第一篇：生化實(shí)驗(yàn)

1．火

（1）酒精及其它可溶于水的液體著火時(shí)，可用水滅火

（2）汽油、乙醚、甲苯等有機(jī)溶劑著火時(shí)，應(yīng)用石棉布或砂土撲滅，絕對不能用水，否則反而會擴(kuò)大燃燒面積。

（3）電起火，不能用水和二氧化碳滅火器，應(yīng)切斷電源或用四氯化碳滅火器。2．燒傷

（1）強(qiáng)堿燒傷：先用大量水沖洗，再用5%的硼酸溶液和2%的乙酸溶液沖洗。（2）強(qiáng)酸燒傷：先用大量水沖洗，再用5%的碳酸氫鈉或5%的氫氧化銨沖洗。

氨基酸的分離鑒定紙層析法

紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。層析溶劑由有機(jī)溶劑和水組成。物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置是用Rf值（比移）來表示的：

在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)；層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)利用紙層析法分離氨基酸。

在操作過程中，手不要摸濾紙。點(diǎn)樣直徑不超過3mm。

點(diǎn)樣的一端朝下, 擴(kuò)展劑的液面需低于點(diǎn)樣線1cm。

即時(shí)取出濾紙, 以免出現(xiàn)氨基酸層析跑到濾紙的外面不能檢測。

蛋白質(zhì)及氨基酸的呈色反應(yīng) 雙縮脲反應(yīng)

紫紅色

肽鍵 可用于蛋白質(zhì)的定性或定量測定 一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。茚三酮反應(yīng)

除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有α—氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。此反應(yīng)的適宜pH為5~7，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時(shí)甚至不顯色。

與茚三酮呈陽性反應(yīng)的不一定就是蛋白質(zhì)或氨基酸。在定性、定量測定中，應(yīng)嚴(yán)防干擾物存在。該反應(yīng)十分靈敏，1∶1 500 000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應(yīng)，是一種常用的氨基酸定量測定方法。茚三酮反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個(gè)水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。黃色反應(yīng)

含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成橙黃色的硝醌酸鈉。苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。

坂口反應(yīng)

與精氨酸反應(yīng)呈紅色，精氨酸是唯一呈此反應(yīng)的氨基酸，反應(yīng)極為靈敏 醋酸鉛反應(yīng)

蛋白質(zhì)分子中常含有半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白質(zhì)在強(qiáng)堿條件下，可分解形成硫化鈉。硫化鈉和醋酸鉛反應(yīng)生成黑色的硫化鉛沉淀。若加入濃鹽酸，就生成有臭味的硫化氫氣體。

蛋白質(zhì)分子中常含有半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白質(zhì)在強(qiáng)堿條件下，可分解形成硫化鈉。硫化鈉和醋酸鉛反應(yīng)生成黑色的硫化鉛沉淀。若加入濃鹽酸，就生成有臭味的硫化氫氣體。

蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測定和沉淀反應(yīng)

當(dāng)溶液的pH達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒上正負(fù)電荷的數(shù)目相等，在電場中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動，也不向陽極移動，此時(shí)溶液pH值稱為此種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制成各種不同pH值的緩沖液。向緩沖液溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)

在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒可因失去電荷和脫水而沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類。

（1）可逆的沉淀的反應(yīng)

此時(shí)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來的溶劑中，并保持其天然性質(zhì)而不變性。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時(shí)間作用于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時(shí)，常利用此類反應(yīng)。

（2）不可逆沉淀反應(yīng)

此時(shí)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固，蛋白質(zhì)與重金屬離子或某些有機(jī)酸的反應(yīng)都屬于此類。

蛋白質(zhì)變性后，有時(shí)由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。

考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度

考馬斯亮藍(lán)G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰(max)位置由465 nm變?yōu)?95 nm，溶液顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。通過測定595 nm處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。靈敏度高，測定快速簡便，干擾物質(zhì)少。

微量凱氏定氮法

有機(jī)物與濃硫酸共熱，有機(jī)氮轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)氮（氨），氨與硫酸作用生成硫酸氨，后者與強(qiáng)堿作用釋放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此過量酸液被中和的程度，即可計(jì)算出樣品的含氮量。

中和程度用滴定法來判斷，分回滴法和直接法兩種。

（1）回滴法：用過量的標(biāo)準(zhǔn)酸吸收氨，其剩余的酸可用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，由鹽酸量減去滴定所耗NaOH的量即為被吸收的氨之量。此法采用甲基紅做指示劑。

（2）直接法：用硼酸作為氨的吸收溶液，結(jié)果使溶液中[H+]降低，混合指示劑（PH4.3－5.4），黑紫色變?yōu)榫G色。再用標(biāo)準(zhǔn)酸來滴定，使硼酸恢復(fù)到原來的氫離子濃度為止，指示劑出來淡紫色為終點(diǎn)，此時(shí)所耗的鹽酸量即為氨的量。

樣液：1g卵清蛋白溶于0.9%NaCl液，并稀釋至100ml。如有不溶物，離心取上清液備用。

醋酸纖維薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)

本實(shí)驗(yàn)是以醋酸纖維素薄膜作為支持體的區(qū)帶電泳。

方法是將少量新鮮血清用點(diǎn)樣器點(diǎn)在浸有緩沖液的乙酸纖維素薄膜上，薄膜兩端經(jīng)過濾紙與電泳槽中緩沖液相連，所用緩沖液pH值為8.6，血清蛋白質(zhì)在此緩沖液中均帶負(fù)電荷，在電場中向正極泳動。

由于血清中不同蛋白質(zhì)帶有的電荷數(shù)量及分子量不同而泳動速度不同。帶電荷多及分子量小者泳動速度快；帶電荷少及分子量大者泳動速度慢，從而彼此分離。

電泳后，將薄膜取出，經(jīng)染色和漂洗，薄膜上顯示出五條藍(lán)色區(qū)帶，每條帶代表一種蛋白質(zhì)，按泳動快慢順序，一般經(jīng)漂洗后，薄膜上可呈現(xiàn)清晰的5條區(qū)帶，由正極端起，依次為清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。

經(jīng)洗脫比色觀察不同蛋白質(zhì)的區(qū)帶。

1、醋酸纖維素薄膜一定要充分浸透后才能點(diǎn)樣。點(diǎn)樣后電泳槽一定要密閉。電流不宜過大，以防止薄膜干燥，電泳圖譜出現(xiàn)條痕。

2、緩沖溶液離子強(qiáng)度不應(yīng)小于0.05或大于0.07。因?yàn)檫^小可使區(qū)帶拖尾，過大則使區(qū)帶過于緊密。

3、電泳槽中緩沖液要保持清潔(數(shù)天過濾)兩極溶液要交替使用；最好將連接正、負(fù)極的線路調(diào)換使用。

4、通電過程中，不準(zhǔn)取出或放入薄膜。通電完畢后，應(yīng)先斷開電源后再取薄膜，以免觸電。

酶的特性

溫度對酶活力的影響

大多數(shù)動物酶的最適溫度為37－40℃，植物酶的最適溫度為50－60℃。高溫失活，低溫能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。pH對酶活性的影響

唾液淀粉酶的最適pH約為6.8。唾液淀粉酶的活化和抑制

酶的活性受活化劑或抑制劑的影響。氯離子為唾液淀粉酶的活化劑，銅離子為其抑制劑。

血糖的定量測定

動物血液中的糖主要是葡萄糖，其含量較恒定。用硫酸鋅和氫氧化鈉除去被檢測血中的蛋白質(zhì)制成無蛋白血濾液。當(dāng)將血濾液與標(biāo)準(zhǔn)鐵氰化鉀溶液共熱時(shí),一部分鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，并與鋅離子生成不溶性化合物。

向混合物中加入碘化物后，用硫代硫酸鈉溶液滴定所釋放的碘。即可知剩余的鐵氰化鉀量。血糖越多，剩余的鐵氰化鉀越少，所消耗的硫代硫酸鈉也越少。硫代硫酸鈉溶液用量與血糖的關(guān)系可以由經(jīng)驗(yàn)確定下來的數(shù)字表查出。對照組要多一些，且要先查表再相減

脂肪酸的β－氧化

樣品中丙酮的含量=(V1-V2)x C Na2S2O3 x 1/6 V1—滴定對照所消耗的Na2S2O3 的體積 V2—滴定樣品所消耗的Na2S2O3 的體積 C—Na2S2O3 的濃度

維生素C的定量測定

2，6-二氯酚靛酚滴定法

用藍(lán)色的堿性染料標(biāo)準(zhǔn)溶液,對含維生素 C的酸性浸出液進(jìn)行氧化還原滴定,染料被還原為無色,當(dāng)?shù)竭_(dá)滴定終點(diǎn)時(shí),多余的染料在酸性介質(zhì)中則表現(xiàn)為淺紅色,如無其他干擾物質(zhì)存在，樣品提取液所還原的標(biāo)準(zhǔn)染料量與樣品中所含的還原性抗壞血酸量成正比。

過氧化物酶的作用 過氧化物酶能催化過氧化氫釋出新生氧以氧化某些酚類和胺類物質(zhì)，例如氧化溶于水中的焦性沒食子酸生成不溶于水的焦性沒食子橙（橙紅色）；氧化愈創(chuàng)木脂中的愈創(chuàng)木酸成為藍(lán)色的愈創(chuàng)木酸的臭氧化物。

目前測定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測定方法：

物理性質(zhì)：紫外分光光度法。

化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法等。染色性質(zhì)：考馬斯亮藍(lán)染色法、銀染法。其他性質(zhì)：熒光法。

一、凱氏定氮法： 根據(jù)蛋白質(zhì)的含氮量來測定蛋白質(zhì)的含量

公式:每g樣品中含氮克數(shù) × 6.25 ×100

二、比色法：利用蛋白質(zhì)與不同試劑的呈色反應(yīng)，測定蛋白質(zhì)的含量，如雙縮尿法和酚試劑法（lowry’s method）。

三、紫外分光光度法：利用蛋白質(zhì)對280nm紫外光有最大的吸光度而采用

第二篇：生化實(shí)驗(yàn)計(jì)劃

2016-2017學(xué)年第一學(xué)期生物化學(xué)教研室實(shí)驗(yàn)室工作計(jì)劃

一、指導(dǎo)思想

堅(jiān)持以鄧小平理論和“三個(gè)代表”的重要思想及科學(xué)發(fā)展觀為指導(dǎo)，踐行社會主義核心價(jià)值觀,開展教育教學(xué)改革，全力推進(jìn)以高等衛(wèi)生職業(yè)教育為核心的素質(zhì)教育，抓好教育教學(xué)管理工作。

二、工作計(jì)劃

（一）實(shí)驗(yàn)室日常管理計(jì)劃

1、牢固樹立“教學(xué)中心”意識，對實(shí)驗(yàn)室的儀器耗材進(jìn)行精確登記備案，以便為《生物化學(xué)》實(shí)驗(yàn)做好后勤服務(wù)。

2、嚴(yán)格執(zhí)行儀器使用人使用儀器必須登記的規(guī)章制度。

3、嚴(yán)格執(zhí)行及時(shí)更新實(shí)驗(yàn)耗材的規(guī)章制度。

4、嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)安全條例，做好實(shí)驗(yàn)室安全意識宣講，做到實(shí)驗(yàn)室安全零事故。

5、嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)室值日制度。

6、嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生制度，保持實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生整潔，給學(xué)生提供一個(gè)良好的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

7、嚴(yán)格執(zhí)行學(xué)院規(guī)定及時(shí)批改實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

8、切實(shí)做好實(shí)驗(yàn)課的示教工作。

（二）實(shí)驗(yàn)室?guī)熧Y隊(duì)伍建設(shè)

1、開展政治學(xué)習(xí)和業(yè)務(wù)學(xué)習(xí)，特別是學(xué)習(xí)社會主義核心價(jià)值體系和人才培養(yǎng)水平評估標(biāo)準(zhǔn)，提高教師的政治品德和業(yè)務(wù)素養(yǎng)，組織教師開展高等衛(wèi)生職業(yè)教育理念討論，切實(shí)轉(zhuǎn)變教學(xué)理念，改變教學(xué)方式，提高教學(xué)水平。

2、加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教師的管理和培養(yǎng)，提高實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)的準(zhǔn)備能力和指導(dǎo)水平。

3、加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教師的安全責(zé)任意識。

生物化學(xué)教研室 2016年9月

第三篇：生化實(shí)驗(yàn)心得

生化實(shí)驗(yàn)心得

劉欣怡

201100140057 2011級生物基地班

我很喜歡做實(shí)驗(yàn)，并且樂于鍛煉自己的動手能力。

本學(xué)期的生化實(shí)驗(yàn)，雖然只從第二周上到第十五周，但是我收獲了很多并且留下了深刻的印象。對于本次實(shí)驗(yàn)心得的撰寫，我將分為以下3個(gè)部分來進(jìn)行：本學(xué)期實(shí)驗(yàn)回顧、本學(xué)期實(shí)驗(yàn)總結(jié)以及對于生化實(shí)驗(yàn)課的支持和建議。

一、本學(xué)期實(shí)驗(yàn)回顧：

本學(xué)期的生化實(shí)驗(yàn)課上，我們一共進(jìn)行了11次實(shí)驗(yàn)，分別是Folin-酚試劑法測定血清蛋白質(zhì)含量、酵母RNA的提取、醋酸纖維薄膜電泳、紫外吸收法測定RNA含量、聚酰胺薄膜層析、纖維素酶活力的測定（三硝基水楊酸法）、還原糖和總糖含量的測定（三硝基水楊酸法）、酶最適PH的測定、費(fèi)林試劑熱滴定糖、肌糖原酵解作用、微量凱氏定氮法。這些實(shí)驗(yàn)具有代表性，是典型的生化實(shí)驗(yàn)。在這些實(shí)驗(yàn)中，涵蓋了以前無機(jī)實(shí)驗(yàn)和有機(jī)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)操作，還有全新的實(shí)驗(yàn)操作以及實(shí)驗(yàn)儀器。

在這學(xué)期的生化實(shí)驗(yàn)課上，我既復(fù)習(xí)并熟練了大一無機(jī)實(shí)驗(yàn)和有機(jī)實(shí)驗(yàn)的基本實(shí)驗(yàn)操作和儀器（比如移液管、滴定管、蒸餾等），又學(xué)習(xí)并掌握了許多新操作以及新儀器的使用，比如紫外分光光度計(jì)、離心機(jī)、聚酰胺薄膜、熱滴定、凱氏定氮儀器等。最重要的是，我學(xué)習(xí)并掌握了一些重要的實(shí)驗(yàn)方法和原理，比如Folin-酚試劑法、紫外吸收法、三硝基水楊酸法、費(fèi)林試劑與糖的反應(yīng)、微量凱氏定氮法等。掌握了這些實(shí)驗(yàn)原理以及方法，有利于我們在以后中靈活運(yùn)用設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。

總體來說，本學(xué)期生化實(shí)驗(yàn)教會了我測定蛋白質(zhì)、糖、核酸的方法，電泳和層析分離物質(zhì)、如何測定酶的相關(guān)特性、驗(yàn)證肌糖原酵解作用、如何提取RNA。

二、本學(xué)期實(shí)驗(yàn)總結(jié)

通過這學(xué)期的生化實(shí)驗(yàn)，我的實(shí)驗(yàn)技能的到了大大地提升，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中的細(xì)節(jié)、注意事項(xiàng)以及老師拓展的知識令我獲益匪淺，也讓我深深地認(rèn)識到科學(xué)是非常嚴(yán)謹(jǐn)?shù)模绕涫窃谧鰧?shí)驗(yàn)的時(shí)候，要全神貫注，井井有條，否則很容易出差錯(cuò)，而這個(gè)小小的差錯(cuò)很有可能就使實(shí)驗(yàn)前功盡棄，既耽誤時(shí)間又浪費(fèi)試劑。

回顧這一學(xué)期我的實(shí)驗(yàn)課程，每一次我都能完成實(shí)驗(yàn)任務(wù)。大多數(shù)都比較順利，小組內(nèi)兩人也大多配合默契，但是有一些美中不足的地方。有的一些實(shí)驗(yàn)比較麻煩，實(shí)驗(yàn)步驟較為繁瑣，我們在做實(shí)驗(yàn)時(shí)偶爾會產(chǎn)生不耐煩的思想，只想著抓緊結(jié)束，但是在這種時(shí)候往往更容易出差錯(cuò)。我有兩次記憶很深，一次是在測定纖維素酶活力（三硝基水楊酸法）時(shí)，沒能及時(shí)貼上空白標(biāo)簽，導(dǎo)致又重新制作空白，拜拜浪費(fèi)了時(shí)間；另一次是在鑒定肌糖原酵解作用時(shí)，實(shí)驗(yàn)步驟較為繁瑣，并且老師對黑板上的簡易實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行了多個(gè)補(bǔ)充，其中一點(diǎn)是要在水浴后取出大塊肉再加下一步驟的試劑，結(jié)果我們當(dāng)時(shí)產(chǎn)生了不耐煩情緒，就直接加了試劑而沒有取出大肉塊。對于這兩次情況，雖然對最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有產(chǎn)生什么明顯的影響，但是，它實(shí)實(shí)在在體現(xiàn)了自己的操作并不是很嚴(yán)謹(jǐn)，需要注意和努力。

在本學(xué)期生化實(shí)驗(yàn)報(bào)告的撰寫中，我重點(diǎn)注意老師強(qiáng)調(diào)的實(shí)驗(yàn)分析部分。上課認(rèn)真聽老師的實(shí)驗(yàn)講解并認(rèn)真記錄有關(guān)的可能實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。在課后撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告時(shí)對這些點(diǎn)重點(diǎn)分析和總結(jié)，有時(shí)甚至是查找相關(guān)資料然后再進(jìn)行分析。通過這一些列的做法，我的實(shí)驗(yàn)分析能力得到了提升，我能在討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果或者實(shí)驗(yàn)操作時(shí)找到更好、更精確的切入點(diǎn)，能得出更好的結(jié)論。

同時(shí)，本學(xué)期老師將我們分為兩人一組來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，兩人之間的磨合和合作是一種鍛煉，對今后很有幫助。

三、對于生化實(shí)驗(yàn)課的支持和建議

我非常感謝老師在這一學(xué)期中的辛勤勞動。老師在課前為我們做好實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備很不容易，配試劑等都很辛苦。謝謝老師您了。

我覺得咱們的額生化實(shí)驗(yàn)課設(shè)計(jì)的挺好的。兩人一組可以分工合作，加快實(shí)驗(yàn)效率，同時(shí)又避免了因?yàn)橥M同學(xué)人數(shù)多而有的同學(xué)無事可做的現(xiàn)象。老師在課上講解實(shí)驗(yàn)時(shí)，有關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟、實(shí)驗(yàn)可能結(jié)果、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)的分析、講解和拓展令我獲益匪淺，有利于培養(yǎng)我的實(shí)驗(yàn)思維并且拓寬了知識視野。

建議方面，我想和老師提的一點(diǎn)建議其實(shí)是有關(guān)實(shí)驗(yàn)器材方面的。對于老師所提到的有關(guān)節(jié)約試劑、減少材料浪費(fèi)等事項(xiàng)我非常贊同，并且大多數(shù)時(shí)候器材和試劑都很全（這和大一的無機(jī)實(shí)驗(yàn)和有機(jī)實(shí)驗(yàn)相比條件進(jìn)步了很多），只是希望咱們的一些其他實(shí)驗(yàn)儀器能更全面一點(diǎn)，舉一個(gè)例子，可以使用的紫外分光光度計(jì)只有3臺，有些過少，實(shí)驗(yàn)中要等待的時(shí)間較長，并且有的儀器還不是很準(zhǔn)確，對于我們的實(shí)驗(yàn)造成了一定的困擾，希望老師能將實(shí)驗(yàn)室內(nèi)有些問題的儀器同一修一修。

總之，我很喜歡咱們的生化實(shí)驗(yàn)課，并且從中學(xué)到了很多知識、實(shí)驗(yàn)方法和應(yīng)用，鍛煉了實(shí)驗(yàn)操作，形成了實(shí)驗(yàn)要耐心、細(xì)心、恒心的觀念。同時(shí)還培養(yǎng)了團(tuán)隊(duì)意識和合作觀念。我獲益匪淺。

第四篇：生化實(shí)驗(yàn)總結(jié)

一、實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1.關(guān)于糖：本學(xué)期我們學(xué)習(xí)了兩種總糖樣品處理方法（面粉總糖酸水解以及肌糖原無氧酵解）以及兩種測定還原糖含量的方法（斐林試劑熱滴定及3，5-二硝基水楊酸法）。還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來，對沒有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計(jì)）。

一種是費(fèi)林試劑熱滴定定糖法：在沸熱條件下,用還原糖溶液滴定一定量的費(fèi)林試劑時(shí), 將費(fèi)林試劑中的銅離子還原為氧化亞銅, 以亞甲基藍(lán)為指示劑, 稍過量的還原糖立即將藍(lán)色的氧化型亞甲基藍(lán)還原為無色的還原型亞甲基藍(lán), 指示滴定終點(diǎn)。

另一個(gè)是3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖：還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計(jì)，在540nm波長下測定光密度值，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。

關(guān)于肌糖元酵解

2.關(guān)于蛋白質(zhì)含量測定：本學(xué)期我們學(xué)習(xí)了醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白、氨基酸聚酰胺薄膜層析，以及利用溶解度差異提取血清中不同蛋白，并通過 BCA法、Folin酚法、凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量

3.關(guān)于酶活性學(xué)習(xí)了纖維素酶活力測定以及酶最適PH測定 4.關(guān)于稀堿法酵母核糖核酸提取以及紫外吸收法測定濃度

二、關(guān)于感悟 經(jīng)過半年的生化實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)讓我受益菲淺。在生化實(shí)驗(yàn)課即將結(jié)束之時(shí)，總結(jié)這學(xué)期的收獲與不足。取之長、補(bǔ)之短，在今后的學(xué)習(xí)和工作中有所受用。

三、這半年的生化實(shí)驗(yàn)主要有菲林試劑熱滴定定糖法、folin-酚法測蛋白、稀堿法提取酵母RNA、醋酸纖維薄膜電泳、RNA定量測定-UV吸收法、纖維素酶活力的測定、最適PH選取、肌糖元的酵解作用、N-末端氨基酸殘基的測定--DNS-CL法柱層析分離色素、凱式定氮法等實(shí)驗(yàn)。

在這些實(shí)驗(yàn)中，凱式定氮法是給我印象最深的一個(gè)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)檫@個(gè)實(shí)驗(yàn)使我認(rèn)識了改良式凱式蒸餾儀的基本結(jié)構(gòu)，同樣的也讓我透過這次實(shí)驗(yàn)掌握了凱式定氮法的操作技術(shù)。在這次實(shí)驗(yàn)中，我和我的同組者-韓文志犯了一些錯(cuò)誤，而且是很不就應(yīng)犯的錯(cuò)誤，我們都忘了在做實(shí)驗(yàn)時(shí)要加入新的沸石，這是個(gè)很低級的錯(cuò)誤，差點(diǎn)引起溶液的暴沸。透過這次錯(cuò)誤我認(rèn)識到，很多知識，即使是老師在怎樣說，它也只是理論，當(dāng)我們不能把它應(yīng)用到實(shí)踐中去時(shí)，它對我們都是毫無好處的。此刻更深的認(rèn)識到了理論結(jié)合實(shí)際的觀點(diǎn)。在這次實(shí)驗(yàn)中我們損壞了改良式凱式蒸餾儀，并且賠了錢，錢不是問題，重要的是操作的問題，我覺得我們在做實(shí)驗(yàn)時(shí)還是對儀器不是很熟悉，做實(shí)驗(yàn)時(shí)不認(rèn)真。

還有一個(gè)是柱層析分離色素，這個(gè)實(shí)驗(yàn)主要是掌握吸附層析的原理和操作技術(shù)，我記得這次實(shí)驗(yàn)我是第二個(gè)到的實(shí)驗(yàn)室，當(dāng)時(shí)還很有成就感，進(jìn)來后就稱菠菜，還有研磨，這是很累人的活，我覺得，因?yàn)橄氚阉心サ暮眯窒?/p>

快點(diǎn)做實(shí)驗(yàn)，于是就一向磨一向磨，直到做下一步時(shí)才覺得手腕有點(diǎn)累。我記得在加棉花時(shí)，由于不明白就應(yīng)加多厚，提取色素時(shí)還很是膽戰(zhàn)心驚的。我覺得在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，裝柱這一步是很重要的，于是我們很留意的裝，直到柱面很平。直到最后，分離色素后，看到我們的色帶分離的很好，很是高興。

半年實(shí)驗(yàn)做下來，最“苦”的要數(shù)“菲林試劑熱滴定定糖法”這個(gè)實(shí)驗(yàn)了。這個(gè)實(shí)驗(yàn)要求我們正確掌握滴定管的使用方法和熱滴定的終點(diǎn)。由于全部滴定過程務(wù)必在沸騰狀態(tài)下快速進(jìn)行，而且終點(diǎn)不容易把握，我們滴了好幾十次才確定了終點(diǎn)。當(dāng)時(shí)我的同組者-韓文志已經(jīng)被火烤的不行了。

在這半年的十幾次的實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)中，我受益頗多。毫無疑問，它培養(yǎng)了我的動手潛力。每個(gè)實(shí)驗(yàn)我都會親自去做，不放下每次鍛煉的機(jī)會。經(jīng)過這半年，我的動手潛力有了明顯的提高；它讓我養(yǎng)成了課前預(yù)習(xí)的好習(xí)慣。一向以來就沒能養(yǎng)成課前預(yù)習(xí)的好習(xí)慣（雖然一向明白課前預(yù)習(xí)是很重要的），但經(jīng)過這半年，讓我不僅僅深深的懂得課前預(yù)習(xí)的重要，更領(lǐng)會了課前預(yù)習(xí)的好處。只有在課前進(jìn)行了認(rèn)真的預(yù)習(xí)，在做實(shí)驗(yàn)時(shí)效率才會更高，才能收獲的更多、掌握的更多；它還提高了我處理數(shù)據(jù)的潛力；做實(shí)驗(yàn)就會有數(shù)據(jù)，有數(shù)據(jù)就要處理，數(shù)據(jù)處理的是否得當(dāng)將直接影響實(shí)驗(yàn)成功與否。

半年實(shí)驗(yàn)雖然收獲很多，但在這中間，我也發(fā)現(xiàn)了我存在的很多不足。我的動手潛力還不夠強(qiáng)，當(dāng)有些實(shí)驗(yàn)需要很強(qiáng)的動手潛力時(shí)我還不能從容應(yīng)對；我的探索方式還有待改善，當(dāng)應(yīng)對一些復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)時(shí)我還不能很快很好的完成；我的數(shù)據(jù)處理潛力還得提高，當(dāng)眼前擺著一大堆復(fù)雜數(shù)據(jù)時(shí)我處理的方式及潛力還不足，不能用最佳的處理手段使實(shí)驗(yàn)誤差減小到最小程度……總之，生化實(shí)驗(yàn)課讓我收獲頗豐，同時(shí)也讓我發(fā)現(xiàn)了自身的不足。在實(shí)驗(yàn)課上學(xué)得的，我將發(fā)揮到其它中去，也將在今后的學(xué)習(xí)和工作中不斷提高、完善；在此間發(fā)現(xiàn)的不足，我將努力改善，透過學(xué)習(xí)、實(shí)踐等方式不斷提高，克服那些不應(yīng)成為學(xué)習(xí)、獲得知識的障礙。在今后的學(xué)習(xí)、工作中有更大的收獲，在不斷地探索中、在無私的學(xué)習(xí)、奉獻(xiàn)中實(shí)現(xiàn)自己的人身價(jià)值！

第五篇：生化實(shí)驗(yàn)教案

生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)（下）

生 物 化 學(xué) 實(shí) 驗(yàn)（下）

實(shí)驗(yàn)三 離子交換柱層析法分離氨基酸

生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)（下）

華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 2012級生物化學(xué)小老師

第三組

離子交換柱層析法分離氨基酸

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1.學(xué)習(xí)離子交換樹脂分離氨基酸的基本原理。2.掌握離子交換柱層析的基本操作。3.掌握氨基酸和茚三酮顯色機(jī)理。

【實(shí)驗(yàn)原理】

1.離子交換層析原理

離子交換法是通過帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換而達(dá)到分離目的的方法。

有些高分子物質(zhì)含有一些可以解離的基團(tuán)，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的離子產(chǎn)生交換反應(yīng)，如：

或

這類高分子物質(zhì)統(tǒng)稱為離子交換劑，離子交換劑是一類具有離子交換功能的高分子材料。功能基團(tuán)由固定在骨架上的帶電基團(tuán)與可進(jìn)行交換的能移動離子兩部分組成，二者所帶電荷相反，以靜電作用結(jié)合。可進(jìn)行交換的離子稱為反離子或抗衡離子，這種反離子可與溶液中帶

生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)（下）

同種電荷的離子進(jìn)行交換反應(yīng)。因離子交換反應(yīng)是可逆的，在一定條件下被交換的離子也可以“解吸”，使離子交換劑又恢復(fù)到原來的離子形式，所以離子交換劑通過交換和再生可以反復(fù)使用。其中使用的最普遍的是離子交換樹脂。由于一定離子交換劑對于不同離子的靜電引力不同，因此在洗脫過程中，不同的離子在離子交換柱上的遷移速度也不同，最后完全分離。

選擇適當(dāng)?shù)臈l件，可使一些溶質(zhì)分子變成離子態(tài)，通過靜電作用結(jié)合到離子交換劑上，而另一些物質(zhì)則不能被交換，這兩類物質(zhì)即被分離。帶同種電荷的不同離子都可以結(jié)合到同一介質(zhì)上，但由于各自所帶電量不同，與介質(zhì)的結(jié)合牢度不同，可改變洗脫條件使它們依次先后被洗脫，從而達(dá)到分離目的。

離子交換層析是一種基于氨基酸電荷行為的層析方法。本實(shí)驗(yàn)采用磺酸型陽離子交換樹脂（732型）分離酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI2.97）和堿性氨基酸賴氨酸（Lys，pI9.74）的混合液。氨基酸是兩性電解質(zhì)，分子上所帶的凈電荷取決于氨基酸的等電點(diǎn)和溶液的pH值。在pH5.3條件下，因?yàn)閜H值低于Lys的PI值，Lys可解離成陽離子結(jié)合在樹脂上；Asp可解離成陰離子，不被樹脂吸附而流出層析柱。在pH12條件下，因pH值高于Lys的pI值Lys可解離成陰離子從樹脂上被交換下來。這樣通過改變洗脫液的pH值可使它們被分別洗脫而達(dá)到分離的目的。2.茚三酮反應(yīng)機(jī)理

茚三酮反應(yīng)是指在加熱條件下，氨基酸或肽與茚三酮反應(yīng)生成紫色（與羥脯氨酸或脯氨酸反應(yīng)生成（亮黃色）化合物的反應(yīng)。

該紫色化合物在570nm處有最大光吸收，所以可以利用分光光度計(jì)測量其含量。

由于該反應(yīng)靈敏度高，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于氨基酸定性和定量的分析，國內(nèi)的大部分教材認(rèn)為其反應(yīng)機(jī)理為：

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但是大量實(shí)驗(yàn)表明而且大部分的學(xué)者認(rèn)為茚三酮顯色反應(yīng)生成的有色物質(zhì)是混合物而不是單一組分。

茚三酮顯色反應(yīng)受pH，茚三酮試劑的配制方法和濃度，氨基酸種類和濃度，反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，冷卻時(shí)間，離子強(qiáng)度等都有較大影響。特別要注意的是pH對顯色反應(yīng)的影響特別大，且該反應(yīng)在一個(gè)小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

【實(shí)驗(yàn)器材和試劑】

一、實(shí)驗(yàn)器材

層析柱（20cm*1cm）；鐵架臺；恒流泵；部分收集器；分光光度計(jì)；移液槍；恒溫水浴鍋；試管；玻璃棒；燒杯；試管架。

二、實(shí)驗(yàn)試劑

①732型陽離子交換樹脂（100-200目）

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②2mol/L氫氧化鈉溶液，1mol/L氫氧化鈉溶液； ③2mol/L鹽酸溶液，0.1mol/L鹽酸溶液； ④標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液

天冬氨酸、賴氨酸均配制成2mg/mL的0.1mol/L鹽酸溶液； ⑤洗脫液

檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖溶液（pH5.3）

取檸檬酸14.25g，氫氧化鈉9.30g和濃鹽酸5.25mL溶于少量水后，定容至500mL，冰箱保存

注：在檸檬酸緩沖液中加入0.1%酚溶液可防止長霉。在室溫較高的夏季，配制緩沖溶液用的蒸餾水必須是新鮮蒸餾水，配前煮沸，配好后在4℃保存。0.01mol/LNaOH溶液（pH12）

取0.4gNaOH固體用適量蒸餾水溶解后，定容至1L ⑥顯色劑

取0.5g茚三酮溶于75mL乙二醇單甲醚中，加水定容至100mL。待測樣品

混合氨基酸溶液：將2mg/mL天冬氨酸、賴氨酸溶液按1:2.5的比例混合，混合后再以1:1的比例用0.1mol/L鹽酸溶液稀釋。

【操作步驟】

1.樹脂的處理

對于市售干樹脂，先是經(jīng)水充分溶脹后，經(jīng)浮選得到顆粒大小合適的樹脂，然后加4倍量的2mol/LHCl溶液浸泡1小時(shí)，傾去酸液，用蒸餾水洗至中性，然后用2mol/LNaOH溶液處理，做法同上。以1mol/LNaOH溶液浸泡樹脂一小時(shí)轉(zhuǎn)化為鈉型，用蒸餾水洗至中性，最后用欲使用的檸檬酸緩沖液浸泡，過剩的樹脂浸入1mol/LNaOH溶液中保存，以防細(xì)菌生長。2 裝柱

取層析柱一支，垂直固定在鐵架臺上，(實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行檢漏，小老師會在實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行演示)用夾子夾緊柱底出口處橡膠管，在柱內(nèi)加2~3cm高的檸檬酸緩沖液。將攪拌成懸浮狀的樹脂沿柱內(nèi)壁緩慢倒入。待樹脂在柱底部逐漸沉降時(shí)，慢慢打開柱底出口處鐵夾，繼續(xù)加入樹脂懸浮液，直至樹脂高度到層析柱高度的3/4處。

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注意：要注意裝柱過程的連續(xù)性，裝好的層析柱應(yīng)均勻，防止產(chǎn)生氣泡，節(jié)痕或界面，否則會對實(shí)驗(yàn)有較大的影響，必須重新裝柱。3平衡

層析柱裝好后，再緩慢沿管壁加入 適量緩沖液至樹脂床面以上2~3cm處，接上橫流泵，用檸檬酸緩沖液以0.5mL/min的流速進(jìn)行平衡，用pH試紙測量流出液pH，直至流出液的pH與緩沖液的pH相等。

注意：調(diào)節(jié)流速前要排除恒流泵與柱間連接管內(nèi)所有氣泡，以免影響流速，影響實(shí)驗(yàn)效果。調(diào)節(jié)流速時(shí)統(tǒng)一將流速調(diào)節(jié)為10滴/min,平衡時(shí)間一般為15分鐘。4加樣

關(guān)閉恒流泵，打開層析柱上端管口，緩慢打開柱底出口，小心放出層析柱內(nèi)的液體至柱內(nèi)液體的凹液面恰好與樹脂上液面相齊，立即關(guān)閉下端出口（注意：不要使液面下降至樹脂表面以下）。用移液槍吸取氨基酸混合樣品0.5ml，沿靠近樹脂表面的管壁緩慢加入，注意不要沖壞樹脂表面。加樣后打開柱底止水夾，使液體盡可能緩慢地流下至液體凹液面恰與樹脂表面相平，立即關(guān)閉止水夾。再用膠頭滴管吸取0.5ml緩沖液清洗柱內(nèi)壁，打開止水夾放出液體，使液體下表面與樹脂表面相平，按照此法清洗2次。然后小心加入緩沖液離柱頂部1cm為止，并將層析柱與恒流泵和部分收集器相連。

注意：樣品體積不要過大，樣品的含量不能超過層析柱內(nèi)離子交換能力，否則影響分離效果。5.洗脫

① 緩沖液洗脫：用檸檬酸緩沖液（pH5.3）以6s/滴的流速開始洗脫，用試管收集洗脫液，每管收集1ml，收集1-10號管。(② 0.01mol/L NaOH溶液（pH12）洗脫：關(guān)閉恒流泵和止水夾，將檸檬酸緩沖液更換為0.01mol/L的NaOH溶液，打開止水夾進(jìn)行洗脫，同法收集11-40管。收集完畢后，關(guān)閉止水夾和恒流泵。

注意：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中要多注意層析柱，避免使柱內(nèi)液體流干，否則實(shí)驗(yàn)即為失敗。6.測定

分別向60管收集液中加入1.5ml檸檬酸緩沖液，混勻后再加入1ml茚三酮顯色劑，混勻。沸水浴15min后取出，冷卻至室溫，在1h內(nèi)用分光光度計(jì)在570nm下以蒸餾水為空白管進(jìn)行比色，測定各管的吸光度值。

注意：比色時(shí)盡量避免將液體沾在手上或衣服上。7.樹脂再生

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層析柱使用幾次后，需將樹脂取出用1mol/LNaOH溶液洗滌，再用蒸餾水洗至中性后可反復(fù)使用。

注意：在本次實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后需將樹脂倒至指定燒杯中。

【結(jié)果與分析】

以吸光度值為縱坐標(biāo)，收集的管數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制出洗脫曲線。以已知兩種氨基酸的純?nèi)芤簶悠罚瓷鲜龇椒ê蜅l件分別操作，將得到的洗脫曲線與混合氨基酸的洗脫曲線對照，可確定2個(gè)峰的大致位置及各峰為何種氨基酸。

【思考題】

1.對于新樹脂我們做的處理是先用2mol/LHCl攪拌半小時(shí)，然后用蒸餾水洗至中性，再用2mol/LNaOH攪拌半小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，最后用1mol/LHCl攪拌半小時(shí)，還用蒸餾水洗至中性。請分析原因。

2.所加樹脂的高度為層析柱高度的3/4，請思考樹脂過高或過低對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有何影響，試分析原因。

3.本實(shí)驗(yàn)加的樣品為天冬氨酸和賴氨酸，若再加一個(gè)組氨酸，請估計(jì)其峰值的位置，說明理由。