第一篇：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)步驟總結(jié)超全（共）

一 目的基因的獲得 細(xì)菌基因組DNA的提取

（一）儀器 1）臺式高速離心機(jī) 2）恒溫水浴箱 3）槍式移液器 4）滅菌的EP管和Tip頭

（二）試劑

1）溶液1: 25% 蔗糖

50mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 50mmol/L

EDTA，pH8.0 500ug/ml

溶菌酶（現(xiàn)用現(xiàn)配）

100ug/ml

RNase 2)溶液Ⅱ：100mmol/L

Tris-Hcl，pH8.0

1%

SDS

400ug/ml

蛋白酶K 3）酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）4）氯仿：異戊醇（24：1）5）3mol/L NaAc(pH5.2)6）異丙醇或無水乙醇 7）70%乙醇

8)TE緩沖液： 10mmol/L

Tris-Hcl，pH8.0

1mmol/L

EDTA，pH8.0(三)實(shí)驗(yàn)步驟

1)5mL細(xì)菌過夜培養(yǎng)，5000rpm離心10分鐘，去上清液。2）將菌體細(xì)胞懸于250uL溶液1中，37°C水浴保溫過夜。3）加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保溫4小時。

4）加0.9倍體積的酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），輕輕混勻，于14000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移水相至新的Ep管，重復(fù)步驟4一次。

5）向轉(zhuǎn)移的水相中加入0,9倍體積的氯仿/異戊醇（24：1），輕輕混勻，于14000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移水相至新的Ep管，重復(fù)步驟5一次。

6）向轉(zhuǎn)移的水相中加入0.1倍體積的3mol/L NaAc和0.7倍體積的異丙醇（或2.5倍體積的無水乙醇），冰上放置30分鐘。

7）14000rpm離心20分鐘，棄上清，用0.5mL70%乙醇洗滌沉淀一次，棄上清，沉淀于室溫干燥。

8）將DNA沉淀溶解于15ul TE緩沖液中，-20°C保存。9）進(jìn)行DNA含量和純度檢測，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

植物DNA的SDS提取法：

（一）試驗(yàn)試劑：

1）研磨緩沖液：稱取59.63gNaCl，13.25g檸檬酸三鈉，37.2gEDTA－Na分別溶解后合并為一，用0.2mol/L的NaOH 調(diào)至pH7.0，并定容至1000ml。

2）10 SSC溶液：稱取87.66gNaCl 和44.12g檸檬酸三鈉，分別溶解，一起定容至1000ml。3）1 SSC溶液：用10 SSC溶液稀釋10倍。4）0.1 SSC溶液：用1 SSC溶液稀釋10倍。

5）Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl 溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前經(jīng)80℃水浴處理5min（以破壞可能存在的Dnase）。6）氯仿－異戊醇：按24ml 氯仿和1ml 異戊醇混合。

7）5mol/L高氯酸鈉溶液：稱取NaClO4．H2O 70.23g，先加入少量蒸餾水溶解再容至100ml。8)SDS（十二烷基硫酸鈉）化學(xué)試劑的重結(jié)晶：將SDS放入無水酒精中達(dá)到飽和為止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁熱過濾，冷卻之后即將濾液放入冰箱，待結(jié)晶出現(xiàn)再置室溫下涼干待用。9)1mol／LHCl。10)0.2mol/LNaOH。

11)二苯胺乙醛試劑：1.5g二苯胺溶于100ml 冰醋酸中，添加1.5ml 濃硫酸，裝入棕色瓶，貯存暗處，使用時加0.1ml 乙醛液［濃乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。12)1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。13)0.05mol/LNaOH。

14)DNA標(biāo)準(zhǔn)液：取標(biāo)準(zhǔn)DNA25mg 溶于少量0.05mol/L NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml 至50ml 容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷卻后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，則得100μg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（二）實(shí)驗(yàn)步驟： 1)稱取植物幼嫩組織10g剪碎置研缽中，加10ml 預(yù)冷研磨緩沖液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊狀。

2)將勻漿無損轉(zhuǎn)入25ml 刻度試管中加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，加上塞子，劇烈振蕩30s，轉(zhuǎn)入離心管，靜置片刻以脫除組織蛋白質(zhì)。以4000rpm離心5min。

3)離心形成三層，小心地吸取上層清液至刻度試管中，棄去中間層的細(xì)胞碎片、變性蛋白質(zhì)及下層的氯仿。

4)將試管置72℃水浴中保溫3min（不超過4min），以滅活組織的DNA酶，然后迅速取出試管置冰水浴中冷卻到室溫，加5mol/L高氯酸鈉溶液［提取液：高氯酸鈉溶液＝4：1（V／V）］，使溶液中高氯酸鈉的最終濃度為1mol/L。

5)再次加入等體積氯仿－異戊醇混合液至大試管中，振蕩1min，靜置后在室溫下離心（4000rpm）5min，取上清液置小燒杯中。

6)用滴管吸95％的預(yù)冷乙醇，慢慢地加入燒杯中上清液的表面上，直至乙醇的體積為上清液的兩倍，用玻璃棒輕輕攪動。此時核酸迅速以纖維狀沉淀纏繞在玻璃棒上。7)然后加入0.5ml 左右的10 SSC，使最終濃度為1 SSC。8)重復(fù)第6步驟和第7步驟即得到DNA的粗制品。

9)加入已處理的Rnase溶液，使其最后的作用濃度為50～70μg/ml，并在37℃水浴中保溫30min，以除去RNA。

10)加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，在三角瓶中振蕩1min，再除去殘留蛋白質(zhì)及所加Rnase蛋白，室溫下以4000rpm離心5min，收集上層水溶液。11)再按6、7步驟處理即可得到純化的DNA液。

二、PCR擴(kuò)增目的基因

(一)器材 1)微量移液器

2)滅菌的Tip頭、PCR管 3)PCR擴(kuò)增儀

4)目的DNA（DNA模板）5)dNTP混合物 6)引物對 7)Tap酶

8)PCR擴(kuò)增試劑盒

（二）試劑

1）10×PCR 緩沖液（含Tris-HCl 100mmol/L;MgCl2 15mmol/L、KCl 500mmol/L, pH8.3，0.1%明膠）

2)脫氧核苷三磷酸dNTPs：配成 10mM—— dATP，dTTP，dGTP，dCTP各10mM，用NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH8.3。）

3）氯仿-異戊醇：配成24：1的比例，室溫避光保存。4)酚：氯仿：異戊醇=25：24：1 5)3M NaAc、ddH2O 6)無水乙醇：70%乙醇 7)TE緩沖液

（三）實(shí)驗(yàn)步驟

1）在0.2ml薄壁反應(yīng)管中加入下列成份：（混勻）

ddH2O: 補(bǔ)至終體積（25μl）10×PCR緩沖液 1/10總體積 2.0mM dNTPs 1μl

2U/μl Taq DNA聚合酶 0.5μl

引物混合液（10 pmol /μl /引物）1μl

DNA模板 0.6μl

混勻后，在臺式離心機(jī)上瞬時離心10秒。2）在設(shè)定好的PCR儀上反應(yīng) 95°C，5min；95°C，1min；56°C，1min；72°C，2min。反應(yīng)30輪。

3）反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)管在72°C充分延伸10分鐘，再將反應(yīng)管冷卻至4°C。取一部分反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(實(shí)驗(yàn)三)，確認(rèn)是否有目的的PCR產(chǎn)物。如果PCR產(chǎn)物純度較低或反應(yīng)液中含有連接反應(yīng)阻礙物，可以通過純化得到改善。純化繼續(xù)4）—6）。4）轉(zhuǎn)至1.5ml離心管，向管中加25μl酚，25μl氯仿-異戊醇混勻，離心10000rpm，30秒。5）吸取上層液，轉(zhuǎn)至另一已加5μl 3M NaAc的1.5ml的離心管，加150μl無水乙醇，-20°C過夜。

6）離心10000rpm，10分鐘，棄上清，加0.5ml 70%乙醇，10000rpm離心，5分鐘。棄上清，烤箱中干（60°C），溶于20μl TE。

（四）技術(shù)要點(diǎn)

1）PCR各組份的配制與加樣量要特別注意。

(1)引物濃度：10 pmol 足夠30個循環(huán)，濃度太高導(dǎo)致與模板非特異結(jié)合增強(qiáng)，擴(kuò)增非 特異片段增多，濃度太低則擴(kuò)增效率低。

(2)引物的配制：廠家提供的引物一般是干粉狀態(tài)并標(biāo)明OD值，1 OD約含33μg。開蓋前先將干粉離心至管底，加雙蒸水至濃度2μg/μl，再取部分稀釋至10 pmol /μl。引物濃度計算公式：1pmol=(3.3×10μg)×n，n是引物的堿基數(shù)

(3)Mg：使用濃度一般在1.5mM，要求模板不含高濃度EDTA和諸如硫酸基團(tuán)類的負(fù)電荷基團(tuán)，Mg濃度升高可導(dǎo)致錯配率升高和非特異性擴(kuò)增。

(4)模板DNA：濃度不可過高，質(zhì)粒DNA 20ng即可，若需第二次擴(kuò)增，可將第一次擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋1000-10000倍作為模板使用。

(5)Taq DNA聚合酶：一般用量5U/100μl。酶量過大易導(dǎo)致擴(kuò)增非特異序列，Taq酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，常在3’端加A。2）擴(kuò)增輪數(shù)與退火溫度

擴(kuò)增輪數(shù)：一般30輪以內(nèi)就可使模板擴(kuò)增10倍，超過30輪，錯配率升高。退火溫度計算公式：Tm值=（GC×4+AT×2）–4

6-42+2+

三、瓊脂糖凝膠電泳的檢測

(一)儀器

1）瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)（天平、錐形瓶、量筒、微波爐、凝膠板、梳子、槍式移液器、滅菌Tip頭、水平電泳槽、電泳儀）2）凝膠成像儀(二)試劑及材料

目的DNA、瓊脂糖、蔗糖、溴酚藍(lán)、硼酸、Tris、EDTA、EB、DNA純化試劑

盒

1)TAE電泳緩沖液

濃儲存液 50×：242g Tris；57.1ml冰乙酸；100ml 0.5mol/L EDTA(PH8.0)

定容至一升。

使用液 1×：4.84g Tris；1.15ml冰乙酸；2ml 0.5 mol/L EDTA(PH8.0)定容至一升。2）樣本液

10×緩沖液: 60%蔗糖；0.4%溴酚藍(lán)

（三）實(shí)驗(yàn)步驟

1）將有機(jī)玻璃內(nèi)槽洗凈、晾干，放置于水平制膠器中，插好梳子，在梳子底部與膠槽之間應(yīng)保持幾毫米的間隙。

2）0.8%瓊脂凝膠板的配制：取0.6g瓊脂糖加80ml TAE（1×），20ml水，微波爐加熱融化3分鐘，將其冷卻至55°C-65°C，加入EB儲存液1ul，小心混勻，緩慢倒入制膠槽中。（根據(jù)目的基因的大小選擇瓊脂糖凝膠濃度）。

3）充分凝固后從制膠槽中卸下凝膠板，放入電泳槽，加入TAE（1×），使其液面略高于瓊脂糖板，撥出樣品梳。

4）DNA樣品按照10：1的比例加入樣本液，在臘面紙上混勻，用移液槍加樣于瓊脂糖板的樣品孔中。同時另取一個DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)上樣于另一樣品孔，在同一凝膠板上進(jìn)行電泳。5）接通電泳槽與電泳儀的電源，維持穩(wěn)壓1-5V/cm（按照兩極之間距離計算），電泳時間根據(jù)溴酚藍(lán)指示劑遷移的位置來判斷，當(dāng)移動到距凝膠前沿1-2cm出停止電泳。6）剝膠并在凝膠成像儀觀察結(jié)果。（四）技術(shù)要點(diǎn)

1）選擇瓊脂糖凝膠濃度取決于所鑒定DNA的大小，小片段DNA應(yīng)用高濃度凝膠，大片段則用低濃度凝膠，在1%的瓊脂糖凝膠中溴酚藍(lán)的泳動速度與500bp的雙鏈線狀DNA一致。不同濃度瓊脂糖凝膠及其可分離的線性DNA大小范圍見下表1。表1 不同濃度瓊脂糖凝膠及其分離線性DNA分子的有效范圍凝膠濃度（%）

0.3 0.6 0.8 1.0 1.2 1.5 2.0 2）電泳中注意防止凝膠發(fā)熱。

3）將電泳儀置穩(wěn)壓檔，電壓設(shè)置小于5V/cm（電極間的最小路徑）。隨著電壓的增加，瓊脂

糖凝膠的有效分離范圍縮小。

4）溴化乙錠有強(qiáng)烈的致癌作用，操作時注意防護(hù)。

60～5 20～1 10～0.8 7～0.5 6～0.4 3～0.2 2～0.1

分離DNA的有效范圍（kb）

四、目的DNA的回收純化

(一)儀器

1）瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) 2）凝膠成像儀 3）離心機(jī) 4）單面刀片 5）恒溫水浴鍋(二）試劑

1）DNA回收試劑盒 2）50×TAE 3）ddH2O(三)實(shí)驗(yàn)步驟

1）在紫外燈下切分含DNA的瓊脂糖塊，盡可能除去多余的瓊脂糖．放入1.5ml離心管中。2）按每100mg瓊脂糖加入300—600μl 溶膠液的比例加入溶膠液（本實(shí)驗(yàn)加500ul），置55℃水浴10分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化，期間每2分鐘顛例混勻一次促溶。3）將溶化后的瓊脂糖液移入吸附柱，12000rpm 室溫離心1分鐘，倒掉收集管中的液體．再將吸附柱放入同一個收集管中。

4）在吸附杜中加入500uI漂洗液，室溫靜置1分鐘后，12000rpm 室溫離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。

5）再在吸附柱中加入500uI漂洗液，12000rpm 室溫離心15秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。6）12000rpm 室溫空離心1分鐘。

7）將吸附柱放入一個干凈的1.5ml的離心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脫緩沖液，室溫靜置2分鐘后，12000rpm 室溫離心1分鐘（為提高回收效率可再洗脫一次），將1.5ml離心管(DNA)貯存于-20℃。

五、限制性內(nèi)切酶消化、產(chǎn)物回收及連接重組

(一)儀器及材料 1）回收得到的目的DNA

2）BamHI、HindIII、T4 DNA連接酶、DNA回收試劑盒 3）pUC18‐CAT 質(zhì)粒、雙蒸水、10×酶切通用緩沖液K 4）EP管、恒溫水浴鍋、微量移液器、臺式離心機(jī)

表1 常用酶切緩沖液配方

緩沖液名稱

配 方

10×L

100mM

Tris-HCl,pH7.5 100mM MgCl

210 mM DTT 10×M

100mM

Tris-HCl,pH7.5 100mM MgCl2mM DTT 500mM NaCl 10×H

500mM

Tris-HCl,pH7.5 100mM MgCl2mM DTT 1000mM NaCl 10×K

200 mM Tris-HCl,pH8.5 100 mM MgCl2mM DTT 1000mM KCl 10×T（BSA－Free）

330mM

Tris-Ac,pH7.9 100mM MgAc 5 mM DTT 660mM KAc

0.1% BSA 0.1% Trition X-100

貯存溫度（℃）-20

-20-20

(二）實(shí)驗(yàn)步驟

1）在滅菌的EP管中按如下方式準(zhǔn)備雙酶切反應(yīng)體系： 酶切反應(yīng)體系（20ul體系）

管號 核酸 10×酶切通用緩沖液K ddH2O BamHI

HindIII 1 15ul目的DNA

2ul

0ul

2ul

1ul 2

10ulpUC18‐CAT質(zhì)粒 2ul 5ul 2ul 1ul 2)37℃保溫三小時。

3)酶切產(chǎn)物的純化回收，每100ul溶液加入700ul溶膠液，其余的操作步驟詳見實(shí)驗(yàn)四 4)載體與目的DNA的連接。在滅菌的EP管中按如下方式準(zhǔn)備雙酶切反應(yīng)體系（20ul）： 目的DNA pUC18‐CAT質(zhì)粒 10×連接緩沖液 T4 DNA連接酶

ddH2O

X ul

Y ul

2ul

1ul

Zul 目的DNA和pUC18‐CAT質(zhì)粒的相對濃度約為1:3—1:10 5）14℃水浴保溫過夜。

六、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及目的DNA的轉(zhuǎn)化

(一)儀器

1．小型高速離心機(jī) 2．恒溫?fù)u床 3．恒溫培養(yǎng)箱 4．‐20℃冰箱 5．恒溫水浴器 6．超凈工作臺 7．高壓滅菌鍋(二)材料 1．氨芐青霉素 2．大腸桿菌DH5a 3．連接產(chǎn)物 4．離心管

5．槍頭、微量移液器 6．試管、培養(yǎng)皿、三角瓶(三)試劑

LB 培養(yǎng)基（根據(jù)需要確定配制的量）：

10g/L 胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，加水至1000ml，高壓滅菌，保存在室溫。氨芐青霉素：

用去離子水配成100mg/ml的儲存液，過濾除菌，－20℃分裝保存?？敲顾兀?/p>

用去離子水配成100mg/ml的儲存液，過濾除菌，－20℃分裝保存 無抗生素LB瓊脂糖平板培養(yǎng)基（根據(jù)需要確定配制的量）：

10g/l 胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 瓊脂粉，加水至1000ml，高壓滅菌；鋪平板，冷卻后在37℃培養(yǎng)24小時，保存在室溫。

含有抗生素LB瓊脂糖平板培養(yǎng)基（根據(jù)需要確定配制的量）：

10g/l 胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 瓊脂粉，加水至1000ml，高壓滅菌；當(dāng)培養(yǎng)基降溫至50℃左右，加入終濃度為100μg/ml 的氨芐青霉素或50μg/ml卡那霉素，并鋪平板，冷卻后在37℃培養(yǎng)24小時，保存在室溫。0.1 M CaCl2（根據(jù)需要確定配制的量）：

11.099克溶解在1000ml滅菌水中，0.22μm濾器過濾除菌。氯化鈣分子量為：110.99。50％甘油：

50ml甘油加入50ml水，混勻，高壓滅菌。其他：

DH5α大腸桿菌，滅菌玻璃平皿若干，接菌環(huán)，加250ml LB液體培養(yǎng)基的1000ml滅菌錐形瓶一個，滅菌50ml和500 mL離心管若干，滅菌刻度吸管若干，冰盒，移液器，滅菌移液器吸頭，滅菌Eppendorf管等。

（四）實(shí)驗(yàn)步驟

1）以接菌環(huán)從－70℃保存的高效轉(zhuǎn)化菌種中蘸取少量菌液劃無抗生素平板，培養(yǎng)12小時； 2）挑取單菌落接種于5 mL無抗生素LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜；

3）按照1:100接種菌液至250 mL LB培養(yǎng)基中，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)1.5-2 小時左右，至OD600達(dá)0.4-0.6；

4）將菌液冰浴10 分鐘，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的500 mL離心管中，4℃，4000 rpm離心10 分鐘； 5）棄上清，將細(xì)菌沉淀重新懸浮于50 mL預(yù)冷的0.1 M CaCl2中，冰浴20 分鐘，4℃，4000 rpm離心10 分鐘；

6）棄盡上清。以12.5 mL（菌液體積的5％）預(yù)冷的0.1 M CaCl2溶液重懸細(xì)菌沉淀，同時加入等體積預(yù)冷的50%甘油水溶液，混勻后按每支50μL在冰上分裝，－80℃保存； 注：以上操作全部在無菌條件下進(jìn)行。

7）取連接產(chǎn)物2μl（在實(shí)際操作中，經(jīng)常需要取全部連接產(chǎn)物）置于冰上； 8）從－80℃冰箱取3管感受態(tài)細(xì)菌（每管50μl），在冰上融化；

9）將連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細(xì)菌中，混勻，放置冰上20－30分鐘；同時做兩個對照管

? 受體菌對照：50μl感受態(tài)細(xì)胞+2μl無菌水 ? 質(zhì)粒對照：50μl0.1 M CaCl2溶液+2μl連接產(chǎn)物 10）42℃加熱90秒，迅速置于冰上1－2分鐘；

11）每管加入400－1000μl的無抗生素液體LB培養(yǎng)基，在37℃搖床緩慢搖蕩20－60分鐘； 12）用<10000rpm離心10秒，棄去大部分上清，留下約50μl并用移液器吹吸重懸細(xì)菌； 13）取適量細(xì)菌懸液均勻的涂布在帶有相應(yīng)抗性（根據(jù)質(zhì)粒所攜帶抗生素抗性基因而定）的LB瓊脂糖平板上，倒置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時以上，出現(xiàn)菌落。

（五）技術(shù)要點(diǎn)

1．加入的連接產(chǎn)物體積應(yīng)該小于感受態(tài)細(xì)胞體積的5％； 2．42℃熱激時，必須要保證溫度的準(zhǔn)確性；

3．涂布LB平板的菌液量應(yīng)該根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。如果連接效率很高，而且所用感受態(tài)細(xì)菌的效率也很高，則吸取較少量的菌液；反之，可以增加，甚至全部菌液涂布平板。判斷的標(biāo)準(zhǔn)：在LB平板上生長密度合適的單菌落；

4．涂布平板之后，在37℃培養(yǎng)的時間不超過12－16小時，否則可能產(chǎn)生衛(wèi)星菌落； 5．防止其它質(zhì)粒污染； 6．防止其它細(xì)菌污染。

七、質(zhì)粒DNA的提取及重組子的鑒定

(一)儀器 1．恒溫培養(yǎng)箱 2．恒溫?fù)u床 3．小型高速離心機(jī) 4．高壓滅菌鍋 5．分光光度計

（二）試劑及材料 1.轉(zhuǎn)化重組子

2.緩沖液A：50mM葡萄糖；10mM EDTA；25mM Tris-HCl，pH8.0。3.堿溶液：0.2M NaOH;1%SDS, PH12.5。

4.乙酸緩沖液：3M NaAC；2M乙酸，pH4.8（鹽酸調(diào)pH）。5.TE緩沖液：10mM Tris-HCl，pH8.0；1mM EDTA.。

6.RNA酶A溶液：10mg/ml RNA酶 A，用TE配制，100°C煮10分鐘，滅活DNA酶。緩慢冷卻至室溫，10000r/min離心5min,上清于-20°C保存。

7.LB培養(yǎng)基: 10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5g NaCl加水至1000ml，用1M NaOH調(diào)pH至7.5，高壓滅菌。

8.氨芐青霉素：用去離子水配成100mg/ml的儲存液，過濾除菌，－20℃分裝保存。9.LA培養(yǎng)基: 在LB培養(yǎng)基中加入終濃度100μg/ml的氨芐青霉素。10.異丙醇

11.酚-氯仿-異戊醇：25：24：1 12.70%乙醇 13.3M NaAc

（三）實(shí)驗(yàn)步驟

1）從轉(zhuǎn)化平皿上挑一克隆接種到LA液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)，待細(xì)菌濃度增至OD600=1—1.2時，收獲細(xì)菌。菌液轉(zhuǎn)到1.5mlEppendorf管中，離心8000rpm，2分鐘，棄上清。

2）加100μl緩沖液A，充分混懸細(xì)菌。

3）加200μl堿溶液，裂解細(xì)菌，反復(fù)倒轉(zhuǎn)管5次至溶液清亮，開蓋后能拉出絲狀粘稠液體。4）加150μl乙酸緩沖液，反復(fù)倒轉(zhuǎn)管5次，混勻，冰浴10分鐘。5）離心10000rpm，5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至另一Eppendorf管中。

6）加等體積的酚-l氯仿-異戊醇（25：24：1）混勻，離心10000rpm，1分鐘。7）吸上層水相至另一Eppendorf管中，加等體積的氯仿混勻，離心10000rpm，1分鐘。8）吸上層水相至另一Eppendorf管中，加0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫或-20°C，10分鐘。

9）離心10000rpm，10分鐘，棄上清，加入1ml 70%乙醇。勿混勻，離心10000rpm，5分鐘，重復(fù)加入1ml 70%乙醇一次，棄上清，干燥箱中干燥。

10）干燥后，加入30μl TE（含RNA酶A 10ul，20μg/ml），使質(zhì)粒溶解，-20°C保存?zhèn)溆谩?1)取一個滅菌的EP管，依次加入下列試劑

10×限制酶緩沖液2.0ul、重組質(zhì)粒5.0ul、ddH2O 11.0ul、限制性內(nèi)切酶2.0ul總體積為20.0ul。

12）將上述試劑輕輕混勻，稍加離心，集中溶液，37°C水浴保溫3—4小時。酶切結(jié)束時，加入0.5mmol/L EDTA(PH8.0)使終濃度達(dá)10mmol/L，以終止反應(yīng)。13）質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析詳見實(shí)驗(yàn)三。

（四）技術(shù)要點(diǎn)

1）每一步都要充分混勻，為獲得高產(chǎn)量DNA，第一步需使菌體完全重懸。

2）加入堿溶液后，反復(fù)混勻使細(xì)菌充分裂解，但需要輕柔，一旦裂解（液體變清亮）必須馬上加乙酸緩沖液中和。

3）70%乙醇洗滌時，離心后應(yīng)小心地將上清倒掉，注意這時DNA沉淀較疏松，易從管壁上脫落。

第二篇：超英分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

超英生物實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)系列服務(wù)項(xiàng)目

1、DNA提取（組織、細(xì)胞、血液、蠟塊）,質(zhì)粒提取，基因克隆、純化。

2、蛋白提取、定量。原核及真核基因蛋白表達(dá)純化（鹽析與透析）、分析鑒定、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,western-blot(常規(guī)DAB顯色及化學(xué)發(fā)光)

蛋白組學(xué)相關(guān)技術(shù)

免疫蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。

3、總RNA提取 定量、電泳?？俁NA是一種非常重要的試驗(yàn)材料。本公司可以提供從多種材料中提取總RNA的服務(wù)。常見的有：血液、培養(yǎng)細(xì)胞、動物組織、植物

4、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

5、RT-PCR：組織或細(xì)胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA.再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,而獲得目的基因或檢測基因表達(dá).降落PCR 引物設(shè)計及PCR相關(guān)實(shí)驗(yàn)

6、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞凍存、原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)技術(shù)

7、細(xì)胞凋亡檢測(TUNEL,單細(xì)胞凝膠電泳等)

8、細(xì)胞周期調(diào)控,同步化細(xì)胞

9、特殊的細(xì)胞爬片材料,提供檢測爬片細(xì)胞的特異性抗體檢測,客戶所感興趣的基因檢測

(RISH,DISH,IS-PCR,PRINS)

第三篇：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)總結(jié)

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.TOMY全自動滅菌鍋的使用

（1）檢查排放蒸汽的水壺，腔體內(nèi)的水位與托板齊平。（2）SET鍵設(shè)置溫度和時間（121℃，20min）（3）關(guān)閉排氣閥，Start機(jī)器開始運(yùn)行，Check Heat檢查設(shè)置的溫度，Stop鍵終止機(jī)器運(yùn)行。（4）程序運(yùn)行結(jié)束，旋開排氣閥或機(jī)器自行排氣至壓力為0。溫度降至80℃以下壓力為0時方可開蓋。運(yùn)行過程中勿接觸蓋子。（5）腔體內(nèi)經(jīng)常清潔。2.LB液體培養(yǎng)基（1000mL）

將胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g完全溶解在950mL去離子水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，加入去離子水至總體積為1000mL，121℃濕熱滅菌20min。冷卻后4℃保存?zhèn)溆?。固體還要再加瓊脂。3.堿裂解法

堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們的。在pH值介于12.0～12.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的氫鍵會斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此纏繞，仍會緊密的結(jié)合在一起。當(dāng)加入 pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液，恢復(fù)pH至中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此完全分開，復(fù)性就不會那么迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。

溶液Ⅰ：葡萄糖，Tris-HCl，EDTA 葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受機(jī)械作用而降解。EDTA可螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制DNase對DNA的降解作用。溶液Ⅱ：氫氧化鈉，SDS 氫氧化鈉加入后堿性環(huán)境12-12.5促使染色體DNA與質(zhì)粒的變性解離成單鏈。SDS是一種陰離子去垢劑，它的主要作用有：①溶解細(xì)胞膜上的脂肪與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜；②解聚細(xì)胞中的核蛋白，使蛋白質(zhì)與DNA分開；③SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀；④SDS能抑制核酸酶的作用，防止對DNA的降解。

溶液Ⅲ：乙酸鉀。用pH4.2的KAc溶液是為了調(diào)整溶液pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol/L醋酸鉀(KAc)有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物凝聚而沉淀。4.loading buffer 電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油組成上樣緩沖液。作用：①增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。②形成肉眼可見的指示帶，預(yù)測核酸電泳的速度和位置。③使樣品呈色，使加樣操作更方便。5.限制性內(nèi)切酶（I型）限制性內(nèi)切酶：能識別專一的核苷酸順序，并在識別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機(jī)的。

(II型)限制性內(nèi)切酶：能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。這類限制性內(nèi)切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的，因此，這種限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。

（III型）限制性內(nèi)切酶：也有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序,在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此不能應(yīng)用于基因克隆。6.引物設(shè)計和選擇目的DNA序列區(qū)域時遵循下列原則： 引物長度約為16～30bp；引物中G+C含量通常為40%～60%，可按Tm＝4(G+C)+2(A+T)粗略估計引物的解鏈溫度；四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3’端不存在連續(xù)3個G或C，因這樣易導(dǎo)致錯誤；引物3’端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應(yīng)，以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對；在引物內(nèi)，尤其在3’端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)；兩引物之間尤其在3’端不能互補(bǔ)，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產(chǎn)量；引物5’端對擴(kuò)增特異性影響不大，可引入酶切位點(diǎn)或突變位點(diǎn)；引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)；簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子；引物的濃度一般為0.1～0.5μmol/L，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，引物濃度偏低則降低產(chǎn)量。7.dNTP 常用的濃度為20～200μmol/L，而且4種dNTP的終濃度相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足而出現(xiàn)的錯誤摻入；dNTP濃度過高雖可加快反應(yīng)速度，但會增加堿基的錯誤摻入率，同時會抑制Taq DNA聚合酶的反應(yīng)活性；適當(dāng)?shù)牡蜐舛葧岣叻磻?yīng)的精確度；注意協(xié)調(diào)Mg2+濃度和dNTP濃度之間的關(guān)系。8.感受態(tài)

處于對數(shù)生長期的細(xì)菌經(jīng)低溫CaCl2處理后接受外源DNA的能力顯著增加。細(xì)菌處于容易吸收外源 DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。在自然條件下，很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi)，但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob 基因，因此不能自行完成從一個細(xì)胞到另一個細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài),以攝取外源DNA。9.轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化是將外源DNA 分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R-,M-)，它可以容忍外源DNA 分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。10.DNA連接酶

有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶；DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為了防止載體本身的自連，可以通過牛小腸堿性磷酸酶CIP處理克服； 連接反應(yīng)的溫度在37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此人們找到了一個折中的溫度，即12～16℃，連接12～16h（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定；

pMD18-T Vector 是一種高效克隆PCR 產(chǎn)物（TA Cloning）的專用載體，該載體由pUC18 載體改建并在其3’端添加“T”而成

大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時都有在PCR產(chǎn)物的3’末端添加一個“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率；

轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程 11.α互補(bǔ)

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，還需對轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行篩選鑒定。利用α互補(bǔ)現(xiàn)象進(jìn)行篩選是最常用的一種鑒定方法； α互補(bǔ)：質(zhì)粒載體上lacZ’基因編碼的α肽段與失去了正常氨基端的β-半乳糖苷酶突變受體菌之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象，由α互補(bǔ)而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用Xgal顯色測定出來；任何攜帶著lacZ’基因的質(zhì)粒載體在轉(zhuǎn)化β半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細(xì)胞后，在含有Xgal的培養(yǎng)基平板上形成藍(lán)色菌落，而含有重組質(zhì)粒載體的克隆往往是白色菌落。

第四篇：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 心得體會

關(guān)于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的體會

梁慧媛（生技01級）

不知不覺間，一年的時間就這樣流逝了，與分子生物實(shí)驗(yàn)相伴，對我而言，的確不同尋常。并不僅僅是學(xué)習(xí)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法的寶貴經(jīng)歷，它意味著更多。

首先是實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)過程、實(shí)驗(yàn)設(shè)計的完備性，從這里可以初步感受到生物學(xué)研究的科學(xué)性與嚴(yán)肅性，自己可以得到寶貴的機(jī)會，親身體會生物學(xué)研究的苦辣酸甜。一直一直喜歡，得到正確實(shí)驗(yàn)結(jié)果時刻的暢快感，那是無法言明的欣慰感，一次身心徹底地放松，可以將所有一整天來積累的疲勞拋之身后，即使僅僅是小小的成功，也會讓我們興奮不已。在整理資料，將一年來保存的記錄一遍一遍的翻看，重溫其中的特別滋味，我，輕輕地笑了。我，喜歡這里，喜歡生物學(xué)。

失誤是常有的，經(jīng)歷過吃驚、后悔、無奈，檢討分析，最后重新開始。一波三折的記憶清晰的印在腦海中，這種深深的挫折感，再試一次的勇氣，我會一生記取的。

一年間，隨著對生物學(xué)實(shí)驗(yàn)知識和技能的進(jìn)一步學(xué)習(xí)，我更堅定了自己學(xué)習(xí)生物學(xué)的志向，感謝分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的“試煉”。

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)心得體會

劉東強(qiáng)（生科01級）

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室本科生第一次接觸到了真正培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ膶?shí)驗(yàn)課，它不同于我們在大二開的植物、動物、微生物等實(shí)驗(yàn)課。在這些課上，主要以制備樣品并觀察樣品的形態(tài)、結(jié)構(gòu)特征為主，這是由于我們當(dāng)時正值大二，專業(yè)知識還遠(yuǎn)不夠。

隨著以后理論課學(xué)習(xí)的深入，我們開始了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)，這無疑對于深刻鞏固我們理論課上學(xué)到的知識是有幫助的，也進(jìn)一步加深了對原有知識的理解，如啟動子的概念、類型、PCR的原理等。另外，在實(shí)驗(yàn)課中，我們掌握并學(xué)會如何運(yùn)用分子生物學(xué)研究中的一些基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如質(zhì)粒的提取、總RNA的制備、PCR技術(shù)等。

我們的實(shí)驗(yàn)動手能力通過親身接觸實(shí)驗(yàn)過程并親自設(shè)計一些實(shí)驗(yàn)得到了提高，使我們不再象剛開始做分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的時候照搬實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)上的實(shí)驗(yàn)步驟，而是通過我們自己的思考，根據(jù)現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)條件，對原有的步驟作必要的改進(jìn)。

此外，通過這門實(shí)驗(yàn)課的學(xué)習(xí)，我們形成了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度，如有時得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論不符，我們漸漸養(yǎng)成了仔細(xì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的習(xí)慣，查找在實(shí)驗(yàn)設(shè)計或操作過程中出現(xiàn)的問題，同時對理論知識認(rèn)識得更清楚。

總之，我認(rèn)為，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課，是稱得上實(shí)用、精彩、有意思的好實(shí)驗(yàn)，對于今后我的研究或工作很有價值。

劉佳凝（生技01級）

一學(xué)期的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對我來說很重要，同時通過一學(xué)期的實(shí)踐讓我給分子生物學(xué)有了較深入地體會：

1、很感謝由我系生化組老師們編寫的這本實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。里面的實(shí)驗(yàn)原理與操作步驟都清晰易懂，有助于我們在學(xué)習(xí)操作。

2、實(shí)驗(yàn)老師的耐心指導(dǎo)對我們幫助很大。他們要求嚴(yán)格，待人和藹可親，實(shí)驗(yàn)要求嚴(yán)且對實(shí)驗(yàn)技術(shù)的知識的深刻掌握與理解給我們留下了很深刻的印象。在老師們的帶領(lǐng)下我們都很認(rèn)真完成了每一次的實(shí)驗(yàn)與之后的總結(jié)與報告。

3、由于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是我們上大學(xué)后接觸的第一個大型實(shí)驗(yàn)課，所以這對我們來說是一個磨練的過程。從不熟練當(dāng)熟練，從不耐煩到耐心認(rèn)真，每個人在一學(xué)期后都有一種“脫胎換骨”的感覺。同時這個實(shí)驗(yàn)幫助我們從分認(rèn)識到生物學(xué)的不可知性、變化多樣性及創(chuàng)新空間的廣博性。在學(xué)期后的設(shè)計實(shí)驗(yàn)中，每組同學(xué)都努力開動腦筋，搜集資料，查閱文獻(xiàn)，提出了很多好的實(shí)驗(yàn)方案。這種設(shè)計與創(chuàng)新調(diào)動了同學(xué)的同學(xué)們的積極性，使得大家在實(shí)驗(yàn)過程中都更加認(rèn)真、仔細(xì)、一絲不茍，并在獲得到好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果后體會到了前所未有的成就感。

所以我們都很感謝分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的老師及設(shè)計這門課的老師們。這個實(shí)驗(yàn)讓我們受益非淺。

實(shí)驗(yàn)心得體會

張鑫蕊（生科01級）

通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課的學(xué)習(xí)，我們首先了解了分子生物學(xué)常用的載體，即質(zhì)粒載體的制備及宿主細(xì)胞的感受態(tài)的制備。這些都讓我們在學(xué)過書本狀的知識以后有了一個親手操作，更深一步所學(xué)的知識的機(jī)會。

生物學(xué)以及分子生物學(xué)本身就是一門實(shí)驗(yàn)性的學(xué)科，如果只有單純的理論課上的講解而沒有與之相配套的實(shí)驗(yàn)操作，跟的無法使我們深刻體會到我們所學(xué)的那些如轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)化之類究竟是怎樣操縱的。

至于PCR基因擴(kuò)增、RT-PCR、蛋白質(zhì)印跡這些實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)的學(xué)習(xí)對我們以后生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn)、生化技術(shù)原理、基因工程、蛋白質(zhì)工程的學(xué)習(xí)都奠定了一個很堅實(shí)的基礎(chǔ)，幫助我們對這一系列等分子生物學(xué)技術(shù)有了很好的了解和掌握的。

相配套的理論課的學(xué)習(xí)與實(shí)驗(yàn)操作上是非常必要，我覺得分子實(shí)驗(yàn)課的時間安排就相當(dāng)合理，在我們學(xué)理論課的同時就進(jìn)行實(shí)驗(yàn)課的操作，這樣相輔相承的學(xué)習(xí)，才能促進(jìn)我們的進(jìn)一步提高。

實(shí)驗(yàn)心得

劉娟（生科01級）

一、實(shí)驗(yàn)操作：

同樣的樣品，同樣的步驟，不同的人可以作出不同的結(jié)果。

當(dāng)然分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)本身的結(jié)果就有一定的偶然性，因?yàn)樗僮鞯牟牧鲜菢O其微小的，肉眼無法看見的，所以用理論來預(yù)見可行的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果往往有些出乎意料。而每個人操作上的細(xì)微差別對RNA、DNA而言就是一場地震。

有人說做生物實(shí)驗(yàn)和學(xué)數(shù)學(xué)不一樣，數(shù)學(xué)只要用靈活的思維，嚴(yán)禁的邏輯就行，而生物實(shí)驗(yàn)要求的往往不止這些，不只要心靈還要手巧肯干，而分子實(shí)驗(yàn)又比其他實(shí)驗(yàn)要求嚴(yán)格，每一步都須三思而后行，而且必須有極大的耐心去重復(fù)一些枯燥的步驟。

二、關(guān)于設(shè)計實(shí)驗(yàn)：

想總比做起來容易，當(dāng)初覺得mRNA差異顯示原理簡單，操作應(yīng)該不成問題。結(jié)果第一天的實(shí)驗(yàn)便給了個下馬威，不僅結(jié)果等于沒有，而且對接下來的步驟更是一無所知，無從下手。而最終自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果只不過是mRNA差異顯示地預(yù)實(shí)驗(yàn)，由于該方法的假陽性率極高，正常的科研實(shí)驗(yàn)是需要反復(fù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并將最后的結(jié)果測序分析，并進(jìn)一步分析是否為新基因，當(dāng)然我們不可能接著做，只完成了該實(shí)驗(yàn)的一小步，也已經(jīng)學(xué)到了很多書上沒有的東西。

三、還存在的問題：

自己在做的過程中，有時會有“照方抓藥”的情況出現(xiàn)，并不完全明白自己所做的步驟有什么作用便做了，事前事后缺乏思考。實(shí)驗(yàn)過程中，儀器、試劑的收集，總只有幾個人在做，其他人只是張口就問在哪，說明擺放無秩序，做實(shí)驗(yàn)時依賴心理太強(qiáng)，（看完其他國外的幾個實(shí)驗(yàn)室照片后，覺得我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)不錯了。）

每一步驟最好都有記錄，特別是樣品多時，要有據(jù)可查。

一門好實(shí)驗(yàn)課

中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 2003級研究生 陸璐

我是生物科學(xué)專業(yè)99級的學(xué)生，在大三的時候選修了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)這門課。在半年的學(xué)習(xí)和實(shí)踐中，我學(xué)會了很多基礎(chǔ)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，掌握了一定的實(shí)驗(yàn)技能，這些都為現(xiàn)階段的實(shí)驗(yàn)工作提供了很大的幫助，這使我避免了剛剛進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室工作時要一切從頭學(xué)起的忙亂，節(jié)省了大量時間。

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課上所講授的質(zhì)粒提取、藍(lán)白斑篩選、RNA提取及鑒定、基因組DNA提取、western blot、瓊脂糖凝膠電泳、PCR技術(shù)等都是我現(xiàn)在常用的技術(shù)。在實(shí)驗(yàn)課的訓(xùn)練中，我也逐步養(yǎng)成了良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣。

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程讓我受益很多，老師們認(rèn)真負(fù)責(zé)的態(tài)度也必然讓更多的師弟師妹們從中獲益。

我是北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)2002級的碩士研究生，在研一第一學(xué)期參加了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程。這門課程將分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作的理論與實(shí)踐相結(jié)合，不僅使我在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技能方面得到系統(tǒng)的訓(xùn)練，而且讓我對具體實(shí)驗(yàn)操作的原理有了清晰地認(rèn)識。尤為難得的是，作為一門實(shí)驗(yàn)課，它還鍛煉了我運(yùn)用已學(xué)到的理論知識和已掌握的實(shí)驗(yàn)技能綜合解決科學(xué)問題的能力。這些都為我之后研究生階段的工作做了必要的準(zhǔn)備，打下了良好的基礎(chǔ)。

這門課程開設(shè)的實(shí)驗(yàn)以綜合性為主，涵蓋面廣，幾乎包括一般分子生物學(xué)研究會涉及的所有內(nèi)容：最基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA；基因克隆所要用到的技術(shù)，如質(zhì)粒提取、DNA重組及重組子篩選、細(xì)菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)等；還有一些其他的常用技術(shù)，如動、植物基因組DNA的提取、植物總RNA的提取、PCR擴(kuò)增、蛋白質(zhì)印跡、Southern雜交等。

我研究生階段的一部分工作是要將外源基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入植物中，并鑒定轉(zhuǎn)化是否成功。首先要用到質(zhì)粒提取、DNA重組等技術(shù)來構(gòu)建插入有外源基因的表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化植物成功后，就需要提取植物基因組DNA及總RNA，利用PCR擴(kuò)增、Southern雜交、RT-PCR、蛋白質(zhì)印跡等技術(shù)，對外源基因進(jìn)行不同水平的鑒定。

正是因?yàn)榉肿由飳W(xué)實(shí)驗(yàn)課對基本原理的詳細(xì)講解、對實(shí)驗(yàn)技能的系統(tǒng)訓(xùn)練，使我在工作中比較容易上手，工作進(jìn)度也有了保證。另外，通過在這門課上系統(tǒng)地、全面的學(xué)習(xí)，也使我在工作需要學(xué)習(xí)新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)時，觸類旁通，比較容易理解消化。

分子生物學(xué)課程對我的科研工作的幫助

胡麗婭

進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室做課題已經(jīng)一年多了，在日常的科研工作中，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課中學(xué)到的知識和技術(shù)給了我很大的幫助，例如“外源基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)”和“SDS－PAGE檢測蛋白”等等。

我的課題主要是研究鈣調(diào)磷酸酶的折疊機(jī)制，而整個研究的基礎(chǔ)就是要拿到純的、具有完整的生物活性的酶。這是整個工作的第一步，也是非常關(guān)鍵的一步。剛開始參與科研工作時，我遇到了蛋白表達(dá)為包含體的問題，因?yàn)槟貌坏降鞍?，?shí)驗(yàn)無法進(jìn)行下去。于是我運(yùn)用在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課中學(xué)到的知識，對表達(dá)條件進(jìn)行了摸索，最終解決了表達(dá)的問題。順利的進(jìn)行了后續(xù)的實(shí)驗(yàn)工作。

隨著課題的深入，我需要構(gòu)建一個點(diǎn)突變體來觀察這一位點(diǎn)對于鈣調(diào)磷酸酶的結(jié)構(gòu)和折疊的作用。由于有在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課中打下的基礎(chǔ)，我利用Primer premier設(shè)計了點(diǎn)突變的引物，運(yùn)用PCR技術(shù)對鈣調(diào)磷酸酶進(jìn)行點(diǎn)突變：質(zhì)粒DNA的提取和酶切、E.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備，轉(zhuǎn)化。每一步實(shí)驗(yàn)都能夠得到理想的結(jié)果。我想正是以前學(xué)到的知識和經(jīng)驗(yàn)使我能夠順利的完成設(shè)計的實(shí)驗(yàn)。

通過一年多來的實(shí)驗(yàn)工作，我更加深切的體會到堅實(shí)的理論基礎(chǔ)和良好的實(shí)驗(yàn)技能對于科研工作的重要性。在我本科的課程中，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課是一門尤其重要的課程，在這門課程的學(xué)習(xí)過程中，我和我的同學(xué)們都打下了很好的基礎(chǔ)。整個課程的安排十分合理，給我們許多親自動手實(shí)踐的機(jī)會；在遇到問題時，老師鼓勵我們積極思考，和我們一起討論，幫助我們解決問題。每一個小實(shí)驗(yàn)的成功，對于我們這些“初生之犢”來說，都是一種莫大的鼓勵，鼓勵我們在科學(xué)研究中前進(jìn)。

與此同時，我們在這門實(shí)驗(yàn)課的學(xué)習(xí)中還培養(yǎng)了良好的合作意識和團(tuán)隊(duì)精神。同學(xué)們齊心協(xié)力，一起動腦筋解決實(shí)驗(yàn)中的問題。在今天的科研工作中，這些品質(zhì)讓我們能夠更好的融入到課題組這一個大家庭中，大家互相幫助，誰遇到了問題，大家一起討論，出謀劃策。同時，在討論的過程中，大家也能學(xué)到更多的知識。

生命科學(xué)學(xué)院 2002碩 細(xì)胞生物學(xué)專業(yè)

王利敏

作為一名細(xì)胞所的二年級研究生，一年級所選修的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程對我的幫助是不可忽視的。在這個課程上，讓我初次接觸到了許多進(jìn)行生物研究時必須具備的實(shí)驗(yàn)技術(shù)以及一些基本技能，象電泳，蛋白質(zhì)印跡，PCR等等，這些實(shí)驗(yàn)在幾乎每個人以后的工作中都會用到，我也不例外。而且這些實(shí)驗(yàn)又不同于本科時，它不但是更復(fù)雜，還給了更多我們自己動手的空間和時間，一來能鍛煉大家的思考能力，比如我們自己設(shè)計引物來合成目的基因；還能鍛煉我們自己安排時間和一個實(shí)驗(yàn)進(jìn)度的能力，分子實(shí)驗(yàn)一般周期比較長，學(xué)習(xí)如何合理地安排時間使之更有效的確對于今后自己實(shí)驗(yàn)地安排大有裨益?？傊?，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程的確是一門對今后實(shí)驗(yàn)很有幫助地課程。

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程學(xué)習(xí)隨感

陳暉

時光荏苒，不知不覺中研究生生活已過去一年，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室也有快一年的時間了。大學(xué)時專業(yè)課的學(xué)習(xí)為我的科研工作打下的堅實(shí)基礎(chǔ)，而實(shí)驗(yàn)課程尤其是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)更讓我獲益匪淺。

分子生物學(xué)課程的學(xué)習(xí)讓我們初步建立了分子的概念，但核酸到底是什么樣子的，什么是PCR，什么是質(zhì)粒，什么是轉(zhuǎn)化，這些概念對于我們始終很抽象。是分子生物學(xué)試驗(yàn)讓我們真正接觸了分子生物學(xué)，將那些抽象的概念變得具體，而不再是紙上談兵。

在分子生物學(xué)試驗(yàn)中我們學(xué)習(xí)到了分子生物學(xué)最基本的實(shí)驗(yàn)技能，如感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒DNA的提取及酶切，植物總RNA的提取等等。這些技能的學(xué)習(xí)讓我在科研工作中很快能進(jìn)入角色。在開始進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室時，常會有種手足無措的感覺。但當(dāng)看到那些熟悉的儀器，如微量移液器，培養(yǎng)箱，PCR儀等時，真有他鄉(xiāng)遇故知的感覺。而不需別人指導(dǎo)，運(yùn)用實(shí)驗(yàn)課上學(xué)到的知識成功地完成實(shí)驗(yàn)，那種滿足感更是無法形容。至今還記得獨(dú)立提出要用的質(zhì)粒時的情形，師兄在夸獎之余將更多的工作放心地交給我，讓我們實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展順利很多。

不過最重要的是在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)的過程中，我們建立了整體大實(shí)驗(yàn)的概念，這是在以往的實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練中沒有的。以往的實(shí)驗(yàn)如無機(jī)化學(xué)，有機(jī)化學(xué)等等，所涉及的通常只是某個數(shù)據(jù)的測定或某種物質(zhì)的提取，實(shí)驗(yàn)持續(xù)的時間通常也就兩三個小時;而分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，每次會持續(xù)一天時間。實(shí)驗(yàn)設(shè)計得與科研比較相似，毫不夸張的講，每個實(shí)驗(yàn)都可以直接用于科研。在這里我們學(xué)到了實(shí)驗(yàn)設(shè)計的概念，不是單純的實(shí)驗(yàn)技術(shù)的堆砌，而是根據(jù)自己的目的，有機(jī)的將各種方法組合起來。所有這些都是我們進(jìn)入科研工作所必須的素質(zhì)。

而老師的講解不會局限于某種技術(shù)，而是更偏重開拓思路，引導(dǎo)我們思考，從而達(dá)到舉一反三的目的。如在講解植物總RNA的提取時，采用的是白化的玉米葉子，所含糖類脂類比較少，此時老師會提出問題如果糖類多時又該如何改進(jìn)提取的方法;書上所講的只是其中一種提取方法，是否還有其他的方法可以提純RNA。老師并不會直接給出這些問題的答案，而是要我們在課后自己查閱資料。這一方面鍛煉了我們查閱文獻(xiàn)的能力，另一方面這些資料的積累成為科研工作時寶貴的一手材料，可以直接應(yīng)用于科研。“授人以魚不如授人以漁”，老師們精心的講解常會給我們豁然開朗的感覺，學(xué)習(xí)到的不是單純的技術(shù)而是一種思路。

感謝分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，感謝給予我們悉心教導(dǎo)的老師，是他們的工作使我們真正接觸到了分子實(shí)驗(yàn)，并為將來進(jìn)入科研工作打下了良好的基礎(chǔ)。

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)小結(jié) 2001級生物科學(xué)專業(yè) 張皓彬

做完半年的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，感到它是一門非常好的課，在我們學(xué)習(xí)生物學(xué)的過程中占據(jù)著很大的分量。

首先，分子生物學(xué)是一門技術(shù)性很強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)的過程中，某些小的失誤可能會對結(jié)果產(chǎn)生很大的影響。所以對實(shí)驗(yàn)中的操作是比較嚴(yán)格的，特別象無菌操作過程。在實(shí)驗(yàn)中從儀器上來說我們接觸了大量的儀器，而且也學(xué)到了一些基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，這對我們將來從事相關(guān)工作有著非常大的幫助。

其次，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中所含的知識和技術(shù)與理論知識結(jié)合的比較好，先學(xué)習(xí)了理論知識再去做實(shí)驗(yàn)，這樣結(jié)合很好，而且我感覺分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是我們所做的實(shí)驗(yàn)中一門設(shè)計到比較“高深”知識或新問題的實(shí)驗(yàn)，能激發(fā)出我們對學(xué)習(xí)分子生物學(xué)理論與實(shí)踐的興趣。

最后，我認(rèn)為最重要的是它給了我們學(xué)生一次自己設(shè)計實(shí)驗(yàn)的機(jī)會。這是我們所做的實(shí)驗(yàn)中唯一能給我們自己設(shè)計實(shí)驗(yàn)機(jī)會的課。第一，整個過程中，我們在做完前面一些基本實(shí)驗(yàn)后，再去設(shè)計一個用自己所學(xué)到的知識技術(shù)的實(shí)驗(yàn)，有了一個整體的了解，也是對一整套技術(shù)的回顧與應(yīng)用。從設(shè)計中所要用到的試劑、儀器，到實(shí)驗(yàn)中試劑的具體用量，儀器使用的具體參數(shù)，以及引物的設(shè)計和整個實(shí)驗(yàn)的時間安排等等都要有明確的概念，可以說是給了我一次科學(xué)探究的機(jī)會。第二，設(shè)計實(shí)驗(yàn)后我們自己去操作檢驗(yàn)它的可行性，檢驗(yàn)自己設(shè)計的實(shí)驗(yàn)?zāi)懿荒軌虺晒?，更重要的是整個過程對我們以后從事相關(guān)工作有著非常重要的幫助，所以這是非常有意義的。

總的來說，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是一門非常好的實(shí)驗(yàn)課程。

設(shè)計實(shí)驗(yàn)和具體操作的感想 生物科學(xué)2001級谷波

2003.12.22

設(shè)計階段：

我們組原本的想法有點(diǎn)不切實(shí)際。我們打算在瑞士的一個酶庫網(wǎng)站上找到一種酶，再從genenbank中找到這種酶的全序列，再自行設(shè)計引物。我們甚至下載了引物設(shè)計軟件。然而我們輸入某種酶某段功能片段的名稱卻從genebank中得到了成百上千序列，我們放棄了。只是從多篇文獻(xiàn)中找到一種酶的某段基因把它的引物和表達(dá)載體進(jìn)行改造和改換，以符合老師提供的限制性內(nèi)切酶。而PCR的溫度與循環(huán)次數(shù)，及其余的各種步驟，僅僅是把是實(shí)驗(yàn)書上的串聯(lián)在一起，并沒有考慮任何改動，更別提摸索實(shí)驗(yàn)條件的部分了。當(dāng)我們的老師講評時，我才了解到，我們的設(shè)計是多么的不充分，成功率有多低。

操作階段：

通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計，我最大的收獲是有了串起已經(jīng)做過的實(shí)驗(yàn)的思路，也明白了做重組的各個步驟的原理。所以，當(dāng)我拿到老師給的設(shè)計方案時，我的思路很清晰。然而具體的操作又暴漏出許多問題。首先是操作時不能做到提前思考，大家往往只會照方抓藥，不能事先想清楚為何要這樣做。這使我們常常忽略細(xì)節(jié)的地方，造成時間的浪費(fèi)甚至結(jié)果不理想。比如我們把第二次回收時的重要數(shù)據(jù)遺失。特別是寫報告時，更會感覺到中間結(jié)果記錄的不詳細(xì)，以至分析原因時沒有具體的可依賴的結(jié)果做支持。還有就是中間各個步驟的現(xiàn)象，如果我們能從最基本的實(shí)驗(yàn)時就觀察現(xiàn)象，之后再做重復(fù)或類似的實(shí)驗(yàn)時，就能及時判斷實(shí)驗(yàn)每一步的正確與否，便于及時糾正錯誤。最后是我們實(shí)驗(yàn)時心態(tài)不夠正確，實(shí)驗(yàn)就是要?dú)v經(jīng)失敗和重復(fù)，不能面對不良結(jié)果時就急噪起來，不能心平氣和的繼續(xù)下去，甚至失去探索的動力。每當(dāng)我們進(jìn)度落后時，大家常常焦急的追趕其它組，往往造成不該出現(xiàn)的錯誤或遺漏。

實(shí)際操作不同于理論學(xué)習(xí)，它要求我們事事親臨，面面俱到，并且積累經(jīng)驗(yàn)，這樣才能從細(xì)微處窺探整個實(shí)驗(yàn)的成敗。這正應(yīng)了老師所說：“我們需要心靈，手巧，兼肯干的學(xué)生”心靈有賴于勤思考，手巧還需要多實(shí)踐總結(jié)，肯干則要求我們持之以恒，腳踏實(shí)地我們會朝這個方向努力的。

生命科學(xué)學(xué)院2002碩 神經(jīng)生物學(xué)專業(yè)

馬駿

我是神經(jīng)生物學(xué)專業(yè)研二的學(xué)生。我在研一時選修了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課，在一個學(xué)期的學(xué)習(xí)中所獲甚多。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)我們主要做的大實(shí)驗(yàn)包括感受態(tài)的制備、質(zhì)粒的提取及鑒定、蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)。我們在本科和研一的時候?qū)W習(xí)了分子生物學(xué)的理論知識，但通過大實(shí)驗(yàn)親身實(shí)踐后才更深刻的理解了這些理論知識，并且在遇到問題－解決問題的過程中，了解了這些知識用于實(shí)驗(yàn)時應(yīng)注意的細(xì)節(jié)。通過系統(tǒng)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)，我還了解了實(shí)驗(yàn)規(guī)劃和實(shí)驗(yàn)安排的重性。分子生物學(xué)大實(shí)驗(yàn)鍛煉了我的實(shí)驗(yàn)操作技能，培養(yǎng)了我耐心細(xì)致的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣，這都有益于我現(xiàn)在所進(jìn)行的課題研究，避免了走彎路，提高了實(shí)驗(yàn)效率。所以我認(rèn)為在進(jìn)行正式的課題研究之前進(jìn)行分子生物學(xué)大實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)是很必要的。師弟師妹們請認(rèn)真學(xué)習(xí)：）

實(shí)驗(yàn)心得

我是北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)2002級的碩士研究生，在研一第一學(xué)期參加了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程。這門課程將分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作的理論與實(shí)踐相結(jié)合，不僅使我在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技能方面得到系統(tǒng)的訓(xùn)練，而且讓我對具體實(shí)驗(yàn)操作的原理有了清晰地認(rèn)識。尤為難得的是，作為一門實(shí)驗(yàn)課，它還鍛煉了我運(yùn)用已學(xué)到的理論知識和已掌握的實(shí)驗(yàn)技能綜合解決科學(xué)問題的能力。這些都為我之后研究生階段的工作做了必要的準(zhǔn)備，打下了良好的基礎(chǔ)。

這門課程開設(shè)的實(shí)驗(yàn)以綜合性為主，涵蓋面廣，幾乎包括一般分子生物學(xué)研究會涉及的所有內(nèi)容：最基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA；基因克隆所要用到的技術(shù)，如質(zhì)粒提取、DNA重組及重組子篩選、細(xì)菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)等；還有一些其他的常用技術(shù)，如動、植物基因組DNA的提取、植物總RNA的提取、PCR擴(kuò)增、蛋白質(zhì)印跡、Southern雜交等。

我研究生階段的一部分工作是要將外源基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入植物中，并鑒定轉(zhuǎn)化是否成功。首先要用到質(zhì)粒提取、DNA重組等技術(shù)來構(gòu)建插入有外源基因的表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化植物成功后，就需要提取植物基因組DNA及總RNA，利用PCR擴(kuò)增、Southern雜交、RT-PCR、蛋白質(zhì)印跡等技術(shù)，對外源基因進(jìn)行不同水平的鑒定。

正是因?yàn)榉肿由飳W(xué)實(shí)驗(yàn)課對基本原理的詳細(xì)講解、對實(shí)驗(yàn)技能的系統(tǒng)訓(xùn)練，使我在工作中比較容易上手，工作進(jìn)度也有了保證。另外，通過在這門課上系統(tǒng)地、全面的學(xué)習(xí)，也使我在工作需要學(xué)習(xí)新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)時，觸類旁通，比較容易理解消化。

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程如何應(yīng)用于科研之我見

生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè) 2003研 李彥杰

作為一名生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)一年級的研究生，在生命科學(xué)領(lǐng)域5年的求知探索中，我深切體會到這期間學(xué)習(xí)的各門課程，包括生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、生理學(xué)，尤其是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程，對培養(yǎng)我今后獨(dú)立進(jìn)行科研，及提高科研能力、拓寬科研思路是不可或缺的。由于它所包含的內(nèi)容與科研連接最直接，最緊密，不僅教給我們實(shí)驗(yàn)的技術(shù)方法，還教給我們設(shè)計實(shí)驗(yàn)的思路及科研中必不可少的合作精神，可以說是生物科研最重要的基礎(chǔ)課之一。

生物學(xué)方面的科研離不開我們在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中學(xué)到的技術(shù)和方法，而為了達(dá)到同一個實(shí)驗(yàn)?zāi)康目捎玫募夹g(shù)與方法常常不止一種，如何選擇最合適的方法以取得最佳實(shí)驗(yàn)結(jié)果其實(shí)就是靈活應(yīng)用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所學(xué)于科研的過程。以下是結(jié)合我的課題的一點(diǎn)粗淺體會。

我的科研課題是小鼠腦紅蛋白及突變體的設(shè)計、融合表達(dá)、蛋白純化及結(jié)構(gòu)、性質(zhì)測定，基本的流程是從小鼠腦組織中提取總RNA，設(shè)計帶有合適酶切位點(diǎn)的引物，利用RT-PCR技術(shù)獲得雙鏈cDNA，再將雙鏈cDNA雙酶切的產(chǎn)物與同樣經(jīng)雙酶切的GST融合表達(dá)載體pGEX-4T-3相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，在2YT培養(yǎng)基中表達(dá)，過GST親和層析柱初純蛋白，凝血酶酶切獲腦紅蛋白和谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)酶，再經(jīng)Sephadex-G75分子篩層析柱分離，得到電泳純的腦紅蛋白，冷干保存。

從第一步提取總RNA到轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，這些步驟全都是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課上學(xué)習(xí)過的基本實(shí)驗(yàn)方法，比如核酸電泳、蛋白電泳、PCR、構(gòu)建載體、感受態(tài)制備、轉(zhuǎn)化等，由于這些技術(shù)已經(jīng)在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課上系統(tǒng)學(xué)習(xí)并親身操作，因此在科研中使用這些技術(shù)時就能駕輕就熟。

但又不能完全照搬課本，有時需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的具體問題對方法進(jìn)行改良，添加適合的步驟或刪減不需要的步驟。例如分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)總RNA提取效果采用的是甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳法，甲醛的作用是使RNA酶變性，阻止其降解RNA，電泳結(jié)果能否出現(xiàn)18S和28S的條帶能說明RNA 的主要成分rRNA是否完整，而我的課題中提總RNA的目的是需要其中的mRNA作為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR，因此電泳檢測只有相對意義，所以只用一般的電泳采用稍高的電壓即可。設(shè)計RT-PCR引物過程中，嚴(yán)格按照分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程所學(xué)的PCR原理部分進(jìn)行設(shè)計，設(shè)計出的引物滿足引物長度15－30bp、G+C含量40％－50％、堿基隨機(jī)分布和引物3'端與模板嚴(yán)格配對這幾個基本要求。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用oligodT做第一輪引物能擴(kuò)增成功，而用特異性引物則擴(kuò)增失敗，分析原因可能是RNA二級結(jié)構(gòu)嚴(yán)重，因此需要消除RNA二級結(jié)構(gòu)，使特異性引物能與模板緊密結(jié)合，采用擴(kuò)增前將模板在65℃保溫10分鐘的方法成功解決了這一問題。

目前我的課題已經(jīng)進(jìn)行到蛋白純化步驟，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課上所學(xué)幫助我順利完成實(shí)驗(yàn)的上游即分子生物學(xué)階段的初步工作。

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課的收獲及其在實(shí)際科研中的應(yīng)用 生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)03級碩研 白 巍

“對一名生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)的研究生來說，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是必須掌握的基本功。熟練的掌握基本的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)是開展實(shí)際研究工作的前提?！边@是我在一年實(shí)驗(yàn)工作中的最大體會。因此，更加體會到，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課對我的幫助有多大!

在這門課中，老師將分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的一些基本方法和理論，包括：載體；分子生物學(xué)中常用的工具酶；電泳；PCR基因擴(kuò)增；基因表達(dá)；印跡法及分子檢測；克隆化定點(diǎn)誘變等等貫穿在感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化；質(zhì)粒的提取和酶切；哺乳動物基因組DNA的分離和提?。恢参镏锌俁NA的提取等十幾個實(shí)驗(yàn)中講授，讓我們不但掌握了實(shí)驗(yàn)技術(shù)，更重要的是使我們弄懂這些實(shí)驗(yàn)的原理，為在自己的實(shí)際科研中運(yùn)用這些方法設(shè)計實(shí)驗(yàn)更好的完成科研工作打下基礎(chǔ)。

我自己在前一段時間的實(shí)驗(yàn)中就應(yīng)用了許多分之生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課中學(xué)到的知識.我在做真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中需要用一種無關(guān)基因作對照,我們選擇的是pKSgp120基因.為了轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞我們需將其克隆于真核載體PIRES1neo中.我們先將空載體PIRES1neo和帶有pKSgp120基因的PUC19分別預(yù)轉(zhuǎn)化在大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞中,然后從中大量提取質(zhì)粒.為免去設(shè)計定做引物在時間和費(fèi)用上的浪費(fèi),我們設(shè)計了一個平端連接方法:將空載體PIRES1neo用EcoRV酶切,再用CIAP(堿性磷酸酶)去磷;將PUC19/ pKSgp120用EcoRI和HindⅢ雙酶切,然后將兩者用T4DNA連接酶連接酶連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞中在從中提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定.可見,沒有分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課上對于實(shí)驗(yàn)基本方法理論的學(xué)習(xí)和對一些基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的操作訓(xùn)練,是很難完成上述實(shí)驗(yàn)工作的!

此外,在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課中,老師結(jié)合實(shí)際,由淺入深的給我們講解了許多實(shí)驗(yàn)的原理和設(shè)計實(shí)驗(yàn)的方法思路,更是對我以后的實(shí)驗(yàn)工作有很大的指導(dǎo)作用,使我受益費(fèi)淺!

中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 2003級研究生 馬艷妮

半年分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課的學(xué)習(xí)，使我掌握了很多分子生物學(xué)的基本方法和技術(shù)，如核酸提取、純化、鑒定的方法，克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建，PCR技術(shù)等，這些基本方法的學(xué)習(xí)及實(shí)驗(yàn)技能的訓(xùn)練，為我現(xiàn)階段的實(shí)驗(yàn)工作奠定了基礎(chǔ)。課程中所開設(shè)的很多實(shí)驗(yàn)，如藍(lán)白斑篩選、Southern雜交等，均是很多高校本科教學(xué)中所不曾涉及的，為我們研究生階段的學(xué)習(xí)提供了競爭優(yōu)勢。在課堂中所培養(yǎng)的良好實(shí)驗(yàn)習(xí)慣及對待實(shí)驗(yàn)科學(xué)、認(rèn)真的態(tài)度也使我收益匪淺，并在今后的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)堅持。在此感謝所有為這門課程認(rèn)真工作的老師和同學(xué)們，謝謝你們！

第五篇：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義

實(shí)驗(yàn) 質(zhì)粒DNA的堿裂解法提取與純化

一、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。

質(zhì)粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質(zhì)粒DNA的提取，本實(shí)驗(yàn)采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，其基本原理為：當(dāng)菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速復(fù)性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。

純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對較小及共價閉環(huán)兩個性質(zhì)。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費(fèi)時。對于小量制備的質(zhì)粒DNA，經(jīng)過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA，所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標(biāo)記等要求，故在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用。

二、實(shí)驗(yàn)試劑

1、溶液Ⅰ： 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高壓滅菌15min，貯存于4℃。

2、溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時配置。

3、溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4、TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5、苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）

6、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）7、5×TBE：Tris 堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

8、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

9、RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free)RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20℃。

10、6×loading buffer（上樣緩沖液）：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11、1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5μg/ml（注意：EB為強(qiáng)誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液0.5×TBE），即可上樣。

三、實(shí)驗(yàn)操作

1、挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于2.0ml LB（含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，37℃、250g振蕩培養(yǎng)過夜（約12-14hr）。

2、取1.0ml培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心8000g×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。

3、將細(xì)菌沉淀重懸于100μl預(yù)冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。

4、加200μl新鮮配制的溶液Ⅱ，顛倒數(shù)次混勻（不要劇烈振蕩），并將離心管放置于冰上2-3min，使細(xì)胞膜裂解（溶液Ⅱ?yàn)榱呀庖?，故離心管中菌液逐漸變清）。

5、加入150μl預(yù)冷的溶液Ⅲ，將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀,4℃離心8000g × 10min, 小心移出上清于一新微量離心管中。

6、加入450μl的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4℃離心8000g × 10min。

7、小心移出上清于一新微量離心管中，加入2.0倍體積（1ml）預(yù)冷的無水乙醇，混勻，室溫放置５min，4℃離心12000g×10min，棄上清。

8、加入1ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1次，4℃離心8000g×7min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干或吹干（不能過于干燥，造成溶解困難）。

9、沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

四、質(zhì)粒DNA的電泳檢測

觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色。該物質(zhì)含有一個可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個平面基團(tuán)，這個基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致染料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身則在302nm和366nm有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來。因此，當(dāng)凝膠中含有游離溴化乙錠時即可以檢測到少量的DNA。

取制備的質(zhì)粒DNA 1-2μl，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣,采用 1-5V/cm的電壓，使DNA分子從負(fù)極向正極移動至合適位置，取出凝膠置紫外燈下檢測，攝片。

五、注意事項(xiàng)

本裂解法小量制備質(zhì)粒 DNA重復(fù)性好，一般無麻煩。若所提取質(zhì)粒 DNA不能被限制性內(nèi)切酶切割，可通過酚/氯仿再次抽提，以清除雜質(zhì)來解決問題。

六、習(xí)題：

1、什么是質(zhì)粒？質(zhì)粒有什么主要用途？

2、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中用的質(zhì)粒是由野生型改建而來的，它必須具備哪三個基本要素？

3、制備的質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠上通常以三種形式條帶存在，它們分別是什么？

實(shí)驗(yàn) 瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

（1）學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的基本原理；

（2）掌握使用水平式電泳儀的方法；

二、實(shí)驗(yàn)原理

瓊脂糖凝膠電泳是基因工程實(shí)驗(yàn)室中分離鑒定核酸的常規(guī)方法。核酸是兩性電解質(zhì)，其等電點(diǎn)為pH2-2.5，在常規(guī)的電泳緩沖液中（pH約8.5），核酸分子帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。核酸分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，但主要為分子篩效應(yīng)。因此，核酸分子的遷移率由下列幾種因素決定：

（1）DNA的分子大小。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中移動，因而遷移得越慢。

（2）DNA分子的構(gòu)象。當(dāng)DNA分子處于不同構(gòu)象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關(guān),還和它本身構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠中移動的速度是不一樣的，超螺旋DNA移動得最快，而開環(huán)狀DNA移動最慢。如在電泳鑒定質(zhì)粒純度時發(fā)現(xiàn)凝膠上有數(shù)條DNA帶難以確定是質(zhì)粒DNA不同構(gòu)象引起還是因?yàn)楹衅渌鸇NA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內(nèi)切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現(xiàn)相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。

（3）電源電壓。在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強(qiáng)度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強(qiáng)升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率達(dá)到最大，所加電壓不得超過5v/cm。

（4）離子強(qiáng)度影響。電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時（如誤用蒸餾水配制凝膠），電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動；在高離子強(qiáng)度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液），則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱，嚴(yán)重時會引起凝膠熔化或DNA變性。

溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1）能插入DNA分子中形成復(fù)合物，在波長為254nm紫外光照射下EB能發(fā)射熒光，而且熒光的強(qiáng)度正比于核酸的含量，如將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作電泳對照，就可估算出待測樣品的濃度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以現(xiàn)在也開發(fā)出了安全的染料，如Sybergreen。

常規(guī)的水平式瓊脂糖凝膠電泳適合于DNA和RNA的分離鑒定；但經(jīng)甲醛進(jìn)行變性處理的瓊脂糖電泳更適用于RNA的分離鑒定和Northern 雜交，因?yàn)樽冃院蟮腞NA是單鏈，其泳動速度與相同大小的DNA分子量一樣，因而可以進(jìn)行RNA分子大小的測定，而且染色后條帶更為銳利，也更牢固結(jié)合于硝酸纖維素膜上，與放射性或非放射性標(biāo)記的探針發(fā)生高效雜交。

三、試劑與器材

（一）材料

電泳儀、水平電泳槽、樣品梳子、瓊脂糖等

（二）試劑 1、50*TAE(1000mL)：242g Tris, 57.1mL 冰醋酸，18.6g EDTA。

2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力攪拌數(shù)小時以確保其完全溶解，分裝，室溫避光保存。

3、DNA加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。

4、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)

四、操作方法

常規(guī)的水平式瓊脂糖電泳：

制備瓊脂糖凝膠：按照被分離DNA分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量；一般情況下，可參考下表：

瓊脂糖的含量（%）分離線狀DNA分子的有效范圍（Kb）

0.3 60-5

0.6 20-1

0.7 10-0.8

0.9 7-0.5

1.2 6-0.4

1.5 4-0.2

2.0 3-0.1

1、制備瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖，加入1x電泳緩沖液，待水合數(shù)分鐘后，置微波爐中將瓊脂糖融化均勻。在加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液；加熱時應(yīng)蓋上封口膜,以減少水份蒸發(fā)。

2、膠板的制備：將膠槽置于制膠板上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙，待膠溶液冷卻至50℃左右時，加入最終濃度為0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分鐘)，搖勻，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡；待凝膠冷卻凝固后，垂直輕拔梳子；將凝膠放入電泳槽內(nèi)，加入1x電泳緩沖液，使電泳緩沖液液面剛高出瓊脂糖凝膠面；

3、加樣：點(diǎn)樣板或薄膜上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X。用10 μL微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個樣品，應(yīng)更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序和點(diǎn)樣量）。

4、電泳：加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。當(dāng)瓊脂糖濃度低于0.5%，電泳溫度不能太高。樣品由負(fù)極（黑色）向正極（紅色）方向移動。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當(dāng)溴酚藍(lán)移動到距離膠板中央時，停止電泳。

5、觀察和拍照：電泳完畢，取出凝膠。在波長為254nm的紫外燈下觀察染色后（2）的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。于凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存之。

五、注意事項(xiàng)

1、EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，易揮發(fā)，配制和使用時都應(yīng)戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗或丟棄。簡單處理方法為：加入大量的水進(jìn)行稀釋（達(dá)到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍體積新鮮配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍體積新鮮配制的0.5mol/L 的亞硝酸鈉，混勻，放置1天后，加入過量的1mol/L碳酸氫鈉。如此處理后的EB的誘變活性可降至原來的1/200左右。

2、由于EB會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使DNA遷移率降低。因此，如果要準(zhǔn)確地測定DNA的分子量，應(yīng)該采用跑完電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。

六、實(shí)驗(yàn)報告要求與思考題

1、附上電泳結(jié)果的圖片并進(jìn)行正確的標(biāo)注（如下圖）

M：1Kb DNA ladder；1：質(zhì)粒DNA

2、瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素的影響？

3、如果樣品電泳后很久都沒有跑出點(diǎn)樣孔，你認(rèn)為有哪幾方面的原因？

4、為什么分子生物學(xué)實(shí)施時要擔(dān)心EB？

5、瓊脂糖凝膠電泳時膠中DNA是靠什么發(fā)出熒光的？為什么？

電泳流程圖：

實(shí)驗(yàn) PCR擴(kuò)增eGFP基因

一、PCR技術(shù)的基本原理

PCR類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。(Plateau)。到達(dá)平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

PCR 技術(shù)應(yīng)用廣泛，不可能有這樣一套條件滿足所有的實(shí)驗(yàn)，但本實(shí)驗(yàn)所介紹的方法可適應(yīng)于大多數(shù)DNA 擴(kuò)增反應(yīng)，即使有的不適應(yīng)，至少也確定了一個共同的起點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上可以作多種變化。不過下列因素在實(shí)驗(yàn)應(yīng)用時應(yīng)予以特別注意，以求取得滿意結(jié)果。

1、模板：單、雙鏈DNA 和RNA都可以作為PCR樣品，若起始材料是RNA，須先通過逆轉(zhuǎn)錄得取第一條cDNA。雖然PCR 可以僅用極微量的樣品，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般宜用ng 量級的克隆DNA，ug 級的染色體DNA，待擴(kuò)增樣品質(zhì)量要求較低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制劑以及能結(jié)合DNA 的蛋白質(zhì)。

2、引物：引物是決定PCR 結(jié)果的關(guān)鍵，下列原則有助于引物的合理設(shè)計。（1）盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，GC 含量類似于被擴(kuò)增片段的引物，盡量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它異常序列的引物。（2）避免具有明顯二級結(jié)構(gòu)（尤其是在引物3'—末端）的序列。

3、防止引物間的互補(bǔ)，特別要注意避免具有3'末端重疊的序列。

4、引物的長度約為20個堿基，較長引物較好，但成本增加，短引物則特異性降低。

5、引物濃度不宜偏高，過高易形成二聚體解鏈；然后冷卻至37—55℃，使引物與模板退

二、實(shí)驗(yàn)試劑

（一）儀器與器皿

PRC 擴(kuò)增儀，瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備，微量取樣器，一次性eppendorf管，凝膠成像儀

（二）試劑與材料

1、瓊脂糖凝膠電泳試劑

1）電泳緩沖液：Tris—乙酸0.04mol/L PH8.0 0.002mol/L EDTA

2）加樣緩沖液：0.25%溴酚蘭40% w/v蔗糖

3）溴化乙錠溶液：0.05mg/ml溴化乙錠/水

4）瓊脂糖

2、TaqDNA 多聚酶3、5′反應(yīng)緩沖液：

125mmol/L Tris-HCl pH8.2；10mmol/L MgCl2；0.5mg/ml gelatin；125mmol/L(NH4)2SO4； Formamide 25%

4、混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2.5 mmol/L)

5、DNA 模板

6、引物 1（10μmol/L）

7、引物 2（10μmol/L）

8、無菌水

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1、按順序在200μl 指形管中加入以下試劑與樣品：（因購入的試劑批次不同，加樣時有所差別，以預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為準(zhǔn)。

1）ddH2O 37μl

2）10*Buffer 5μl(含有MgCL2)

3）dNTP ２μl

4）引物1(上游)２μl

5）引物2（下游）２μl

6）模板 1μl（pEGFP質(zhì)粒）

7）TaqDNA聚合酶１μl（2.5U）總體積共50μl

2、在PCR 擴(kuò)增儀上按以下反應(yīng)條件編入程序：（以下為參考值，因擴(kuò)增的DNA片段不同，各類PCR 擴(kuò)增儀程序設(shè)定各不相同，編程過程視擴(kuò)增的DNA 片段的要求及儀器而定參數(shù)。）

1)預(yù)變性 94℃ 3 分種

2)循環(huán)條件（30 次）

變性 94℃ 30 秒

復(fù)性 55℃ 30 秒

延伸 72℃ 1分

3)延長延伸 72℃ 7 分鐘

編完反應(yīng)程序，置反應(yīng)管于PCR擴(kuò)增儀的反應(yīng)孔中，開動機(jī)器，擴(kuò)增循環(huán)反應(yīng)開始。

3、PCR 擴(kuò)增完畢，配1.5%瓊脂糖凝膠，電泳觀察結(jié)果。

4、凝膠成像儀或紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是否已擴(kuò)增到實(shí)驗(yàn)設(shè)計的DNA片段

四、習(xí)題

1、PCR反應(yīng)液中主要成分是哪些？在PCR反應(yīng)過程中各起什么作用？

2、為什么在PCR反應(yīng)過程中，使用三個不同的溫度變化？

3、用PCR擴(kuò)增目的基因，要想得到特異性產(chǎn)物需注意哪些事項(xiàng)？

實(shí)驗(yàn) 從動物組織（豬肝）中提取DNA

一、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

采用SDS裂解和蛋白酶K消化法從豬肝中提取DNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。目的

(1)掌握SDS裂解法從豬肝中的原理和方法；(2)鞏固DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析實(shí)驗(yàn)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

DNA是一切生物細(xì)胞的重要組成成分，主要存在于細(xì)胞核中。通過研磨和SDS作用破碎細(xì)胞；苯酚和氯仿可使蛋白質(zhì)變性，用其混合液（酚：氯仿：異戊醇）重復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性，然后離心除去變性蛋白質(zhì)；RNase降解RNA，從而得到純凈的DNA分子。

三、實(shí)驗(yàn)材料

新鮮豬肝

TES 緩沖液 ： pH8.0 Tris-HCl 10 mmoL/L , EDTA 1mmoL/ L , SDS 0.1 mmoL/ L

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1、剪取約0.5g肝臟組織，放入到研缽中磨碎；

2、向研缽中再加入1 ml TES輕輕研磨，將TES與破碎的組織混勻；

3、吸取535 μl組織勻漿液于2 ml EP管中，再加入60 μl SDS（10%），5.0 μl蛋白酶K，充分混勻后，于56°C保溫1 h，每30分鐘輕搖1次；

4、放置到室溫，加入等體積飽和酚（600μl），顛倒混勻，11000 rpm，離心10 min，吸取400 μl水相，并轉(zhuǎn)移至一個新的1.5 ml離心管中；

5、加入2倍體積（1000 μl）的無水乙醇和1/10倍體積（40 μl）3 M 醋酸鈉沉淀DNA，12000 rpm離心10 min，棄乙醇；

6、加入適量TE溶解DNA和RNAse A（具體依DNA的多少而定），并利用0.7%的瓊 脂溏進(jìn)行電泳分析。

五、注意事項(xiàng)

1、在將豬肝剪碎前要將豬肝清洗干凈，除去脂肪及系膜成分。

2、抽提每一步用力要柔和，防止機(jī)械剪切力對DNA的損傷。

3、取上層清液時，注意不要吸起中間的蛋白質(zhì)層。

4、乙醇漂洗去乙醇時，不要蕩起DNA。

5、離心后，不要晃動離心管，拿管要穩(wěn)。

6、在乙醇沉淀后，經(jīng)離心要觀察留在EP管中的小白點(diǎn)，其主要成分就是DNA，在以后的實(shí)驗(yàn)中都要細(xì)心觀察，防止因?qū)⑿“c(diǎn)丟失。

六、習(xí)題

1、為了獲得高質(zhì)量的肝臟DNA，在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意什么。

2、結(jié)合本人操作體會，總結(jié)在提取過程中如何避免大分子DNA的降解。

3、核酸提取中，去除蛋白質(zhì)的方法有哪些？ 實(shí)驗(yàn) 限制性內(nèi)切酶切割DNA

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1． 通過對DNA的酶切，學(xué)會設(shè)計構(gòu)建體外重組DNA分子； 2． 根據(jù)目的基因合理選擇載體與限制性內(nèi)切酶； 3． 掌握DNA的酶切技術(shù)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

限制性內(nèi)切酶是從細(xì)菌中分離出來的一種能在特異位點(diǎn)切割DNA分子的核酸內(nèi)切酶，目前已從多種細(xì)菌中分離出超過400種，識別各自不同的核苷酸順序，這一順序大多為具有一對稱中心的回文序列，如從大腸桿菌中分離的 EcoR I識別?GAATTC? 切割后產(chǎn)生?CTTAAG?、?G 和

AATTC?的末端，?CTTAAG?該末端由于有一段小的能互補(bǔ)配對的單鏈突出，故稱為粘性末端。切割后的末端為3’-OH和5’-磷酸基團(tuán)，即?G-OH和?CTTAA-P。

有的限制性酶識別四堿基對的順序，如 San3A識別?GATC ?；有的識別六

堿基對，如上述的ECOR I。識別四堿基對的內(nèi)切酶由于識別順序在DNA出現(xiàn)的頻率更高（四堿基酶為44=256，六堿基酶為46＝4096），因而可將DNA切割成更小的片段，而識別八堿基對的Not I?GCGGCCGC?、?CGCCGGCG? 則識別和切割位點(diǎn)更少（48＝65536），但堿基并不以均等的概率出現(xiàn)，因而切割后產(chǎn)生的片段變化范圍很大。

＋

限制性內(nèi)切酶作用的溫度一般為37℃，反應(yīng)體系中以Mg2為唯一的輔助因子，且要求pH緩沖在7.5左右。

商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃貯存，活性通常較高，5u/μl（每單位即最適條件下1小時內(nèi)完全酶解1μg DNA的酶量）。

三、實(shí)驗(yàn)材料

待酶切的DNA樣品

四、實(shí)驗(yàn)儀器、器皿及試劑

1、儀器：可調(diào)微量加樣器、恒溫水浴箱、電泳儀、電泳槽、紫外檢測燈

2、器皿：Eppendorf管、Tip、試管架

3、試劑：標(biāo)準(zhǔn)DNA(Marker)

EcoRI限制性內(nèi)切酶

10×buffer：50mmol/l NaCl

10mmol/l Tris-HCl(pH7.5)

10mmol/l MgCl2

lmmol/l

DTT（二硫蘇糖醇）

五、實(shí)驗(yàn)步驟

1、將DNA樣品8.5μl(質(zhì)粒pEGFP, 1μg)

2、加入1μl 10×buffer，酶解buffer由廠家提供。

3、加入1u（0.5μl）的限制性內(nèi)切酶EcoRI（限制性酶很昂貴，從-20℃取出要置于冰上，吸取要新的Tip頭，以免污染雜質(zhì)，吸完后盡快放回冰箱）。

4、混勻反應(yīng)液后，稍離心使液體聚集，置37℃溫育１小時。

5、進(jìn)行電泳檢查酶切結(jié)果，100V 25分鐘。

6、紫外燈下觀察消化效果。

六、注意事項(xiàng)

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)大多為微量操作，DNA樣品與限制性內(nèi)切酶的用量都極少，必須嚴(yán)格注意吸樣量的準(zhǔn)確性以保證酶切效果最佳?，F(xiàn)介紹三種微量取樣方法：

(1)吸樣時，將Tip尖剛剛接觸到液面時，輕輕吸取。此法可吸取0.2~0.5μl的樣品，注意不要將Tip尖全部插入溶液，這樣Tip壁上會沾上很多的樣品，導(dǎo)致吸樣不準(zhǔn)。

(2)用1cm長的塑料毛細(xì)管代替Tip吸樣，此法也可吸取0.2~0.5μl的樣量。

(3)目前也有細(xì)長Tip出售，專門用于吸取微量樣品。

2、限制性內(nèi)切酶價格比較貴，因此要注意不使其污染而導(dǎo)致浪費(fèi)。這就要求每次吸酶時要用新的無菌Tip。另一個造成限制性內(nèi)切酶浪費(fèi)的因素就是限制性內(nèi)切酶的失活。因此，要注意加樣次序，即各項(xiàng)試劑加好后，最后才加酶，并要在冰上操作，且操作要盡可能快，以使限制性內(nèi)切酶拿出冰箱的時間盡可能短。

若用同一酶消化很多樣品時，可先計算出所需酶量（可稍多計一點(diǎn)），取出此量的酶與1×緩沖液混合，然后再分裝至各個反應(yīng)管內(nèi)。這樣可節(jié)約用酶且縮短操作過程、減少污染機(jī)會。

3、開啟Eppendorf管時，手不要接觸到管蓋內(nèi)面，以防雜酶污染。

4、樣品在37℃與65℃保溫時，要注意將Eppendorf管蓋嚴(yán)，以防水進(jìn)入管內(nèi)造成實(shí)驗(yàn)失敗。

5、無實(shí)驗(yàn)必要應(yīng)盡量避免長時間酶消化樣品。因長時間消化，限制酶溶液中可能存在的雜酶會影響試驗(yàn)結(jié)果。

七、習(xí)題

1、限制性核酸內(nèi)切酶天然存在于什么生物體內(nèi)？

2、什么是細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng)？限制-修飾系統(tǒng)對細(xì)菌有什么用途？

3、限制性內(nèi)切酶有幾類？這幾類限制性內(nèi)切酶各有什么特點(diǎn)？可作為工具酶的限制性內(nèi)切酶是哪一類？為什么？

4、限制性內(nèi)切酶的識別序列有什么特點(diǎn)？稱為什么序列？

5、酶通常在什么溫度中保存？為什么酶在該溫度下保存不會結(jié)凍？酶最后工作的時候其甘油濃度必須低于多少？ 6、1個單位（1 U）的限制性內(nèi)切酶代表什么意思？

實(shí)驗(yàn) 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握熱激法或電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化子的鑒定方法。實(shí)驗(yàn)材料：質(zhì)粒DNA；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

二、實(shí)驗(yàn)原理

質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)粒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)重組克隆的增殖，便于后續(xù)分子操作?？梢圆捎枚喾N方法篩選和鑒定目的克隆。

（1）熱激法：大腸桿菌在0℃ CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基－鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，重組子基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉(zhuǎn)化子。

（2）電轉(zhuǎn)化法：外加于細(xì)胞膜上的電場造成細(xì)胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，不僅有利于離子和水進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，也有利于孔DNA等大分子進(jìn)入。同時DNA在電場中形成的極性對于它運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞也是非常重要的。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1、制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的250ml LB固體培養(yǎng)基中（冷卻止55攝氏度以下）加入Amp至終濃度50μg/ml，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；

2、取出1管制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；

3、每100μl感受態(tài)細(xì)胞加入約20ng質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，在冰上放置30分鐘；

4、熱擊：將離心管放置42℃水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動離心管；

5、冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，放置1－2分鐘；

6、復(fù)蘇：每管加400 μl LB培養(yǎng)基，在37℃搖床溫和搖動溫育45分鐘，使細(xì)菌復(fù)蘇；

7、布皿：取適當(dāng)體積均勻涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板；

8、培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)皿，于37℃培養(yǎng)12－16小時即可觀察到白色的菌落，即為轉(zhuǎn)化子。

四、結(jié)果與分析

計算轉(zhuǎn)化效率

菌落數(shù)/DNA質(zhì)量（μg）*稀釋倍數(shù)

五、習(xí)題

1、制備感受態(tài)細(xì)胞的關(guān)鍵是什么？

2、如果DNA轉(zhuǎn)化后，沒有得到轉(zhuǎn)化子或者轉(zhuǎn)化子很少，分析原因。

3、如何提高轉(zhuǎn)化效率？