第一篇：2012年分子生物學組實習小結

分子生物學室實習報告

前言

分子診斷學作為一門新興的學科，在疾病的診斷、療效監測等多方面都逐漸扮演起了重要的角色，但真正能很好的將分子生物學診斷信息運用好的醫務工作者還只是少數，不少醫生目前仍對傳統的檢驗項目的臨床意義和可信度仍然懷有質疑的態度，更不用說一些剛發展起來的檢驗項目。因此檢驗專業的實習生不僅要掌握分子診斷學常用檢驗項目的原理、方法，更應該孰知其臨床意義，更好的與臨床進行溝通，才能更好的運用先進的檢驗診斷技術為患者服務。實習目的：

熟悉分子室常規的檢查項目，掌握標本的簽收和處理，掌握PCR的原理，核酸（DNA和RNA）的提取，PCR儀的使用，熟悉核酸雜交的原理和操作方法及雜交儀的使用。了解各檢測項目的臨床意義。

實習內容：

1．HBV DNA檢測（定性和定量）、HCV RNA檢測（定量）：核酸提取是擴增前最主要的步驟，每個環節都要注意防止交叉污染。主要步驟：每個EP管加100微升DNA濃縮液，再加100微升待測血清，震蕩混勻，離心12000rpmx10min，用加樣槍棄上清，加30微升DNA提取液，震蕩，金屬浴（100℃）10min，離心12000 rpmx5min。提取后，配試劑，加樣，擴增1h45min，擴增儀型號為7300。分析結果。注意，金屬浴過程中，金屬浴箱要蓋上，每個EP管要蓋嚴，防止加熱過程中發生爆管，造成實驗室的污染。若發生爆管，詳細記錄好發生爆管的標本編號，爆管發生的原因，時間等情況。HSV-II型病毒DNA檢測（定量）、HPV病毒（6、11型和16、18型）DNA檢測（定量）的標本均為分泌物，標本加生理鹽水，震蕩，取1ml至EP管，離心12000rpmx5min，棄上清，注意沉淀易漂起，不要講沉淀棄掉，加50微升DNA提取液，震蕩，金屬浴（100℃）10min。然后配試劑，加樣，擴增1h20min，PCR儀為7600。檢驗結果需要與患者的病史、臨床信息綜合分析，絕對不可僅僅只憑PCR結果進行疾病的診斷。2．核酸雜交 主要是指HPV21型檢測，標本多為女性的陰道分泌物，首先提取DNA，進行核酸體外擴增，得到擴增產物，然后金屬浴煮沸，淬火，得到大量單鏈的DNA片段，將單鏈DNA片段加入到500微升雜交液中（之前的DNA提取及淬火等操作在標本處理間進行，擴增在核酸擴增間進行），并到產物分析間進行核酸的雜交，每臺雜交儀可一次做15個標本，應注意防止漏液和交叉污染。

3．其他

流式細胞術等，但由于標本量較少，平時多的不多。

實習存在的問題和不足

分子生物學室的實習感覺還是太過短暫，再加之實習人數多，操作的機會少，特別是標本少的項目，基本還是處于見習的狀態，而且相比其他組的實習，缺乏主動思考的的動力，也許事理論知識學習不夠扎實，也許是跟老師交流太少，在以后的學習和工作中，應加強相關學習，真正掌握好這這一門新興的學科，為今后的學習、該工作或者科研服務

實習感想：

一個月的實習很快結束了，每天其實都在做著大量的重復工作，但是我并沒有因此而感到厭煩，相反我覺得這是一門藝術，因為沒有誰能保證2次加樣的量是完全一樣的，而我們能做的就是是通過不斷的練習，規范我們的操作，使每次加樣量盡可能的減小誤差，會做不代表能做好，真正的快樂就在于，將別人認為枯燥無聊的工作做的完美無瑕。

分子診斷學是一門有力的科研武器，不僅可以運用于臨床診斷，在今后的工作中我們也可以運用這一門學科，在學術上進行更深入的探索

在實習結束之際，我要感謝分子生物學室每一位老師，感謝他們耐心、親切的教導，是他們嚴謹、一絲不茍的工作態度教育了我，是他們團結協作、融洽的工作氣氛感染了我。他們循循善誘給我講解，他們耐心規范了我的操作，他們給予我很大的信任與鼓勵。而我能做的是在今后的學習和工作中帶著一顆感恩的心認真負責地工作，培養高尚的職業道德、嚴肅的科學態度和一絲不茍的工作作風，使自己成為一名合格的檢驗專業的的優秀人員。祝福分子生物學室每一位老師工作順利、闔家幸福

第二篇：分子生物學組實習報告

重慶醫科大學檢驗醫學院

實習科室：重醫附一院檢驗科分子生物學室

實習時間：

專業：

年級：

學號：

姓名：

實習報 告2011.8.29～2011.9.252007級2007221349潘俊希

分子生物學室實習報告

前言

分子診斷學作為一門新興的學科，在疾病的診斷、療效監測等多方面都逐漸扮演起了重要的角色，但真正能很好的將分子生物學診斷信息運用好的醫務工作者還只是少數，不少醫生目前仍對傳統的檢驗項目的臨床意義和可信度仍然懷有質疑的態度，更不用說一些剛發展起來的檢驗項目。因此檢驗專業的實習生不僅要掌握分子診斷學常用檢驗項目的原理、方法，更應該孰知其臨床意義，更好的與臨床進行溝通，才能更好的運用先進的檢驗診斷技術為患者服務。

一、實習時間：

2011.8.29～2011.9.2

5二、實習科室

附一院檢驗科分子生物學室

三、實習目的：

熟悉分子室常規的檢查項目，掌握標本的簽收和處理，掌握PCR的原理，核酸（DNA和RNA）的提取，PCR儀的使用，熟悉核酸雜交的原理和操作方法及雜交儀的使用。了解各檢測項目的臨床意義。

四、實習內容：

1．HBV DNA檢測（定性和定量）、HCV RNA檢測（定量）：核酸提取是擴增前最主要的步驟，每個環節都要注意防止交叉污染。主要步驟：每個EP管加100微升DNA濃縮液，再加100微升待測血清，震蕩混勻，離心12000rpmx10min，用加樣槍棄上清，加30微升DNA提取液，震蕩，金屬浴（100℃）10min，離心12000 rpmx5min。提取后，配試劑，加樣，擴增1h45min，擴增儀型號為7300。分析結果。注意，金屬浴過程中，金屬浴箱要蓋上，每個EP管要蓋嚴，防止加熱過程中發生爆管，造成實驗室的污染。若發生爆管，詳細記錄好發生爆管的標本編號，爆管發生的原因，時間等情況。HSV-II型病毒DNA檢測（定量）、HPV

病毒（6、11型和16、18型）DNA檢測（定量）的標本均為分泌物，標本加生理鹽水，震蕩，取1ml至EP管，離心12000rpmx5min，棄上清，注意沉淀易漂起，不要講沉淀棄掉，加50微升DNA提取液，震蕩，金屬浴（100℃）10min。然后配試劑，加樣，擴增1h20min，PCR儀為7600。檢驗結果需要與患者的病史、臨床信息綜合分析，絕對不可僅僅只憑PCR結果進行疾病的診斷。

2．核酸雜交 主要是指HPV21型檢測，標本多為女性的陰道分泌物，首先提取DNA，進行核酸體外擴增，得到擴增產物，然后金屬浴煮沸，淬火，得到大量單鏈的DNA片段，將單鏈DNA片段加入到500微升雜交液中（之前的DNA提取及淬火等操作在標本處理間進行，擴增在核酸擴增間進行），并到產物分析間進行核酸的雜交，每臺雜交儀可一次做15個標本，應注意防止漏液和交叉污染。

3．其他流式細胞術等，但由于標本量較少，平時多的不多。

五、實習存在的問題和不足

分子生物學室的實習感覺還是太過短暫，再加之實習人數多，操作的機會少，特別是標本少的項目，基本還是處于見習的狀態，而且相比其他組的實習，缺乏主動思考的的動力，也許事理論知識學習不夠扎實，也許是跟老師交流太少，在以后的學習和工作中，應加強相關學習，真正掌握好這這一門新興的學科，為今后的學習、該工作或者科研服務

六、實習感想：

一個月的實習很快結束了，每天其實都在做著大量的重復工作，但是我并沒有因此而感到厭煩，相反我覺得這是一門藝術，因為沒有誰能保證2次加樣的量是完全一樣的，而我們能做的就是是通過不斷的練習，規范我們的操作，使每次加樣量盡可能的減小誤差，會做不代表能做好，真正的快樂就在于，將別人認為枯燥無聊的工作做的完美無瑕。

分子診斷學是一門有力的科研武器，不僅可以運用于臨床診斷，在今后的工作中我們也可以運用這一門學科，在學術上進行更深入的探索

在實習結束之際，我要感謝分子生物學室每一位老師，感謝他們耐心、親切的教導，是他們嚴謹、一絲不茍的工作態度教育了我，是他們團結協作、融洽的工作氣氛感染了我。他們循循善誘給我講解，他們耐心規范了我的操作，他們給予我很大的信任與鼓勵。而我能做的是在今后的學習和工作中帶著一顆感恩的心認真負責地工作，培養高尚的職業道德、嚴肅的科學態度和一絲不茍的工作作風，使自己成為一名合格的檢驗專業的的優秀人員。

祝福分子生物學室每一位老師工作順利、闔家幸福

07級醫學檢驗本科潘俊希

2011-10-05

第三篇：分子生物學小結

第二章小結

在自然界各種生物中，DNA和RNA的一級序列貯存著遺傳信息，大多數生物以DNA作為遺傳信息的主要載體。RNA也可以作為遺傳物質，但目前這種現象只存在于病毒中。除DNA，RNA序列貯存遺傳信息以外，DNA的甲基化修飾造成與調節蛋白結合特性的改變、染色質組蛋白的乙酰化、甲基化修飾造成DNA與核小體結合特性的變化，以及蛋白質本身也具有DNA序列變化以外的、可遺傳的表觀遺傳信息。朊病毒是不含有核酸的蛋白質顆粒，但是可以復制并具有傳染性。

核酸包括DNA和RNA，DNA和RNA分別由A、T、C、G和A、U、C、G等核苷酸組成。A、T、C、G和A、U、C、G等堿基與核糖構成核苷，核苷與磷酸殘基形成核苷酸，不同核苷酸的排列組合構成了核酸的一級結構。體內的DNA由兩條DNA單鏈形成雙鏈，是DNA的主要存在形式。DNA雙鏈之間通過堿基配對方式形成，即A-T, C-G，因此，只要知道其中的一條鏈的序列，即可推導出另一條鏈的堿基組成。

雙鏈DNA具有規則的右手雙螺旋結構，在螺旋結構中，脫氧核糖和磷酸間隔排列組成主鏈，而堿基局限于螺旋內部，并在A-T和C-G間以氫鍵相連配對。氫鍵結合力和相鄰堿基的堆集力有利于DNA維持雙螺旋構型，而磷酸基的靜電斥力和堿基分子的內能則不利于DNA維持雙螺旋構型。這四種因素競爭的結果形成穩定的DNA分子結構。

Watson–Crick DNA雙螺旋結構在一定環境條件下，或在不同功能狀態下可以發生扭曲、旋轉、伸展等結構變化，特別是細胞核內的DNA常常與蛋白質緊密結合，因此可以形成不同形態的DNA結構，如A-、B-、Z等不同的構象。不同構象DNA的存在，對DNA的基本功能如復制和轉錄以及基因表達調控都是十分重要的。復制和轉錄時DNA雙鏈的解螺旋，轉錄因子與基因調控區特定結合序列的結合等都涉及蛋白質對DNA特定構型上的特定信息的解讀。

DNA除了存在特定的二級結構以外，還形成不同的三級結構。原核細胞和真核細胞的DNA在生理狀態下均存在超螺旋結構形式。根據DNA每個螺旋的堿基對數目不同，超螺旋具有正超螺旋和負超螺旋兩種方向。所有的DNA超螺旋都是由DNA拓撲異構酶產生。同時，在DNA發生同源重組過程中還成Holliday聯合體，在真核細胞中DNA雙螺旋還進一步與組蛋白包裝成核小體的結構。

在化學和/或物理因素的影響下，核酸分子可發生變性，由穩定的雙螺旋結構松解為無規則線性結構甚至解旋成單鏈。凡能破壞有利于維持DNA雙螺旋構型的因素，以及增強不利于維持DNA雙螺旋構型的因素的各種理化條件都可以成為變性的原因。常用的DNA變性方法主要是熱變性和堿變性。核酸分子變性的過程可以逆轉，在適當條件下，變性DNA可以復性，兩條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構。

復性受到溫度、時間、DNA濃度以及DNA復雜性的影響。根據DNA變、復性的特點，可以針對特定序列的DNA設計探針，進行檢測特定DNA和RNA的定性、定量和定位的分子雜交研究。

第三章小結

從抽象符號到具體的化學本質，人們對基因的理解隨著研究手段的發展而不斷深入。目前，人們不僅能從表型上去研究基因，而且能夠先克隆基因，再深入研究其結構和功能，并且發現了諸如斷裂基因、重復片段、重疊基因、轉位基因和假基因等以各種形式存在的基因。真核生物基因是以單順反子的形式存在，編碼的是單基因產物；而原核生物基因卻是以多順反子的形式存在，由它轉錄產生的是一種大分子量的mRNA，可同時編碼兩種甚至數種基因產物。原核生物的基因和真核生物的基因都可以分為編碼區和非編碼區。絕大多數真核生物其編碼區被非編碼區所打斷，稱為斷裂基因；但是絕大多數的原核生物，其編碼區則是連續的。當然，某些真核生物的基因也可能是連續，而某些原核生物中也有斷裂基因存在。基因的大小與外顯子沒有關系，而是決定于內含子的大小和數目。內含子越多，片段越長，則其基因越大。真核生物中，從酵母到人類，基因的平均大小略有增加。根據基因密度可推知基因組中基因的數目。生物從低等到高等，基因數目逐漸增加。真核生物基因組中來源相同，結構相似，功能相關的一組基因，稱為基因家族。根據家族成員在染色體上的分布形式，基因家族又分為在染色體上串聯重復存在的基因簇和在染色體上散在分布的散在基因家族。除了能編碼蛋白的基因家族外，染色體上還存在大量無轉錄活性的重復DNA序列。根據重復單位的大小，一些高度重復序列又分為了衛星DNA、小衛星和微衛星DNA。

基因組可分為原核生物基因組、真核生物基因組和細胞器基因組。原核生物基因組簡單，只有一個染色體組成，其類核外可能有質粒DNA存在；細胞器基因組主要指真核生物的線粒體和葉綠體基因組，能夠合成部分所需的蛋白質。真核生物的基因組比較復雜，可分為非重復序列、中度重復序列和高重復序列。非重復序列是獨特的，中度重復序列是分散但并非已知的拷貝，高重復序列是短的前后串聯重復序列。每個基因組中各成分所占比率不同，但較大的基因組非重復序列部分較少。復雜度描述了其中獨特序列的長度，重復頻率描述了每個序列重復的次數。C值矛盾描述了真核基因組中編碼潛力和DNA含量并非一致。大多數結構基因位于非重復DNA內。非重復DNA的復雜度比總基因組能更好地反映生物的復雜程度，非重復DNA 最大復雜度達2×109 bp。人類基因組計劃自1990年啟動到現在，其基本任務已經完成，成功繪制了人類的遺傳學和物理學圖譜，并完成人類基因組的全部測序工作。在繪制遺傳學圖譜時，主要用到的遺傳標記有RFLP、STR和SNP等。物理圖譜的繪制實際上是對DNA序列兩點間的實際距離的測定，用到的遺傳標記主要為STS。利用全基因組的“鳥槍法”測序策略，除了人類基因組序列外，還得到了數十幾種模式生物的基因組序列。

研究基因組的科學即為基因組學，包括結構基因組學和功能基因組學。結構基因組學的主要任務已經完成，即人類基因組的作圖、測序和基因定位。目前，對基因組的研究進入了功能基因組學時代。功能基因組學以高通量、大規模實驗方法以及統計與計算機分析為特征。基因芯片、基因表達系列分析、定位克隆等都是功能基因組學的主流研究方法。蛋白質組學是功能基因組學的一個分支，包括結構蛋白質組學和功能蛋白質組學，采用的主要研究方法有蛋白質分離中的2D電泳，蛋白質分析中的質譜分析和蛋白質相互作用研究中用到的酵母雙雜交、蛋白質芯片等等。功能基因組學的發展，尤其是蛋白質組學的研究，都少不了生物信息學的支持，同時海量的數據也帶給了生物信息學巨大的挑戰。

第四章小結

DNA的生物合成有DNA復制和逆轉錄兩種手段。DNA復制是以DNA為模板合成相

＋同DNA分子的過程，其主要特征有：需要模板、四種dNTP和Mg2；被復制的區域必須進行解鏈；半保留復制；需要引物，作為引物的主要是短的RNA，少數是蛋白質；復制的方向始終是5′→3′；具有固定的起點；多為雙向復制；半不連續性；高度有序、高度進行和高度忠實。

參與DNA復制的主要酶和蛋白質有DNA聚合酶、解鏈酶、SSB、引發酶、拓撲異構酶、連接酶和端聚酶等。

DNA聚合酶是參與DNA復制的主要酶。E.coli細胞中有DNA聚合酶I、II、III、IV和V。E.coli的DNA聚合酶I也稱為Kornberg酶，是一種多功能酶，具有5′→3′的聚合酶活性、5′→3′和3′→5′的核酸外切酶活性。使用特殊的蛋白酶處理聚合酶I得到的大片段稱為Klenow酶，具有3′→5′外切酶和5′→3′聚合酶活性，Klenow酶的手指-拇指-掌心三維結構模式出現在許多具聚合酶上。聚合酶II也具有3′→5′外切酶活性，但無5′→3′外切酶活性，參與DNA的修復。聚合酶III由多個亞基組成，雖然也具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切酶活性，但卻分屬不同的亞基。該酶是參與E.coli染色體DNA復制的主要酶。完整的聚合酶III由核心酶、滑動鉗和鉗載復合物組成。在DNA復制過程中，滑動鉗松散地夾住DNA模板，并能自由地向前滑動，大大提高了酶的進行性。DNA聚合酶IV和V屬于易錯的DNA聚合酶，參與DNA的修復合成。真核細胞中至少有15種以上的DNA聚合酶，除了5種發現較早的聚合酶α、β、γ、δ和ε以外，還發現了聚合酶ζ、δ、ε、θ、η、κ、ι、ψ和ξ等。這些新發現的聚合酶主要參與DNA的跨越合成。γ、δ、ε和ζ具有3′-外切酶活性。

DNA解鏈酶是一類催化DNA雙螺旋解鏈的酶，它除了能夠結合DNA以外，還能夠結合NTP并同時具有依賴于DNA的NTP酶活性。SSB是一種專門與DNA單鏈區域結合的蛋白質，無任何酶的活性。

DNA拓撲異構酶是一類通過催化DNA鏈的斷裂、旋轉和重新連接而直接改變DNA拓撲學性質的酶。拓撲異構酶被分I型和II型。I型在作用過程中，只能切開DNA的一條鏈，而II型在作用過程中同時交錯切開DNA的兩條鏈。參與DNA復制的是II型。所有拓撲異構酶的作用都是通過兩次轉酯反應來完成的。

DNA引發酶是一種特殊的RNA聚合酶，用來合成RNA引物。原核細胞內切除RNA的酶是DNA聚合酶I或核糖核酸酶H。真核細胞內負責切除RNA引物的酶核糖核酸酶HⅠ/FEN1或FEN1/Dna2。

DNA連接酶是一類催化一個雙螺旋DNA內相鄰核苷酸3′-羥基和5′-磷酸甚至兩個雙螺旋DNA兩端的3′-羥基和5′-磷酸發生連接反應形成3′,5′-磷酸二酯鍵的酶。DNA連接酶在催化連接反應時需消耗能量。有的連接酶使用 NAD+，有的使用ATP。

尿嘧啶-DNA糖苷酶是一種專門用來切除出現在DNA鏈上非正常U的水解酶。

端聚酶由蛋白質和RNA組成，其中RNA部分序列充當模板，蛋白質具有逆轉錄酶的活性，它所起的作用是復制端粒DNA，維持染色體端粒結構的完整。

所有的DNA復制都可以分為起始、延伸、終止和分離三個階段。復制是以復制子為單位進行的。任何一個復制子都含有一個復制起始區。不同基因組DNA具有不同的復制子結構，像細菌染色體、質粒、噬菌體、病毒和線粒體基因組DNA都只有一個復制子，而真核細胞內的每一個染色體DNA則含有多個復制子。

E.coli染色體DNA的復制為ζ復制，起始階段最重要的事件是對其復制起始區OriC的識別，直到形成引發體。在此階段涉及DnaA、DnaC、DnaT、DnaB、PriA、PriB、PriC和DnaG蛋白，它們按照一定的次序在OriC結合或解離，相互間具有招募作用。復制的延伸首先是復制體的形成，這需要聚合酶III全酶加入到引發體。一個雙向復制的復制子有兩個復制體。在每一個復制體上，同時進行前導鏈和后隨鏈的合成。在一個復制叉內的聚合酶III全酶同時催化前導鏈和后隨鏈的合成，這是因為后隨鏈的模板在復制中形成突環結構。復制結束于終止區，需要Tus蛋白的幫助。最后的兩個子代DNA分子的分離需要拓撲異構酶IV。

某些噬菌體DNA和一些小的質粒在宿主細胞內以滾環復制方式擴增DNA，此外，真核細胞染色體DNA的局部擴增也可以通過這種方式進行；線粒體DNA、葉綠體DNA和少數病毒以D-環的方式進行復制。

真核細胞的細胞核DNA復制與原核細胞的染色體DNA復制不完全相同。參與細胞核DNA正常復制的聚合酶是α、δ和ε。前導鏈和后隨鏈的合成都經歷了從DNA聚合酶α/引發酶復合物到PCNA/DNA聚合酶δ的轉換；FEN-1/RNaseH1負責切除RNA引物，DNA連接酶I負責連接相鄰的岡崎片段，拓撲異構酶I負責清除復制叉移動中形成的正超螺旋，拓撲異構酶IIa和IIb則負責將最后的2個以共價鍵相連的連環體DNA分開。

解決線形DNA末端復制難題的機制有：使用端聚酶、經重組形成串聯體、將線形DNA暫時轉變為環形DNA、滾環復制，以及使用蛋白質-dNTP作為引物。

DNA復制的調控主要在起始階段，原核細胞利用甲基化來調控，ColE1利用反義RNA進行調控，真核細胞內存在兩種機制控制DNA復制的起動，一種是由執照因子控制的正調控，另一種是由增殖蛋白控制的負調控。

逆轉錄是以RNA為模板合成DNA的過程，它主要發生在逆轉錄病毒的生活史之中。一個典型的逆轉錄病毒顆粒按照從外到內的次序，依次是外被、衣殼和基因組RNA。基因組RNA共有兩個拷貝，有逆轉錄酶、整合酶、蛋白酶和tRNA引物與其結合。一個基因組RNA等同于一個全長的病毒mRNA。

HIV屬于逆轉錄病毒，它是艾滋病的元兇。其宿主細胞主要包括：CD4-T淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞和樹突狀細胞，這些細胞都含有CD4蛋白和趨化因子受體。HIV的生活史包括：附著與融合；核心顆粒釋放和逆轉錄；原病毒DNA進入細胞核；整合；轉錄及后加工；轉錄物輸出到細胞質；翻譯及翻譯后加工；新病毒裝配和出芽釋放。

逆轉錄病毒編碼的逆轉錄酶以tRNA為引物，具有三個酶活性： 5'→3'的依賴于RNA的DNA聚合酶活性，該活性用來催化負鏈DNA的合成；核糖核酸酶H活性，該活性用來水解tRNA引物和基因組RNA； 5'→3'的依賴于DNA的DNA聚合酶活性，該活性用來合成正鏈DNA。逆轉錄酶無3'→5'外切酶活性而缺乏校對能力。

逆轉錄病毒基因組RNA的逆轉錄共經歷7步反應，直至基因組RNA被轉變成兩端含有LTR（U3-R-U5）序列的雙鏈DNA。控制逆轉錄病毒基因轉錄的啟動子和增強子序列位于U3，在T淋巴細胞和巨噬細胞中含有與啟動子結合的轉錄因子，只有在5'-端加上了U3以后，將來才可能在宿主細胞RNA聚合酶II的催化下得到全長的mRNA，再經過后加工得到完整的基因組RNA。

其它與逆轉錄現象有關的成分有：反轉座子、反轉錄轉座子、逆轉錄質粒、逆轉錄內含子、逆轉子、端聚酶催化的逆轉錄反應。某些DNA病毒的生活史中也有逆轉錄。

第五章小結

DNA的雙螺旋結構使其成為細胞內唯一的一種損傷后可被完全修復的生物大分子。導致DNA損傷的內在因素有DNA復制過程中發生的錯誤、DNA結構本身的不穩定、細胞內活性氧的破壞作用；屬于環境因素的有紫外輻射、離子輻射和各種化學誘變劑。

DNA損傷分為堿基損傷和DNA鏈的損傷。堿基損傷包括堿基脫落、轉換、修飾、交聯和錯配。DNA鏈的損傷包括DNA鏈的斷裂和交聯。

DNA修復可分為直接修復、切除修復、易錯修復和重組修復等。

直接修復是直接將損傷逆轉，通常只需要單一的酶。能夠被這種機制修復的損傷有嘧啶二聚體、6-烷基鳥嘌呤和某些簡單的DNA鏈斷裂。參與嘧啶二聚體直接修復的酶為光復活酶，此酶能夠直接識別和結合嘧啶二聚體，利用吸光色素捕捉到的光能將嘧啶二聚體打開，最后再與DNA解離。催化烷基化堿基直接修復的酶是烷基轉移酶，該酶以“自殺”的方式參與反應。DNA鏈斷裂的直接修復由DNA連接酶催化。

切除修復就是先切除損傷的堿基或核苷酸，然后以互補鏈為模板，重新合成正常的核苷酸，包括識別、切除、重新合成和重新連接等幾個階段。切除修復又分為BER和NER，前者直接識別具體的受損傷的堿基，而后者識別損傷對DNA雙螺旋結構造成的扭曲。

BER最初的切點一般是N-糖苷鍵，首先切除的受損傷的堿基，由DNA糖苷酶催化。堿基切除后在DNA分子上留下AP位點，AP位點被細胞內的AP內切酶識別后切除。隨后的修補合成有短修補和長修補兩種途徑，其中短修補是主要途徑。

NER最初的切點是損傷部位附近的3′,5′-磷酸二酯鍵，損傷以寡聚核苷酸的形式被切除。修復過程在所有的生物體內都很相似，共包括5步：識別損傷、特殊的內切酶在損傷部位的兩側切開DNA鏈、去除切口之間的帶有損傷的DNA片段、聚合酶填補缺口、連接酶重新縫合切口。NER分為GGR和TCR，前者負責修復整個基因組的損傷，速度慢，效率低；后者專門負責修復那些正在轉錄的基因在模板鏈上的損傷，速度快，效率高。兩類NER的主要差別在于識別損傷的機制，TCR識別損傷的是RNA聚合酶，當它轉錄到受損傷部位而前進受阻的時候，TCR即被起動。

MMR屬于是一種特殊的NER，主要用來修復DNA分子上錯配的堿基，也能修復一些因“復制打滑”而誘發的核苷酸插入或缺失。E.coli的MMR系統為甲基化導向的錯配修復，它利用甲基化來區分子鏈和母鏈的。

DNA雙鏈斷裂修復機制有精確性較高的同源重組和易錯的NHEJ。后者是人類修復雙鏈斷裂的主要方式，需要Ku70、K80、Artemis、DNA-PKCS、連接酶IV以及XRCC4。

損傷跨越僅僅是細胞面對DNA損傷做出的一種適應反應，損傷并沒有真正消失。反應的目的是為了維持復制的連續性，克服損傷對復制的阻礙。反應的手段一是通過重組，第二種是所謂的“跨越合成術”。重組跨越使用同源重組的方法將DNA模板進行交換以避免損傷對復制的抑制；跨越合成由專門的一般無校對能力的DNA聚合酶與取代停留在損傷位點上原來的催化復制的聚合酶，在子鏈上隨意插入核苷酸結果導致對損傷位點的跨越。

發生在DNA分子上可遺傳的結構變化通稱為突變，分為點突變和移碼突變。點突變是指DNA 分子某一位點上所發生的堿基對變化，有轉換和顛換兩種形式。其后果取決于突變位置和具體的變換方式。根據突變的后果，發生在蛋白質基因編碼區的點突變可分為沉默突變、錯義突變、無義突變和通讀突變。移碼突變是指在一個蛋白質基因的編碼區發生的一個或多個核苷酸的缺失或插入，其危害性最大。

突變的原因有內因和外因。由內因引起的突變被稱為自發性突變，由外因引發的突變被稱為誘發突變。自發移碼突變的主要原因有“復制打滑”和轉座作用。誘發點突變的試劑有堿基類似物、烷基化試劑、脫氨基試劑和羥胺。誘發移碼突變的主要是能插入到堿基之間DNA嵌入試劑。

DNA突變在特定的情況下可以發生逆轉。如果在第一次突變位點上發生第二次突變，導致原來的表現型得到恢復，這樣的突變為回復突變；如果發生在非起始突變位點上但能夠掩蓋或抵消起始突變的第二次突變，則稱為校正突變。校正突變又名假回復突變，有基因內校正和基因間校正。基因內校正與第一次突變發生在相同的基因內，基因間校正發生在與第一次突變不同的基因上，通常在翻譯的水平上起作用。

第六章小結

DNA重組是指發生在DNA分子內或DNA分子之間核苷酸序列的交換、重排和轉移現象，主要包括同源重組、位點特異性重組和轉座重組。

同源重組是兩個DNA分子的同源序列直接進行交換。細菌的接合、轉導、轉化和真核細胞的同源染色體之間的交換等都屬于同源重組。解釋同源重組的模型有Holliday 模型、Aviemore模型（單鏈斷裂模型）和雙鏈斷裂模型。三種模型在重組過程中形成χ狀的Holliday連接是一致的。同源重組的基本步驟包括：鏈斷裂與切除、鏈侵入、退火與合成、形成Holliday 結構、Holliday連接的分離和交換。

重組是在特定的蛋白質和酶的協助下完成的。參與E.coli同源重組有關的蛋白質包括：RecA蛋白、RecBCD蛋白、RuvA、RuvB和RuvC蛋白等。RecA蛋白是同源重組中最重要的蛋白質，它參與E.coli所有的同源重組途徑。RecA的主要功能有促進2個DNA分子之間鏈的交換，以及作為共蛋白酶促進LexA 阻遏蛋白的自我水解。RecBCD蛋白由RecB、RecC和RecD三個亞基組成，具有外切核酸酶V、解鏈酶、核酸內切酶、ATP酶和單鏈DNA外切酶共五個酶活性。RecBCD蛋白的功能是參與細胞內的RecBCD同源重組途徑。RuvA蛋白的功能是識別Holliday連接，協助RuvB蛋白催化分叉的遷移。RuvB蛋白是一個解鏈酶，其功能是催化Holliday連接中分叉的遷移。RuvC蛋白是一種特殊的核酸內切酶，催化Holliday連接的分離，因此被稱為解離酶。

發生在E.coli的同源重組途徑有RecBCD途徑、RecF途徑和RecE途徑。真核生物的同源重組主要發生在細胞的減數分裂的前期I的兩個配對的同源染色體之間，其中，在細線期和合線期，形成聯會復合體，在粗線期進行交換。同源重組也會發生在DNA修復之中，用以修復DNA雙鏈斷裂、單鏈斷裂和鏈間交聯。適合真核生物同源重組的模型應該是雙鏈斷裂模型，參與同源重組的主要蛋白質有Rad50、Mre11、Nbs1、Spo11、MSH4、Dmc1、PCNA、RPA和DNA聚合酶δ/ε等。

位點特異性重組是指在DNA特定位點上發生的重組，需要專門的蛋白質識別發生重組的特異性位點并催化重組反應。位點特異性重組也發生鏈交換、形成Holliday連接、分叉遷移和Holliday連接解離。位點特異性重組可以發生在2個DNA分子之間，導致2個DNA分子之間發生整合。位點特異性重組也可以發生在1個DNA分子內部，可能導致缺失或倒位。位點特異性重組的功能包括：調節噬菌體的整合、調節基因表達、調節胚胎發育期間程序性的DNA重排。

轉座重組是指DNA上的核苷酸序列從一個位置轉位或跳躍到另外一個位置的現象，在原核生物和真核生物的基因組內均可以發生，發生轉位或跳躍的核苷酸序列被稱為轉座子。轉座子的靶點與轉座子并不存在序列的同源性，接受轉座子的靶位點可能是隨機的，也可能具有一定的傾向性，這與轉座子本身的性質有關。轉座事件可導致基因組內核苷酸序列發生轉移、缺失、倒位或重復。轉座子本身還可能作為細胞內同源重組系統的底物。兩個轉座子之間發生的同源重組可導致缺失、插入、倒位和移位。細菌內的轉座子分為插入序列、復雜型轉座子、復合型轉座子和Mu噬菌體四類。

轉座機制分為 “剪切”和“粘貼”機制以及“復制”和“粘貼”機制。原核轉座子與真核轉座子的差別主要反映在轉座的機制上：真核生物轉座過程中的剪切和插入是分開進行的，轉座子的復制很多通過RNA中間物來進行。根據轉座的機理將真核生物的轉座子反轉座子和DNA轉座子。反轉座子在結構、性質和轉位的方式上與逆轉錄病毒的復制相似。根據兩端的結構，反轉座子可進一步分為LTR反轉座子和非LTR反轉座子。果蠅基因組上的Copia 元件和酵母體基因組上的 Ty元件屬于LTR反轉座子，LINE和SINE屬于非LTR反轉座子。DNA轉座子又分為復制型DNA轉座子和保留型DNA轉座子。每一類轉座子都有自主型和非自主型。自主型轉座子含有開放的閱讀框架，它們編碼轉座所必需的酶或蛋白質；非自主型轉座子缺乏足夠的編碼能力，卻保留了轉座所必需的順式序列，在合適的自主型轉座子編碼的轉座酶的作用下，它們照樣可以進行轉座。

第七章小結

以DNA作為模板合成RNA的過程被稱為轉錄，它是基因表達的第一步。轉錄具有以下特征：發生在DNA分子上某些特定的區域；以四種NTP為原料，并需要Mg2+的激活；需要模板，需要解鏈，但不需要引物；第一個被轉錄的核苷酸通常是嘌呤核苷酸；轉錄的方向總是從5′→3′；具有高度的忠實性和進行性；轉錄是受到嚴格調控的。

參與轉錄反應的主要酶是RNAP，它不需要引物，缺乏3′-外切酶活性。在三維結構結構上，RNAP類似于DNA聚合酶的“手掌”狀結構。形成原核細胞RNAP只有一種，有核心酶和全酶兩種形式，全酶由核心酶α2ββ′ω和可變的ζ因子組裝而成，負責起始階段的反應，純粹的核心酶只負責延伸階段的反應。原核細胞RNAP特異性的抑制劑有利福霉素和利鏈霉素。在真核細胞有RNAPI、II和III，它們分別催化不同性質的RNA的合成。真核RNAPII對α-鵝膏蕈堿高度敏感。所有的真核細胞RNAPII最大亞基的羧基端都含有一段7個富含羥基氨基酸殘基組成的高度重復的序列，為CTD，CTD的磷酸化參與調節RNAPII的活性。

轉錄過程分為起始、延伸和終止三個階段。轉錄起始階段最重要的事件是識別啟動子，形成轉錄起始復合物。原核轉錄系統中，RNAP能夠直接識別啟動子。而真核轉錄系統之中，直接識別啟動子序列的是特定的轉錄因子。原核生物屬于啟動子的序列通常包含稱為“－35”區和Pribnow盒（或－10區），其中－35區的一致序列為TTGACA，Pribnow盒的一致序列是TATAAT。起始復合物的形成為轉錄的限速步驟，起始頻率主要取決于啟動子強度。一旦啟動發生，RNA合成的速度與啟動子強度無關。轉錄的起始實際上是RNAP與啟動子相互作用并形成活性轉錄起始復合物的過程，E.coli轉錄起始反應依次為： RNAP全酶與dsDNA非特異性結合；全酶與啟動子形成封閉復合物；封閉復合物異構化成開放復合物；形成第一個磷酸二酯鍵；啟動子清空。在E.coli中，當ζ因子釋放后，轉錄即進入延伸階段。失去ζ因子的核心酶通過“滑動鉗”構象握住DNA，以更快的速度沿著DNA模板鏈向前移動，催化RNA鏈的延伸。原核系統轉錄的終止有兩種方式：一種依賴于被稱為ρ因子；另一種方式則不需要ρ因子，而需要RNA轉錄物3′-端的終止子序列。轉錄的忠實性除了聚合酶本身的高度選擇性以外，還與轉錄過程中的校對機制有關。轉錄校對有兩種方式：一種是焦磷酸解編輯，使用聚合酶的活性中心，以逆反應形式，通過重新參入焦磷酸，催化錯誤插入的核苷酸的去除；另一種是水解編輯，需要聚合酶倒退一到幾個核苷酸，然后通過GreA和GreB切除 3′-端幾個核苷酸，包括錯配的核苷酸。

真核轉錄系統與原核系轉錄系統的差別有：染色質和核小體結構對轉錄有深刻的影響；真核細胞RNAP高度分工；需要許轉錄因子；啟動子以外的序列參與調節基因的轉錄；轉錄與翻譯不存在偶聯關系；轉錄的產物多為單順反子。

真核細胞RNAPI負責28S rRNA、18S rRNA和5.8S rRNA的基因轉錄，轉錄的場所為核仁。這三種rRNA共享一個啟動子，由核心啟動子上游啟動子元件組成。轉錄需要UBF和SL1兩種轉錄因子。UBF作為組裝因子，SL1作為定位因子將聚合酶I招募到啟動子上。轉錄的終止于一個分散的由18個nt組成的終止子區域，需要轉錄終止因子。

RNAPIII負責小分子RNA的轉錄，包括tRNA、5S rRNA、7S RNA、snoRNA和無帽子結構的snRNA和某些病毒的mRNA等。轉錄需要的轉錄因子有TFIIIA、B和C。其中TFIIIC為組裝因子，TFIIIB為定位因子。轉錄終止與原核生物不需要ρ因子的終止機制相似。

RNAPII負責催化mRNA、具有帽子結構的snRNA和某些病毒RNA的轉錄。控制蛋白質基因的轉錄順式作用元件包括核心啟動子、調控元件、增強子和沉默子。屬于核心啟動子的原件有：TATA盒、起始子、TFIIB識別元件、下游啟動子元件和GC盒。調控元件的作用需要特殊的反式作用因子的結合。增強子是一種能夠大幅度增強基因轉錄效率的順式作用元件，沉默子則是一種抑制基因表達的順式作用元件。增強子和沉默子的作用與距離、方向、位置均無關，對臨近的基因作用最強。參與蛋白質基因轉錄的轉錄因子有所有的蛋白質基因轉錄都需要的基礎轉錄因子和特定基因轉錄才需要特異性轉錄因子。已知的基礎轉錄因子有TFIIA、B、D、E、F、H和J等。轉錄因子和RNAPII與啟動子結合的可能次序是：TFIID→TFIIA→TFIIB→(TFIIF + RNAP II)→TFIIE→TFIIH。

第八章小結

基因轉錄的直接產物在細胞內必須經歷轉錄后加工才會轉變成有活性的成熟RNA分子。RNA經歷的后加工反應主要有：去除或填加某些核苷酸序列，修飾某些特定的核苷酸。

原核系統的mRNA很少經歷后加工。原核細胞的rRNA前體的后加工主要是剪切、修剪和核苷酸的修飾。原核細胞的三種rRNA和某些tRNA作為一個共轉錄物被轉錄，需要通過剪切將三種rRNA從共轉錄物中釋放出來。剪切和修剪涉及核糖核酸酶有III、D、P、F、E、M16、M23和M5等。核苷酸的修飾主要形式為核糖2′-羥基的甲基化，它發生在剪切和修剪反應之前。原核細胞tRNA前體的后加工方式也包括剪切和修剪以及核苷酸的修飾。其中的核糖核酸酶P由M1RNA和蛋白質組成。核苷酸的修飾主要集中在堿基上。已發現tRNA上的堿基修飾有近百種方式。

真核細胞的細胞核mRNA前體所經歷的后加工反應主要包括5′-端“戴帽”、3′-端“加尾”、內部甲基化、剪接和編輯。戴帽和加尾僅發生在mRNA和某些snRNA，這與聚合酶II的CTD發生特異的磷酸化有關。

帽子與第一個被轉錄的核苷酸之間以5′,5′三磷酸酯鍵相連，有0型、1型和2型。加帽反應是一種共轉錄反應。尾巴是指大多數真核細胞核mRNA的3′-端含有一段多聚腺苷酸序列，是在轉錄后填加上去的。由兩種因素控制加尾反應：一種位于mRNA前體內部，為一段6核苷酸序列，充當加尾信號，其一致序列為AAUAAA；另一種為識別加尾信號的蛋白質或催化加尾反應的酶，包括剪切/多聚腺苷酸化特異性因子、剪切刺激因子、剪切因子I和II、poly A聚合酶，以及poly A結合蛋白。剪接就是去除內含子，連接外顯子的過程。真核細胞mRNA前體的剪接是高度精確的。其精確性取決于兩個因素：其一是位于外顯子和內含子交界處的剪接信號；其二是5種snRNP。

真核細胞內有主要剪接途徑和次要剪接途徑。在主要剪接途徑中，剪接信號的一致序列是內含子的前兩個GU和最后兩個AG，此外還包括在3′-SS不遠處存在的一段主要由11個嘧啶堿基組成的序列，還有內含子中間還有一段被稱為分支點的一致序列。參與剪接反應snRNP有U1、U2、U4、U5和U6。其中U1負責識別5′-SS的信號；U2的主要識別分支點。U2與U6之間通過配對形成兩段雙螺旋，對于剪接反應非常重要；U5能夠與一個外顯子的最后一個核苷酸以及下一個外顯子的第一個核苷酸結合，從而有助于將兩個相鄰的外顯子并置在一起；U6既能與內含子的5′-端互補配對，也能夠與U4配對。U4和U6之間的配對導致兩者形成緊密的復合物。次要剪接途徑的位于內含子和外顯子的剪接信號為AT-GC，參與剪接的snRNP有U11、U12、U4atac、U6atac和U5。剪接反應發生在剪接體。而剪接體主要是由mRNA前體、mRNA前體結合蛋白和5種snRNP在細胞核內按照一定的次序組裝起來的超分子復合物。剪接反應是2次連續的轉酯反應。剪接體的組裝是一個有序和耗能的過程，而且剪接體本身又處在動態變化過程中。同一種Pre-mRNA的不同剪接方式被稱為選擇性剪接，選擇性剪接可導致一個基因編碼出兩種或兩種以上的蛋白質。在某些生物體內（錐體蟲和線蟲），剪接能發生在兩種不同的mRNA前體分子之間，這樣的剪接被稱為反式剪接。

編輯是指在mRNA 的編碼區內引入或丟失任何與其基因編碼鏈序列不同信息的過程。它主要有兩種方式：一種是在編碼區內增加或減少一定數目的核苷酸（主要是U）；另外一種是編碼區的堿基在RNA水平上發生轉換或顛換。編輯的機理因編輯方式的不同而不同，核苷酸的插入或缺失一般需要gRNA引導，而堿基的轉換或顛換則需要特殊的核苷酸脫氨酶的催化。編輯都需要一系列特殊蛋白質的參與，形成所謂的編輯體，以識別、結合和加工編輯點，保證編輯的忠實性。編輯的意義是調節基因表達、創造起始密碼子或終止密碼子等。

真核生物rRNA前體的后加工包括剪切、修剪和修飾，有的還需要剪接。一般需要snoRNA。某些snoRNAs 參與rRNA初級轉錄物剪切成個別rRNA，但絕大多數snoRNA是通過其特定序列與rRNA前體上修飾位點周圍序列的互補配對來確定修飾位點。在核苷酸修飾的同時或結束以后，rRNA前體在特定的核酸酶的催化下進行剪切和修剪。

四膜蟲26S rRNA前體含有內含子，其后加工包括剪接。此類內含子的切除需要鳥苷或鳥苷酸充當輔助因子，但不需要剪接體和任何其它的蛋白質的參與，完全是一種自我催化的過程。四膜蟲rRNA前體中的內含子同時被稱為第一類內含子。起催化作用的是由414個核苷酸組成的內含子。除了第一類內含子以外，還有第二類內含子、第三類內含子和tRNA內含子。第一類內含子和第二類內含子的切除不需要任何蛋白質因子的參與，完全是一種自我催化，屬于核酶；第三類內含子的去除需要SnRNP的幫助，并在剪接體內發生的；tRNA中的內含子非常短，通常為10-20 nt，無一致序列。對于真細菌，tRNA內含子屬于第一類或第二類內含子，但在真核生物和古細菌，tRNA剪接由一系列專門的蛋白質組成的酶按照一定的次序進行催化。

真核生物tRNA前體的后加工方式包括剪切、修剪、堿基修飾、添加CCA和剪接。其中剪切、修剪和堿基修飾與原核系統相似。而添加CCA和tRNA剪接則是真核系統所特有的兩種后加工方式。

第九章小結

蛋白質的生物合成也稱為翻譯，參與翻譯的主要成分有核糖體、mRNA、各種氨酰-tRNA、一種特殊的起始tRNA、起始因子、延伸因子和終止因子。

核糖體含有多個功能部位，包括A部位、P部位、E部位、肽酰轉移酶、mRNA結合部位、多肽鏈離開通道、一些可溶性蛋白質因子的結合部位。在蛋白質生物合成中起決定性作用的是rRNA，其肽酰轉移酶的活性由大亞基的23S rRNA承擔。

mRNA作為翻譯的模板，在其分子上至少含有一個ORF。每一個ORF一般以起始密碼子AUG開始，終止密碼子UAG、UGA或UAA結束。原核生物的mRNA通常是多順反子，含有幾個ORF，每一個ORF可翻譯出一種蛋白質，而真核生物mRNA為單順反子，只有一個ORF，一般只翻譯出一種蛋白質。

tRNA負責攜帶特定的氨基酸通過其反密碼子去閱讀mRNA上的密碼子。決定某一種tRNA接受氨基酸專一性的主要因素是tRNA分子上由幾個核苷酸甚至一個核苷酸組成的正、負元件。

氨基酸與tRNA形成氨酰-tRNA的過程被稱為氨基酸的活化。活化反應由特定的aaRS催化，共消耗2個ATP。催化反應的每一種aaRS面對兩種不同的底物都表現出高度的特異性，以確保能夠識別和結合正確的tRNA與正確的氨基酸，從而合成正確的氨酰-tRNA。氨酰-tRNA合成酶使用“雙篩”機制盡可能降低誤載的氨酰-tRNA的生成。

起始因子、延伸因子、釋放因子和核糖體循環因子分別參與翻譯的起始、延伸、肽鏈釋放和核糖體循環。其中的某些蛋白質因子為G蛋白，其功能的發揮需要結合和水解GTP。

自然界存在原核翻譯系統、真核細胞質翻譯系統、葉綠體翻譯系統和線粒體翻譯系統。所有的翻譯系統都具有以下特征：以mRNA為模板，tRNA為運載氨基酸的工具，核糖體為翻譯的場所；閱讀mRNA的方向都是從5′-端→3′-端，多肽鏈延伸的方向是從N-端→C-端；使用三聯體密碼；正確的氨基酸的參入取決于密碼子與反密碼子之間的相互作用，與tRNA所攜帶的氨基酸無關；遵守擺動規則。

翻譯可分為氨基酸的活化、起始、延伸、終止和釋放。在原核生物的氨基酸活化階段，除了形成各種氨酰-tRNA以外，還要形成fMet-tRNAfMet，由它閱讀起始密碼子。翻譯的起始階段發生的主要事件是起始密碼子的識別和起始復合物的形成。

原核起始密碼子的識別主要是依賴于mRNA的5′-端的SD序列與16S rRNA3′-端的一段反SD序列之間的互補配對。SD序列是mRNA分子上位于起始密碼子上游的一段富含嘌呤堿基的序列。此外，mRNA分子上的特殊的二級結構對起始密碼子的識別也有影響。起始復合物的形成需要IF-

1、IF-2和IF-3的幫助。在形成的三元復合物中，起始密碼子正好處于P部位，而fMet-tRNAfMet通過密碼子與反密碼子的互補作用定位于P部位，A部位是空著的。肽鏈的合成進入延伸階段以后，發生的主要事件是進位、轉肽和移位且不斷的循環。進位需要EF-Tu和ET-Ts，轉肽由23SrRNA催化，移位由EF-G催化。正在合成的多肽鏈通過一個狹窄的出口通道離開核糖體。當終止密碼子進入A部位以后，RF1或RF2便識別并結合上去，RF3·GTP促進RF1和RF2的作用。核糖體上的肽酰轉移酶的活性受到釋放因子的作用發生改變，它將肽酰基轉移給水分子，肽鏈因此被釋放出來。隨后空載的tRNA離開核糖體，釋放因子因為與RF3結合的GTP水解而得以釋放。最后，在RRF的幫助下，核糖體與mRNA解離。

真核生物翻譯過程與原核生物的差別有：核糖體的結構不同；原核生物的翻譯和轉錄是緊密偶聯的，而真核生物的轉錄和翻譯不存在偶聯關系；真核起始tRNA并不進行甲酰化；起始密碼子的識別機制不同；起始tRNA與小亞基的結合先于mRNA；起始階段不僅需要GTP，還需要ATP；起始因子種類與結構比原核生物要復雜得多；還沒有證據表明肽酰轉移酶活性由rRNA承擔；釋放因子有2種；對抑制劑的敏感性不同。

真核生物的翻譯的起始分為四個階段：mRNA的準備和檢查；Met-tRNAiMet 與核糖體小亞基的結合；小亞基復合物與mRNA復合物結合后通過掃描發現起始密碼子。一些病毒病毒使用內部進入識別起始密碼子；大亞基的結合與起始因子的解離。

真核生物的肽鏈延伸反應與原核生物相似，同樣不斷地經歷進位、轉肽和移位反應，只是由eEF-1代替了EF-Tu和EF-Ts，eEF-2代替了EF-G，轉肽酶的活性似乎由核糖體蛋白提供。在真菌中，還需要第三種延伸因子eEF-3的參與。

真核生物的肽鏈終止反應只有2個釋放因子，其中eRF1識別所有的3種終止密碼子。線粒體和葉綠體內發生的翻譯更接近原核生物，但是它們也各有自己特有的性質。細胞有專門的質量控制機制處理異常的mRNA，以防止錯誤的翻譯產物的在細胞內的堆積。原核細胞對喪失終止密碼子的mRNA使用tmRNA進行搶救翻譯，以釋放出核糖體以及水解異常的多肽產物。真核細胞對于異常mRNA控制的機制有兩種，一種是無義介導的mRNA降解，另一種無終止mRNA降解。

細胞內的蛋白質在不斷地合成或分解。在真核細胞中，主要存在兩套蛋白質降解系統：一套是溶酶體系統，不依賴于ATP，另一套是蛋白酶體系統，依賴于ATP，還需要泛素，而降解的真正場所是在蛋白酶。蛋白質的泛酰化有單泛酰化、多重單泛酰化和多聚泛酰化三種形式。通過泛素Lys48殘基的多聚泛酰化參與蛋白酶體的降解，實際上，多泛素鏈的形成是將需要降解的蛋白質打上“死亡標簽”，它似乎是靶蛋白進入蛋白酶體進行降解的先決條件。細菌既沒有泛素，也缺乏與蛋白酶體相關的蛋白質，但也存在依賴于ATP的蛋白酶降解系統。

第十章小結

細胞內剛翻譯好的產物還需經歷后加工、定向和分揀等過程，才能最終成為有功能的蛋白質。翻譯后加工反應來主要包括：多肽鏈的剪切、N-端添加氨基酸、蛋白質的剪接、氨基酸的修飾、添加輔助因子和寡聚化。

多肽鏈的剪切是在特殊的蛋白酶催化下進行的。通過剪切反應，許多蛋白質丟掉一些已經無用的氨基酸序列，如信號序列的切除，還有許多蛋白質只有去除一些氨基酸序列以后才有活性，如酶原的水解激活和激素原轉變為激素等。某些蛋白質在翻譯以后以多聚蛋白質的形式存在，或者與其它蛋白質融合在一起，需要通過剪切才能釋放出來。

N-端添加氨基酸是在特定的氨酰-tRNA:蛋白質轉移酶的催化下進行的，添加氨基酸的場所并不在核糖體上。

蛋白質剪接是指一條多肽鏈內部的內蛋白子序列被去除，兩側的外蛋白子的序列重新被連接起來的翻譯后加工方式。剪接反應經歷一種分枝蛋白中間體，是一種自催化反應。

氨基酸的修飾包括對肽鏈N-端或C-端的修飾以及對各種氨基酸側鏈的修飾。氨基酸修飾的主要形式有：磷酸化、糖基化、脂酰基化、異戊二烯化、羥基化、泛酰化、ADP-核糖體基化、甲基化、酰胺化、乙酰化、甲酰化、γ羧基化、碘基化、焦谷氨酰化、硫酸化、GPI附著、腺苷酸化、小泛素相關修飾物修飾

多肽鏈的折疊有時也可視為后加工的一種方式。體內一個蛋白質的折疊總結起來有五點：正確折疊的信號包含在其一級結構之中；不同種類的蛋白質具有不同的折疊途徑；體內絕大多數蛋白質的折疊需要分子伴侶的幫助；某些蛋白質折疊還需要肽酰脯氨酰順反異構酶或蛋白質二硫鍵異構酶的幫助；非折疊蛋白會誘發內質網的過載反應。

蛋白質在細胞內的定向和分揀可用信號學說進行解釋。其主要內容是：各種蛋白質在細胞中的最終定位是由蛋白質本身所具有的特定氨基酸序列決定的。這些特殊的氨基酸序列起著一種信號的作用，稱為信號序列。信號序列能夠被細胞中的特殊成分識別，由此啟動定向和分揀的過程。如果一個蛋白質缺乏任何一種信號序列，則會留在細胞液。整個定向和分揀的過程可分為三步：識別、移位和成熟。

細胞內的蛋白質定向和分揀有兩種途徑，一種是共翻譯途徑，另一種是翻譯后途徑。細胞膜蛋白、內質網蛋白、分泌蛋白和溶酶體蛋白為共翻譯定向，這些蛋白質的信號肽序列一般位于N-段，富含疏水氨基酸殘基。轉位過程需要SRP。膜蛋白和可溶性蛋白的移位過程有所不同，其中前者還可能含有停止轉移序列，其作用是阻止肽鏈的進一步移位而讓肽鏈在信號序列被切除以后仍然錨定在膜上。

由細胞核基因編碼的定位于線粒體、質體、細胞核和過氧化物酶體的蛋白質基本上屬于翻譯后定向。某些蛋白質具有雙重的定位信號（其中有一種定位信號比較隱蔽），這樣的蛋白質可定位到不同的細胞器。進入線粒體的蛋白質信號序列位于N-端。為了便于將來的跨膜轉運，細胞質中的分子伴侶與蛋白質前體結合，以防止其提前折疊。分子伴侶在細胞液和細胞器分別執行不同的功能：在細胞液阻止蛋白質折疊，維持蛋白質處于一種細長的、容易跨膜的伸展狀態，而在細胞器，卻是促進蛋白質折疊成有功能的形式。蛋白質進入葉綠體的過程與蛋白質進入線粒體很相似，但也有不同：分揀和定位更加復雜；參與跨膜運輸的通道與參與線粒體膜運輸的蛋白質無同源性；輸入到線粒體基質的蛋白質需要跨線粒體內膜的質子梯度。蛋白質定位于細胞核信號序列NLS位于多肽鏈的內部，主要由一些堿性氨基酸殘基組成。核蛋白不是直接通過膜的轉運，而是通過核孔復合物，以完全折疊的狀態進入的。指導蛋白質進入過氧化物酶體的信號序列PTS一般位于肽鏈的C-端，其一致序列為SKL，進入過氧化物酶體蛋白質在細胞液已完全折疊成有功能的形式。

細菌也需要將它的某些蛋白質輸送到外膜、內膜、外周腔或胞外的培養基上。這些需要被輸送出細胞質的蛋白質在N-端也含有特殊的信號序列。在原核細胞里也發現了SRP，也發現分子伴侶結合需要轉運的蛋白質。

第十一章小結

基因表達的調控主要集中在轉錄水平、RNA轉錄物的選擇性后加工水平和翻譯水平。由于原核生物細胞容量有限，能獲得的物質和能量也有限，其基因表達的調控主要發生在轉錄水平上。

原核生物的基因多數以操縱子的形式組成基因表達調控的單元，操縱子是原核生物基因表達調控最重要的形式。組成操縱子的最基本的元件包括結構基因群、啟動子、操作子、調節基因和終止子。

大腸桿菌乳糖操縱子是第一個被發現的操縱子，由一個調節基因（i）、操作子（o）和三個結構基因（z、y 和a）組成。在沒有乳糖的環境中，lac操縱子處于阻遏狀態，低水平、組成型表達產生阻遏蛋白，同乳糖操縱子的操縱子區域結合，阻止轉錄的進行。在有乳糖的環境中，誘導物與R結合，使R構象變化，失去與ｏ的親和力，結構基因開始轉錄這就是乳糖對lac操縱子的誘導作用。乳糖操縱子中還有CAP結合位點，CAP-cAMP起正調控作用。隨后，又發現了多個操縱子，如阿拉伯糖操縱子，其調控蛋白具有正調控和負調控功能；具有雙啟動子的大腸桿菌gal操縱子，以及可阻遏的色氨酸操縱子。

結構基因起始轉錄后，細胞還可以根據細胞內表達產物的含量通過衰減作用對轉錄進行進一步的調控。衰減子由轉錄出的RNA中的幾個區域組成，是在RNA聚合酶起始合成后控制轉錄的進行。前導序列位于操縱子第一個編碼區起始位點之前。衰減子序列包含編碼前導肽的密碼子，這段RNA能夠形成多個不同穩定性的莖環結構，對翻譯的終止起到調節作用。

原核生物的基因表達還有時序調節。在λ噬菌體中，是通過抗終止作用，調控從早期基因的表達轉換到下一個區域基因的表達。

群體感應是細菌根據細胞密度變化進行基因表達調控的一種生理行為。具有群體感應的細菌能產生并釋放被稱為自體誘導物的信號分子，它隨著細胞密度增加而同步增加。當自體誘導物積累到一定濃度時會改變細菌特定基因的表達，與特異的靶基因啟動子結合，從而激活目的基因的轉錄，改變細菌的一系列生理活性。

RNA也可以調節基因的表達。核開關最初由耶魯大學的分子生物學家Ronald Breaker和他的同事提出的。這種RNA分子同特異蛋白結合后能夠改變它的形狀，從而打開或關閉基因的表達。所有已知的核開關都會折疊形成RNA二級結構，有一個莖，一個中心多環和幾個分支發夾結構。核開關在細菌中廣泛存在。核開關是mRNA所形成的調節基因表達的結構。與其它的RNA調節結構不同，它們調節基因表達的機制為同小分子效應物直接作用，形成可變的結構，從而打開或關閉基因的表達。核開關還可以進行翻譯水平的調控。此外，還有的核開關的作用機制與核酶的作用類似。核開關調節許多代謝途徑的表達，包括維生素（如核黃素、硫氨素和鈷胺素）的生物合成途徑以及Met、Leu和嘌呤的合成等。在古細菌和真核生物中也發現有核開關的存在。

除核開關外，mRNA高級結構可以影響翻譯的進行，還可以通過影響mRNA的壽命進行基因表達的調節已經早已被人們所認識。反義RNA是指與靶RNA（多為mRNA）具有互補序列的RNA分子，它通過與靶RNA進行堿基配對結合的方式參與基因表達的調控。現在反義RNA技術已經有了廣泛的應用。

當細菌生長在饑餓的條件下，特別是缺乏維持蛋白質合成的氨基酸時，還可以通過嚴謹反應，將大部分代謝活動都關閉掉。這是它們抵御不良條件，保存自己的一種機制。細菌通過僅僅維持最低量的活性來節約其資源，直到條件改善時，它們又恢復活動，所有代謝區域也都活躍起來。

第四篇：分子生物學實習總結

分子生物學實習總結

三天的分子生物學實習，我能認真聽老師的講解和很好的按照老師的安排完成實驗。期間，接觸和學習到了很多有關分子生物學實驗的方法、儀器的使用、技術，而且對分子生物學實驗有一個大致的了解，學習到很多以前沒有接觸過的知識。

這幾天來做的不足的地方有：

1.預習不夠充分。只是瀏覽了實驗報告上的原理、操作等內容，并沒有深入了解每一個步驟的操作會對實驗有什么的作用和影響。實驗失敗了，不能自主找到原因。

2.實驗操作過程不夠細心。實驗要求十分細心，嚴謹和專注。實驗中很多細小的地方還是沒有很好的注意到。

3.遇到不懂的沒有及時發問。實驗就是一個讓我們實操的過程，一邊操作一邊鞏固書本上的知識。過程中，遇到不明白的地方應該及時問別人活著自己翻閱資料，力求把實驗弄透徹。

但是我還是有很多收獲的：

1.對分子生物學實驗有了了解。例如實驗的基本的流程和操作，常用的方法等基礎知識已經有了一定了解，對以后的實驗會有一定的幫助。

2.最基本的移液槍、離心機、渦旋器等的使用還有實驗中的PCR儀、電泳等有一定的認。3.學會了嚴謹和細心。實驗所用的材料都是比較昂貴的，而且實驗只要一步錯了，就得重做。所以需要非常嚴謹。不僅僅是分子生物學實驗，其他實驗也要求，所以培養這個有點對以后的實驗非常有好處。

4.學會了堅持。很多次因為實驗做的時間很長，大家都會很累，但是，還是要堅持，一點點累都受不了是不能把實驗做好的。開始慢慢了解到做科研的人員的辛酸，長時間整天呆在實驗室做實驗，這需要很大的毅力。

5.把握實驗機會，讓自己學得更多。實驗過程中，只要有實操的機會，我都會去操作。因為說和做是不一樣的。而且在操作中能加深鞏固知識和學得更加深入。

三天的分子生物學實習雖然很累，因為要天天去院樓，而卻實驗時間都比較長。但是還是很有意義的，因為學習到很到東西，收獲了很多。

老師也為我們準備了很多的材料和準備，實驗才做得那么快和順利，其實，實驗室簡化了很多了，而且我們所做的實驗都是已經設計好的，按照操作做就行了。如果時間和資金允許，應該設立一些自主完成的實驗，這樣可以培養我們更加多的能力，開闊知識面和拓寬思維。

第五篇：2012臨床血液組實習小結

實習目的

熟練掌握WBC計數，WBC分類，血紅蛋白比色，血小板計數，網織紅細胞計數，找狼瘡細胞，嗜酸性細胞計數，找瘧原蟲等項目的檢驗目的、方法學原理、標本的收集及處理、檢測儀器（半自動、全自動血球儀，全自動血凝儀）的使用、檢測試劑的評價、質控品及校準品的要求、操作步驟、結果計算、操作中的注意事項、參考值范圍、警告值、校準程序、質控程序、臨床意義、及當檢驗系統或儀器不能工作時應如何采取應急措施。

1.血常規分析

血常規儀開機——質控全血做質控——采血（兒童以末梢血為主）——編號——進樣——試驗完畢后浸泡清洗——關機 2.凝血象

接收標本——核對標本和化驗單信息——分類編號——3000rpm離心10min——上儀器檢測——刷化驗單條碼，錄入病人信息——審核結果——打印報告。3.CRP 采血（血常規時同時取血）——稀釋——加樣——比色——錄入結果

五、實習中的問題和不足

1.在凝血象的檢測中沒有注意標本的狀態，有凝塊的標本沒有拒收，還好老師比較細心，沒有將異常的結果發出，否則將犯下大錯

2.在血常規的檢查中也有不少困擾，特別是給小孩采血，很少有主動配合的患兒，這就不僅考驗的是采血的技術，也要求具備與小孩溝通的能力

六、實習感想

臨床血液組實習中印象最深刻的就是給小孩子采末梢血，本以為采末梢血是最簡單最基本的操作了，但當真正拿起采血針的時候還是有點膽怯了，你不僅要面對小孩的哭鬧，還有后面家長們那一雙雙緊張焦慮的眼睛。生怕扎疼扎深了孩子會哭鬧，家長會責怪，可是自己開始的仁慈卻讓孩子們挨了兩針甚至更多，經歷幾次之后，自己決定要膽子大一點，寧可一次扎得深一點也不愿多扎幾次。在這個過程中，還要學會安撫孩子、哄孩子使他們乖乖的接受扎針采血，要把握采血時機，進針快速，保證一針見血達到目的。

在實習的過程中，自己發覺基礎知識掌握的不牢固，學校已經學習了的，考完試實習前已經忘了一大半，在實驗的過程中總是對檢驗項目的原理、目的和意義似懂非懂，有時老師提出的最基本問題自己也回答不出來。深深意識到要隨時溫故而知新，不能隨學隨丟。所以以后的學習和工作中一定要及時復習，日積月累，知識就會慢慢的積累下來。

臨床血液組的標本量很大，每天都在一直在忙忙于常規工作，可是自己卻很少去嘗試去對每個化驗單進行解釋，更不用說將檢驗結果與臨床相結合，這一方面甚是欠缺，這是今后能與臨床醫生溝通的基礎，必須加強這方面的學習。

在臨床血液組實習結束之際，我要感謝細菌室的每一位老師，感謝他們耐心、和藹的教導，是他們嚴謹、一絲不茍的科學態度教育了我，是他們團結協作、融洽的工作氣氛感染了我。他們循循善誘給我講解，他們耐心規范了我的操作，他們給予我很大的信任與鼓勵，放手讓我操作。而我能做的是在今后的學習和工作中帶著一顆感恩的心認真負責地工作，培養高尚的職業道德、嚴肅的科學態度和一絲不茍的工作作風，使自己成為一名合格的檢驗專業的的優秀人員。

祝福臨床血液組每一位老師工作順利、闔家幸福。