第一篇：真菌感染的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢查方法

真菌感染的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢查方法

對(duì)真菌的診斷需要了解真菌寄生的部位，完整的病史，包括職業(yè)、業(yè)余愛(ài)好和旅游史。檢查一般采用直接鏡檢和真菌培養(yǎng)兩種方法即可確診。必要時(shí)再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)、血清學(xué)反應(yīng)或動(dòng)物接種等。

標(biāo)本的采集 用無(wú)菌操作收集適宜部位的標(biāo)本，可疑淺部真菌感染應(yīng)取病變部位的毛發(fā)、指（趾）甲屑及皮屑等，可疑深部真菌感染的病人應(yīng)根據(jù)臨床癥狀和體征選取、腦脊液或分泌物、排泄物及痰液等并及時(shí)檢查，一般不超過(guò)1～2小時(shí)，以免變質(zhì)污染。

真菌的直接鏡檢 皮屑、指（趾）甲和毛發(fā)等致密而難以透明的標(biāo)本應(yīng)先用10%的KOH微加溫處理，溶解角質(zhì)層和細(xì)胞基質(zhì)，然后進(jìn)行鏡檢。膿、痰或血標(biāo)本可直接涂片鏡檢。鏡下觀察是否有孢子、菌絲或假菌絲。若懷疑新生隱球菌等有莢膜的真菌感染，根據(jù)所致疾病選取標(biāo)本，經(jīng)墨汁負(fù)染后鏡檢，見(jiàn)有芽生菌體外圍繞著寬厚的莢膜即可做出診斷。

真菌的分離培養(yǎng) 一般用于直接鏡檢不能確診時(shí)。病原性真菌培養(yǎng)用沙保弱培養(yǎng)基（pH5.6，不適宜生長(zhǎng)）培養(yǎng)，為了防止細(xì)菌或腐生性真菌的污染，經(jīng)常加入放線（菌）酮、青霉素、鏈霉素或其他抑

制性抗生素。如果是皮膚、毛發(fā)和甲屑等標(biāo)本，需經(jīng)70%乙醇或2%石炭酸浸泡2～3分鐘殺死雜菌，再經(jīng)無(wú)菌鹽水洗凈后接種于沙保弱培養(yǎng)基上，在25℃～28℃的條件下培養(yǎng)數(shù)日至數(shù)周，觀察菌落特征。

可疑深部真菌感染的標(biāo)本可接種于血平板、肉渣培養(yǎng)基或硫酸鈉肉湯內(nèi)，分別在室溫和37℃培養(yǎng)數(shù)日至數(shù)周。必要時(shí)可在玻片上做真菌小培養(yǎng)，能在光鏡下觀察真菌的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)及生長(zhǎng)發(fā)育的全過(guò)程，便于鑒別。陰道或口腔粘膜處標(biāo)本可直接用棉拭子取材，在血平板上分離。血液標(biāo)本需事先增菌，腦脊液標(biāo)本則取其沉淀物接種于血平板上，于37℃培養(yǎng)。若疑為假絲酵母菌，可取菌落接種于0.5ml血清試管內(nèi)，37℃1h后涂片，革蘭染色后鏡下見(jiàn)有假絲酵母菌細(xì)胞長(zhǎng)出芽管即可初步鑒定為白假絲酵母菌。

血清學(xué)診斷可輔助檢查深部真菌感染。通常使用的方法是乳膠凝集和補(bǔ)體結(jié)合等試驗(yàn)。用乳膠凝集試驗(yàn)可檢測(cè)腦脊液或血液中新生隱球菌的莢膜抗原，經(jīng)有效治療后，其抗原效價(jià)下降；但是在AIDS患者合并新生隱球菌感染時(shí)，抗原效價(jià)經(jīng)常會(huì)在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持高水平。但主要問(wèn)題是多種真菌細(xì)胞壁缺乏具有原性的成分。

核酸雜交探針技術(shù) 已經(jīng)用于深部感染真菌的特異性鑒定。從培養(yǎng)物中提取RNA，加入標(biāo)記化學(xué)發(fā)光化合物的單鏈DNA探針。當(dāng)培養(yǎng)物中出現(xiàn)目的真菌，相應(yīng)的DNA探針與其RNA雜交。本實(shí)驗(yàn)方

法只需要最小量的真菌生長(zhǎng)物（通常少于5天），與經(jīng)典方法比較，更節(jié)省時(shí)間，可應(yīng)用于絲狀真菌或酵母型真菌的檢查。另有檢測(cè)真菌DNA中的G+C mol%、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）和PCR限制性酶切片長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）等技術(shù)的應(yīng)用。與經(jīng)典方法比較，這些技術(shù)敏感、省時(shí)，無(wú)疑會(huì)推動(dòng)真菌感染性疾病的診斷水平向前發(fā)展。

第二篇：真菌鑒定方法

真菌鑒定方法

一般常用的有：

1、直接鑒定法

2、通過(guò)篩子檢驗(yàn)

3、比重檢驗(yàn)法

4、染色檢驗(yàn)法

5、洗滌檢驗(yàn)法

6、保濕萌芽檢驗(yàn)

7、分離培養(yǎng)檢驗(yàn)

真菌主要是酵母，霉菌和大型真菌三種，最常用的鑒定方法就是表形觀察，霉菌和大型真菌可以通過(guò)菌絲的顏色，孢子的形態(tài)進(jìn)行區(qū)分，輔以23srRNA就基本ok，酵母可以通過(guò)發(fā)酵代謝觀察輔以23rRNA進(jìn)行鑒定，真菌鑒定方法。

真菌是細(xì)菌的一種嗎?

隨著生活水平的逐漸提高，人們的衛(wèi)生防病意識(shí)也在不斷加強(qiáng)。大多數(shù)人知道細(xì)菌可以導(dǎo)致疾病，并習(xí)慣用“有病菌”或“有細(xì)菌”來(lái)形容一個(gè)臟的環(huán)境或物品。那么，真菌又是怎么回事，是細(xì)菌的一種嗎?的確，真菌也很微小，也能使人生病，但它和細(xì)菌有著本質(zhì)的區(qū)別。

我們知道，植物和動(dòng)物都是由細(xì)胞組成的，細(xì)胞內(nèi)都有細(xì)胞核，鑒定材料《真菌鑒定方法》。而微生物中只有真菌具有真正的細(xì)胞核和完整的細(xì)胞器，故又稱真核細(xì)胞型微生物;細(xì)菌僅有原始核結(jié)構(gòu)，無(wú)核膜和核仁，細(xì)胞器很少，屬于原核細(xì)胞型微生物;而病毒則沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，屬于原生微生物。

真菌在自然界中分布極廣，有十萬(wàn)多種，其中能引起人或動(dòng)物感染的僅占極少部分，約300種。很多真菌對(duì)人類是有益的，如面粉發(fā)酵，做醬油、醋、酒和霉豆腐等都要用真菌來(lái)發(fā)酵。工業(yè)上許多酶制劑、農(nóng)業(yè)上的飼料發(fā)酵都離不開(kāi)真菌。許多真菌還可食用，如蘑菇、銀耳、香菇、木耳等。真菌還是醫(yī)藥事業(yè)中的寶貴資源，有的可以用于生產(chǎn)抗生素和維生素以及酶類;有的本身就可以入藥用于醫(yī)治疾病，如中藥馬勃、茯苓、冬蟲(chóng)夏草等。

真菌還可引起動(dòng)、植物和人類的多種疾病，在人類主要有三種類型：①真菌感染;②變-態(tài)反應(yīng)性疾病;③中毒性疾玻

霉菌

亦稱“絲狀菌”。屬真菌。體呈絲狀，叢生，可產(chǎn)生多種形式的孢子。多腐生。種類很多，常見(jiàn)的有根霉、毛霉、曲霉和青霉等。霉菌可用以生產(chǎn)工業(yè)原料(檸檬酸、甲烯琥珀酸等)，進(jìn)行食品加工(釀造醬油等)，制造抗菌素(如青霉素、灰黃霉素)和生產(chǎn)農(nóng)藥(如“920”、白僵菌)等。但也能引起工業(yè)原料和產(chǎn)品以及農(nóng)林產(chǎn)品發(fā)霉變質(zhì)。另有一小部分霉菌可引起人與動(dòng)植物的病害，如頭癬、腳癬及番薯腐爛病等。

酵母菌

屬真菌。體呈圓形、卵形或橢圓形，內(nèi)有細(xì)胞核、液泡和顆粒體物質(zhì)。通常以出芽繁殖;有的能進(jìn)行二等分分-裂;有的種類能產(chǎn)生子囊孢子。廣泛分布于自然界，尤其在葡萄及其他各種果品和蔬菜上更多。是重要的發(fā)酵素，能分解碳水化合物產(chǎn)生酒精和二氧化碳等。生產(chǎn)上常用的有面包酵母、飼料酵母、酒精酵母和葡萄酒酵母等。有些能合成纖維素供醫(yī)藥使用，也有用于石油發(fā)酵的。

啤酒酵母(Saccharomyces)

屬酵母菌屬。細(xì)胞呈圓形、卵形或橢圓形。以出芽繁殖，能形成子囊孢子。在發(fā)酵工業(yè)上，可用來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)酒精或藥用酵母，也可通過(guò)菌體的綜合利用提取凝血質(zhì)、麥角固醇、卵磷脂、輔酶甲與細(xì)胞色素丙等產(chǎn)品。

紅曲霉素(Monascuspurpureus)屬于囊菌綱，曲霉科。菌絲體紫紅色。無(wú)性生殖時(shí)，茵絲分枝頂端形成單獨(dú)的或一小串球形或梨形的分生抱子。有性生殖時(shí)，產(chǎn)生球形、橙紅色的閉囊果，內(nèi)生含有八個(gè)子囊孢子的子囊。紅曲霉可制紅曲、釀制紅乳腐和生產(chǎn)糖化酶等

第三篇：泌尿系統(tǒng)感染的檢查方法

泌尿系統(tǒng)感染的檢查方法

一般來(lái)說(shuō)，泌尿系統(tǒng)感染多與衛(wèi)生不良有關(guān)，大約50%的女性至少患過(guò)一次泌尿系統(tǒng)感染，20%的女性則有多重感染——許多女性一年患1—2次，是很常有的事。通常在陰道時(shí)，這些細(xì)菌無(wú)大礙，問(wèn)題開(kāi)始于它們進(jìn)入尿道時(shí)。那些患尿道感染的婦女，其體內(nèi)結(jié)構(gòu)和其他女性并無(wú)兩樣。就某些不明原因，某些女性較易受感染。致病菌引起的泌尿、男生殖系統(tǒng)炎癥稱泌尿、男生殖系統(tǒng)感染。致病菌是泌尿、男生殖系感染的先決條件，當(dāng)泌尿、男生殖系統(tǒng)存在病理基礎(chǔ)時(shí)，既減弱了機(jī)體的防御機(jī)制，而易于誘發(fā)感染。

還有一些女性泌尿系統(tǒng)感染是在性交中受到挫傷的結(jié)果;男性也會(huì)得此病，但較為罕見(jiàn)，男性泌尿系統(tǒng)感染通常是由性病所引起。非特異性尿道炎及淋病兩種性病最常引起尿道和膀胱炎癥。

診斷檢查

1。新生兒多為血行感染，男多于女，癥狀不典型。應(yīng)注意有無(wú)發(fā)熱或體溫過(guò)低、哭鬧、吐瀉、黃疸、拒奶、體重不增、煩躁、抽搐及泌尿道畸形等情況。

2。嬰兒發(fā)病率較高，女多于男。常有高熱、寒戰(zhàn)、面色灰白、惡心、頻繁嘔吐、驚厥、尿頻、尿痛或腹痛、尿液混濁。注意外陰部衛(wèi)生情況和男嬰的包皮過(guò)長(zhǎng)。

3。學(xué)齡前后患兒，應(yīng)注意寒戰(zhàn)、發(fā)熱，單側(cè)或雙側(cè)腰痛或叩擊痛，尿頻、尿痛、尿急、血尿、排尿困難以及遺尿癥。

4。慢性或反復(fù)發(fā)作者，應(yīng)注意面色蒼白、消瘦、精神不振、生長(zhǎng)遲緩。久病者注意腎功能不全表現(xiàn)。

檢驗(yàn)血、尿常規(guī)。尿細(xì)菌鏡檢(中段尿一滴，不離心，滴于玻璃片上，烘干，亞甲藍(lán)或革蘭染色，油鏡下每視野見(jiàn)一個(gè)或更多細(xì)菌，表示尿內(nèi)細(xì)菌>10萬(wàn)/ml)。清潔中段尿細(xì)菌培養(yǎng)(男性尿細(xì)菌計(jì)數(shù)>1萬(wàn)菌落/ml;女性尿>10萬(wàn)菌落/ml，80%為真性細(xì)菌尿;女性1萬(wàn)～10萬(wàn)菌落/ml為可疑)。尿濃縮功能試驗(yàn)。必要時(shí)進(jìn)行有關(guān)的腎功能檢查。

6。腎超聲波檢查，必要時(shí)行腎圖、CT或磁共振、腎掃描、靜脈腎盂造影及膀胱尿道造影等檢查。

來(lái)源：中國(guó)青年網(wǎng)健康頻道

第四篇：微生物實(shí)驗(yàn)室真菌檢查質(zhì)量控制流程

微生物實(shí)驗(yàn)室真菌檢查質(zhì)量控制流程

一、目的

規(guī)范微生物實(shí)驗(yàn)室管理程序，確保臨床報(bào)告的質(zhì)量。

二、適用范圍

微生物實(shí)驗(yàn)室的各類真菌檢測(cè)。

三、職責(zé)

實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員均必須熟知并遵守本程序。

四、程序

(一)臨床樣本的采集與處理

1.皮屑

邊緣、皰壁、膿液、深層趾（指）間皮屑或活動(dòng)邊緣皮屑，取材前75%酒精消毒，作KOH涂片。

2.甲屑

用細(xì)挫或牙科磨鉆取病甲與正常甲交界處并且貼近甲床部的甲屑，作KOH涂片。

3.毛發(fā)

取病發(fā)（變色，無(wú)光澤，彎曲，脆易折斷，松動(dòng)易拔除）15根，75%酒精消毒，3～5根作直接鏡檢。

4.膿液

無(wú)菌采集，注意顆粒，用無(wú)菌蒸餾水稀釋后尋找。可作革蘭染色，常規(guī)的KOH涂片。5.CSF

采集于無(wú)菌試管3～5ml，立即送檢。置冰 箱不宜超過(guò)1h。離心后以無(wú)菌吸管吸取離心沉淀物1ml，作墨汁涂片鏡檢。

6.血液

無(wú)菌抽血3～5ml立即于無(wú)菌抗凝管中，BHIB:血標(biāo)本量為培養(yǎng)基量的1/10，37℃5～7d出現(xiàn)渾濁或菌團(tuán)，挑取鏡檢同時(shí)移種SDA（注：每天檢查完畢后需搖動(dòng)培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)可加速真菌的生長(zhǎng)，提高檢出率。不作直接檢查，因其直接檢查陽(yáng)性率低。

7.體液、痰液、尿液、糞便

①體液標(biāo)本量10ml離心沉淀取2ml沉淀液做直接鏡檢培養(yǎng)。②晨痰3～5ml集于無(wú)菌瓶中(無(wú)菌生理鹽水漱口數(shù)次后)，挑取黏液或膿性部分：KOH涂片培養(yǎng)。③早晨中段尿或清潔尿10ml，離心取沉淀液1ml做KOH涂片培養(yǎng)（SDA每管種0.5ml）。④拭子：一般盡量不用，缺點(diǎn)：A.不能得到足量的標(biāo)本；B.采集的標(biāo)本也不易從棉花纖維上分離下來(lái);C.容易干竭。采集標(biāo)本后應(yīng)迅速放入內(nèi)裝1~2ml無(wú)菌蒸餾水的試管送檢KOH涂片培養(yǎng)。⑤紙盒送檢，挑取黏液、膿血、乳酪樣部分KOH涂片培養(yǎng)（加抗生素）注：?jiǎn)渭兣囵B(yǎng)陽(yáng)性，不一定有臨床意義，KOH涂片發(fā)現(xiàn)菌絲，有診斷意義。

8.組織：標(biāo)本置無(wú)菌平皿中立即送檢，置無(wú)菌勻漿器加2ml蒸餾水，研磨成漿或1～2mm的小塊，KOH 涂片培養(yǎng)。

(二)涂片染色和直接鏡檢的質(zhì)控

1.氫氧化鉀/復(fù)方氫氧化鉀法：標(biāo)本置于載玻片上，加一滴浮載液，蓋上蓋玻片，放置片刻或微加熱，即在火焰上快速通過(guò)2～3次，不應(yīng)使其沸騰，以免結(jié)晶，然后輕壓蓋玻片，驅(qū)逐氣泡并將標(biāo)本壓薄，用棉拭或吸水紙吸去周圍溢液，置于顯微鏡下檢查。檢查時(shí)應(yīng)遮去強(qiáng)光，先在低倍鏡下檢查有無(wú)菌絲和孢子，然后用高倍鏡觀察孢子和菌絲的形態(tài)、特征、位置、大小和排列等。

2.膠紙粘貼法：用1cm×1.5cm的透明雙面膠帶貼于取材部位數(shù)分鐘后自取材部位揭下，撕去復(fù)帶在上面的底板紙貼在載玻片上，使原貼在取材部位的一面暴露在上面，再進(jìn)行革蘭染色或過(guò)碘酸錫夫染色，在操作過(guò)程中應(yīng)注意雙向膠帶粘貼在載玻片上時(shí)不可貼反，而且要充分展平，否則影響觀察。

革蘭染色檢查法：在載玻片上滴1滴生理鹽水，將所采集的標(biāo)本均勻涂在載玻片上，自然干燥后，火焰固定或甲醇固定。再選擇革蘭染色方法，染色后，以油鏡觀察。

3.染液的質(zhì)量控制

（1）革蘭染液每次新配置和使用中每周一次進(jìn)行質(zhì)控，并進(jìn)行記錄。（2）氫氧化鉀/復(fù)方氫氧化鉀每周進(jìn)行一次質(zhì)控。(三)真菌鑒定質(zhì)量保證

1.對(duì)酵母樣真菌如念珠菌或隱球菌在常規(guī)臨床細(xì)菌室已有較成熟的方法學(xué)，可用顯色培養(yǎng)基。

2.常規(guī)鑒定絲狀真菌主要依賴于其生長(zhǎng)過(guò)程中形態(tài)變化和特點(diǎn)，所以要求從事絲狀真菌檢測(cè)的檢驗(yàn)人員應(yīng)作專業(yè)短期培訓(xùn)；任何實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)建立規(guī)范的涂片鑒定方法，要正確區(qū)分酵母樣真菌或絲狀真菌、毛霉菌和曲霉（有頂囊），對(duì)不常見(jiàn)的真菌不要輕易作為污染菌報(bào)告。(四)結(jié)果報(bào)告

1.藥敏崗位檢驗(yàn)人員綜合真菌鑒定和藥敏結(jié)果形成檢驗(yàn)報(bào)告并簽名，微生物實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或指定人按照相關(guān)抗菌藥物試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程核對(duì)藥敏結(jié)果，尤其注意異常和少見(jiàn)結(jié)果。

2.告病人結(jié)果之前，應(yīng)確定質(zhì)控在可接受范圍。3.經(jīng)雙人雙核后的報(bào)告單交報(bào)告發(fā)放員分發(fā)到各病房或門診病人，注意簽收并記錄。缺乏審核者得報(bào)告結(jié)果，應(yīng)由微生物實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人或指定人在 24 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行評(píng)估。

4.血培養(yǎng)陽(yáng)性涂片為真菌和腦脊液墨汁染色發(fā)現(xiàn)隱球菌的初步報(bào)告經(jīng)核實(shí)后，按《三級(jí)報(bào)告程序》報(bào)告。5.完成分析后的微生物標(biāo)本，檢驗(yàn)人員應(yīng)按照《檢驗(yàn)后標(biāo)本保存程序》安全保管標(biāo)本和平板，要求有明確標(biāo)識(shí)以備復(fù)查。3-5 日后，由廢棄物處理崗位人員按照《廢棄物處理程序》處理。

遇到來(lái)自臨床或病人對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的抱怨，應(yīng)按照《投訴與抱怨處理程序》處理。

第五篇：醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室四種菌種保存方法的比較

醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室四種菌種保存方法的比較

摘要：目的 ： 探索一種經(jīng)濟(jì)、方便、長(zhǎng)期的保存常用微生物菌種的方法。方法： 將21種細(xì)菌分別用半固體、甘油、脫脂牛奶、微孔珠進(jìn)行保存及復(fù)蘇鑒定，比較4種菌種保存方法的保存效果。結(jié)果： 通過(guò)2年的實(shí)驗(yàn)證明用甘油、脫脂牛奶、微孔珠保存法保存時(shí)間長(zhǎng)，且未發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性的變異。結(jié)論： 甘油、脫脂牛奶、微孔珠保存法操作簡(jiǎn)便易行，長(zhǎng)期保存的存活率高，菌種的變異率低，適用于一般微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室菌種的保存工作。

關(guān)鍵詞：半固體；甘油；脫脂牛奶；微孔珠；菌種保存

基金項(xiàng)目：湖南省“十二五”綜合改革試點(diǎn)項(xiàng)目，湖南省教育廳教改項(xiàng)目（編號(hào)： 2010516）

微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，典型的菌種是實(shí)驗(yàn)教學(xué)能否成功開(kāi)展和達(dá)到滿意的教學(xué)效果的關(guān)鍵因素。菌種因受到外界環(huán)境及自身代謝的影響，長(zhǎng)期在培養(yǎng)基上移種和傳代后，其形態(tài)、菌落、毒力均易發(fā)生變異，而成為不典型的菌株甚至死亡[1]。因而菌種保存工作在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作中變得尤為重要。我們通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)試圖尋求既操作簡(jiǎn)便又可保持菌種的存活率，降低菌種的變異率，適用于醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的菌種保存方法。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，25922）、表皮葡萄球菌（S.epidermidis，26104）、腐生葡萄球菌（S.saprophyticus，27101）、甲型溶血性鏈球菌（α-hemolytic streptococcus，32212）、乙型溶血性鏈球菌（β-hemolytic strepto-coccus，32210-4a）、肺炎鏈球菌（S.pneumoniae，31002-16）、腦膜炎奈瑟菌（N.meningitides，29019）、大腸埃希菌（Escherichia coli，44101）、肺炎克雷伯菌（K.peumoniae）產(chǎn)氣腸桿菌（E.aerogenes，45103）、變形桿菌（P.mirabilis，49006）、傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi，50402）、甲型副傷寒沙門氏菌（S.paratyphi A，50001）、乙型副傷寒沙門氏菌（S.paratyphi B，50602）、痢疾志賀菌（S.dysenteriae 51252-8）、福氏志賀菌（S.flexneri，51573）、宋內(nèi)志賀菌（S.sonnei，51334-21）、銅綠假單胞菌（P.aeruginosa，10102）、蠟樣芽胞桿菌（B.cereus，63301）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis，63501）、白色念珠菌（C.albicans）。以上菌種中，肺炎克雷伯菌、白色念珠菌由湖南醫(yī)藥學(xué)院附屬一醫(yī)院分離，甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌和痢疾志賀菌購(gòu)自北京生物制品檢定所，其余均購(gòu)自湖南省疾控中心。

1.1.2培養(yǎng)基

半固體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、血清肉湯、脫脂牛奶培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力瓊脂、沙氏瓊脂，培養(yǎng)基均用常規(guī)方法配制、滅菌。

1.1.3微孔珠保存管

甘油（分析純）分裝于玻璃試管中經(jīng)121.3℃滅菌30min。保存管為購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，主要組成是冷凍保存管內(nèi)有微孔珠（10粒）、培養(yǎng)基（胰蛋白胨、NaCl、甘油）。

1.2方法

1.2.1菌種的純化

甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、肺炎鏈球菌在血瓊脂培養(yǎng)基純化；腦膜炎奈瑟菌在巧克力瓊脂上純化；白色念珠菌在沙氏瓊脂純化；其余菌種在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上純化。

1.2.2甘油保存法

純化后，挑取甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、肺炎鏈球菌于血清肉湯培養(yǎng)基中，置普通培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)12～18h；挑取腦膜炎奈瑟菌于血清肉湯培養(yǎng)基中，5%～10%CO2環(huán)境37℃培養(yǎng)12～18h；其余菌種分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置普通培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)12～18h。將以上培養(yǎng)物與等量的已滅菌的甘油充分混勻后，分裝于微量無(wú)菌離心管或細(xì)胞凍存管中，每個(gè)菌種均分裝20支，并分成2組。置-20℃保存。

1.2.3脫脂牛奶保存法

將滅菌脫脂牛奶培養(yǎng)基分裝于無(wú)菌的微量離心管或細(xì)胞凍存管中，挑取純化后的菌種（菌落盡量多）于分裝好的牛奶培養(yǎng)基中，每個(gè)菌種均分裝20支，并分成2組。充分混勻后置-20℃保存。

1.2.4半固體保存法

挑取純化后甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、肺炎鏈球菌和腦膜炎奈瑟菌接種于血清半固體培養(yǎng)基中，其余菌種分別接種于半固體培養(yǎng)基中，每個(gè)菌種均接種20支，并分成2組。置普通培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)12～18h后加一層1cm厚的無(wú)菌液體石蠟，置4℃冰箱保存。

1.2.5微孔珠保存法

3.討論

菌種是微生物實(shí)驗(yàn)室中不可缺少實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，為了保證實(shí)驗(yàn)教學(xué)的需要，對(duì)菌種必須妥善保存和保管。保存菌種不僅要求不死，還要求其生物學(xué)性狀、生理特性、抗原性等方面不發(fā)生變異，這是保存菌種的重要環(huán)節(jié)。真空冷凍干燥保存法是目前菌種保存最有效的方法之一，但是此方法操作過(guò)程繁瑣，且需要專用的設(shè)備（冷凍真空干燥機(jī)），成本較高，普通微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)。因此，我們需要既有效，又方便、經(jīng)濟(jì)適用的菌種保存方法用于微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)。我們近2年來(lái)用甘油、脫脂牛奶、半固體、微孔珠對(duì)21種菌株分別進(jìn)行保存試驗(yàn)的比較，結(jié)果表明，半固體保存法雖然操作簡(jiǎn)單，菌種復(fù)蘇方便，但不適用于對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求特殊的鏈球菌和奈瑟氏菌等菌株，且菌種需3～6個(gè)月轉(zhuǎn)種一次，菌種在多次傳代轉(zhuǎn)種過(guò)程中易發(fā)生變異。甘油、脫脂牛奶、微孔珠保存法相對(duì)來(lái)說(shuō)操作簡(jiǎn)單、運(yùn)行成本低廉，20個(gè)菌種包括鏈球菌也能保存至少24個(gè)月，且無(wú)變異現(xiàn)象產(chǎn)生[4]。而腦炎奈瑟氏菌在以上4中保存方法中存活率的很低，這可能是因?yàn)殛惻f培養(yǎng)物中細(xì)菌自身所產(chǎn)生的有害代謝產(chǎn)物過(guò)多，使其在保存過(guò)程中容易死亡，因此，在以后的工作中需要繼續(xù)摸索和尋找腦炎奈瑟氏菌保存的簡(jiǎn)便和有效的方法。總之，除半固體保存法外，其余三種方法均適用于微生物學(xué)教學(xué)和科研常用菌種的保存。

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