第一篇：分子生物學實驗方案設計

梅衣屬ITS條形碼物種的快速鑒定

實驗目的：

一、學習并熟練地衣DNA提取技術

二、掌握PCR技術的原理及操作

三、DNA條形碼技術的應用

實驗技術路線：

1、地衣總DNA的提取

2、PCR擴增

3、基因測序

4、基因序列對比

地衣總DNA提取：

1.取帶有子囊盤或未有子囊盤的帶藻地衣體30~300mg，用無菌水沖洗，除去表面雜質，再用DNA提取液浸泡2~3h（4℃）。

2.將地衣體取出，濾紙吸干表面液體，剪碎放于預冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末狀。

3.將粉末小心、全部轉入1.5ml離心管中，加入400μL DNA提取液，混勻。

4.加入10% SDS 50μL、氯化芐150μL，振蕩混合，于50℃保溫1h，每隔10min振蕩混合一次。

5.保溫1h后，每管加入3mol/L NaAc 50μL，混勻冰浴15min.6.用等體積 酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）和等體積 酚：氯仿（1：1）各抽提一次，直至無白色沉淀為止。

7.移上清液于另一離心管，加入2倍體積無水乙醇，4℃放置2~3h，15000r/min，離心10min（4℃），棄上清液。

8.將沉淀用70%乙醇沖洗2次后，真空干燥，再加入50~80μL TE緩沖液，保存于冰箱（4℃）

PCR擴增：

稀釋50 倍用于后續 PCR 操作。真菌 ITS rDNA 由通用引 物 ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。

PCR 反應條件：95℃預變性 5min； 95℃變性 30s，52℃退火 30s，72℃延伸 2min，反應 32 個循環；72℃延伸 10min，4℃保存。反應結 束后，PCR 產物通過 0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗,ABI3730DNA 分析儀測序。

序列比對：

所獲測序結果序列包含小亞基部分結尾序列、ITS1-5.8S-ITS2、大亞基部分起始序列，去除大小 亞基部分序列后所得片段大小約 500bp，即為所需的序列

利用 DNAMAN（Lynnon Biosoft）軟件將測序結果同 GenBank 下載數據進行 比對分析，如果序列長度不同，則只保留共有區段。

如果該DNA序列與GenBank中梅衣屬的某個種的序列相同，則可確定所測定的地衣是哪個種。

實驗試劑：

一、DNA提取

1、DNA提取液（50mmol/L Tris HCL pH9.0;12.5mmol/L EDTA pH8.0）:（1）稱取7.5712gTris,加入150ml蒸餾水，加HCL調pH至9.0，定容至250ml（2）稱取3.6531gEDTA，加入20ml蒸餾水，調pH至8.0，定容至250ml 2、10%SDS:稱取10gSDS，加入100ml蒸餾水

3、NaAc：0.51g醋酸鈉固體，加蒸餾水溶解，定容25ml

4、TE緩沖液：（1）1mol/L Tris-HCL(pH8.0)1ml(2)0.5mol/L EDTA(pH8.0)0.2ml 超純水至100ml

5、氯化芐

二、pcr試劑準備

1.DNA模版

2．對應目的基因的特異引物

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5．Taq酶

二、詳細配制比例

1．在冰浴中，按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。10×PCR buffer 5μl

dNTP mix（2mM）4μl

引物1（10pM）2μl

引物2（10pM）2μl

Taq酶（2U/μl）1μl

DNA模板（50ng-1μg/μl）1μl

加ddH2O至 50μl

視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

1、配制20μL反應體系，在PCR板中依次加入下列溶液： 模板DNA

2μL 引物1

1μL 引物2

1μL dNTP

1.5μL MgCl2

2μL 10×buffer

2μL ddH2O

10μL Taq酶

0.5μL

第二篇：分子生物學實驗總結

分子生物學實驗

1.TOMY全自動滅菌鍋的使用

（1）檢查排放蒸汽的水壺，腔體內的水位與托板齊平。（2）SET鍵設置溫度和時間（121℃，20min）（3）關閉排氣閥，Start機器開始運行，Check Heat檢查設置的溫度，Stop鍵終止機器運行。（4）程序運行結束，旋開排氣閥或機器自行排氣至壓力為0。溫度降至80℃以下壓力為0時方可開蓋。運行過程中勿接觸蓋子。（5）腔體內經常清潔。2.LB液體培養基（1000mL）

將胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g完全溶解在950mL去離子水中，用NaOH調節pH至7.0，加入去離子水至總體積為1000mL，121℃濕熱滅菌20min。冷卻后4℃保存備用。固體還要再加瓊脂。3.堿裂解法

堿裂解法提取質粒是根據共價閉合環狀質粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離它們的。在pH值介于12.0～12.5這個狹窄的范圍內，線性的DNA雙螺旋結構解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉合環狀質粒DNA的氫鍵會斷裂，但兩條互補鏈彼此纏繞，仍會緊密的結合在一起。當加入 pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液，恢復pH至中性時，共價閉合環狀質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此完全分開，復性就不會那么迅速而準確，它們纏繞形成網狀結構。通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA，蛋白質－SDS復合物等一起沉淀下來而被除去。

溶液Ⅰ：葡萄糖，Tris-HCl，EDTA 葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受機械作用而降解。EDTA可螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制DNase對DNA的降解作用。溶液Ⅱ：氫氧化鈉，SDS 氫氧化鈉加入后堿性環境12-12.5促使染色體DNA與質粒的變性解離成單鏈。SDS是一種陰離子去垢劑，它的主要作用有：①溶解細胞膜上的脂肪與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜；②解聚細胞中的核蛋白，使蛋白質與DNA分開；③SDS能與蛋白質結合成為SDS-蛋白質復合物，使蛋白質變性而沉淀；④SDS能抑制核酸酶的作用，防止對DNA的降解。

溶液Ⅲ：乙酸鉀。用pH4.2的KAc溶液是為了調整溶液pH至中性，使變性的質粒DNA能夠復性，并能穩定存在。而高鹽的3mol/L醋酸鉀(KAc)有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白質復合物凝聚而沉淀。4.loading buffer 電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油組成上樣緩沖液。作用：①增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內。②形成肉眼可見的指示帶，預測核酸電泳的速度和位置。③使樣品呈色，使加樣操作更方便。5.限制性內切酶（I型）限制性內切酶：能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。

(II型)限制性內切酶：能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內的固定位置上切割雙鏈。這類限制性內切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的，因此，這種限制性內切酶是DNA重組技術中最常用的工具酶之一。

（III型）限制性內切酶：也有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序,在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對不是特異性的。因此，這種限制性內切酶切割后產生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此不能應用于基因克隆。6.引物設計和選擇目的DNA序列區域時遵循下列原則： 引物長度約為16～30bp；引物中G+C含量通常為40%～60%，可按Tm＝4(G+C)+2(A+T)粗略估計引物的解鏈溫度；四種堿基應隨機分布，在3’端不存在連續3個G或C，因這樣易導致錯誤；引物3’端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應，以減少由于密碼子擺動產生的不配對；在引物內，尤其在3’端應不存在二級結構；兩引物之間尤其在3’端不能互補，以防出現引物二聚體，減少產量；引物5’端對擴增特異性影響不大，可引入酶切位點或突變位點；引物不與模板結合位點以外的序列互補；簡并引物應選用簡并程度低的密碼子；引物的濃度一般為0.1～0.5μmol/L，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性產物擴增，引物濃度偏低則降低產量。7.dNTP 常用的濃度為20～200μmol/L，而且4種dNTP的終濃度相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足而出現的錯誤摻入；dNTP濃度過高雖可加快反應速度，但會增加堿基的錯誤摻入率，同時會抑制Taq DNA聚合酶的反應活性；適當的低濃度會提高反應的精確度；注意協調Mg2+濃度和dNTP濃度之間的關系。8.感受態

處于對數生長期的細菌經低溫CaCl2處理后接受外源DNA的能力顯著增加。細菌處于容易吸收外源 DNA的狀態叫感受態。在自然條件下，很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內，但在人工構建的質粒載體中，一般缺乏此種轉移所必需的mob 基因，因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌，需誘導受體細菌產生一種短暫的感受態,以攝取外源DNA。9.轉化

轉化是將外源DNA 分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體(R-,M-)，它可以容忍外源DNA 分子進入體內并穩定地遺傳給后代。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。10.DNA連接酶

有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶；DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為了防止載體本身的自連，可以通過牛小腸堿性磷酸酶CIP處理克服； 連接反應的溫度在37℃時有利于連接酶的活性。但是在這個溫度下，粘性末端的氫鍵結合是不穩定的。因此人們找到了一個折中的溫度，即12～16℃，連接12～16h（過夜），這樣既可最大限度地發揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對結構的穩定；

pMD18-T Vector 是一種高效克隆PCR 產物（TA Cloning）的專用載體，該載體由pUC18 載體改建并在其3’端添加“T”而成

大部分耐熱性DNA聚合酶進行PCR反應時都有在PCR產物的3’末端添加一個“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR產物的連接、克隆效率；

轉化是指質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程 11.α互補

重組質粒轉化宿主細胞后，還需對轉化菌落進行篩選鑒定。利用α互補現象進行篩選是最常用的一種鑒定方法； α互補：質粒載體上lacZ’基因編碼的α肽段與失去了正常氨基端的β-半乳糖苷酶突變受體菌之間實現互補的現象，由α互補而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用Xgal顯色測定出來；任何攜帶著lacZ’基因的質粒載體在轉化β半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細胞后，在含有Xgal的培養基平板上形成藍色菌落，而含有重組質粒載體的克隆往往是白色菌落。

第三篇：分子生物學實驗 心得體會

關于分子生物學實驗的體會

梁慧媛（生技01級）

不知不覺間，一年的時間就這樣流逝了，與分子生物實驗相伴，對我而言，的確不同尋常。并不僅僅是學習生物學實驗技術和方法的寶貴經歷，它意味著更多。

首先是實驗條件、實驗過程、實驗設計的完備性，從這里可以初步感受到生物學研究的科學性與嚴肅性，自己可以得到寶貴的機會，親身體會生物學研究的苦辣酸甜。一直一直喜歡，得到正確實驗結果時刻的暢快感，那是無法言明的欣慰感，一次身心徹底地放松，可以將所有一整天來積累的疲勞拋之身后，即使僅僅是小小的成功，也會讓我們興奮不已。在整理資料，將一年來保存的記錄一遍一遍的翻看，重溫其中的特別滋味，我，輕輕地笑了。我，喜歡這里，喜歡生物學。

失誤是常有的，經歷過吃驚、后悔、無奈，檢討分析，最后重新開始。一波三折的記憶清晰的印在腦海中，這種深深的挫折感，再試一次的勇氣，我會一生記取的。

一年間，隨著對生物學實驗知識和技能的進一步學習，我更堅定了自己學習生物學的志向，感謝分子生物學實驗的“試煉”。

分子生物學實驗心得體會

劉東強（生科01級）

分子生物學實驗室本科生第一次接觸到了真正培養實驗能力的實驗課，它不同于我們在大二開的植物、動物、微生物等實驗課。在這些課上，主要以制備樣品并觀察樣品的形態、結構特征為主，這是由于我們當時正值大二，專業知識還遠不夠。

隨著以后理論課學習的深入，我們開始了分子生物學實驗的學習，這無疑對于深刻鞏固我們理論課上學到的知識是有幫助的，也進一步加深了對原有知識的理解，如啟動子的概念、類型、PCR的原理等。另外，在實驗課中，我們掌握并學會如何運用分子生物學研究中的一些基本實驗技術，如質粒的提取、總RNA的制備、PCR技術等。

我們的實驗動手能力通過親身接觸實驗過程并親自設計一些實驗得到了提高，使我們不再象剛開始做分子生物學實驗的時候照搬實驗指導上的實驗步驟，而是通過我們自己的思考，根據現有的實驗條件，對原有的步驟作必要的改進。

此外，通過這門實驗課的學習，我們形成了嚴謹的態度，如有時得出的實驗結果與理論不符，我們漸漸養成了仔細分析實驗結果的習慣，查找在實驗設計或操作過程中出現的問題，同時對理論知識認識得更清楚。

總之，我認為，分子生物學實驗課，是稱得上實用、精彩、有意思的好實驗，對于今后我的研究或工作很有價值。

劉佳凝（生技01級）

一學期的分子生物學實驗對我來說很重要，同時通過一學期的實踐讓我給分子生物學有了較深入地體會：

1、很感謝由我系生化組老師們編寫的這本實驗指導。里面的實驗原理與操作步驟都清晰易懂，有助于我們在學習操作。

2、實驗老師的耐心指導對我們幫助很大。他們要求嚴格，待人和藹可親，實驗要求嚴且對實驗技術的知識的深刻掌握與理解給我們留下了很深刻的印象。在老師們的帶領下我們都很認真完成了每一次的實驗與之后的總結與報告。

3、由于分子生物學實驗是我們上大學后接觸的第一個大型實驗課，所以這對我們來說是一個磨練的過程。從不熟練當熟練，從不耐煩到耐心認真，每個人在一學期后都有一種“脫胎換骨”的感覺。同時這個實驗幫助我們從分認識到生物學的不可知性、變化多樣性及創新空間的廣博性。在學期后的設計實驗中，每組同學都努力開動腦筋，搜集資料，查閱文獻，提出了很多好的實驗方案。這種設計與創新調動了同學的同學們的積極性，使得大家在實驗過程中都更加認真、仔細、一絲不茍，并在獲得到好的實驗結果后體會到了前所未有的成就感。

所以我們都很感謝分子生物學實驗的老師及設計這門課的老師們。這個實驗讓我們受益非淺。

實驗心得體會

張鑫蕊（生科01級）

通過分子生物學實驗課的學習，我們首先了解了分子生物學常用的載體，即質粒載體的制備及宿主細胞的感受態的制備。這些都讓我們在學過書本狀的知識以后有了一個親手操作，更深一步所學的知識的機會。

生物學以及分子生物學本身就是一門實驗性的學科，如果只有單純的理論課上的講解而沒有與之相配套的實驗操作，跟的無法使我們深刻體會到我們所學的那些如轉導轉化之類究竟是怎樣操縱的。

至于PCR基因擴增、RT-PCR、蛋白質印跡這些實驗操作技術的學習對我們以后生物化學大實驗、生化技術原理、基因工程、蛋白質工程的學習都奠定了一個很堅實的基礎，幫助我們對這一系列等分子生物學技術有了很好的了解和掌握的。

相配套的理論課的學習與實驗操作上是非常必要，我覺得分子實驗課的時間安排就相當合理，在我們學理論課的同時就進行實驗課的操作，這樣相輔相承的學習，才能促進我們的進一步提高。

實驗心得

劉娟（生科01級）

一、實驗操作：

同樣的樣品，同樣的步驟，不同的人可以作出不同的結果。

當然分子生物學實驗本身的結果就有一定的偶然性，因為所操作的材料是極其微小的，肉眼無法看見的，所以用理論來預見可行的實驗，結果往往有些出乎意料。而每個人操作上的細微差別對RNA、DNA而言就是一場地震。

有人說做生物實驗和學數學不一樣，數學只要用靈活的思維，嚴禁的邏輯就行，而生物實驗要求的往往不止這些，不只要心靈還要手巧肯干，而分子實驗又比其他實驗要求嚴格，每一步都須三思而后行，而且必須有極大的耐心去重復一些枯燥的步驟。

二、關于設計實驗：

想總比做起來容易，當初覺得mRNA差異顯示原理簡單，操作應該不成問題。結果第一天的實驗便給了個下馬威，不僅結果等于沒有，而且對接下來的步驟更是一無所知，無從下手。而最終自己的實驗結果只不過是mRNA差異顯示地預實驗，由于該方法的假陽性率極高，正常的科研實驗是需要反復重復實驗，并將最后的結果測序分析，并進一步分析是否為新基因，當然我們不可能接著做，只完成了該實驗的一小步，也已經學到了很多書上沒有的東西。

三、還存在的問題：

自己在做的過程中，有時會有“照方抓藥”的情況出現，并不完全明白自己所做的步驟有什么作用便做了，事前事后缺乏思考。實驗過程中，儀器、試劑的收集，總只有幾個人在做，其他人只是張口就問在哪，說明擺放無秩序，做實驗時依賴心理太強，（看完其他國外的幾個實驗室照片后，覺得我們實驗室已經不錯了。）

每一步驟最好都有記錄，特別是樣品多時，要有據可查。

一門好實驗課

中國協和醫科大學基礎醫學院 2003級研究生 陸璐

我是生物科學專業99級的學生，在大三的時候選修了分子生物學實驗這門課。在半年的學習和實踐中，我學會了很多基礎的分子生物學實驗方法，掌握了一定的實驗技能，這些都為現階段的實驗工作提供了很大的幫助，這使我避免了剛剛進入實驗室工作時要一切從頭學起的忙亂，節省了大量時間。

分子生物學實驗課上所講授的質粒提取、藍白斑篩選、RNA提取及鑒定、基因組DNA提取、western blot、瓊脂糖凝膠電泳、PCR技術等都是我現在常用的技術。在實驗課的訓練中，我也逐步養成了良好的實驗習慣。

分子生物學實驗課程讓我受益很多，老師們認真負責的態度也必然讓更多的師弟師妹們從中獲益。

我是北京師范大學生命科學學院生物化學與分子生物學專業2002級的碩士研究生，在研一第一學期參加了分子生物學實驗課程。這門課程將分子生物學實驗操作的理論與實踐相結合，不僅使我在分子生物學實驗技能方面得到系統的訓練，而且讓我對具體實驗操作的原理有了清晰地認識。尤為難得的是，作為一門實驗課，它還鍛煉了我運用已學到的理論知識和已掌握的實驗技能綜合解決科學問題的能力。這些都為我之后研究生階段的工作做了必要的準備，打下了良好的基礎。

這門課程開設的實驗以綜合性為主，涵蓋面廣，幾乎包括一般分子生物學研究會涉及的所有內容：最基本實驗技術，如瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA；基因克隆所要用到的技術，如質粒提取、DNA重組及重組子篩選、細菌感受態的制備及轉化、外源基因的誘導表達等；還有一些其他的常用技術，如動、植物基因組DNA的提取、植物總RNA的提取、PCR擴增、蛋白質印跡、Southern雜交等。

我研究生階段的一部分工作是要將外源基因通過農桿菌介導的方法轉入植物中，并鑒定轉化是否成功。首先要用到質粒提取、DNA重組等技術來構建插入有外源基因的表達載體。轉化植物成功后，就需要提取植物基因組DNA及總RNA，利用PCR擴增、Southern雜交、RT-PCR、蛋白質印跡等技術，對外源基因進行不同水平的鑒定。

正是因為分子生物學實驗課對基本原理的詳細講解、對實驗技能的系統訓練，使我在工作中比較容易上手，工作進度也有了保證。另外，通過在這門課上系統地、全面的學習，也使我在工作需要學習新的實驗技術時，觸類旁通，比較容易理解消化。

分子生物學課程對我的科研工作的幫助

胡麗婭

進入實驗室做課題已經一年多了，在日常的科研工作中，分子生物學實驗課中學到的知識和技術給了我很大的幫助，例如“外源基因在大腸桿菌中的誘導表達”和“SDS－PAGE檢測蛋白”等等。

我的課題主要是研究鈣調磷酸酶的折疊機制，而整個研究的基礎就是要拿到純的、具有完整的生物活性的酶。這是整個工作的第一步，也是非常關鍵的一步。剛開始參與科研工作時，我遇到了蛋白表達為包含體的問題，因為拿不到蛋白，實驗無法進行下去。于是我運用在分子生物學實驗課中學到的知識，對表達條件進行了摸索，最終解決了表達的問題。順利的進行了后續的實驗工作。

隨著課題的深入，我需要構建一個點突變體來觀察這一位點對于鈣調磷酸酶的結構和折疊的作用。由于有在分子生物學實驗課中打下的基礎，我利用Primer premier設計了點突變的引物，運用PCR技術對鈣調磷酸酶進行點突變：質粒DNA的提取和酶切、E.coli感受態細胞的制備，轉化。每一步實驗都能夠得到理想的結果。我想正是以前學到的知識和經驗使我能夠順利的完成設計的實驗。

通過一年多來的實驗工作，我更加深切的體會到堅實的理論基礎和良好的實驗技能對于科研工作的重要性。在我本科的課程中，分子生物學實驗課是一門尤其重要的課程，在這門課程的學習過程中，我和我的同學們都打下了很好的基礎。整個課程的安排十分合理，給我們許多親自動手實踐的機會；在遇到問題時，老師鼓勵我們積極思考，和我們一起討論，幫助我們解決問題。每一個小實驗的成功，對于我們這些“初生之犢”來說，都是一種莫大的鼓勵，鼓勵我們在科學研究中前進。

與此同時，我們在這門實驗課的學習中還培養了良好的合作意識和團隊精神。同學們齊心協力，一起動腦筋解決實驗中的問題。在今天的科研工作中，這些品質讓我們能夠更好的融入到課題組這一個大家庭中，大家互相幫助，誰遇到了問題，大家一起討論，出謀劃策。同時，在討論的過程中，大家也能學到更多的知識。

生命科學學院 2002碩 細胞生物學專業

王利敏

作為一名細胞所的二年級研究生，一年級所選修的分子生物學實驗課程對我的幫助是不可忽視的。在這個課程上，讓我初次接觸到了許多進行生物研究時必須具備的實驗技術以及一些基本技能，象電泳，蛋白質印跡，PCR等等，這些實驗在幾乎每個人以后的工作中都會用到，我也不例外。而且這些實驗又不同于本科時，它不但是更復雜，還給了更多我們自己動手的空間和時間，一來能鍛煉大家的思考能力，比如我們自己設計引物來合成目的基因；還能鍛煉我們自己安排時間和一個實驗進度的能力，分子實驗一般周期比較長，學習如何合理地安排時間使之更有效的確對于今后自己實驗地安排大有裨益。總之，分子生物學實驗課程的確是一門對今后實驗很有幫助地課程。

分子生物學實驗課程學習隨感

陳暉

時光荏苒，不知不覺中研究生生活已過去一年，進入實驗室也有快一年的時間了。大學時專業課的學習為我的科研工作打下的堅實基礎，而實驗課程尤其是分子生物學實驗的學習更讓我獲益匪淺。

分子生物學課程的學習讓我們初步建立了分子的概念，但核酸到底是什么樣子的，什么是PCR，什么是質粒，什么是轉化，這些概念對于我們始終很抽象。是分子生物學試驗讓我們真正接觸了分子生物學，將那些抽象的概念變得具體，而不再是紙上談兵。

在分子生物學試驗中我們學習到了分子生物學最基本的實驗技能，如感受態細胞的制備及轉化，質粒DNA的提取及酶切，植物總RNA的提取等等。這些技能的學習讓我在科研工作中很快能進入角色。在開始進入實驗室時，常會有種手足無措的感覺。但當看到那些熟悉的儀器，如微量移液器，培養箱，PCR儀等時，真有他鄉遇故知的感覺。而不需別人指導，運用實驗課上學到的知識成功地完成實驗，那種滿足感更是無法形容。至今還記得獨立提出要用的質粒時的情形，師兄在夸獎之余將更多的工作放心地交給我，讓我們實驗的進展順利很多。

不過最重要的是在分子生物學實驗學習的過程中，我們建立了整體大實驗的概念，這是在以往的實驗訓練中沒有的。以往的實驗如無機化學，有機化學等等，所涉及的通常只是某個數據的測定或某種物質的提取，實驗持續的時間通常也就兩三個小時;而分子生物學實驗，每次會持續一天時間。實驗設計得與科研比較相似，毫不夸張的講，每個實驗都可以直接用于科研。在這里我們學到了實驗設計的概念，不是單純的實驗技術的堆砌，而是根據自己的目的，有機的將各種方法組合起來。所有這些都是我們進入科研工作所必須的素質。

而老師的講解不會局限于某種技術，而是更偏重開拓思路，引導我們思考，從而達到舉一反三的目的。如在講解植物總RNA的提取時，采用的是白化的玉米葉子，所含糖類脂類比較少，此時老師會提出問題如果糖類多時又該如何改進提取的方法;書上所講的只是其中一種提取方法，是否還有其他的方法可以提純RNA。老師并不會直接給出這些問題的答案，而是要我們在課后自己查閱資料。這一方面鍛煉了我們查閱文獻的能力，另一方面這些資料的積累成為科研工作時寶貴的一手材料，可以直接應用于科研。“授人以魚不如授人以漁”，老師們精心的講解常會給我們豁然開朗的感覺，學習到的不是單純的技術而是一種思路。

感謝分子生物學實驗，感謝給予我們悉心教導的老師，是他們的工作使我們真正接觸到了分子實驗，并為將來進入科研工作打下了良好的基礎。

分子生物學實驗小結 2001級生物科學專業 張皓彬

做完半年的分子生物學實驗，感到它是一門非常好的課，在我們學習生物學的過程中占據著很大的分量。

首先，分子生物學是一門技術性很強的實驗，在實驗的過程中，某些小的失誤可能會對結果產生很大的影響。所以對實驗中的操作是比較嚴格的，特別象無菌操作過程。在實驗中從儀器上來說我們接觸了大量的儀器，而且也學到了一些基本的實驗技術，這對我們將來從事相關工作有著非常大的幫助。

其次，分子生物學實驗中所含的知識和技術與理論知識結合的比較好，先學習了理論知識再去做實驗，這樣結合很好，而且我感覺分子生物學實驗是我們所做的實驗中一門設計到比較“高深”知識或新問題的實驗，能激發出我們對學習分子生物學理論與實踐的興趣。

最后，我認為最重要的是它給了我們學生一次自己設計實驗的機會。這是我們所做的實驗中唯一能給我們自己設計實驗機會的課。第一，整個過程中，我們在做完前面一些基本實驗后，再去設計一個用自己所學到的知識技術的實驗，有了一個整體的了解，也是對一整套技術的回顧與應用。從設計中所要用到的試劑、儀器，到實驗中試劑的具體用量，儀器使用的具體參數，以及引物的設計和整個實驗的時間安排等等都要有明確的概念，可以說是給了我一次科學探究的機會。第二，設計實驗后我們自己去操作檢驗它的可行性，檢驗自己設計的實驗能不能夠成功，更重要的是整個過程對我們以后從事相關工作有著非常重要的幫助，所以這是非常有意義的。

總的來說，分子生物學實驗是一門非常好的實驗課程。

設計實驗和具體操作的感想 生物科學2001級谷波

2003.12.22

設計階段：

我們組原本的想法有點不切實際。我們打算在瑞士的一個酶庫網站上找到一種酶，再從genenbank中找到這種酶的全序列，再自行設計引物。我們甚至下載了引物設計軟件。然而我們輸入某種酶某段功能片段的名稱卻從genebank中得到了成百上千序列，我們放棄了。只是從多篇文獻中找到一種酶的某段基因把它的引物和表達載體進行改造和改換，以符合老師提供的限制性內切酶。而PCR的溫度與循環次數，及其余的各種步驟，僅僅是把是實驗書上的串聯在一起，并沒有考慮任何改動，更別提摸索實驗條件的部分了。當我們的老師講評時，我才了解到，我們的設計是多么的不充分，成功率有多低。

操作階段：

通過實驗設計，我最大的收獲是有了串起已經做過的實驗的思路，也明白了做重組的各個步驟的原理。所以，當我拿到老師給的設計方案時，我的思路很清晰。然而具體的操作又暴漏出許多問題。首先是操作時不能做到提前思考，大家往往只會照方抓藥，不能事先想清楚為何要這樣做。這使我們常常忽略細節的地方，造成時間的浪費甚至結果不理想。比如我們把第二次回收時的重要數據遺失。特別是寫報告時，更會感覺到中間結果記錄的不詳細，以至分析原因時沒有具體的可依賴的結果做支持。還有就是中間各個步驟的現象，如果我們能從最基本的實驗時就觀察現象，之后再做重復或類似的實驗時，就能及時判斷實驗每一步的正確與否，便于及時糾正錯誤。最后是我們實驗時心態不夠正確，實驗就是要歷經失敗和重復，不能面對不良結果時就急噪起來，不能心平氣和的繼續下去，甚至失去探索的動力。每當我們進度落后時，大家常常焦急的追趕其它組，往往造成不該出現的錯誤或遺漏。

實際操作不同于理論學習，它要求我們事事親臨，面面俱到，并且積累經驗，這樣才能從細微處窺探整個實驗的成敗。這正應了老師所說：“我們需要心靈，手巧，兼肯干的學生”心靈有賴于勤思考，手巧還需要多實踐總結，肯干則要求我們持之以恒，腳踏實地我們會朝這個方向努力的。

生命科學學院2002碩 神經生物學專業

馬駿

我是神經生物學專業研二的學生。我在研一時選修了分子生物學實驗課，在一個學期的學習中所獲甚多。分子生物學實驗我們主要做的大實驗包括感受態的制備、質粒的提取及鑒定、蛋白在大腸桿菌中的表達。我們在本科和研一的時候學習了分子生物學的理論知識，但通過大實驗親身實踐后才更深刻的理解了這些理論知識，并且在遇到問題－解決問題的過程中，了解了這些知識用于實驗時應注意的細節。通過系統科學的實驗，我還了解了實驗規劃和實驗安排的重性。分子生物學大實驗鍛煉了我的實驗操作技能，培養了我耐心細致的實驗習慣，這都有益于我現在所進行的課題研究，避免了走彎路，提高了實驗效率。所以我認為在進行正式的課題研究之前進行分子生物學大實驗的學習是很必要的。師弟師妹們請認真學習：）

實驗心得

我是北京師范大學生命科學學院生物化學與分子生物學專業2002級的碩士研究生，在研一第一學期參加了分子生物學實驗課程。這門課程將分子生物學實驗操作的理論與實踐相結合，不僅使我在分子生物學實驗技能方面得到系統的訓練，而且讓我對具體實驗操作的原理有了清晰地認識。尤為難得的是，作為一門實驗課，它還鍛煉了我運用已學到的理論知識和已掌握的實驗技能綜合解決科學問題的能力。這些都為我之后研究生階段的工作做了必要的準備，打下了良好的基礎。

這門課程開設的實驗以綜合性為主，涵蓋面廣，幾乎包括一般分子生物學研究會涉及的所有內容：最基本實驗技術，如瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA；基因克隆所要用到的技術，如質粒提取、DNA重組及重組子篩選、細菌感受態的制備及轉化、外源基因的誘導表達等；還有一些其他的常用技術，如動、植物基因組DNA的提取、植物總RNA的提取、PCR擴增、蛋白質印跡、Southern雜交等。

我研究生階段的一部分工作是要將外源基因通過農桿菌介導的方法轉入植物中，并鑒定轉化是否成功。首先要用到質粒提取、DNA重組等技術來構建插入有外源基因的表達載體。轉化植物成功后，就需要提取植物基因組DNA及總RNA，利用PCR擴增、Southern雜交、RT-PCR、蛋白質印跡等技術，對外源基因進行不同水平的鑒定。

正是因為分子生物學實驗課對基本原理的詳細講解、對實驗技能的系統訓練，使我在工作中比較容易上手，工作進度也有了保證。另外，通過在這門課上系統地、全面的學習，也使我在工作需要學習新的實驗技術時，觸類旁通，比較容易理解消化。

分子生物學實驗課程如何應用于科研之我見

生命科學學院 生物化學與分子生物學專業 2003研 李彥杰

作為一名生物化學與分子生物學專業一年級的研究生，在生命科學領域5年的求知探索中，我深切體會到這期間學習的各門課程，包括生物化學、分子生物學、細胞生物學、遺傳學、生理學，尤其是分子生物學實驗課程，對培養我今后獨立進行科研，及提高科研能力、拓寬科研思路是不可或缺的。由于它所包含的內容與科研連接最直接，最緊密，不僅教給我們實驗的技術方法，還教給我們設計實驗的思路及科研中必不可少的合作精神，可以說是生物科研最重要的基礎課之一。

生物學方面的科研離不開我們在分子生物學實驗課程中學到的技術和方法，而為了達到同一個實驗目的可用的技術與方法常常不止一種，如何選擇最合適的方法以取得最佳實驗結果其實就是靈活應用分子生物學實驗所學于科研的過程。以下是結合我的課題的一點粗淺體會。

我的科研課題是小鼠腦紅蛋白及突變體的設計、融合表達、蛋白純化及結構、性質測定，基本的流程是從小鼠腦組織中提取總RNA，設計帶有合適酶切位點的引物，利用RT-PCR技術獲得雙鏈cDNA，再將雙鏈cDNA雙酶切的產物與同樣經雙酶切的GST融合表達載體pGEX-4T-3相連，轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，在2YT培養基中表達，過GST親和層析柱初純蛋白，凝血酶酶切獲腦紅蛋白和谷胱苷肽硫轉酶，再經Sephadex-G75分子篩層析柱分離，得到電泳純的腦紅蛋白，冷干保存。

從第一步提取總RNA到轉化感受態細胞，這些步驟全都是分子生物學實驗課上學習過的基本實驗方法，比如核酸電泳、蛋白電泳、PCR、構建載體、感受態制備、轉化等，由于這些技術已經在分子生物學實驗課上系統學習并親身操作，因此在科研中使用這些技術時就能駕輕就熟。

但又不能完全照搬課本，有時需要根據實驗過程中出現的具體問題對方法進行改良，添加適合的步驟或刪減不需要的步驟。例如分子生物學實驗中檢驗總RNA提取效果采用的是甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳法，甲醛的作用是使RNA酶變性，阻止其降解RNA，電泳結果能否出現18S和28S的條帶能說明RNA 的主要成分rRNA是否完整，而我的課題中提總RNA的目的是需要其中的mRNA作為模板進行逆轉錄PCR，因此電泳檢測只有相對意義，所以只用一般的電泳采用稍高的電壓即可。設計RT-PCR引物過程中，嚴格按照分子生物學實驗課程所學的PCR原理部分進行設計，設計出的引物滿足引物長度15－30bp、G+C含量40％－50％、堿基隨機分布和引物3'端與模板嚴格配對這幾個基本要求。但實驗結果表明用oligodT做第一輪引物能擴增成功，而用特異性引物則擴增失敗，分析原因可能是RNA二級結構嚴重，因此需要消除RNA二級結構，使特異性引物能與模板緊密結合，采用擴增前將模板在65℃保溫10分鐘的方法成功解決了這一問題。

目前我的課題已經進行到蛋白純化步驟，分子生物學實驗課上所學幫助我順利完成實驗的上游即分子生物學階段的初步工作。

分子生物學實驗課的收獲及其在實際科研中的應用 生命科學學院生物化學與分子生物學專業03級碩研 白 巍

“對一名生物化學與分子生物學專業的研究生來說，分子生物學實驗技術是必須掌握的基本功。熟練的掌握基本的分子生物學實驗技術是開展實際研究工作的前提。”這是我在一年實驗工作中的最大體會。因此，更加體會到，分子生物學實驗課對我的幫助有多大!

在這門課中，老師將分子生物學實驗的一些基本方法和理論，包括：載體；分子生物學中常用的工具酶；電泳；PCR基因擴增；基因表達；印跡法及分子檢測；克隆化定點誘變等等貫穿在感受態細胞的制備和轉化；質粒的提取和酶切；哺乳動物基因組DNA的分離和提取；植物中總RNA的提取等十幾個實驗中講授，讓我們不但掌握了實驗技術，更重要的是使我們弄懂這些實驗的原理，為在自己的實際科研中運用這些方法設計實驗更好的完成科研工作打下基礎。

我自己在前一段時間的實驗中就應用了許多分之生物學實驗課中學到的知識.我在做真核細胞轉染實驗中需要用一種無關基因作對照,我們選擇的是pKSgp120基因.為了轉染真核細胞我們需將其克隆于真核載體PIRES1neo中.我們先將空載體PIRES1neo和帶有pKSgp120基因的PUC19分別預轉化在大腸桿菌DH5α的感受態細胞中,然后從中大量提取質粒.為免去設計定做引物在時間和費用上的浪費,我們設計了一個平端連接方法:將空載體PIRES1neo用EcoRV酶切,再用CIAP(堿性磷酸酶)去磷;將PUC19/ pKSgp120用EcoRI和HindⅢ雙酶切,然后將兩者用T4DNA連接酶連接酶連接后轉化到大腸桿菌DH5α的感受態細胞中在從中提取質粒進行酶切鑒定.可見,沒有分子生物學實驗課上對于實驗基本方法理論的學習和對一些基礎實驗的操作訓練,是很難完成上述實驗工作的!

此外,在分子生物學實驗課中,老師結合實際,由淺入深的給我們講解了許多實驗的原理和設計實驗的方法思路,更是對我以后的實驗工作有很大的指導作用,使我受益費淺!

中國協和醫科大學基礎醫學院 2003級研究生 馬艷妮

半年分子生物學實驗課的學習，使我掌握了很多分子生物學的基本方法和技術，如核酸提取、純化、鑒定的方法，克隆、表達載體的構建，PCR技術等，這些基本方法的學習及實驗技能的訓練，為我現階段的實驗工作奠定了基礎。課程中所開設的很多實驗，如藍白斑篩選、Southern雜交等，均是很多高校本科教學中所不曾涉及的，為我們研究生階段的學習提供了競爭優勢。在課堂中所培養的良好實驗習慣及對待實驗科學、認真的態度也使我收益匪淺，并在今后的實驗中繼續堅持。在此感謝所有為這門課程認真工作的老師和同學們，謝謝你們！

第四篇：分子生物學實驗講義

實驗 質粒DNA的堿裂解法提取與純化

一、實驗原理

細菌質粒是一類雙鏈、閉環的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質粒都是存在于細胞質中、獨立于細胞染色體之外的自主復制的遺傳成份，通常情況下可持續穩定地處于染色體外的游離狀態，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。

質粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質粒DNA的提取，本實驗采用堿裂解法提取質粒DNA。堿裂解法是一種應用最為廣泛的制備質粒DNA的方法，其基本原理為：當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質與DNA發生變性，當加入中和液后，質粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態，離心時留在上清中；蛋白質與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。

純化質粒DNA的方法通常是利用了質粒DNA相對較小及共價閉環兩個性質。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費時。對于小量制備的質粒DNA，經過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質和RNA，所得純化的質粒DNA已可滿足細菌轉化、DNA片段的分離和酶切、常規亞克隆及探針標記等要求，故在分子生物學實驗室中常用。

二、實驗試劑

1、溶液Ⅰ： 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高壓滅菌15min，貯存于4℃。

2、溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時配置。

3、溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存備用。

4、TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存備用。

5、苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）

6、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）7、5×TBE：Tris 堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存備用。

8、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

9、RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free)RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20℃。

10、6×loading buffer（上樣緩沖液）：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11、1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5μg/ml（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液0.5×TBE），即可上樣。

三、實驗操作

1、挑取LB固體培養基上生長的單菌落，接種于2.0ml LB（含相應抗生素）液體培養基中，37℃、250g振蕩培養過夜（約12-14hr）。

2、取1.0ml培養物入微量離心管中，室溫離心8000g×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。

3、將細菌沉淀重懸于100μl預冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。

4、加200μl新鮮配制的溶液Ⅱ，顛倒數次混勻（不要劇烈振蕩），并將離心管放置于冰上2-3min，使細胞膜裂解（溶液Ⅱ為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

5、加入150μl預冷的溶液Ⅲ，將管溫和顛倒數次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時質粒DNA復性，染色體和蛋白質不可逆變性，形成不可溶復合物，同時K+使SDS-蛋白復合物沉淀,4℃離心8000g × 10min, 小心移出上清于一新微量離心管中。

6、加入450μl的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4℃離心8000g × 10min。

7、小心移出上清于一新微量離心管中，加入2.0倍體積（1ml）預冷的無水乙醇，混勻，室溫放置５min，4℃離心12000g×10min，棄上清。

8、加入1ml預冷的70%乙醇洗滌沉淀1次，4℃離心8000g×7min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干或吹干（不能過于干燥，造成溶解困難）。

9、沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），-20℃保存備用。

四、質粒DNA的電泳檢測

觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色。該物質含有一個可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個平面基團，這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近，導致染料與DNA結合并呈現熒光，其熒光產率比游離染料溶液有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結合的染料本身則在302nm和366nm有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區的590nm處重新發射出來。因此，當凝膠中含有游離溴化乙錠時即可以檢測到少量的DNA。

取制備的質粒DNA 1-2μl，加適當loading buffer混勻上樣,采用 1-5V/cm的電壓，使DNA分子從負極向正極移動至合適位置，取出凝膠置紫外燈下檢測，攝片。

五、注意事項

本裂解法小量制備質粒 DNA重復性好，一般無麻煩。若所提取質粒 DNA不能被限制性內切酶切割，可通過酚/氯仿再次抽提，以清除雜質來解決問題。

六、習題：

1、什么是質粒？質粒有什么主要用途？

2、分子生物學實驗中用的質粒是由野生型改建而來的，它必須具備哪三個基本要素？

3、制備的質粒DNA在瓊脂糖凝膠上通常以三種形式條帶存在，它們分別是什么？

實驗 瓊脂糖凝膠電泳實驗

一、實驗目的

（1）學習瓊脂糖凝膠電泳的基本原理；

（2）掌握使用水平式電泳儀的方法；

二、實驗原理

瓊脂糖凝膠電泳是基因工程實驗室中分離鑒定核酸的常規方法。核酸是兩性電解質，其等電點為pH2-2.5，在常規的電泳緩沖液中（pH約8.5），核酸分子帶負電荷，在電場中向正極移動。核酸分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，具有電荷效應和分子篩效應，但主要為分子篩效應。因此，核酸分子的遷移率由下列幾種因素決定：

（1）DNA的分子大小。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中移動，因而遷移得越慢。

（2）DNA分子的構象。當DNA分子處于不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋質粒DNA在瓊脂糖凝膠中移動的速度是不一樣的，超螺旋DNA移動得最快，而開環狀DNA移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。

（3）電源電壓。在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率達到最大，所加電壓不得超過5v/cm。

（4）離子強度影響。電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時（如誤用蒸餾水配制凝膠），電導率最小，DNA幾乎不移動；在高離子強度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液），則電導很高并明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。

溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1）能插入DNA分子中形成復合物，在波長為254nm紫外光照射下EB能發射熒光，而且熒光的強度正比于核酸的含量，如將已知濃度的標準樣品作電泳對照，就可估算出待測樣品的濃度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以現在也開發出了安全的染料，如Sybergreen。

常規的水平式瓊脂糖凝膠電泳適合于DNA和RNA的分離鑒定；但經甲醛進行變性處理的瓊脂糖電泳更適用于RNA的分離鑒定和Northern 雜交，因為變性后的RNA是單鏈，其泳動速度與相同大小的DNA分子量一樣，因而可以進行RNA分子大小的測定，而且染色后條帶更為銳利，也更牢固結合于硝酸纖維素膜上，與放射性或非放射性標記的探針發生高效雜交。

三、試劑與器材

（一）材料

電泳儀、水平電泳槽、樣品梳子、瓊脂糖等

（二）試劑 1、50*TAE(1000mL)：242g Tris, 57.1mL 冰醋酸，18.6g EDTA。

2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力攪拌數小時以確保其完全溶解，分裝，室溫避光保存。

3、DNA加樣緩沖液：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。

4、DNA分子量標準

四、操作方法

常規的水平式瓊脂糖電泳：

制備瓊脂糖凝膠：按照被分離DNA分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量；一般情況下，可參考下表：

瓊脂糖的含量（%）分離線狀DNA分子的有效范圍（Kb）

0.3 60-5

0.6 20-1

0.7 10-0.8

0.9 7-0.5

1.2 6-0.4

1.5 4-0.2

2.0 3-0.1

1、制備瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖，加入1x電泳緩沖液，待水合數分鐘后，置微波爐中將瓊脂糖融化均勻。在加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液；加熱時應蓋上封口膜,以減少水份蒸發。

2、膠板的制備：將膠槽置于制膠板上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙，待膠溶液冷卻至50℃左右時，加入最終濃度為0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分鐘)，搖勻，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡；待凝膠冷卻凝固后，垂直輕拔梳子；將凝膠放入電泳槽內，加入1x電泳緩沖液，使電泳緩沖液液面剛高出瓊脂糖凝膠面；

3、加樣：點樣板或薄膜上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數應不小于1X。用10 μL微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內，每加完一個樣品，應更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序和點樣量）。

4、電泳：加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。當瓊脂糖濃度低于0.5%，電泳溫度不能太高。樣品由負極（黑色）向正極（紅色）方向移動。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當溴酚藍移動到距離膠板中央時，停止電泳。

5、觀察和拍照：電泳完畢，取出凝膠。在波長為254nm的紫外燈下觀察染色后（2）的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。于凝膠成像系統中拍照并保存之。

五、注意事項

1、EB是強誘變劑并有中等毒性，易揮發，配制和使用時都應戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經專門處理后才能清洗或丟棄。簡單處理方法為：加入大量的水進行稀釋（達到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍體積新鮮配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍體積新鮮配制的0.5mol/L 的亞硝酸鈉，混勻，放置1天后，加入過量的1mol/L碳酸氫鈉。如此處理后的EB的誘變活性可降至原來的1/200左右。

2、由于EB會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA，使DNA遷移率降低。因此，如果要準確地測定DNA的分子量，應該采用跑完電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。

六、實驗報告要求與思考題

1、附上電泳結果的圖片并進行正確的標注（如下圖）

M：1Kb DNA ladder；1：質粒DNA

2、瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素的影響？

3、如果樣品電泳后很久都沒有跑出點樣孔，你認為有哪幾方面的原因？

4、為什么分子生物學實施時要擔心EB？

5、瓊脂糖凝膠電泳時膠中DNA是靠什么發出熒光的？為什么？

電泳流程圖：

實驗 PCR擴增eGFP基因

一、PCR技術的基本原理

PCR類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。(Plateau)。到達平臺期所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

PCR 技術應用廣泛，不可能有這樣一套條件滿足所有的實驗，但本實驗所介紹的方法可適應于大多數DNA 擴增反應，即使有的不適應，至少也確定了一個共同的起點，在此基礎上可以作多種變化。不過下列因素在實驗應用時應予以特別注意，以求取得滿意結果。

1、模板：單、雙鏈DNA 和RNA都可以作為PCR樣品，若起始材料是RNA，須先通過逆轉錄得取第一條cDNA。雖然PCR 可以僅用極微量的樣品，但為了保證反應的特異性，一般宜用ng 量級的克隆DNA，ug 級的染色體DNA，待擴增樣品質量要求較低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制劑以及能結合DNA 的蛋白質。

2、引物：引物是決定PCR 結果的關鍵，下列原則有助于引物的合理設計。（1）盡可能選擇堿基隨機分布，GC 含量類似于被擴增片段的引物，盡量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它異常序列的引物。（2）避免具有明顯二級結構（尤其是在引物3'—末端）的序列。

3、防止引物間的互補，特別要注意避免具有3'末端重疊的序列。

4、引物的長度約為20個堿基，較長引物較好，但成本增加，短引物則特異性降低。

5、引物濃度不宜偏高，過高易形成二聚體解鏈；然后冷卻至37—55℃，使引物與模板退

二、實驗試劑

（一）儀器與器皿

PRC 擴增儀，瓊脂糖凝膠電泳設備，微量取樣器，一次性eppendorf管，凝膠成像儀

（二）試劑與材料

1、瓊脂糖凝膠電泳試劑

1）電泳緩沖液：Tris—乙酸0.04mol/L PH8.0 0.002mol/L EDTA

2）加樣緩沖液：0.25%溴酚蘭40% w/v蔗糖

3）溴化乙錠溶液：0.05mg/ml溴化乙錠/水

4）瓊脂糖

2、TaqDNA 多聚酶3、5′反應緩沖液：

125mmol/L Tris-HCl pH8.2；10mmol/L MgCl2；0.5mg/ml gelatin；125mmol/L(NH4)2SO4； Formamide 25%

4、混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2.5 mmol/L)

5、DNA 模板

6、引物 1（10μmol/L）

7、引物 2（10μmol/L）

8、無菌水

三、實驗步驟

1、按順序在200μl 指形管中加入以下試劑與樣品：（因購入的試劑批次不同，加樣時有所差別，以預實驗結果為準。

1）ddH2O 37μl

2）10*Buffer 5μl(含有MgCL2)

3）dNTP ２μl

4）引物1(上游)２μl

5）引物2（下游）２μl

6）模板 1μl（pEGFP質粒）

7）TaqDNA聚合酶１μl（2.5U）總體積共50μl

2、在PCR 擴增儀上按以下反應條件編入程序：（以下為參考值，因擴增的DNA片段不同，各類PCR 擴增儀程序設定各不相同，編程過程視擴增的DNA 片段的要求及儀器而定參數。）

1)預變性 94℃ 3 分種

2)循環條件（30 次）

變性 94℃ 30 秒

復性 55℃ 30 秒

延伸 72℃ 1分

3)延長延伸 72℃ 7 分鐘

編完反應程序，置反應管于PCR擴增儀的反應孔中，開動機器，擴增循環反應開始。

3、PCR 擴增完畢，配1.5%瓊脂糖凝膠，電泳觀察結果。

4、凝膠成像儀或紫外燈下觀察實驗結果，是否已擴增到實驗設計的DNA片段

四、習題

1、PCR反應液中主要成分是哪些？在PCR反應過程中各起什么作用？

2、為什么在PCR反應過程中，使用三個不同的溫度變化？

3、用PCR擴增目的基因，要想得到特異性產物需注意哪些事項？

實驗 從動物組織（豬肝）中提取DNA

一、實驗內容

采用SDS裂解和蛋白酶K消化法從豬肝中提取DNA，并進行瓊脂糖凝膠電泳分析。目的

(1)掌握SDS裂解法從豬肝中的原理和方法；(2)鞏固DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析實驗。

二、實驗原理

DNA是一切生物細胞的重要組成成分，主要存在于細胞核中。通過研磨和SDS作用破碎細胞；苯酚和氯仿可使蛋白質變性，用其混合液（酚：氯仿：異戊醇）重復抽提，使蛋白質變性，然后離心除去變性蛋白質；RNase降解RNA，從而得到純凈的DNA分子。

三、實驗材料

新鮮豬肝

TES 緩沖液 ： pH8.0 Tris-HCl 10 mmoL/L , EDTA 1mmoL/ L , SDS 0.1 mmoL/ L

四、實驗步驟

1、剪取約0.5g肝臟組織，放入到研缽中磨碎；

2、向研缽中再加入1 ml TES輕輕研磨，將TES與破碎的組織混勻；

3、吸取535 μl組織勻漿液于2 ml EP管中，再加入60 μl SDS（10%），5.0 μl蛋白酶K，充分混勻后，于56°C保溫1 h，每30分鐘輕搖1次；

4、放置到室溫，加入等體積飽和酚（600μl），顛倒混勻，11000 rpm，離心10 min，吸取400 μl水相，并轉移至一個新的1.5 ml離心管中；

5、加入2倍體積（1000 μl）的無水乙醇和1/10倍體積（40 μl）3 M 醋酸鈉沉淀DNA，12000 rpm離心10 min，棄乙醇；

6、加入適量TE溶解DNA和RNAse A（具體依DNA的多少而定），并利用0.7%的瓊 脂溏進行電泳分析。

五、注意事項

1、在將豬肝剪碎前要將豬肝清洗干凈，除去脂肪及系膜成分。

2、抽提每一步用力要柔和，防止機械剪切力對DNA的損傷。

3、取上層清液時，注意不要吸起中間的蛋白質層。

4、乙醇漂洗去乙醇時，不要蕩起DNA。

5、離心后，不要晃動離心管，拿管要穩。

6、在乙醇沉淀后，經離心要觀察留在EP管中的小白點，其主要成分就是DNA，在以后的實驗中都要細心觀察，防止因將小白點丟失。

六、習題

1、為了獲得高質量的肝臟DNA，在實驗過程中應注意什么。

2、結合本人操作體會，總結在提取過程中如何避免大分子DNA的降解。

3、核酸提取中，去除蛋白質的方法有哪些？ 實驗 限制性內切酶切割DNA

一、實驗目的

1． 通過對DNA的酶切，學會設計構建體外重組DNA分子； 2． 根據目的基因合理選擇載體與限制性內切酶； 3． 掌握DNA的酶切技術。

二、實驗原理

限制性內切酶是從細菌中分離出來的一種能在特異位點切割DNA分子的核酸內切酶，目前已從多種細菌中分離出超過400種，識別各自不同的核苷酸順序，這一順序大多為具有一對稱中心的回文序列，如從大腸桿菌中分離的 EcoR I識別?GAATTC? 切割后產生?CTTAAG?、?G 和

AATTC?的末端，?CTTAAG?該末端由于有一段小的能互補配對的單鏈突出，故稱為粘性末端。切割后的末端為3’-OH和5’-磷酸基團，即?G-OH和?CTTAA-P。

有的限制性酶識別四堿基對的順序，如 San3A識別?GATC ?；有的識別六

堿基對，如上述的ECOR I。識別四堿基對的內切酶由于識別順序在DNA出現的頻率更高（四堿基酶為44=256，六堿基酶為46＝4096），因而可將DNA切割成更小的片段，而識別八堿基對的Not I?GCGGCCGC?、?CGCCGGCG? 則識別和切割位點更少（48＝65536），但堿基并不以均等的概率出現，因而切割后產生的片段變化范圍很大。

＋

限制性內切酶作用的溫度一般為37℃，反應體系中以Mg2為唯一的輔助因子，且要求pH緩沖在7.5左右。

商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃貯存，活性通常較高，5u/μl（每單位即最適條件下1小時內完全酶解1μg DNA的酶量）。

三、實驗材料

待酶切的DNA樣品

四、實驗儀器、器皿及試劑

1、儀器：可調微量加樣器、恒溫水浴箱、電泳儀、電泳槽、紫外檢測燈

2、器皿：Eppendorf管、Tip、試管架

3、試劑：標準DNA(Marker)

EcoRI限制性內切酶

10×buffer：50mmol/l NaCl

10mmol/l Tris-HCl(pH7.5)

10mmol/l MgCl2

lmmol/l

DTT（二硫蘇糖醇）

五、實驗步驟

1、將DNA樣品8.5μl(質粒pEGFP, 1μg)

2、加入1μl 10×buffer，酶解buffer由廠家提供。

3、加入1u（0.5μl）的限制性內切酶EcoRI（限制性酶很昂貴，從-20℃取出要置于冰上，吸取要新的Tip頭，以免污染雜質，吸完后盡快放回冰箱）。

4、混勻反應液后，稍離心使液體聚集，置37℃溫育１小時。

5、進行電泳檢查酶切結果，100V 25分鐘。

6、紫外燈下觀察消化效果。

六、注意事項

1、分子生物學實驗大多為微量操作，DNA樣品與限制性內切酶的用量都極少，必須嚴格注意吸樣量的準確性以保證酶切效果最佳。現介紹三種微量取樣方法：

(1)吸樣時，將Tip尖剛剛接觸到液面時，輕輕吸取。此法可吸取0.2~0.5μl的樣品，注意不要將Tip尖全部插入溶液，這樣Tip壁上會沾上很多的樣品，導致吸樣不準。

(2)用1cm長的塑料毛細管代替Tip吸樣，此法也可吸取0.2~0.5μl的樣量。

(3)目前也有細長Tip出售，專門用于吸取微量樣品。

2、限制性內切酶價格比較貴，因此要注意不使其污染而導致浪費。這就要求每次吸酶時要用新的無菌Tip。另一個造成限制性內切酶浪費的因素就是限制性內切酶的失活。因此，要注意加樣次序，即各項試劑加好后，最后才加酶，并要在冰上操作，且操作要盡可能快，以使限制性內切酶拿出冰箱的時間盡可能短。

若用同一酶消化很多樣品時，可先計算出所需酶量（可稍多計一點），取出此量的酶與1×緩沖液混合，然后再分裝至各個反應管內。這樣可節約用酶且縮短操作過程、減少污染機會。

3、開啟Eppendorf管時，手不要接觸到管蓋內面，以防雜酶污染。

4、樣品在37℃與65℃保溫時，要注意將Eppendorf管蓋嚴，以防水進入管內造成實驗失敗。

5、無實驗必要應盡量避免長時間酶消化樣品。因長時間消化，限制酶溶液中可能存在的雜酶會影響試驗結果。

七、習題

1、限制性核酸內切酶天然存在于什么生物體內？

2、什么是細菌的限制-修飾系統？限制-修飾系統對細菌有什么用途？

3、限制性內切酶有幾類？這幾類限制性內切酶各有什么特點？可作為工具酶的限制性內切酶是哪一類？為什么？

4、限制性內切酶的識別序列有什么特點？稱為什么序列？

5、酶通常在什么溫度中保存？為什么酶在該溫度下保存不會結凍？酶最后工作的時候其甘油濃度必須低于多少？ 6、1個單位（1 U）的限制性內切酶代表什么意思？

實驗 質粒的轉化

一、實驗目的

掌握熱激法或電轉化法轉化大腸桿菌感受態細胞及轉化子的鑒定方法。實驗材料：質粒DNA；大腸桿菌感受態細胞。

二、實驗原理

質粒的轉化是指將質粒或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。將連接產物轉化到感受態細胞中，實現重組克隆的增殖，便于后續分子操作。可以采用多種方法篩選和鑒定目的克隆。

（1）熱激法：大腸桿菌在0℃ CaCl2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基－鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經42℃短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收DNA復合物，在豐富培養基上生長數小時后，球狀細胞復原并分裂增殖。在被轉化的細胞中，重組子基因得到表達，在選擇性培養基平板上可挑選所需的轉化子。

（2）電轉化法：外加于細胞膜上的電場造成細胞膜的不穩定，形成電穿孔，不僅有利于離子和水進入細菌細胞，也有利于孔DNA等大分子進入。同時DNA在電場中形成的極性對于它運輸進細胞也是非常重要的。

三、實驗步驟

1、制備選擇性培養基平板：在融化的250ml LB固體培養基中（冷卻止55攝氏度以下）加入Amp至終濃度50μg/ml，混勻后倒入滅菌培養皿中；

2、取出1管制備好的感受態細胞，放在冰上融化；

3、每100μl感受態細胞加入約20ng質粒DNA，輕輕混勻，在冰上放置30分鐘；

4、熱擊：將離心管放置42℃水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動離心管；

5、冰鎮：快速將離心管轉移至冰浴，放置1－2分鐘；

6、復蘇：每管加400 μl LB培養基，在37℃搖床溫和搖動溫育45分鐘，使細菌復蘇；

7、布皿：取適當體積均勻涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板；

8、培養：倒置培養皿，于37℃培養12－16小時即可觀察到白色的菌落，即為轉化子。

四、結果與分析

計算轉化效率

菌落數/DNA質量（μg）*稀釋倍數

五、習題

1、制備感受態細胞的關鍵是什么？

2、如果DNA轉化后，沒有得到轉化子或者轉化子很少，分析原因。

3、如何提高轉化效率？

第五篇：分子生物學實驗方案

實驗一 分子生物學實驗安全注意事項及分子生物學實驗室所需要的儀器設備的使用（2學時）實驗二 分子材料的采集、保存和植物/動物基因組DNA 的分離（8學時）實驗三 DNA/RNA 的瓊脂糖凝膠檢測（4學時）實驗三 聚合酶鏈式反應（PCR）（3學時）

實驗四 PCR產物的瓊脂糖凝膠檢測與聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測（6學時）實驗五 分子生物學軟件的使用（4學時）

實驗六 生物信息學（3學時）生物信息獲取與利用 實驗考試

實驗三：瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA

【目的要求】

學習并掌握DNA瓊脂糖凝膠電泳基本原理和操作，了解如何通過電泳判斷DNA純度、含量和分子量。

【實驗原理】

凝膠電泳是分離、純化和鑒定DNA的常用方法。因為DNA分子是兩性解離分子，在pH高于其等電點（約3.5）的中性或堿性溶液中帶負電荷，在電場中向正極方向泳動。DNA凝膠電泳的介質主要有兩種：瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。聚丙烯凝膠的孔徑較小，適合于分離5-500bp的小片段DNA；而瓊脂糖凝膠的孔徑較大，可以分離100bp-60kb的較大片段DNA。不同濃度的瓊脂糖凝膠適合于分離不同大小的DNA片段（表7-1）。

瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，當熔化后再凝固時就會形成固體基質，具有多孔的網狀結構，孔徑大小取決于瓊脂糖濃度。DNA在瓊脂糖凝膠中泳動時，受到電荷效應和分子篩效應的雙重影響。電荷效應由分子所帶的電荷量多少來決定，而分子篩效應則與分子大小和構象有關。在一定的電場強度下，DNA分子的泳動速度主要取決于分子量大小和構象。線狀雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠介質中的遷移率與其分子量的對數值成反比。分子越大，遷移速度越慢，從而可以將不同大小的DNA分子分開。因此，通過與DNA標準分子量參照物（MW marker）的遷移率對照，可以鑒定DNA分子的大小。DNA分子的構象也可以明顯影響其遷移率。在細胞內質粒DNA有3種構象：超螺旋的共價閉環DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），松弛型的開環DNA（open circular DNA，ocDNA）和線性DNA，在瓊脂糖凝膠電泳中，其泳動速度依次為：cccDNA >線性DNA >ocDNA，因而未酶切的質粒DNA在電泳中多顯示為3條帶，泳動速度最快的超螺旋帶越亮，說明質粒DNA提取質量越好。

表7-1：不同濃度瓊脂糖凝膠對DNA的有效分離范圍

瓊脂糖濃度（%）線性DNA有效分離范圍(kb)0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3 DNA的遷移率還與電場強度（即單位長度的電壓降）有關，電場強度越大，泳動速度越快。當需要快速觀察電泳結果時，可以適當加大電場強度。但是電泳分辨率會隨著電場強度的增大而縮小，因為高分子高速流動時摩擦力增加，相對分子質量與移動速度就不一定成正比，因此一般電場強度應不超過5V/cm。特別是當需要較精確測定DNA片段大小、獲得理想的分辨率和漂亮的帶型時，應該適當降低電場強度，相應的適當延長電泳時間，并選用相對較低的凝膠濃度。

為了顯示凝膠中DNA的泳動位置，需要加入染色劑染色。最常用的染色劑是溴化乙錠（ethidium bromide EB）。溴化乙錠可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間，在紫外線的激發下發出橘紅色熒光。一般是在凝膠中直接加入終濃度為0.5μg/ml的溴化乙錠，這樣可以在電泳過程中隨時利用紫外燈觀察核酸的遷移情況。但是EB與DNA的結合會影響DNA的遷移率，因此對于需要較精確測定DNA片段大小、或需根據熒光強度測定DNA含量時，EB染色應在電泳結束后再進行（將凝膠浸入0.5μg/ml的溴乙錠水溶液中10min即可）。注意：EB是強誘變劑，使用EB必須戴一次性手套，不要灑在桌面地面上，被污染的物品必須專門處理后（加少量漂白粉可使EB分解），再徹底清洗或丟棄。

指示劑溴酚藍和二甲苯青的作用是指示樣品在凝膠中的遷移過程，以確定終止電泳時間。在0.6 %、1%、2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚藍分別約與1kb、600bp、150bp雙鏈線狀DNA片段的遷移率大致相同。在1%瓊脂糖凝膠中，二甲苯青大致相當于2kb雙鏈線狀DNA的位置。【試劑器材】

1．5×TAE：

2．10mg/ml溴化乙錠（EB），避光4℃保存。/ GoldView 常溫保存。3．6×上樣緩沖液（配方見附錄）4．（電泳）瓊脂糖

5． DNA、PCR擴增產物

6．DNA標準分子量marker（λDNA/HindIII）7．水平式電泳槽、電泳儀 8．透射式紫外燈 9．膠帶

10．微波爐或恒溫水浴 11．微量移液器 【操作步驟】

1．稱取瓊脂糖1g，置三角燒瓶中，加入1×TAE 100 ml，置沸水浴或微波爐中加熱，使充分溶解。注意：微波爐煮沸1次可能不能充分溶解，需取出混合后反復加熱1-2次，注意此時可能出現爆沸現象，避免蒸汽燙傷。

2．待瓊脂糖溶液冷卻至60-65℃左右時加入溴化乙錠/5ulGold View，使終濃度為0.5μg/ml，混勻。

3．用膠帶把制膠模具的兩端邊緣封好，置水平位置，選擇孔徑適宜的加樣孔模板（梳子），并垂直安插好。注意梳齒必須與模具底面保持一定距離（約0.5-1mm），防止樣品槽破裂，導致樣品泄漏。

圖3-1：凝膠灌膠過程示意圖

4．將冷卻至50-60℃左右的瓊脂糖溶液緩慢倒入制膠模具中，使凝膠液緩慢展開，直至形成厚度適當（一般為0.3-0.5cm）的膠層。小心去除加樣孔周圍的氣泡。室溫靜置30-60分鐘。（如圖3-1）

5．瓊脂糖完全凝固后，小心取出梳子，去掉模具兩端的膠帶，將凝膠放入電泳槽中。6．電泳槽中注入適量0.5×TBE緩沖液，使液面高于凝膠約1mm左右。7．分別取5μl DNA或者2μl PCR產物和約0.5μg DNA分子量marker，加入1/5體積（2ul）的上樣緩沖液，混勻。

8．小心緩慢將樣品上樣于凝膠加樣孔中。記錄樣品加樣孔順序。

9．上樣完成后，盡快開始電泳，以防止樣品漂流。接通電源，注意正負極是否正確。調節電壓在1-5V/cm左右，樣品進膠前電壓不要太高。電泳開始后不久就可以觀察到溴酚藍從加樣孔遷移到凝膠中。

10．根據指示劑遷移的位置，或根據反射紫外燈顯示的DNA遷移位置，判斷是否需要終止電泳。切斷電源后，取出凝膠。

11．將凝膠置于透射紫外燈上，打開紫外燈（注意盡量避免使用254nm短波紫外燈，并戴好防護眼鏡或防護罩），觀察染色后發出橘紅色熒光的DNA條帶，拍照記錄。

注意觀察樣品DNA條帶是否清晰，有無拖尾現象，條帶數量、大小是否正確，判斷樣品DNA分子大小，與預期大小是否相符，并目測粗略估算樣品DNA含量。【注意事項】

（1）凝膠不能有氣泡。（2）電泳是從負極到正極。

（3）EB是致癌劑，操作要帶手套。【實驗安排】

本實驗一天內可做完。【作業】

寫出實驗步驟及注意事項。

相關溶液配制

1,50倍TAE緩沖液的配制(pH8.5)配方：2MTris-HAc、100mM EDTA 配制量：1L 配制方法：

1）稱取Tris堿242.3g，置于燒杯中

2）稱取EDTA固體29.3g或Na2EDTA-2H2O固體37.2g 3）加入700mLddH2O，溶解完全 4）加入57mLHAc，充分攪拌 5）用HAc調pH至8.5 6）定容至1L，室溫保存

2，溴化乙錠(EB)【強致癌物】 配制量：100mL 配制方法：

1）1gEB于專用容器中

2）加入100mLddH2O,攪拌數小時至溶解完全 3）轉移至棕色瓶中，避光保存 3，6×上樣緩沖液Loading Buffer 配方：30mMEDTA；36%（V/V）丙三醇；0.05%溴酚藍；pH7.0 配制量：100mL 配置方法：

1）6mL EDTA（500mM，pH8.0）加入50ml ddH2O中 2）5mL 1%溴酚藍 3）取36mL丙三醇

4)用2N的NaOH調pH=7.0 5）定容至100mL 4，6×甘油上樣緩沖液Loading Buffer 配方、配制量：

成分及終濃度 0.15%溴酚藍

0.15%二甲苯靑EF 5mmol/L EDTA 50%甘油 水

配制10ml溶液各成分用量 1.5ml 1%溴酚藍

1.5ml 1%二甲苯靑EF

100ul 0.5mol/L EDTA(pH8.0)3ml 3.9ml

5.GoldView(GV)GoldView(GV)是一種可代替溴化乙錠（EB）的新型核酸染料，其靈敏度與EB相當，使用方法與之完全相同，在100ml瓊脂糖膠溶液中加入5μl GoldView?即可。在紫外透射光下雙鏈DNA呈現綠色熒光，也可用于染RNA。

由于未發現GoldView?有致癌作用，且靈敏度與EB相當，將有可能逐漸取代EB而得以廣泛應用。

概 述

GoldView?是一種可代替溴化乙錠（EB）的新型核酸染料，采用瓊脂糖電泳檢測DNA時，GoldView?與核酸結合后能產生很強的熒光信號，其靈敏度與EB相當，使用方法與之完全相同。在紫外透射光下雙鏈DNA呈現綠色熒光，而且也可用于染RNA。

通過Ames試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、小鼠睪丸精母細胞染色體畸變試驗，致突變性結果均為陰性；而溴化乙錠（EB）是一種強致癌劑。因此用Goldview?代替EB不失為一種明智的選擇。

使用方法

1.將100ml瓊脂糖凝膠溶液（濃度一般為0.8%~2%）在微波爐中融化。

2.加入5ul GoldView，輕輕搖勻，避免產生氣泡。

3.冷卻至不燙手時倒膠，待瓊脂糖凝膠完全凝固后上樣電泳。

4.電泳完畢在紫外燈下觀察。若使用數碼相機照相記錄，則關閉相機的閃光燈，放在自動檔即可；若使用凝膠成像系統照相，通過調節光圈、曝光時間，選擇合適的濾光片，可得到成像清晰、背景較低的照片。

注意事項

1.膠厚度不宜超過0.5cm，膠太厚會影響檢測的靈敏度。

2.加入GoldView的瓊脂糖凝膠反復融化可能會對核酸檢測的靈敏度產生一定影響，但不明顯。

3.通過凝膠電泳回收DNA片段時，建議使用GoldView染色，在自然光下切割DNA條帶，避免紫外線與EB對目的DNA產生的損傷，可明顯提高克隆、轉化、轉錄等分子生物學下游操作的效率。

4.雖然未發現GoldView有致癌作用，但對皮膚、眼睛會有一定的刺激，操作時應戴上手套。