質量穩定、統一質量標準，獲得工廠經濟效益的重要因素，而氣相色譜儀是最理想的分析工具。基礎酒的三項指標：

a.主體香含量測定：例如濃香型白酒的主體香是已酸乙酯，已被輕工部納入濃香型白酒標準（QB850-83）。

b.已酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯的酯比關系的測定，大量試驗表明：四大酯之間協調，恰當的兩比關系是決定酒香香氣濃郁，純正的關鍵，特別是已酸乙酯含量及其與乳酸乙酯的量比關系，如五糧液酒中乳酸乙酯與已酸乙酯之比值必須小于1。

c.微量香味成份含量范圍的測定：白酒中四大酯作為主體香味成份決定了白酒的香型，但除此之外，其它微量的酯、酸、醛、酮都是助香成份，它們在助香過程中起著烘托、緩沖、平衡的三大作用，注意它們的含量范圍以及與主體香味成份的量比關系是否恰當，直接影響白酒的風味特征。

3、開展對白酒芳香成份的剖析和風味關系的研究：

白酒成份非常復雜，酒中的有些重要成份對酒的典型風味關系還沒有被認識，需要酒廠技術人員利用氣相色譜儀的重要分析工具并與其它儀器配合使用開展醇和醇以外的多種復雜微量成份分析，為保證名特優白酒產品提供更廣泛、準確的科學依據。

4、對于各級衛生防疫站，各級技術監督局產品質量監督檢驗所，可以應用氣相色譜技術來加強市場管理和打擊假冒偽劣白酒產品。

第五篇：高效液相色譜系統中氣泡對檢測的影響及其解決方法

高效液相色譜系統中氣泡對檢測的影響及其解決方法

在我們進行液相色譜分析時，有時會遇到這樣一個問題：系統的流路中存在氣泡。

由于氣泡的存在，會造成色譜圖上出現尖銳的噪聲峰，嚴重時會造成分析靈敏度下降；氣泡變大進入流路或色譜柱時會使流動相的流速變慢或不穩定，使基線起伏。

造成上述現象的主要原因有三條：一是流動相溶液中往往因溶解有氧氣或混入了空氣而形成氣泡；二是系統開始工作時未能將流路中的空氣驅趕干凈；三是在注入樣品時不注意混入了空氣。

為了避免這類問題的出現，液相色譜實際分析過程中必須重視對流動相進行脫氣處理。常用的脫氣方法有以下幾種：

1.吹氦脫氣法 使用在液體中比空氣溶解度低的氦氣，在0.1Mpa壓力下，以約60ml/min流速通入流動相10-15min以驅除溶解的氣體。此法使用于所有的溶劑，脫氣效果較好，但在國內因氦氣價格較貴，本法使用較少；

2.加熱回流法 此法的脫氣效果較好；

3.抽真空脫氣法 此時可使用微型真空泵，降壓至0.05-0.07MPa即可除區溶解的氣體。顯然使用水泵連接抽濾瓶和G4微孔玻璃漏斗可一起完成過濾機械雜質和脫氣的雙重任務。由于抽真空會引起混合溶劑組成的變化，故此法適用于單一溶劑體系脫氣。對多元溶劑體系應預先脫氣后再進行混合，以保證混合后的比例不變。

4.超聲波脫氣法 它是目前實驗室使用最廣泛的脫氣方法，將配制好的流動相連同容器一起放入超聲波水漕中脫氣10-20min即可。該方法操作簡便，基本能滿足日常分析的要求。

5.在線真空脫氣法 把真空脫氣裝置串聯到儲液系統中，并結合膜過濾器，實現了流動相在進入輸液泵前的連續真空脫氣。此法的脫氣效果明顯優于上述幾種方法，并適用于多元溶劑體系。

其二，在液相色譜系統開始工作前，可以用注射器連接恒流泵的排空閥，抽入流動相，將流路中的空氣驅趕干凈。

其三，在注入樣品前注意排出樣品注射器中的空氣。