第一篇：現(xiàn)代分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)儀器
實(shí)驗(yàn)一
分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器及使用
事實(shí)證明，在科學(xué)飛速發(fā)展的今天，無論從事哪個(gè)領(lǐng)域的研究，要想突破，除了有良好的理論基礎(chǔ)外，更重要的是依賴于先進(jìn)的技術(shù)和優(yōu)良的儀器設(shè)備以及良好的研究環(huán)境。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室除了具有一般生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)儀器設(shè)備外，還具有一些特殊用途的儀器，這些儀器一般較精密，價(jià)格昂貴。下面介紹這些儀器的使用方法和注意事項(xiàng)。
一、冷凍離心機(jī)
低溫分離技術(shù)是分子生物學(xué)研究中必不可少的手段。基因片段的分離、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物樣品的分離制備實(shí)驗(yàn)中都離不開低溫離心技術(shù)，因此低溫冷凍離心機(jī)成為分子生物學(xué)研究中必備的重要儀器。在國內(nèi)，有多個(gè)廠家生產(chǎn)冷凍離心機(jī)，本實(shí)驗(yàn)室的高速冷凍離心機(jī)為GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式轉(zhuǎn)頭：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。極限轉(zhuǎn)速20000rpm。
1.安裝與調(diào)試
離心機(jī)應(yīng)放置在水平堅(jiān)固的地面上，應(yīng)至少距離10cm以上且具有良好的通風(fēng)環(huán)境中，周圍空氣應(yīng)呈中性，且無導(dǎo)電性灰塵、易燃?xì)怏w和腐蝕性氣體，環(huán)境溫度應(yīng)在0～30℃之間，相對(duì)濕度小于80%。試轉(zhuǎn)前應(yīng)先打開蓋門，用手盤動(dòng)轉(zhuǎn)軸，輕巧靈活，無異常現(xiàn)象方可上所用的轉(zhuǎn)頭。轉(zhuǎn)子準(zhǔn)確到位后打開電源開關(guān)，然后用手按住門開關(guān)，再按運(yùn)轉(zhuǎn)鍵，轉(zhuǎn)動(dòng)后立即停止，并觀察轉(zhuǎn)軸的轉(zhuǎn)向，若逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)即為正確，機(jī)器可投入使用。
2.操作程序
（1）插上電源，待機(jī)指示燈亮；打開電源開關(guān)，調(diào)速與定時(shí)系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示的閃爍數(shù)字為機(jī)器工作轉(zhuǎn)速的出廠設(shè)定，溫控系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示此時(shí)離心腔的溫度。（2）設(shè)定機(jī)器的工作參數(shù)，如工作溫度，運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間，工作轉(zhuǎn)速等。
（3）將預(yù)先平衡好的樣品放置于轉(zhuǎn)頭樣品架上，關(guān)閉機(jī)蓋。按控制面板的運(yùn)轉(zhuǎn)鍵，離心機(jī)開始運(yùn)轉(zhuǎn)。在預(yù)先設(shè)定的加速時(shí)間內(nèi)，其運(yùn)速升至預(yù)先設(shè)定的值。（5）在預(yù)先設(shè)定的運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間內(nèi)（不包括減速時(shí)間），離心機(jī)開始減速，其轉(zhuǎn)速在預(yù)先設(shè)定的減速時(shí)間內(nèi)降至零。
（6）按控制面板上的停止鍵，數(shù)碼管顯示dedT，數(shù)秒鐘后即顯示閃爍的轉(zhuǎn)速值，這時(shí)機(jī)器已準(zhǔn)備好下一次工作。
3.注意事項(xiàng)
（1）離心機(jī)應(yīng)始終處于水平位置，外接電源系統(tǒng)的電壓要匹配，并要求有良好的接地線，機(jī)器不使用，要拔掉電源插頭。
（2）開機(jī)前應(yīng)檢查轉(zhuǎn)頭安裝是否牢固，機(jī)腔中有無異物掉入。
（3）樣品應(yīng)預(yù)先平衡，使用離心筒離心時(shí)離心筒與樣品應(yīng)同時(shí)平衡。
（4）揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時(shí)，應(yīng)使用帶蓋的離心管，并確保液體不外漏以免腐蝕機(jī)腔或造成事故。（5）除工作溫度、運(yùn)轉(zhuǎn)速度和運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間外，不要隨意更改機(jī)器的工作參數(shù)，以免影響機(jī)器性能。轉(zhuǎn)速設(shè)定不得超過最高轉(zhuǎn)速，以確保機(jī)器安全運(yùn)轉(zhuǎn)。
（6）使用中如出現(xiàn)0.00或其它數(shù)字，機(jī)器不運(yùn)轉(zhuǎn)，應(yīng)關(guān)機(jī)斷電，10秒鐘后重新開機(jī)，待所設(shè)轉(zhuǎn)速顯示后，再按運(yùn)轉(zhuǎn)鍵，機(jī)器將照常運(yùn)轉(zhuǎn)。
（7）不得在機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)過程中或轉(zhuǎn)子未停穩(wěn)的情況下打開蓋門，以免發(fā)生事故。（8）每次操作完畢應(yīng)做好使用情況記錄，并定期對(duì)機(jī)器各項(xiàng)性能進(jìn)行檢修。
二、電泳儀
電泳技術(shù)是分子生物學(xué)研究不可缺少的重要手段。電泳一般分為自由界面電泳和區(qū)帶電泳大類，自由界面電泳不需支持物，如等速電泳、密度梯度電泳及顯微電泳等，這類電泳目前已很少使用。區(qū)帶電泳需用各種類型的物質(zhì)作為支持物，常用的支持物有濾紙、醋酸纖維薄膜、非凝膠性支持物、凝膠性支持物及硅膠―G薄層等，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的是瓊脂糖凝膠電泳。應(yīng)用電泳法可以對(duì)不同物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析，或?qū)⒁欢ɑ旌衔镞M(jìn)行組份分析或單個(gè)組份提取制備。下面以DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）為例介紹其使用方法。1.使用方法
（1）按電源開關(guān)，顯示屏出現(xiàn)“歡迎使用DYY-12型電腦三恒多用電泳儀?”等字樣后，同時(shí)系統(tǒng)初始化，蜂鳴4聲，設(shè)置常設(shè)置。屏幕轉(zhuǎn)成參數(shù)設(shè)置狀態(tài)，見圖一：
U:0V U＝100V ｜Mode： STD
I: 0mAI ＝50mA｜ P: 0W P＝50W｜T: 00:00 T＝ 01:00｜
其中:左側(cè)大寫U: I: P: T: 為電泳時(shí)實(shí)際值；中間部分顯示程序的常設(shè)值（預(yù)置值）。Mode(模)：STD(標(biāo)準(zhǔn))；TIME(定時(shí))；VH（伏時(shí)）；STEP（分步）
（2）設(shè)置工作程序。用鍵盤輸入新的工作程序。例如，要求工作電壓U＝1000V，電流I限200mA以內(nèi)，功率W限制在100W以內(nèi)，時(shí)間T為3小時(shí)20 分，并且到時(shí)間自
動(dòng)關(guān)掉輸出。則操作步驟如下：
①按“模式”鍵，將工作模式由標(biāo)準(zhǔn)（STD）轉(zhuǎn)為定時(shí)（TIME）3 模式。每按一下模式鍵，其工作方式按下列順序改變： STD?TIME?VH?STEP?STD。
②先設(shè)置電壓U，按“選擇”鍵，先將其反顯，然后輸入數(shù)字鍵即可設(shè)置該參數(shù)的數(shù)值。按數(shù)字1000,則電壓即設(shè)置完成。
③設(shè)置電流I，按“選擇”鍵，先使I反顯，然后輸入數(shù)字200。
④設(shè)置功率P，按“選擇”鍵，先使P反顯，然后輸入數(shù)字100。
⑤設(shè)置時(shí)間T，按“選擇”鍵，先使T反顯，然后輸入數(shù)字320。如果輸入錯(cuò)誤，可以按“清除”鍵，再重新輸入。
⑥確認(rèn)各參數(shù)無誤后，按“啟動(dòng)”鍵，啟動(dòng)電泳儀輸出程序。在顯示屏狀態(tài)欄中顯示Start!并蜂鳴4聲，提醒操作者電泳儀將輸出高電壓，注意安全。之后逐漸將輸出電壓加至設(shè)置值。同時(shí)在狀態(tài)欄中顯示“Run”，并有兩個(gè)不斷閃爍的高壓符號(hào)，表示端口已有電壓輸出。在狀態(tài)欄最下方，顯示實(shí)際的工作時(shí)間（精確到秒）。
⑦每次啟動(dòng)輸出時(shí)，儀器自動(dòng)將此時(shí)的設(shè)置數(shù)值存入“MO”號(hào)存儲(chǔ)單元。以后需要調(diào)用時(shí)可以按“讀取”鍵，再按“0”鍵，按“確定”鍵，即可將上次設(shè)置的工作程序取出執(zhí)行。
⑧電泳結(jié)束，儀器顯示：“END”，并連續(xù)蜂鳴提醒。此時(shí)按任一鍵可止鳴。2.注意事項(xiàng)
(1)U、I、P三個(gè)參數(shù)的有效輸入范圍是：U：5～3000V；I：4～400mA；P：4～400W.(2)一般情況下，當(dāng)No Load！時(shí)，首先應(yīng)關(guān)機(jī)檢查電極導(dǎo)線與電泳槽之間是否有接觸不良的地方，可以用萬用表的歐姆檔逐段測(cè)量。
(3)如果輸出端接多個(gè)電泳槽，則儀器顯示的電流數(shù)值為各槽電流之和，此時(shí)應(yīng)選擇穩(wěn)壓輸出，以減小各槽的相互影響。
(4)注意保持儀器的清潔，不要遮擋儀器后方進(jìn)風(fēng)通道。嚴(yán)禁將電泳槽放在儀器頂部，避免緩沖液灑進(jìn)儀器內(nèi)部。
(5)本儀器輸出電壓較高，使用中應(yīng)不避免接觸輸出回路及電泳槽內(nèi)部，以免發(fā)生危險(xiǎn)。
(6）長期不用儀器，應(yīng)放置在干燥通風(fēng)的清潔環(huán)境中保存
三、分析天平
分析天平是定量分析工作中不可缺少的重要儀器，充分了解儀器性能及熟練掌握其使用方法，是獲得可靠分析結(jié)果的保證。分析天平的種類很多，有普通分析天平、半自動(dòng)/全自動(dòng)電光分析天平及電子分析天平等。目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)備用的是自動(dòng)化程度較高的電子分析天平。下面介紹電子分析天平
PL203/01型和AL104/01型
(METTLER-TOLEDO)的性能及使用方法。
PL203/01型精密電子天平：最大稱量210g；實(shí)際分度值0.001g；
AL104/01型高分辨率電子分析天平：最大稱量110g；實(shí)際分度值0.0001g 1.使用方法
（1）檢查并調(diào)整天平至水平位置。檢查電源電壓是否匹配（使用配置的穩(wěn)壓器），按天平儀器要求通電預(yù)熱至所需時(shí)間30min。
（2）打開天平開關(guān)“on”，天平則自動(dòng)進(jìn)行靈敏度及零點(diǎn)調(diào)節(jié)。待顯示屏上所有字段短時(shí)點(diǎn)亮，天平回零時(shí)，可進(jìn)行正式稱量。
（3）稱量時(shí)將潔凈稱量瓶或稱量紙置于稱盤上，關(guān)上側(cè)門，天平將顯示該重量，點(diǎn)擊“?O/T?”鍵自動(dòng)校對(duì)零，然后逐漸加入待稱物質(zhì)，直至所需重量為止。
（4）稱量結(jié)束應(yīng)及時(shí)除去稱量瓶（紙），關(guān)上側(cè)門，切斷電源，并做好使用情況登記。
2.注意事項(xiàng)
（1）天平應(yīng)放置在牢固平穩(wěn)水泥臺(tái)或木臺(tái)上，室內(nèi)要求清潔、干燥，同時(shí)應(yīng)避免光線直接照射到天平上。
（2）稱量時(shí)應(yīng)從側(cè)門取放物質(zhì)，讀數(shù)時(shí)應(yīng)關(guān)閉箱門以免空氣流動(dòng)引起天平擺動(dòng)。（3）揮發(fā)性、腐蝕性、強(qiáng)酸強(qiáng)堿類物質(zhì)應(yīng)盛于帶蓋稱量瓶內(nèi)稱量，防止腐蝕天平。
（4）電子分析天平若長時(shí)間不使用，則應(yīng)定時(shí)通電預(yù)熱，每周一次，每次預(yù)熱2h，以確保儀器始終處于良好使用狀態(tài)。
四、分光光度計(jì)
不同物質(zhì)對(duì)不同波長入射的吸收程度各不相同，從而形成各具特征的吸收光譜。根據(jù)這一原理，應(yīng)用比色法可以對(duì)某些有色物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析。但由于比色法僅限于可見光區(qū)，而且精度低，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足高精度微量分析的要求。隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，分析儀器也 不斷地更新?lián)Q代，人們引進(jìn)了分光光度法的概念，分光光度計(jì)隨之應(yīng)用。分光光度計(jì)由光源、單色器、吸收池、接受器、顯示屏幕所組成，它不僅適應(yīng)于可見光區(qū)，同時(shí)還擴(kuò)展至紫外光 區(qū)及紅外光區(qū)。光密度（OD）是許多溶液中的溶質(zhì)定量的指標(biāo)之一，通過所產(chǎn)生的單色光 而測(cè)定某一溶液對(duì)該單色光的吸收值。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行核酸溶 液定量和純度的初步判斷。下面介紹紫外可見光分光光度計(jì)GeneQantTM Pro（Amersham）的使用方法。該儀器除了能檢測(cè)核酸樣品濃度外，還可進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度以及細(xì)胞培養(yǎng)液濃度 的測(cè)定，能檢測(cè)低至幾微升樣品（70μl和5～7μl），樣品無需稀釋，測(cè)量后還可全部回收。5 使用方法
(1）打開電源開關(guān)（ON），等待數(shù)秒鐘，顯示屏上顯示一系列數(shù)據(jù)，如本機(jī)型號(hào)、當(dāng)前日期 等，這些數(shù)據(jù)可以重新設(shè)置，當(dāng)出現(xiàn)“instrument Ready”即可進(jìn)入下一程序。
(2）在儀器面板上有許多功能鍵，其中包括檢測(cè)base sep、Tm、DNA、RNA、oligo、Protein595assay、Protein280 meas、cell culture等。例如，欲檢測(cè)DNA，按DNA鍵，即進(jìn)入DNA檢測(cè)程序。在顯示屏上：Pathlengh 10mm Units μg/μl Use 320nm NO Dilution Faotor 1 Insert reference, 以上為儀器預(yù)設(shè)置的參考數(shù)據(jù)，若按“enter”鍵，和“select”鍵可以將以上的參數(shù)進(jìn)行重新設(shè)定。
(3）取石英樣品杯70μl或5～7μl，容量大小根據(jù)需要。先用吸管吸高純水入樣品杯中，然 后放入儀器上的樣品槽中，放入時(shí)注意樣品杯的光學(xué)面朝前方。
(4)按“set ref”鍵，進(jìn)行空白測(cè)試。顯示屏上出現(xiàn)一系列數(shù)據(jù)均“0.000”并提示插入樣品“Insert sample ”。將樣品杯取出，吸干水分，稍干燥后，同樣吸入待測(cè)樣品，放入樣品槽 中進(jìn)行測(cè)定。
(5）一個(gè)樣品測(cè)定完畢，按“stop”鍵，返回“Instrument Ready”。
(6）取出樣品杯，吸出樣品，然后用高純水洗幾次，自然晾干。由于樣品杯十分昂貴，使用時(shí)要小心操作。不能用手指拿樣品杯的光學(xué)面，用后要及時(shí)洗滌，可用溫水或稀鹽酸，乙醇以至鉻酸洗液（濃酸中浸泡不要超過15分鐘），表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈。
五、數(shù)字式酸度計(jì)
酸度計(jì)是實(shí)驗(yàn)室配置溶液必備的儀器。本實(shí)驗(yàn)室的酸度計(jì)為臺(tái)式微電腦酸堿度計(jì)和溫度計(jì)（Hanna）,測(cè)量pH范圍為0.00～14.00pH；溫度為0.0～100.0℃；
1.使用方法
（1）將pH電極和溫度探頭與主機(jī)連接，主機(jī)與電源連接。
第二篇：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器及使用方法
實(shí)驗(yàn)一
分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用儀器及使用
事實(shí)證明，在科學(xué)飛速發(fā)展的今天，無論從事哪個(gè)領(lǐng)域的研究，要想突破，除了有良好的理論基礎(chǔ)外，更重要的是依賴于先進(jìn)的技術(shù)和優(yōu)良的儀器設(shè)備以及良好的研究環(huán)境。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室除了具有一般生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)儀器設(shè)備外，還具有一些特殊用途的儀器，這些儀器一般較精密，價(jià)格昂貴。下面介紹這些儀器的使用方法和注意事項(xiàng)。
一、冷凍離心機(jī)
低溫分離技術(shù)是分子生物學(xué)研究中必不可少的手段。基因片段的分離、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物樣品的分離制備實(shí)驗(yàn)中都離不開低溫離心技術(shù)，心機(jī)成為分子生物學(xué)研究中必備的重要儀器。室的高速冷凍離心機(jī)為GL-20G-Ⅱ型（上海安亭）×10ml和12×1.5ml。極限轉(zhuǎn)速20000rpm。
1.安裝與調(diào)試
離心機(jī)應(yīng)放置在水平堅(jiān)固的地面上，應(yīng)至少距離中，周圍空氣應(yīng)呈中性，且無導(dǎo)電性灰塵、易燃?xì)怏w和腐蝕性氣體，環(huán)境溫度應(yīng)在之間，相對(duì)濕度小于80%。試轉(zhuǎn)前應(yīng)先打開蓋門，用手盤動(dòng)轉(zhuǎn)軸，輕巧靈活，無異常現(xiàn)象方可上所用的轉(zhuǎn)頭。轉(zhuǎn)子準(zhǔn)確到位后打開電源開關(guān)，然后用手按住門開關(guān)，動(dòng)后立即停止，并觀察轉(zhuǎn)軸的轉(zhuǎn)向，若逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)即為正確，機(jī)器可投入使用。2.操作程序
（1）插上電源，待機(jī)指示燈亮；打開電源開關(guān)，調(diào)速與定時(shí)系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示的閃爍數(shù)字為機(jī)器工作轉(zhuǎn)速的出廠設(shè)定，溫控系統(tǒng)的數(shù)碼管顯示此時(shí)離心腔的溫度。
（2）設(shè)定機(jī)器的工作參數(shù)，如工作溫度，運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間，工作轉(zhuǎn)速等。
（3）將預(yù)先平衡好的樣品放置于轉(zhuǎn)頭樣品架上，關(guān)閉機(jī)蓋。
（4）按控制面板的運(yùn)轉(zhuǎn)鍵，離心機(jī)開始運(yùn)轉(zhuǎn)。預(yù)先設(shè)定的值。
（5）在預(yù)先設(shè)定的運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間內(nèi)（不包括減速時(shí)間）定的減速時(shí)間內(nèi)降至零。
（6）按控制面板上的停止鍵，數(shù)碼管顯示機(jī)器已準(zhǔn)備好下一次工作。
3.注意事項(xiàng)
（1）離心機(jī)應(yīng)始終處于水平位置，外接電源系統(tǒng)的電壓要匹配，并要求有良好的接地線，機(jī)器不使用，要拔掉電源插頭。
（2）開機(jī)前應(yīng)檢查轉(zhuǎn)頭安裝是否牢固，機(jī)腔中有無異物掉入。
（3）樣品應(yīng)預(yù)先平衡，使用離心筒離心時(shí)離心筒與樣品應(yīng)同時(shí)平衡。
（4）揮發(fā)性或腐蝕性液體離心時(shí)，應(yīng)使用帶蓋的離心管，并確保液體不外漏以免腐蝕機(jī)腔或造成事故。
在國內(nèi)，有多個(gè)廠家生產(chǎn)冷凍離心機(jī)，落地式。配有角式轉(zhuǎn)頭：10cm在預(yù)先設(shè)定的加速時(shí)間內(nèi)，其運(yùn)速升，離心機(jī)開始減速，其轉(zhuǎn)速在預(yù)先設(shè)dedT，數(shù)秒鐘后即顯示閃爍的轉(zhuǎn)速值，這時(shí)1
本實(shí)驗(yàn)6×50ml、120～30℃
至 因此低溫冷凍離 以上且具有良好的通風(fēng)環(huán)境再按運(yùn)轉(zhuǎn)鍵，轉(zhuǎn)
（5）除工作溫度、運(yùn)轉(zhuǎn)速度和運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間外，不要隨意更改機(jī)器的工作參數(shù)，以免影響機(jī)器性能。轉(zhuǎn)速設(shè)定不得超過最高轉(zhuǎn)速，以確保機(jī)器安全運(yùn)轉(zhuǎn)。
（6）使用中如出現(xiàn)0.00或其它數(shù)字，機(jī)器不運(yùn)轉(zhuǎn)，應(yīng)關(guān)機(jī)斷電，10秒鐘后重新開機(jī)，待所設(shè)轉(zhuǎn)速顯示后，再按運(yùn)轉(zhuǎn)鍵，機(jī)器將照常運(yùn)轉(zhuǎn)。
（7）不得在機(jī)器運(yùn)轉(zhuǎn)過程中或轉(zhuǎn)子未停穩(wěn)的情況下打開蓋門，以免發(fā)生事故。
（8）每次操作完畢應(yīng)做好使用情況記錄，并定期對(duì)機(jī)器各項(xiàng)性能進(jìn)行檢修。
二、電泳儀
電泳技術(shù)是分子生物學(xué)研究不可缺少的重要手段。帶電泳大類，自由界面電泳不需支持物，泳目前已很少使用。區(qū)帶電泳需用各種類型的物質(zhì)作為支持物，纖維薄膜、非凝膠性支持物、是瓊脂糖凝膠電泳。應(yīng)用電泳法可以對(duì)不同物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析，組份分析或單個(gè)組份提取制備。下面以為例介紹其使用方法。
1.使用方法
（1）按電源開關(guān)，顯示屏出現(xiàn)“歡迎使用同時(shí)系統(tǒng)初始化，蜂鳴
U:
0V
U＝
I:
0mA
I ＝
P:
0W
P＝
T:
00:00
T＝
其中:左側(cè)大寫Mode(模式)：STD(標(biāo)準(zhǔn)
（2）設(shè)置工作程序。用鍵盤輸入新的工作程序。例如，要求工作電壓I限制在200mA以內(nèi)，功率動(dòng)關(guān)掉輸出。則操作步驟如下：
①按“模式”鍵，將工作模式由標(biāo)準(zhǔn)（凝膠性支持物及硅膠―4聲，設(shè)置常設(shè)置。屏幕轉(zhuǎn)成參數(shù)設(shè)置狀態(tài)，見圖一：
100V
50mA
｜
50W
｜ 01:00
｜U: I: P: T:)；TIME(定時(shí)W限制在 電泳一般分為自由界面電泳和區(qū)如等速電泳、密度梯度電泳及顯微電泳等，這類電G薄層等，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）DYY-12型電腦三恒多用電泳儀?”等字樣后，Mode：
STD
中間部分顯示程序的常設(shè)值)；VH（伏時(shí)）；STEP（分步）100W以內(nèi)，時(shí)間T為3STD）轉(zhuǎn)為定時(shí)（TIME）2
醋酸或?qū)⒁欢ɑ旌衔镞M(jìn)行（預(yù)置值）。U＝1000V，電流20分，并且到時(shí)間自常用的支持物有濾紙、｜
為電泳時(shí)實(shí)際值； 小時(shí) 模式。每按一下模式鍵，其工作方式按下列順序改變：
STD?TIME?VH?STEP?STD。
②先設(shè)置電壓U，按“選擇”鍵，先將其反顯，然后輸入數(shù)字鍵即可設(shè)置該參數(shù)的數(shù)值。按數(shù)字1000,則電壓即設(shè)置完成。
③設(shè)置電流I，按“選擇”鍵，先使I反顯，然后輸入數(shù)字200。
④設(shè)置功率P，按“選擇”鍵，先使P反顯，然后輸入數(shù)字100。
⑤設(shè)置時(shí)間以按“清除”鍵，再重新輸入。
⑥確認(rèn)各參數(shù)無誤后，按“啟動(dòng)”鍵，啟動(dòng)電泳儀輸出程序。在顯示屏狀態(tài)欄中顯示Start!并蜂鳴至設(shè)置值。同時(shí)在狀態(tài)欄中顯示“壓輸出。在狀態(tài)欄最下方，顯示實(shí)際的工作時(shí)間（精確到秒）
⑦每次啟動(dòng)輸出時(shí)，儀器自動(dòng)將此時(shí)的設(shè)置數(shù)值存入“要調(diào)用時(shí)可以按“讀取”鍵，再按“出執(zhí)行。
⑧電泳結(jié)束，儀器顯示：
2.注意事項(xiàng)
(1)U、I、P三個(gè)參數(shù)的有效輸入范圍是：
(2)一般情況下，當(dāng)?shù)牡胤剑梢杂萌f用表的歐姆檔逐段測(cè)量。
(3)如果輸出端接多個(gè)電泳槽，則儀器顯示的電流數(shù)值為各槽電流之和，此時(shí)應(yīng)選擇穩(wěn)壓輸出，以減小各槽的相互影響。
(4)注意保持儀器的清潔，不要遮擋儀器后方進(jìn)風(fēng)通道。嚴(yán)禁將電泳槽放在儀器頂部，避免緩沖液灑進(jìn)儀器內(nèi)部。
(5)本儀器輸出電壓較高，使用中應(yīng)不避免接觸輸出回路及電泳槽內(nèi)部，以免發(fā)生危險(xiǎn)。
(6）長期不用儀器，應(yīng)放置在干燥通風(fēng)的清潔環(huán)境中保存。
三、分析天平
分析天平是定量分析工作中不可缺少的重要儀器，充分了解儀器性能及熟練掌握其使用方 T，按“選擇”鍵，先使 4聲，提醒操作者電泳儀將輸出高電壓，“No Load！時(shí)，首先應(yīng)關(guān)機(jī)檢查電極導(dǎo)線與電泳槽之間是否有接觸不良
T反顯，然后輸入數(shù)字Run”，并有兩個(gè)不斷閃爍的高壓符號(hào)，表示端口已有電0”鍵，按“確定”鍵，即可將上次設(shè)置的工作程序取END”，并連續(xù)蜂鳴提醒。此時(shí)按任一鍵可止鳴。U：5 3
注意安全。3000V；I：320。如果輸入錯(cuò)誤，可之后逐漸將輸出電壓加 MO”號(hào)存儲(chǔ)單元。以后需4～400mA P：4～400W.。～ ； 法，是獲得可靠分析結(jié)果的保證。分析天平的種類很多，有普通分析天平、半自動(dòng)/全自動(dòng)電光分析天平及電子分析天平等。目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)備用的是自動(dòng)化程度較高的電子分析天平。下面介紹電子分析天平PL203/01型和AL104/01型(METTLER-TOLEDO)的性能及使用方法。PL203/01型精密電子天平：最大稱量210g；實(shí)際分度值0.001g；AL104/01型高分辨率電子分析天平：最大稱量110g；實(shí)際分度值0.0001g
1.使用方法
（1）檢查并調(diào)整天平至水平位置。檢查電源電壓是否匹配（使用配置的穩(wěn)壓器），按天平儀器要求通電預(yù)熱至所需時(shí)間
（2）打開天平開關(guān)“短時(shí)點(diǎn)亮，天平回零時(shí)，可進(jìn)行正式稱量。
（3）稱量時(shí)將潔凈稱量瓶或稱量紙置于稱盤上，關(guān)上側(cè)門，天平將顯示該重量，點(diǎn)擊“?O/T?”鍵自動(dòng)校對(duì)零，然后逐漸加入待稱物質(zhì)，直至所需重量為止。
（4）稱量結(jié)束應(yīng)及時(shí)除去稱量瓶（紙）
2.注意事項(xiàng)
（1）天平應(yīng)放置在牢固平穩(wěn)水泥臺(tái)或木臺(tái)上，室內(nèi)要求清潔、干燥，同時(shí)應(yīng)避免光線直接照射到天平上。
（2）稱量時(shí)應(yīng)從側(cè)門取放物質(zhì)，讀數(shù)時(shí)應(yīng)關(guān)閉箱門以免空氣流動(dòng)引起天平擺動(dòng)。
（3）揮發(fā)性、腐蝕性、強(qiáng)酸強(qiáng)堿類物質(zhì)應(yīng)盛于帶蓋稱量瓶內(nèi)稱量，防止腐蝕天平。
（4）電子分析天平若長時(shí)間不使用，則應(yīng)定時(shí)通電預(yù)熱，每周一次，每次預(yù)熱確保儀器始終處于良好使用狀態(tài)。
四、分光光度計(jì)
不同物質(zhì)對(duì)不同波長入射的吸收程度各不相同，從而形成各具特征的吸收光譜原理，應(yīng)用比色法可以對(duì)某些有色物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析。而且精度低，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足高精度微量分析的要求。不斷地更新?lián)Q代，人們引進(jìn)了分光光度法的概念，單色器、吸收池、接受器、顯示屏幕所組成，它不僅適應(yīng)于可見光區(qū)，同時(shí)還擴(kuò)展至紫外光區(qū)及紅外光區(qū)。光密度（而測(cè)定某一溶液對(duì)該單色光的吸收值。液定量和純度的初步判斷。下面介紹紫外可見光分光光度計(jì)的使用方法。該儀器除了能檢測(cè)核酸樣品濃度外，的測(cè)定，能檢測(cè)低至幾微升樣品（30min。on”，天平則自動(dòng)進(jìn)行靈敏度及零點(diǎn)調(diào)節(jié)。待顯示屏上所有字段，關(guān)上側(cè)門，切斷電源，并做好使用情況登記。
隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，分光光度計(jì)隨之應(yīng)用。OD）是許多溶液中的溶質(zhì)定量的指標(biāo)之一，通過所產(chǎn)生的單色光分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行核酸溶還可進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度以及細(xì)胞培養(yǎng)液濃度70μl和5～7μl），樣品無需稀釋，測(cè)量后還可全部回收。4
分光光度計(jì)由光源、GeneQantTM Pro
2h，以。根據(jù)這一分析儀器也Amersham）
但由于比色法僅限于可見光區(qū)，（使用方法
(1）打開電源開關(guān)（ON），等待數(shù)秒鐘，顯示屏上顯示一系列數(shù)據(jù)，如本機(jī)型號(hào)、當(dāng)前日期等，這些數(shù)據(jù)可以重新設(shè)置，當(dāng)出現(xiàn)“instrument Ready”即可進(jìn)入下一程序。
(2）在儀器面板上有許多功能鍵，其中包括檢測(cè)base sep、Tm、DNA、RNA、oligo、Protein595assay、Protein280 meas、cell culture等。例如，欲檢測(cè)DNA，按DNA鍵，即進(jìn)入DNA檢測(cè)程序。在顯示屏上：
以上為儀器預(yù)設(shè)置的參考數(shù)據(jù)，若按“新設(shè)定。
(3）取石英樣品杯后放入儀器上的樣品槽中，放入時(shí)注意樣品杯的光學(xué)面朝前方。
(4)按“set ref”鍵，進(jìn)行空白測(cè)試。顯示屏上出現(xiàn)一系列數(shù)據(jù)均““Insert sample 中進(jìn)行測(cè)定。
(5）一個(gè)樣品測(cè)定完畢，按“
(6）取出樣品杯，吸出樣品，然后用高純水洗幾次，自然晾干。由于樣品杯十分昂貴，使用時(shí)要小心操作。以至鉻酸洗液（濃酸中浸泡不要超過
五、數(shù)字式酸度計(jì)
酸度計(jì)是實(shí)驗(yàn)室配置溶液必備的儀器。本實(shí)驗(yàn)室的酸度計(jì)為臺(tái)式微電腦酸堿度計(jì)和溫度計(jì)（Hanna
1.使用方法
（1）將pH
70μl或5。將樣品杯取出，吸干水分，稍干燥后，同樣吸入待測(cè)樣品，放入樣品槽 ,測(cè)量pH范圍為
Pathlengh
10mm
Units
μg/μl
Use 320nm
NO
Dilution Faotor 1
Insert reference，enter”鍵，和“select”鍵可以將以上的參數(shù)進(jìn)行重7μl，容量大小根據(jù)需要。先用吸管吸高純水入樣品杯中，然 0.000”并提示插入樣品stop”鍵，返回“Instrument Ready”。可用溫水或稀鹽酸，乙醇15分鐘），表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈。0.00～14.00pH；溫度為0.0～100.0℃；
～”不能用手指拿樣品杯的光學(xué)面，用后要及時(shí)洗滌，）電極和溫度探頭與主機(jī)連接，主機(jī)與電源連接。
（2）取出電極保護(hù)套，如果有結(jié)晶鹽出現(xiàn)，這是電極常見現(xiàn)象，浸入水后就會(huì)消逝。如果薄膜玻璃或透析膜發(fā)干，可在HI170300電極保存液中浸泡1小時(shí)。
（3）pH校準(zhǔn)。將pH電極和溫度探棒浸泡在所選的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液內(nèi)4cm（建議用pH6.86、7.01），緩沖液值可通過“D℃”或“?℃”鍵來調(diào)節(jié)。按“CAL”鍵，儀器將顯示“CAL”和“BUF”符號(hào)及“7.01”數(shù)據(jù)。當(dāng)讀數(shù)不穩(wěn)定時(shí)，屏幕會(huì)顯示“NOTREADY”；當(dāng)讀數(shù)穩(wěn)定時(shí)，屏幕會(huì)顯示“READY”和“CFM”，按“CFM”鍵確認(rèn)校準(zhǔn)值。確認(rèn)第一校準(zhǔn)點(diǎn)后，將pH電極與溫度探棒浸泡在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液內(nèi)4cm（建議用pH4.01、9.18、10.01）；再按“CAL”鍵，儀器將顯示“CAL”和“BUF”符號(hào)及“4.01”數(shù)據(jù)。按“CFM”鍵確認(rèn)校正值。
（4）pH測(cè)量。校準(zhǔn)完畢后，儀器自動(dòng)進(jìn)入溶液約4cm，停幾分鐘讓電極讀數(shù)穩(wěn)定。
2.注意事項(xiàng)
（1）由于pH211酸度計(jì)內(nèi)裝有可充電電池，在剛購買或長時(shí)間放置后，再使用時(shí)，通電校正測(cè)量完畢后，可將電源繼續(xù)還插入電源插座，只需關(guān)閉開關(guān)，這樣可以保證電池充電，是校正值得以儲(chǔ)存，下次測(cè)量時(shí)無須校正即可進(jìn)入精確測(cè)量。
（2）不可用蒸餾水、去離子水和純水浸泡電極。如果讀數(shù)偏差太大（±沒有校正或電極變干。為避免電極受損，在關(guān)機(jī)前要將狀態(tài)時(shí)，在電極浸入電極保存液前，電極要與機(jī)器分開。
（3）如儀器已測(cè)過幾種不同的樣品溶液，請(qǐng)用自來水清洗，樣品清洗電極。
（4）溫度會(huì)影響pH的讀數(shù)，為測(cè)量準(zhǔn)確的補(bǔ)償，用HI7669/2W溫度探棒浸入樣品中，緊靠電極并停幾分鐘，如果被測(cè)溶液的溫度已知或測(cè)量是在相同溫度下進(jìn)行，只需動(dòng)手補(bǔ)償，示溫度讀數(shù)伴有℃信號(hào)閃爍。溫度可通過“
六、PCR儀
PCR儀，也稱DNA熱循環(huán)儀、基因擴(kuò)增儀，它是使一對(duì)寡核苷酸引物結(jié)合到正負(fù)上的靶序列兩側(cè)，從而酶促合成拷貝數(shù)為百萬倍的靶序列三種不同溫度進(jìn)行DNA變性、引物復(fù)性、PCR儀主要應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究等許多領(lǐng)域，如基因分析、序列分析、進(jìn)化分析、臨床診斷、法醫(yī)學(xué)等等。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，因此了解PCR儀的性能，熟練掌握儀器的正確使用方法及使用過程中的注意事項(xiàng)，將是十分必要的。
現(xiàn)介紹PCR 擴(kuò)增儀（Tl Thermocycler）的使用方法和注意事項(xiàng)。
pH測(cè)量狀態(tài)，將電極與溫度探棒浸泡在待測(cè)
pH電極從溶液中拿出。當(dāng)處于關(guān)機(jī) 或在插入樣品溶液前，用待測(cè)pH值，溫度要在適合的范圍內(nèi)進(jìn)行自動(dòng)溫度那么此時(shí)溫度探棒是不用連接，?℃”或“D℃”來調(diào)節(jié)。DNA片段，它的每一循環(huán)包括在DNA聚合酶催化的延伸反應(yīng)的三個(gè)過程。PCR擴(kuò)增技術(shù)也得到普及推廣應(yīng)用，6
1pH），則是由于屏幕上會(huì)顯DNA鏈 1.使用方法
(1）接通電源開關(guān)，儀器進(jìn)入準(zhǔn)備狀態(tài)；在顯示屏上記錄了當(dāng)前儀器的溫度和蓋子（Lid）的溫度。若儀器正在運(yùn)行時(shí)，須按“
B ”鍵（start/stop），才能退出運(yùn)行并返回準(zhǔn)備狀態(tài)。
(2）編寫程序段。在準(zhǔn)備狀態(tài)下按“
C ”鍵(programs)進(jìn)入編程狀態(tài)，選定一程序號(hào)，然后按“enter”鍵，進(jìn)入下一程序；按 “A”(list)鍵后，選一文件號(hào)（empty program）；再按“enter”鍵，進(jìn)入下一程序；按“ABC”鍵，進(jìn)入下一程序，用上下左右鍵號(hào)選擇一個(gè)字母（A、B、C、D、?），然后按“enter”鍵，進(jìn)入下一程序；按“name ok”鍵，完成文件命名。
(3）設(shè)定蓋子的溫度。性溫度是95℃，那么蓋子的溫度就要設(shè)定為程序。
(4）設(shè)定變性溫度、變性時(shí)間、延伸溫度、延伸時(shí)間、退火溫度、退火時(shí)間及循環(huán)總數(shù)等參數(shù)。從第一步依次按“間，全部參數(shù)設(shè)置完后，按“
(5）運(yùn)行程序。檢查設(shè)定是否正確，屏上可觀察到系統(tǒng)運(yùn)行的情況，按“
七、凝膠成像系統(tǒng)
本系統(tǒng)屬全自動(dòng)電腦控制影像分析系統(tǒng)，主要拍攝核酸的acrylamide電泳膠片。在與確定量，是分子生物學(xué)及生化蛋白試驗(yàn)的重要檢測(cè)工具。像頭，變焦鏡，電腦以及專業(yè)凝膠圖象采集及分析斑點(diǎn)測(cè)量、PCR密度的定量分析等。此外，還提供圖像采集、標(biāo)注、打印、數(shù)據(jù)和圖像發(fā)送到Word、Excel、圖像處理等功能。
1.使用方法
(1)打開電腦，啟動(dòng)凝膠分析軟件，進(jìn)入用戶界面。
（2）打開采集凝膠圖像的暗箱裝置電源開關(guān)，放入凝膠，打開紫外光源或白光光源，將采集裝置與電腦上采集卡相連，然后選擇“文件”菜單中的“圖像采集”或工具欄的“圖像采集”按鈕，出現(xiàn)圖像窗口：晰，可以調(diào)節(jié)暗箱上的變焦鏡，使之清晰。可直接將圖像保存起來，也可通過“圖像處理”對(duì)圖像進(jìn)行旋轉(zhuǎn)、裁剪、濾波、調(diào)節(jié)對(duì)比度??方面的處理。
(3)對(duì)讀入的電泳凝膠圖像，可以啟動(dòng)電泳凝膠分析系統(tǒng)。在“功能選擇”菜單中選擇“電泳凝膠”或在工具欄上的“電泳凝膠”工具，將出現(xiàn)泳道分析工具欄，并在“圖像顯示”子窗口中出現(xiàn)一個(gè)紅色的矩形框。還可進(jìn)入“條帶分析”系統(tǒng)，對(duì)條帶 lid temp：
℃”enter”鍵進(jìn)入，用四個(gè)移位鍵移動(dòng)設(shè)定位置。先設(shè)定溫度，后設(shè)定時(shí)pgm ok”鍵，所設(shè)定的程序自動(dòng)被保存。
按“Stop”可停止運(yùn)行。markers比較后，可精確計(jì)算樣本的分子量，對(duì)核酸電泳也可準(zhǔn) “開始采集”105℃。待蓋子預(yù)熱后按“start”鍵，選擇設(shè)定好的程序，開始運(yùn)行。顯示 agarose本系統(tǒng)包括暗箱，.軟件（3.3版）。該軟件提供對(duì)電泳凝膠、、“停止采集”、“采集圖像”等。如果圖像不清 7
10℃，例如變enter”鍵，進(jìn)入下一 紫外透射儀，攝 進(jìn)行編號(hào)，對(duì)“，蓋子的溫度一般比變性溫度要高 電泳膠片，及蛋白質(zhì)的二條以上的條帶進(jìn)行比較。
（4）采集圖像結(jié)束后，關(guān)閉暗箱電源開關(guān)，從暗箱中取出凝膠，并將玻璃板清洗干凈，晾干。
八、空氣恒溫?fù)u床
搖床（振蕩器）為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)設(shè)備。SHK-99-Ⅱ型臺(tái)式空氣恒溫?fù)u床，采用微電腦控制系統(tǒng)，溫度范圍：室溫＋5℃～60℃，精度±0.5℃；時(shí)間范圍：1分鐘～99小時(shí)59分鐘；轉(zhuǎn)速范圍：60RPM～250RPM。
1.使用方法
(1）LED屏幕上各段數(shù)據(jù)：
000
00.0
屏幕上“1”表示第一段，如果是第二段則為“轉(zhuǎn)速，“Time”表示時(shí)間，不設(shè)定時(shí)可自動(dòng)累計(jì)時(shí)間一直運(yùn)行。的值隨時(shí)可以修改，隨時(shí)按新值運(yùn)行。
(2）工作程序設(shè)置。按“F1”鍵，進(jìn)入設(shè)置狀態(tài)。可在速度，溫度，時(shí)間，運(yùn)行等四部分之間切換。在每一部分按“F2”鍵輸入數(shù)據(jù)，輸入完十位數(shù)據(jù)，再輸入個(gè)位數(shù)據(jù)，按“鍵，再按“F2”鍵，到小數(shù)位，再按“
(3）再按“F1”鍵，轉(zhuǎn)回運(yùn)行狀態(tài)，按“
(4）按“End”鍵，結(jié)束系統(tǒng)運(yùn)行。
2.注意事項(xiàng)
（1）打開電源，系統(tǒng)開始自檢，等待完畢，可以進(jìn)行第2步參數(shù)設(shè)置。若屏幕出現(xiàn)：錯(cuò)誤；b.“MOTOR ERROR”，表示電機(jī)部分有錯(cuò)誤。
（2）運(yùn)行過程可以打開箱蓋，這樣電機(jī)不運(yùn)行，時(shí)間也停止，蓋上蓋接著運(yùn)行。
（3）工作完畢，關(guān)閉電源。關(guān)機(jī)后，要等一段時(shí)間再開機(jī)。
九、水的凈化裝置
分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)水的純度要求越來越高，RPM
Temp
Time
00:00 2”，“Temp”表示溫度，“RPM”表示每分鐘“Temp”、“RPM”、F2”鍵，又到十位，以此循環(huán)。Start”鍵，電機(jī)開始運(yùn)行，時(shí)間開始計(jì)時(shí)。LCD屏幕出現(xiàn)“WELCOME”字樣，系統(tǒng)自檢a.“TEMP ERROR”，表示溫度檢測(cè)線路有
一般蒸餾水常常難以滿足實(shí)驗(yàn)要求，大多要求要
Time”F2”
“ 進(jìn)行第二次蒸餾（雙蒸水），它可以去除水中的大部分有機(jī)雜質(zhì)，但制作時(shí)間較長，而且無機(jī)雜質(zhì)還是很多。許多實(shí)驗(yàn)還需要去離子水，這就需要陰陽離子交換樹脂進(jìn)行處理。目前，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都使用高質(zhì)量的超純水。如美國微孔濾膜公司的Milli-Q超純水制造系統(tǒng)所制造的超純水適用于許多學(xué)科領(lǐng)域，如分子克隆、各種色譜分析、氨基酸分析、DNA測(cè)序、酶反應(yīng)、組織和細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)。下面介紹RO-MB壁掛式反滲透高純水機(jī)性能及使用方法。RO-MB反滲透高純水機(jī)（杭州永潔達(dá)）產(chǎn)水量（25℃）10L/H；產(chǎn)水水質(zhì)：RO純水：<10μs/cm，高純水：>15MΩ.cm；可用自來水制成普通實(shí)驗(yàn)用水和高純水，同時(shí)滿足不同水質(zhì)要求。在線電導(dǎo)率儀對(duì)產(chǎn)水水質(zhì)連續(xù)檢測(cè)，可保證產(chǎn)水質(zhì)量。
1.使用方法
(1)準(zhǔn)備：先檢測(cè)與純水機(jī)相連的原水管路、廢水管路連接是否正常，打開原水閥門。供電電源是否正常，檢查按鈕是否在關(guān)閉狀態(tài)（按鈕彈出狀態(tài)）220V電源插座上。
(2）開機(jī)：依次按下電源開關(guān)，泵開關(guān)，純水機(jī)啟動(dòng)產(chǎn)水，同時(shí)廢水排出，指示燈亮起，并處于自動(dòng)運(yùn)行狀態(tài)。
(3）取純水：若打開閥門打開時(shí)，檢測(cè)儀表顯示高純水電導(dǎo)率或電阻值。一杯水后再取新鮮水。
(4）關(guān)機(jī)：不用時(shí)可關(guān)閉個(gè)按鈕停機(jī)，自來水進(jìn)水閥門不必關(guān)閉，這時(shí)機(jī)子內(nèi)部的進(jìn)水電磁閥已自動(dòng)切斷水路。只要管路閥門不漏，也可使機(jī)子保持自動(dòng)待機(jī)狀態(tài)。
2.注意事項(xiàng)
（1）純水機(jī)的正常使用環(huán)境溫度為度不低于5℃。
（2）預(yù)處理濾芯一般三至六個(gè)月更換一次，實(shí)際使用壽命與自來水水質(zhì)、總過濾量等有關(guān)。
（3）混床濾芯產(chǎn)高純水約水中含鹽量、總用水量等有關(guān)。天開機(jī)30分鐘沖洗一次，冬季每隔
（4）使用過程若發(fā)現(xiàn)停機(jī)后泵仍頻繁地每隔數(shù)分鐘有規(guī)則地啟動(dòng)數(shù)秒鐘又停機(jī)，此為管路漏水引起，需及時(shí)打開機(jī)箱加以解決。象，有利于沖洗和保護(hù)反滲透膜元件，十、消毒設(shè)備
細(xì)菌和細(xì)胞培養(yǎng)以及核酸等有關(guān)實(shí)驗(yàn)所用的試劑、RO純水或高純水出口閥門，則可獲得相應(yīng)水質(zhì)的純水。當(dāng)高純水出口 115～3噸，約二至四個(gè)月更換一次，2～3避免遭到微生物繁殖和減少污物沉積。將電源插頭插入帶有接地線的為了獲得高質(zhì)量的高純水，可以先放掉 35℃，產(chǎn)水量會(huì)隨溫度降低而下降，冬季保養(yǎng)溫實(shí)際使用壽命與自來水水質(zhì)、2天。必須注意定期沖洗維護(hù)。夏季宜每 乃屬正常現(xiàn)尤其高溫季節(jié)。器皿及實(shí)驗(yàn)用具，應(yīng)嚴(yán)格滅菌，有的實(shí)驗(yàn)
～設(shè)備停運(yùn)時(shí)間超過天開機(jī)沖洗一次。若每隔半小時(shí)以上啟動(dòng)數(shù)秒鐘又停機(jī)，還要求沒有核酸酶的污染，故應(yīng)將實(shí)驗(yàn)器械，試劑等進(jìn)行高壓消毒。對(duì)于經(jīng)過導(dǎo)入DNA重組分子的菌株，操作后必須進(jìn)行嚴(yán)格的高壓消毒滅活處理。
大批實(shí)驗(yàn)物品、試劑、培養(yǎng)基等可以使用大型消毒器進(jìn)行消毒。一些不能經(jīng)受高壓、高溫消毒的試劑可用濾器濾膜除菌，器皿可用紫外線照射、75%乙醇或0.1%的十二烷基硫酸鈉（SDS）浸泡消毒。所有的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)菌培養(yǎng)的操作，都應(yīng)在紫外線消毒后的超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。
下面介紹立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器（LDZX-40BI）的使用方法。
1.使用方法
（1）開蓋：轉(zhuǎn)動(dòng)手輪，使鍋蓋離開密封圈。
（2）通電：連接自動(dòng)進(jìn)水裝置。接通電源，將控制面板上電源開關(guān)按至低（LOW）紅燈亮，蒸發(fā)鍋內(nèi)屬斷水狀態(tài)；缺水（（3）加水：打開水源，水位達(dá)到低水位，控制面板上低水位紅燈和缺水黃燈相繼滅，加熱（1-綠燈）亮，繼續(xù)加水至高水位（（4）堆放物品：需包扎的滅菌物品，體積不超過包裝之間留有間隙，堆放在金屬框內(nèi)，這樣有利于蒸汽的穿透，提高滅菌效果。
（5）密封高壓鍋：推橫梁入立柱內(nèi)，旋轉(zhuǎn)手輪，使鍋蓋下壓，充分壓緊。
（6）設(shè)定溫度：通電后數(shù)顯窗燈亮，上層為紅色，顯示溫度，下層為綠色，設(shè)定溫度和時(shí)間。先按控制面板上確認(rèn)鍵，綠色數(shù)顯閃爍，進(jìn)入溫度設(shè)定狀態(tài)。按一次移位鍵指相應(yīng)位置閃爍，根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進(jìn)行（單項(xiàng)循環(huán)）移位。按△增加鍵或所需溫度設(shè)定。設(shè)定完畢，按二次確認(rèn)鍵，進(jìn)行溫度確認(rèn)。
（7）設(shè)定時(shí)間：按一次確認(rèn)鍵，將溫度設(shè)定切換成時(shí)間設(shè)定；再按一次移位鍵，所指相應(yīng)位置閃爍，完畢，按二次確認(rèn)鍵，定時(shí)器開始倒計(jì)時(shí)。
（8）滅菌：在加熱初，將下排汽閥打開至垂直位置；下排汽閥待蒸汽冒出時(shí)，壓力表顯示指示為的15%為宜。安全閥設(shè)定數(shù)，超出壓力部分，安全閥將自動(dòng)泄壓，并開始計(jì)數(shù)滅菌所需時(shí)間。滅菌完成，電控裝置將自動(dòng)關(guān)閉加熱系統(tǒng)，伴有蜂鳴提醒；并將保溫時(shí)間切換成控制面板上電源開關(guān)按至
（9）干燥：物品滅菌后需要迅速干燥，須打開放汽閥和下排汽閥，將滅菌器內(nèi)的蒸汽迅速排出，使物品上殘留水蒸汽快速揮發(fā)。根據(jù)所需數(shù)據(jù)位置進(jìn)行移位；進(jìn)行時(shí)間設(shè)定確認(rèn)。℃時(shí)，將下排汽閥推向水平關(guān)閉位置；留有微量蒸汽逸出，以控制總汽流量使用最高滅菌溫度為OFF HIGH）綠燈亮，自動(dòng)停止加水。按增加鍵或減少鍵，時(shí)間采用倒計(jì)時(shí)，124℃～126℃，ON處，若水位LACK）黃燈亮，電源已正常輸入。
200mm×100mm×100mm為宜，各
所??減少鍵，進(jìn)行 進(jìn)行所需時(shí)間設(shè)定。設(shè)定當(dāng)滅菌鍋內(nèi)溫度達(dá)到設(shè)定溫度，0.145Mpa～0.165Mpa范圍內(nèi)屬于END顯示；此時(shí)，將
100壓力在處；關(guān)閉電源，停止加熱待其冷卻。
（10）將蓋開啟，取出已滅菌物品。關(guān)閉水源，打開下排水閥，排盡滅菌室的水與水垢，以備下次使用。
2.注意事項(xiàng)
（1）堆放滅菌物品時(shí)，嚴(yán)禁堵塞安全閥的出汽孔，必須留出空位保證其空氣暢通，否則安全閥因出汽孔堵塞不能工作，造成事故。
（2）滅菌液體時(shí)，應(yīng)將液體灌裝在硬制的耐熱玻璃瓶中，以不超過選用棉花紗塞，切勿使用未打孔的橡膠或軟木塞，放蒸汽，必須待壓力表指針回零位方可排放余汽。
（3）對(duì)不同類型，不同滅菌物要求的物品，切勿放在一起滅菌，以免顧此失彼，造成損失。
實(shí)驗(yàn)二
質(zhì)粒DNA
一、實(shí)驗(yàn)原理
細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的在于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，于染色體外的游離狀態(tài)，制而復(fù)制，并通過細(xì)胞分裂傳遞到后代。
DNA，大小范圍從
在滅菌液體結(jié)束時(shí)不準(zhǔn)立即釋 至200kb3/4體積為好，瓶口隨著染色體的復(fù)特別注意，的提取－堿裂解法1kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處但在一定條件下也會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，一般分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)步驟：①培養(yǎng)細(xì)菌，使質(zhì)粒DNA大量擴(kuò)增；②收集和裂解細(xì)菌；③分離和純化質(zhì)粒DNA。分離制備質(zhì)粒DNA的方法很多，其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法、羥基磷灰石層析法等。在實(shí)際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)以及質(zhì)粒DNA的用途進(jìn)行選擇。本實(shí)驗(yàn)介紹堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。
堿裂解法提取質(zhì)粒DNA是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離質(zhì)粒DNA。在pH值介于12.0-12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH至中性時(shí)，因?yàn)楣矁r(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會(huì)那么迅速而準(zhǔn)確，它們相互纏繞形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而復(fù)性的質(zhì)粒DNA恢復(fù)原來構(gòu)型，保持可溶性狀態(tài)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去，最后用酚氯仿抽提純化上清液中的質(zhì)粒DNA。
二、儀器及試劑
1.儀器及耗材：37℃恒溫?fù)u床、冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、微量移液器、50 ml離心管、1.5 ml離心管管、槍頭、各種規(guī)格的量筒、接種環(huán)、試劑瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。
2.試劑及配制：
LB培養(yǎng)液的配制：
酵母浸提物
5.0 g；
胰蛋白胨
10.0 g；
NaCl
10.0 g；
依次稱量后加入800 ml去離子水后攪拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH（約0.2 ml）調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值至7.0。再加去離子水將溶液定容至總體積為1000 ml，10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。
溶液 Ⅰ（GET緩沖液）： 25 mmol/LTris-HCl（pH8.0）, 10 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 葡萄糖
配制：1000 ml
mol/L Tris-HCl（pH8.0）
ml
0.5 mol/L EDTA（pH8.0）ml
20% Glucose（1.11mol/L）
ml
dH2O
910ml
將以上溶液混合裝瓶，10磅高壓滅菌20 min，冷卻后4℃保存。
溶液II（變性液）：200 mmol/L NaOH，1% SDS
配制： 500 ml
10% SDS
ml
2N NaOH
ml
取以上溶液，用滅菌去離子水定容至500 ml，充分混勻。室溫保存，此溶液保存時(shí)間最好不超過一個(gè)月，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意：SDS易產(chǎn)生氣泡，不要?jiǎng)×覕嚢琛?/p>
溶液 III(醋酸鉀液)：3 mol/L 醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 5.6。5 mol/L 冰醋酸
配制：500 ml
醋酸鉀
g
冰醋酸
57.5 ml
加入300 ml去離子水后攪拌溶解。待醋酸鉀溶解后，再加去離子水將溶液定容至高溫高壓滅菌后，4℃保存。
10×TE緩沖液（pH 8.0）：100 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L EDTA
配制：1000ml mol/LTris-HCl 緩沖液(pH 8.0)
100ml
500 mmol/L EDTA(pH8.0)ml
加入約800 ml的去離子水，均勻混合。溶液定容至1 L。高溫高壓滅菌后，苯酚/氯仿/異戊醇(25 : 24 : 1)：將量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入 13
500 ml。4℃保存。24 ml 氯仿和 1 ml 異戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。
其它試劑：TE（pH8.0）、異丙醇、氯仿/異戊醇（24:1）、無水乙醇、70％乙醇、氨卞青霉素貯存液（50 mg/ml）
三、操作步驟
1.菌體的培養(yǎng)和收獲
(1）將5～10 ml含有氨卞青霉素（后接入一單菌落，并保持通氣良好，于接一次，于37℃ 220 rpm振搖培養(yǎng)(2）吸取培養(yǎng)的菌液1.5 ml，轉(zhuǎn)入棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。
2.質(zhì)粒DNA提取（堿裂解法）
（1）加100 ul 溶液Ⅰ 重懸細(xì)菌沉淀，用槍吹打直至混和均勻。
（2）加200 ul溶液 Ⅱ，蓋緊管口，液變透明，粘稠）。
（3）加150 ul溶液 Ⅲ，輕微振蕩混和
（4）12000 rpm離心6 min，取上清液至另一離心管（棄沉淀）
（5）加等量的酚/氯仿/異戊醇，旋渦混勻離心管。
（6）加1倍異丙醇，振蕩混勻，靜置倒置于吸水紙，將附于管壁的殘余液滴除凈。
（7）加200 ul 70％乙醇洗滌沉淀物，臺(tái)式離心機(jī)在室溫下晾干（或在50℃－60℃的烘箱中也可）
（8）沉淀加20μl TE, 反復(fù)吹打使質(zhì)粒
四、常見問題及可能原因
1.提取的質(zhì)粒DNA不純：變性不充分；關(guān)鍵步驟反應(yīng)時(shí)間過短；離心時(shí)間或速度不夠。
2.提取的質(zhì)粒DNA呈涂布狀：操作過程中用力過猛，動(dòng)作過大；操作系統(tǒng)內(nèi)有污染。
AP）的LB培養(yǎng)基加入到容量為100ml的三角瓶中，然37℃ 220 rpm振搖過夜培養(yǎng)（約16h）后可以再轉(zhuǎn)3～4 h。的離心管中，用臺(tái)式離心機(jī)以12000 rpm
輕緩上下顛倒離心管以混合內(nèi)容物。室溫靜置10 sec，置冰上10 min(溶液出現(xiàn)白色沉淀。1 min，12000 r/min離心6min，取上清液至另一10 min，12000 rpm離心6 min。棄上清液，將離心管 12000 rpm離心2 min，棄上清液，將沉淀。DNA充分溶解，－20℃保存。14 min。5 min（溶)。
1.5 ml離心 3.與染色體DNA分離不全：變性過程不完全；試劑配制有問題（成分，濃度或pH）。
實(shí)驗(yàn)三
瓊脂糖凝膠電泳
一、實(shí)驗(yàn)原理
瓊脂糖凝膠電泳是分離和純化的多孔支持介質(zhì)（瓊脂糖凝膠）的樣品孔中，并置于靜電場(chǎng)上。由于架兩側(cè)帶有含負(fù)電荷的磷酸根殘基，分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)。因而可依據(jù)DNA可以分離相對(duì)分子質(zhì)量相同，而構(gòu)型不同的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。以提供一個(gè)用于確定EB)，其分子可插入下，呈桔紅色熒光，因此也可對(duì)分離的
一般瓊脂糖凝膠電泳適用于大小在膠的制備以及瓊脂糖凝膠電泳在
二、儀器及試劑
1.儀器及耗材：
水平電泳槽、電泳儀、100 ml或250 ml錐形瓶、量筒、吸頭等。
2.試劑及配制：
50×TAE緩沖液的配制：
配制1000 ml
DNA 片段的常用技術(shù)。把DNA樣品加入到一塊包含電解質(zhì)DNA分子的雙螺旋骨因此在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，DNA，也DNA分子。在電泳過程中可以通過示蹤染料或相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參照物相對(duì)可DNA片段大小的標(biāo)準(zhǔn)。在凝膠中加入少量溴化乙錠(ethidium bromide, DNA的堿基之間，形成一種絡(luò)合物，在254～365nm波長紫外光照射DNA進(jìn)行檢測(cè)。0.2kb～50kb范圍內(nèi)的DNA片段。本實(shí)驗(yàn)介紹瓊脂糖凝
DNA片段分離中的應(yīng)用方法。
凝膠成像分析系統(tǒng)、微波爐、微量移液器、透明膠帶、點(diǎn)樣板或parafilm、2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH 8.0）15 分子的大小來使其分離。凝膠電泳不僅可分離不同分子質(zhì)量的Tris
242 g
冰乙酸
57.1 ml
0.5 mol/L EDTA
ml
加入600 ml去離子水后攪拌溶解，將溶液定容至1 L后。高溫高壓滅菌，室溫保存。
1×TAE緩沖液的配制：
稱量20 ml的50×TAE緩沖液，再加入980 ml的去離子水。
溴化乙啶貯存液：10 mg/ml 溴化乙啶
配制：100 ml
稱取1 g溴化乙啶，置于100 ml燒杯中，加入80 ml去離子水后攪拌溶解。將溶液定容至100 ml后，轉(zhuǎn)移到棕色瓶中。室溫保存。
6×上樣緩沖液：0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF，30%甘油。
配制：10 ml
溴酚藍(lán)mg
二甲苯青FF
mg
甘油
ml
用6×TAE緩沖液定溶至10 ml，分裝成1 ml/管。-20℃保存。
其它試劑：DNA樣品、DNA Ladder、瓊脂糖、三、操作步驟
1.制備1％瓊脂糖凝膠(大膠用70ml，小膠用50ml)：稱取0.7 g中，加入70 ml（50ml）1×TAE，瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸搖勻，即成1.0%瓊脂糖凝膠液。
2.膠板制備：取電泳槽內(nèi)的有機(jī)玻璃內(nèi)槽（制膠槽）洗干凈、晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，好梳子。將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取 16
0.5 g）瓊脂糖置于錐形瓶3次至瓊脂糖全部融化，并在固定位置放（下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。添加1×TAE電泳緩沖液至沒過膠板為止。
3.加樣：在點(diǎn)樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1X。用10 ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。
4.電泳：加樣后的凝膠板立即通電進(jìn)行電泳，電壓60－100V，樣品由負(fù)極（黑色）向正極（紅色）方向移動(dòng)。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板下沿約1cm處時(shí)，停止電泳。
(5）電泳完畢后，取出凝膠，用含有0.5 ug/ml的溴化乙錠1×TAE用清水漂洗10 min。
(6)觀察照相：在紫外燈下觀察，DNA存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。
四、常見問題及注意事項(xiàng)
1．配瓊脂糖時(shí)應(yīng)使其完全熔化后方可制膠。
2．瓊脂糖凝膠易于破碎，操作時(shí)要輕緩。
3．電泳時(shí)應(yīng)注意電源線路，預(yù)防觸電。
4．溴化乙淀具有致癌作用，配制及使用時(shí)應(yīng)帶乳膠或一次性塑料手套。并在專門的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用。
5．紫外線對(duì)人體有損傷作用，開燈時(shí)間不宜太長，注意防護(hù)。
6．DNA帶形狀模糊：DNA加樣過多；電壓太高；凝膠中有氣泡。
7．質(zhì)粒DNA的存在形式有3種，①共價(jià)閉環(huán)DNA（cccDNA），常以超螺旋形式存在；②開環(huán)DNA（ocDNA），此種質(zhì)粒DNA的兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除張力，形成松弛的環(huán)狀分子；③線狀DNA，因質(zhì)粒處斷裂而造成。因此質(zhì)粒DNA電泳的結(jié)果中有可能出現(xiàn)三條泳帶，它們的泳動(dòng)速度為：cccDNA > 線狀DNA > ocDNA。min，再DNA的兩條鏈在同一溶液染色約 DNA18
DNA
實(shí)驗(yàn)四
限制性內(nèi)切核酸酶的酶切與鑒定
一、實(shí)驗(yàn)原理
限制性內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈分子中特異核苷酸序列的水解酶，主要存在于原核生物中。根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。其中Ⅱ類酶在分子克隆和基因操作中最為有用，是常用的分子生物學(xué)工具酶。
限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列長度一般為4～8個(gè)呈回文序列的特異核苷酸對(duì)。一般情況下，識(shí)別序列越長，在同一DNA分子中識(shí)別位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率就越小。許多限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)已被確定。例如EcoRl 酶的識(shí)別與切割序列為以下6個(gè)堿基對(duì)。
5′??GAATTC??3′
EcoR I以獨(dú)特的方式識(shí)別并裂解這個(gè)順序，形成兩個(gè) 和
……G
這些末端為互補(bǔ)的，即粘性末端，并可在連接酶的催化下與由相連接。
限制性內(nèi)切酶主要用于基因組基因片段的分離與回收以及單酶切、雙酶切或部分酶切等不同方式。大量的酶切反應(yīng)。小量酶切反應(yīng)主要應(yīng)用于質(zhì)粒的酶切鑒定，DNA，大量酶切反應(yīng)用于制備目的基因片段，體積為
本實(shí)驗(yàn)為EcoR I對(duì)質(zhì)粒性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定酶切效果。
二、儀器與試劑
1.儀器：
水浴鍋、離心管、移液器、吸頭、2.試劑：
質(zhì)粒pUC18、EcoR I限制性內(nèi)切核酸酶、內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液、瓊脂糖、電泳緩沖液、樣緩沖液、溴化乙啶染液、無菌水等。
三、操作步驟
3′??
……CTT AA DNA的片段化、重組DNA分子物理圖譜的構(gòu)建等。根據(jù)酶切目的和要求不同，可有pUC18的小量酶切。在用特定的限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)后，CTT AAG?? 5′
5′突出末端：
AATTC……
EcoR I產(chǎn)生的其它分子末端DNA分子的構(gòu)建與鑒定、載體中目的可分為小量酶切反應(yīng)和體積為20 μ50～100 μl，DNA
在質(zhì)粒的雙鏈環(huán)狀DNA電泳設(shè)備等。
l, 含0.210通常可采用1 μg 30ug。6×上
G……根據(jù)酶切反應(yīng)的體積不同，～用量在～分子上有多個(gè)限制
1．限制性內(nèi)切酶反應(yīng)一般在滅菌的0.2或0.5ml PCR薄壁離心管中進(jìn)行。
2.酶切反應(yīng)體系（10ul）：
酶解緩沖液（10×buffer）ul
限制性內(nèi)切酶
0.5 ul EcoR I(7.5U)
底物DNA（質(zhì)粒）
滅菌ddH2O
限制性內(nèi)切酶最后加入，手彈混勻或用吸頭輕輕上下吹吸，混勻后離心15s。37℃水浴消化
3.酶切完畢，分子量標(biāo)準(zhǔn)物同時(shí)進(jìn)行電泳以確定應(yīng)，或加入適量酶后繼續(xù)反應(yīng)。
5.經(jīng)電泳觀察酶切反應(yīng)完全后，將上述反應(yīng)液置將剩余酶切產(chǎn)物保存于
四、注意事項(xiàng)
1.限制性內(nèi)切酶需保存于
2.限制性內(nèi)切酶溶液通常含有溶液底部，所以要充分搖勻。
3.加樣時(shí)吸頭垂直進(jìn)入試劑管，避免碰到管壁，每加完一樣要換一個(gè)吸頭，同時(shí)在已加的樣品前做個(gè)記號(hào)以防止錯(cuò)加或漏加，避免污染。
4.酶（置于冰盒上）應(yīng)最后加入，盡量減少室溫接觸機(jī)會(huì)。加酶時(shí)吸頭深入不可過深。
5.酶解消化反應(yīng)溫度及時(shí)間根據(jù)該酶使用說明書而定。
6.注意酶的用量，加入的酶量按的10%，以避免酶液中甘油干擾反應(yīng)活性的可能，即在識(shí)別序列以外的位點(diǎn)進(jìn)行切割。此外，反應(yīng)體系中甘油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于12%，以及缺少
五、相關(guān)問題
2h。取5ul酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，?C20℃?zhèn)溆谩?20℃，操作時(shí)應(yīng)將酶保持在冰浴中，避免長時(shí)間置于高溫中。NACL和存在M
x ul（依質(zhì)粒濃度而定）
加至10 ul 鑒定酶切反應(yīng)效果，DNA片段的大小。如果酶切不完全，可繼續(xù)65℃水浴中10～15min，中止酶切反應(yīng)，50%甘油，加入反應(yīng)管后，因密度較大，往往沉淀至
1-3U/ug DNA計(jì)算，酶的體積應(yīng)低于反應(yīng)總體積
。酶量過大（≥25U/ug DNA）時(shí)，有產(chǎn)生所謂星號(hào) 20
6000 r/min，DNA.酶解消化反
必須用 等情況下，都有可能出現(xiàn)星號(hào)活性。
1.酶的保存
不同的限制酶往往保存在大致相似的緩沖液中，這種特定配方的緩沖液能使酶活性維持較長時(shí)間。常用的保存緩沖液各組分作用如下：
Tris-HCl（7.4―7.8）：
維持穩(wěn)定的pH范圍。
50-100mmol/L
NaCl或KCl：提供一定的離子強(qiáng)度。
0.1mmol/L EDTA：
1mmol/L
DTT：
200-500ug/ml BSA：
度，防止蛋白質(zhì)分子濃度過低而導(dǎo)致酶分子變性。
50%的甘油：
1-5 g/L的Triton-100：
白質(zhì)分子的表面變性作用。
2.酶單位的定義
限制酶的單位通常定義為：1U的酶能在約完成酶切1ug的λDNA。確定限制酶單位的具體操作方法是分別向列的酶（1U左右），當(dāng)電泳觀察到酶切片段的條帶不再發(fā)生變化時(shí)說明已作用完全，割的最少酶量定為1U的酶量。
3.限制酶的作用條件
限制酶切割DNA的反應(yīng)中，酶切條件是實(shí)驗(yàn)成功的重要因素，其中包括反應(yīng)的溫度、時(shí)間與反應(yīng)的緩沖體系，除了這些條件外，只有在正確選擇酶反應(yīng)條件時(shí)才能達(dá)到最佳酶切效果。
（1）作用溫度
早期的酶切反應(yīng)都在37℃進(jìn)行，這種方法雖然簡單、統(tǒng)一，但卻不能達(dá)到每個(gè)酶的最適反應(yīng)溫度。為了達(dá)到最佳酶切的效果，最好根據(jù)所選用的酶確定所需要的反應(yīng)溫度。
（2）緩沖體系
限制酶反應(yīng)的緩沖體系大致相同，都含有以下組分：約作用是將酶反應(yīng)體系的pH維持在7.5-8.5；約
絡(luò)合掉能激活限制酶的鎂離子。
保護(hù)酶分子上的還原性基團(tuán)。
牛血清白蛋白提高溶液中蛋白質(zhì)的濃
使酶液保存于-20℃不至凍結(jié)。
這是一種非離子型表面活性劑，能防止蛋50ul合適的反應(yīng)緩沖體系中，在1ug的底物中加入一系DNA的純度與濃度也會(huì)影響酶切效果，100mmol/L10mmol/L的MgCl2，作用是為限制酶提供激
1h內(nèi)完全切Tris-HCl，的活因子；1mmol/L的DTT，作用是保護(hù)還原性基團(tuán)；約150mmol/L的NaCl，作用是提供合適的離子強(qiáng)度。由于認(rèn)識(shí)的局限性，早期的限制酶反應(yīng)體系僅根據(jù)其中NaCl含量的不同分為高鹽、中鹽與低鹽三種，這同樣不能使每種酶獲得最適反應(yīng)條件。現(xiàn)在提供酶的很多廠商能提供4-10種緩沖體系，其中各必需成分之間只有很小的差別，目的是使每種酶都發(fā)揮最大的作用。
緩沖液一般配成10倍的濃度，使用時(shí)以1/10的比例加入，當(dāng)然為了減小吸量誤差也可自行配制5倍的緩沖液。
(3)反應(yīng)體積與時(shí)間
酶反應(yīng)體積一般不宜小于20ul。因?yàn)檫^小的反應(yīng)體積在加入各種成分時(shí)易產(chǎn)生誤差，甘油含量易超過10%。在37℃保溫可因水分蒸發(fā)而明顯改變反應(yīng)體系中各成分的濃度，從而影響酶活力。同時(shí)還要考慮反應(yīng)完畢進(jìn)行電泳時(shí)，所加樣品中DNA的量能夠在電泳中顯出清晰的泳帶。
常規(guī)的酶切反應(yīng)一般控制在60min內(nèi)進(jìn)行，但也可以根據(jù)切割對(duì)象與所用的酶將保溫時(shí)間延長至十幾個(gè)小時(shí)。
(4)DNA的純度與濃度
除了上述酶反應(yīng)條件外，影響酶切效果的最主要因素是DNA的純度。例如，樣品中含有大量RNA雜質(zhì)時(shí)會(huì)因減少了酶的有效濃度而影響酶切效果；某些雜蛋白未除凈而結(jié)合在DNA時(shí)也會(huì)影響酶切效果。至于抽提過程中未除凈的各種影響因素就更多了，可能是微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或是瓊脂糖凝膠中的硫酸根離子等。
DNA純度的另一個(gè)指標(biāo)是不可含有微量的DNA酶。如果酶切后電泳結(jié)果顯示出不清晰條帶或成為一片紅色（術(shù)語稱Smear）時(shí)，可肯定系統(tǒng)中已經(jīng)污染了DNA酶。
DNA樣品中含有大量RNA時(shí)可用RNA酶處理；含有結(jié)合在DNA上的雜蛋白與DNA酶時(shí)都可用氯仿/異戊醇抽提；當(dāng)樣品中含有氯仿、SDS、硫酸根等抑制酶切的小分子物質(zhì)時(shí)可以通過沉淀更換一個(gè)新的緩沖體系。當(dāng)然，酶切失敗時(shí)也不能排除除DNA外的一切因素，如無菌水，EP管，吸咀等的干凈程度以及內(nèi)切酶自身的酶活性情況。
除純度外，DNA的濃度也會(huì)影響酶切效果，一般DNA質(zhì)量濃度在1ug/20ul才能得到較好的酶切效果，質(zhì)量濃度高達(dá)1.5ug/20ul時(shí)就可能發(fā)生酶切困難。
(5)終止酶切反應(yīng)的方法
如果需對(duì)酶切片段進(jìn)行連接或標(biāo)記等操作時(shí)，首先要將限制酶滅活。滅活的方法可分為三種：第一種是向反應(yīng)緩沖體系中加入終濃度為10-12.5mmol/L的EDTA，原理是絡(luò)合掉酶反應(yīng)中所需的鎂離子。但這種方法會(huì)影響需鎂離子的后續(xù)反應(yīng)。所以一般加入EDTA后，要用乙醇沉淀法來更換緩沖體系，以除去EDTA，但這樣就會(huì)造成DNA的損失。第二種方法是熱失活：一般的酶如EcoRⅠ等在65℃保溫60min即可；另一些酶如Hind Ⅲ等需在85℃保溫 22 30min方能達(dá)到目的；極端的例子是Ttb Ⅲ甚至不能用加熱的方法使之失活。熱失活方法的特點(diǎn)是簡單并且未向體系中引入任何物質(zhì)，特別適用于連續(xù)進(jìn)行幾個(gè)酶切反應(yīng)；熱失活法的另一個(gè)特點(diǎn)是不用更換體系，所以不會(huì)造成DNA的損失。第三種方法是用酚和氯仿抽提使之失活，之后以乙醇沉淀DNA片段。這種方法的特點(diǎn)是處理?xiàng)l件劇烈，能使酶徹底失活（不像第一種方法中酶蛋白并未變性而只是沒有激活因子而已）。
實(shí)驗(yàn)五
大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
一、實(shí)驗(yàn)原理
體外連接的重組DNA分子導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中才能大量的進(jìn)行復(fù)制、增殖和表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，用含Ca2+ 的溶液處理大腸桿菌細(xì)胞會(huì)易于吸收外源DNA。大腸桿菌吸收外源DNA的過程被稱為轉(zhuǎn)化。細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)稱為感受態(tài)。用理化方法可以誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)，如電轉(zhuǎn)化法、CaCL2法。
CaCL2法是目前實(shí)驗(yàn)室常用的制備感受態(tài)細(xì)胞的方法，其原理是使細(xì)菌處于0°C、CaCl2低滲溶液中，細(xì)胞膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，外源DNA附著于細(xì)胞膜表面，經(jīng)42°C短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。宿主細(xì)胞一般是限制―修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株，而質(zhì)粒載體攜帶有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。若將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布與于含氨卞青霉素的平板上，則只有那些含有被轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)胞才能生存并生長增殖。從而可以篩選出哪個(gè)克隆含有質(zhì)粒。
本實(shí)驗(yàn)以E.coli JM109菌株為受體細(xì)胞，受體菌使其處于感受態(tài)，然后與pUC18質(zhì)粒共保溫實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的全部受體細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)稀釋，在含有氨卞青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，化的受體細(xì)胞則因無抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA分離提取出來，用于電泳分析、限制性內(nèi)切酶圖譜的制作以及
二、儀器及試劑
1.儀器：
恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴鍋、超凈工作臺(tái)、分光光度計(jì)、高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)。
2.材料
E.coli JM109受體菌、質(zhì)粒pUC18。
3.試劑：
LB培養(yǎng)液（1L）：
胰蛋白胨
10g
酵母粉
5g
NaCl
10g（高鹽）或
氨芐青霉素（Ampicillin）
100mg/ml
用CaCl2處理而未有轉(zhuǎn)DNA測(cè)序等實(shí)驗(yàn)。5g（低鹽）在三角瓶中將胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高壓滅菌。待冷卻至55℃，向溶液中加入1.5ml 100mg/ml 的氨芐青霉素。然后貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
LB平板培養(yǎng)基：
胰蛋白胨
10g
酵母粉
5g
NaCl
10g
瓊脂
13g
在三角瓶中依次將上述配方加入1L的重蒸水中并高壓滅菌。待培養(yǎng)基降溫至養(yǎng)基并輕輕旋轉(zhuǎn)以使溶解的瓊脂均勻分布于整個(gè)培養(yǎng)基溶液中，根據(jù)需要加入氨芐青霉素，然后可直接從三角瓶中倒出培養(yǎng)基鋪制平板。90mm直徑的培養(yǎng)皿約需培養(yǎng)基完全凝結(jié)后，倒置平皿并貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
其它試劑：
0.1M CaCl2溶液、滅菌蒸餾水
三、操作步驟
1.感受態(tài)細(xì)菌的制備：
（1）用接種環(huán)從E.coli JM109菌平板上挑取一單克隆菌落，培養(yǎng)基的試管中中，37℃ 220 rpm振蕩培養(yǎng)過夜（12～16h）。
（2）取0.5 ml過夜菌液接種到裝有50ml LB液體培養(yǎng)基三角瓶中中，振蕩培養(yǎng)2－3h，隔20－30min測(cè)量OD600值，至OD600值為轉(zhuǎn)至1.5ml 離心管中，每管1ml菌液，按需要決定管數(shù)。
（3）4℃，12000 rpm，離心2 min，以回收細(xì)菌。
（4）倒凈上清液，倒置離心管于濾紙上1min，使殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2懸浮細(xì)胞，冰浴30 min。
（5）4℃，12000 rpm，2 min。
（6）倒凈上清液，倒置離心管1min，使殘留液流盡。每管加CaCl2重新懸浮細(xì)胞（重懸時(shí)操作要輕），即成感受態(tài)細(xì)胞懸浮液。
2.細(xì)菌轉(zhuǎn)化：
（1）取3只滅菌的Ep管，分別編號(hào)1、2、3、分別加入以下各組分：加入
5g，30接種于裝有0.3-0.4。無菌條件下將細(xì)菌100 ul冰預(yù)冷的 50℃，取出培50ml培養(yǎng)基。5ml LB液體37℃，220 rpm每管加1ml0.1 mol/L 10～20ng
或 ～ 質(zhì)粒DNA（體積小于10ul），同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照組：
1號(hào)：受體菌對(duì)照組：
100ul感受態(tài)細(xì)胞懸浮液+2ul無菌ddH2O
2號(hào)：質(zhì)粒DNA對(duì)照組：100ul 0.1mol/L CaCl2+2ul pUC19
3號(hào)：正常轉(zhuǎn)化組：100ul感受態(tài)細(xì)胞懸浮液+2ul pUC19
（2）輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴30min，促進(jìn)DNA分子在感受態(tài)細(xì)胞表面的吸附。
（3）轉(zhuǎn)入便于DNA分子的吸附進(jìn)入，提高轉(zhuǎn)化率。
（4）迅速轉(zhuǎn)入冰上冷卻
（5）使受體菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并且表達(dá)
（6）取200ul37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)可將之置于37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，100ul左右，用移液器吹打重懸，再全部涂于含
（7）觀察并記錄轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)的數(shù)目，計(jì)算轉(zhuǎn)化率。
四、注意事項(xiàng)：
1.實(shí)驗(yàn)中所用的器皿均要滅菌，以防止雜菌和外源
2.實(shí)驗(yàn)過程中要注意無菌操作，溶液移取、分裝等均應(yīng)在無菌超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。
3.必須設(shè)對(duì)照組，以檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)過程中是否有污染。
4.整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均需置于冰上。
5.選用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，42℃水浴2min，通過熱刺激增強(qiáng)CaCL2的作用，2min，修復(fù)細(xì)胞膜。600u無抗生素lLB液體培養(yǎng)基，搖勻后于37℃，Ampicillin抗性基因。Ampicillin的LB平板，將平板置于無菌臺(tái)直至液體被吸收，12－16h后觀察結(jié)果，其余保存于4℃。如果平板上沒有長出菌落，同時(shí)將剩下的500ul菌液離心，Ampicillin的LB平板上，置 DNA
OD600不應(yīng)高于0.6。26
使細(xì)胞膜產(chǎn)生通道，220 rpm，振蕩倒掉大部分上清，37℃培養(yǎng)。60min。留 加菌液涂在含 的污染。
實(shí)驗(yàn)六
動(dòng)物組織細(xì)胞基因組
一、實(shí)驗(yàn)原理
真核生物的一切有核細(xì)胞（包括培養(yǎng)細(xì)胞）都能用來制備基因組的DNA是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，質(zhì)、脂類和糖類等分離，又要保持組織細(xì)胞在含仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì)，得到的
蛋白酶K在勻漿后提取EDTA則抑制細(xì)胞中分子完整地分離出來。
二、儀器及試劑
1.恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)（離心管（滅菌）
SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶DNA的反應(yīng)體系中，Dnase
、吸頭（滅菌）DNA提取 因此，制備DNA分子的完整。提取KDNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在下保持很高的活性。SDS可破壞細(xì)胞膜、活性；而蛋白酶K可將 27
DNA的原則是既要將DNADNA核膜，并使組織蛋白與蛋白質(zhì)降解成小肽或氨基酸，GeneQuant）DNA。真核生物DNA與蛋白 DNA分離，使DNA 的一般過程是將分散好的的溶液中消化分解蛋白質(zhì)，再用酚和氯從溶液中析出。的重要特性是能在的 儀器：、移液器、玻璃勻漿器、2.試劑：
（1）細(xì)胞裂解緩沖液：
Tris(pH8.0)
mmol/L
EDTA(pH 8.0)
500 mmol/L
NaCL
mmol/L
SDS
10%
胰RNA酶
20ug/ml
（2）蛋白酶K：
稱取20mg蛋白酶k溶于1ml滅菌的雙蒸水中，?C20℃?zhèn)溆谩?/p>
（3）TE緩沖液（pH 8.0）：高壓滅菌，室溫貯存。
（4）酚?氯仿?異戊醇（25:24:1）、（5）異丙醇、冷無水乙醇、70%乙醇、滅菌水。
三、操作步驟
1.取新鮮或冰凍動(dòng)物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K（500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺(tái)式離心機(jī)以12000 rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。
2.加2倍體積異丙醇，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進(jìn)行PCR反應(yīng)等，需要進(jìn)一步純化的按下列步驟進(jìn)行）
3.加等量的酚?氯仿?異戊醇振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。
4.取上層溶液至另一管，加入等體積的氯仿?異戊醇，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。
5.取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min，離心12000 rpm ,10min。
6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。
7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm，5min。
8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。
9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測(cè)濃度和純度。
四、常見問題
1.選擇的實(shí)驗(yàn)材料要新鮮，處理時(shí)間不易過長。
2.在加入細(xì)胞裂解緩沖液前，細(xì)胞必須均勻分散，以減少
3.提取的DNA不易溶解：不純，含雜質(zhì)較多；加溶解液太少使?jié)舛冗^大。沉淀物太干燥，也將使溶解變得很困難。
4.電泳檢測(cè)時(shí)DNA成涂布狀：操作不慎；污染核酸酶等。
5.分光光度分析DNA應(yīng)加入SDS至終濃度為
6.酚/氯仿/異戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高濃度的的量或減少所取組織的量。
A280/A2600.5%，并重復(fù)步驟 DNA團(tuán)塊形成。1.8；不純，含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。在這種情況下，2～8。DNA，可加大抽提前緩沖液29
的小于
實(shí)驗(yàn)七
DNA的定量
一、實(shí)驗(yàn)原理
核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵，在260 nm的紫外吸收峰，其吸收強(qiáng)度與核酸的濃度成正比，這個(gè)物理特性為測(cè)定核酸溶液濃度提供了基礎(chǔ)。OD260相當(dāng)于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml。可以此來計(jì)算核酸樣品的濃度。
紫外分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可通過測(cè)定260nm和280nm的紫外線吸收值的比值（A260/A280）估計(jì)核酸的純度，純的DNA制品的比值為1.8，RNA的比值為DNA高于1.8,則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質(zhì)污染。
對(duì)于很稀的核酸溶液，可用熒光光度法進(jìn)行測(cè)定。DNA 本身并不產(chǎn)生熒光，但在熒光染料溴化乙錠（EB）插入DNA 的堿基對(duì)平面之間并與之結(jié)合后，DNA樣品能在紫外光的激發(fā)下產(chǎn)生桔紅色熒光。熒光強(qiáng)度與被結(jié)合的EB的量成正比，而被結(jié)合的EB的量又與核酸分子長度和含量成正比，使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，可比較出被測(cè)DNA溶液的濃度。靈敏度可達(dá)1～5ng。由于是基于目測(cè)，所以是估計(jì)水平。簡便，但準(zhǔn)確性較低。
二、儀器及試劑
1.儀器：Amersham
GeneQantTM Pro 紫外可見分光光度儀，瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備。
2.試劑及配制：
5×上樣緩沖液：
配制10 ml
2.0, 波長處有特異若 該方法經(jīng)濟(jì)
0.5 mol/L EDTA(pH8.0)
ml
10% SDS
ul
50% 甘油
2.5 ml
0.2% 溴酚藍(lán)
mg
0.2% 二甲苯青FF
mg
加去離子水至10 ml
其它試劑：0.1×TE、DNA標(biāo)準(zhǔn)液，EB儲(chǔ)存液（10 mg/ml），三、實(shí)驗(yàn)步驟
1.紫外分光光度法
（1）用0.1×TE對(duì)待測(cè)DNA樣品按1:20或合適的倍數(shù)稀釋。
（2）開機(jī)，儀器會(huì)自動(dòng)對(duì)光路及分析軟件進(jìn)行檢測(cè)，待顯示屏上出現(xiàn)“instrument Ready”時(shí)，進(jìn)入核酸測(cè)定窗口
（3）調(diào)零。先用0.1×TE緩沖液注入樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。點(diǎn)擊“set ref”鍵，儀器自動(dòng)校正零點(diǎn)。將樣品槽內(nèi)的樣品杯取出，換上待測(cè)樣品。
（4）吸70 ul已稀釋的DNA樣品轉(zhuǎn)入石英樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。如果樣品很少，可以用5～7ul的石英樣品杯。點(diǎn)擊“enter” 鍵，儀器即進(jìn)入分析狀態(tài)。窗口同時(shí)顯示260和280nm處的光密度（OD值）及260/280nm和280/260nm的比率以及DNA樣品的濃度等。
（5）打開蓋板，取出石英樣品杯，吸出樣液，用高純水清潔石英樣品杯，風(fēng)干后，再加入下一個(gè)待測(cè)樣品。
（6）DNA純度：以O(shè)D260/ OD280比值來反映。當(dāng)OD60 /OD80比值 <1.8時(shí)，說明樣品存在蛋白質(zhì)或酚等雜質(zhì)，可采用平衡酚/氯仿―異戊醇再抽提除去蛋白質(zhì)或用乙醚抽提去除殘留酚，再用無水乙醇沉淀，TE懸浮后再測(cè)定。當(dāng)OD60/OD280比值>2.0，說明樣品存在RNA污染，可以用RNA酶處理樣品去處RNA。
2.EB熒光分析法
（1）瓊脂糖凝膠的制備。
（2）樣品的準(zhǔn)備。把待測(cè)DNA樣品進(jìn)行1:2連續(xù)稀釋，并準(zhǔn)備一份DNA標(biāo)準(zhǔn)液作對(duì)照。
（3）上樣。稀釋樣品與上樣緩沖液按1:5混合均勻后上樣。
（4）電泳。用100V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠的3/4處停止電泳。
（5）取出凝膠，入EB熒光染液中作用20min，取出后清水漂洗干凈，然后紫外檢測(cè)。肉眼可見到的最高稀釋度約含DNA 80ng。此法也可用于了解核酸樣品中的嚴(yán)重污染干擾核酸紫外線吸收物質(zhì)的情況。
四、常見問題
1． 紫外分光光度法不能區(qū)分三種構(gòu)型，也不能區(qū)分染色體染色體DNA、以及偏高。
2．OD320值是背景，若溶液鹽濃度越高，3．的光面以避免干擾測(cè)定。
DNADNA和DNA解鏈的增色效應(yīng)等因素的影響，因此測(cè)得的數(shù)據(jù)往往比實(shí)際濃度 RNA等。由于測(cè)定吸收光度OD320也越高。要小心不要摔破，32
DNA分子的超螺旋、開環(huán)、線狀A(yù)260時(shí)，難以排除 持杯時(shí)也不要接觸透明RNA、分子的構(gòu)型，如質(zhì)粒測(cè)樣品時(shí)使用的石英樣品杯比較貴，實(shí)驗(yàn)八
PCR基因擴(kuò)增
一、實(shí)驗(yàn)原理
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，其原理類似DNA分子的天然復(fù)制過程，是將在待擴(kuò)增的DNA片段和與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡聚核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，生物學(xué)中一種有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。
PCR的工作程序?qū)嶋H上是一個(gè)在模板種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)。擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的結(jié)合。整個(gè)擴(kuò)增過程分三步：①變性，加熱使模板裂而形成兩條單鏈；②退火，突然降低溫度后模板存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度、物與模板之間；③延伸，在DNA聚合酶及鎂離子等的存在條件下，從引物的結(jié)合單核苷酸，形成與模板鏈互補(bǔ)的新的循環(huán)，樣本中的DNA量就增加一倍，新形成的40個(gè)循環(huán)后，DNA 可擴(kuò)增106～109倍。
二、儀器及試劑
1.儀器：PCR儀、臺(tái)式離心機(jī)、移液器及吸頭、2.試劑：
10X PCR 緩沖液配制（部分隨Taq
250～500 mmol/L
100～500 mmol/L
15～20 mmol/L
0.5%
1mg/L
其它試劑：模板DNA、dNTP 混合液、凝膠、等
DNA擴(kuò)增 DNA、一對(duì)已知序列的寡核苷酸引物和四DNA引物按堿基配對(duì)原則互補(bǔ)結(jié)合，也結(jié)構(gòu)簡單等特點(diǎn)，DNA鏈。完成以上三步為一個(gè)循環(huán)，每經(jīng)過一個(gè)DNA鏈又成為下一輪循環(huán)的模板。現(xiàn)用圖示說明PCRPCR薄壁管、電泳儀等： KCl Tris-Cl（pH8.4）
MgCl2
Tween-20
BSA Taq聚合酶、上游和下游寡核苷酸引物、瓊脂糖33
2n 倍。該技術(shù)已成為分子DNA主要的結(jié)合發(fā)生在引: 3 ′端開始，經(jīng)過25～ 雙鏈間的氫鍵斷 原理酶提供）
三、操作步驟
1.PCR 體系（40ul）：
4ul
10XPCR 緩沖液
4ul
25mM MgCl2（根據(jù)不同公司PCR 緩沖液的不同而定）
Xul
模板DNA ≥50ng
1ul
上游引物（50-100ng）
1ul
下游引物（50-100ng）
1ul
dNTP Mixture（終濃度
0.4 ul
Taq聚合酶
加ddH2O至40ul
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2.將上述試劑依次加入PCR薄壁管。加樣后用手輕彈混勻，使反應(yīng)成分集于管底。
3.PCR反應(yīng)熱循環(huán)程序設(shè)置：
（1）95℃
300s
變性
（2）94℃
45s
變性
（3）55℃
45s
退火（根據(jù)不同引物可能有不同退火溫度）
（4）72℃
45s
延伸（每分鐘可延伸
重復(fù)步驟2-4共 30 循環(huán)
（5）72℃
600s
延伸
反應(yīng)結(jié)束后短暫離心，吸取少量（10ul）進(jìn)行分析，其余置
4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
4.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。
20－200uM）1kp）6000 rpm 15 sec
離心
四、注意事項(xiàng)：
1.PCR 體系所加成分的實(shí)際用量應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)者選用的該成分的終濃度及所擁有的貯備液濃度進(jìn)行核算。
2.加樣時(shí)要認(rèn)真,吸頭垂直進(jìn)入試劑管，每加完一樣要換一個(gè)吸頭，同時(shí)在已加的樣品前做個(gè)記號(hào)以防止錯(cuò)加或漏加，避免污染。
3.Taq聚合酶（置于冰盒上）應(yīng)最后加入，盡量減少室溫接觸機(jī)會(huì)。加酶時(shí)吸頭深入不可過深，酶量不能過多。
五、影響PCR的主要因素
1.模板DNA
單鏈、雙鏈DNA白水解酶等的污染。模板用量依具體實(shí)驗(yàn)而定，PCR反應(yīng)時(shí)模板變性要充分。
2.PCR引物
PCR引物設(shè)計(jì)是否成功是能否獲得高質(zhì)量應(yīng)用時(shí)，需注意以下重要環(huán)節(jié)：
（1）PCR引物的長度約為以使它們?cè)谙嘟臏囟认屡c其互補(bǔ)序列結(jié)合。隨機(jī)的，應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個(gè)以上的單一堿基，否則會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。引物免選用T ,尤其應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)
（2）一般來說，PCR引物長度選擇24bp左右為宜。
（3）要避免引物分子自身序列互補(bǔ)，否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)。兩個(gè)互之間的3，末端序列不能有明顯的互補(bǔ)性，以免形成引物二聚體。
（4）引物的熔點(diǎn)溫度（引物的GC/AT應(yīng)與要擴(kuò)增的模板
（5）引物的3，末端必須與模板嚴(yán)格互補(bǔ)，而
（6）目前在引物選擇中已廣泛應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件，從基因序列，并對(duì)設(shè)計(jì)的引物在引物二聚體形成、自身互補(bǔ)性及特異性等方面進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。PCR
18～30個(gè)核苷酸，并且成對(duì)引物間的2個(gè)以上T500bp時(shí)，引物長度選擇 Tm值）要適當(dāng)。DNA相當(dāng)或略高些。一般熔點(diǎn)溫度以大于DNA樣品盡量純凈，不能有核酸酶、蛋一般為100ul反應(yīng)液有105-106個(gè)目標(biāo)分子。PCR產(chǎn)物最關(guān)鍵的因素之一。在設(shè)計(jì)和G＋C含量應(yīng)相似。G+C含量應(yīng)為45%～55%之間。堿基分布是尤其是不應(yīng)在其3，端出現(xiàn)3個(gè)連續(xù)G或C，3，端堿基最好選用A、G、C,盡可能地避16-18bp；PCR產(chǎn)物≥5kb時(shí)，PCR引物相 Tm值與引物的堿基組成和長度有關(guān)；PCR55℃為宜。5，末端的要求可靈活些。EMBL或Genebank中查找有關(guān)
均可作為的模板。產(chǎn)物≤
（7）用于亞克隆的引物，常在引物的5，端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。為了保證內(nèi)切酶有效酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，一般在酶切位點(diǎn)的5，端再加上幾個(gè)額外的堿基。
（8）引物的濃度，在終濃度為0.2～1.0 umol/L的范圍內(nèi)產(chǎn)量基本相同，低于0.2 umol/L時(shí)會(huì)影響產(chǎn)量。但過高時(shí)一乃不經(jīng)濟(jì)，二則會(huì)出現(xiàn)非特異擴(kuò)增及增加引物二聚體的產(chǎn)生。
3.熱穩(wěn)定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）
一般用量為2.5 U/100uL 反應(yīng)體積。酶量過多易導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物的產(chǎn)生。適溫度為75℃，在低溫下仍保留相當(dāng)高的活性，易引起不完全配對(duì)的引物伸及引物二聚體的擴(kuò)增延伸，所以應(yīng)注意防止非特異性產(chǎn)物的出現(xiàn)。
4.dNTPs
PCR常用的dNTP濃度在50-200umol/L。四種
低則反應(yīng)速度下降，過高則特異性下降，可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來確定最適的
5.PCR緩沖液
因PCR反應(yīng)中的dNTP能與Mg2+結(jié)合，影響反應(yīng)液中游離應(yīng)按不同條件，確定合適的Mg2+濃度。一般在標(biāo)準(zhǔn)的Mg2+濃度約為1.5mmol/L。Mg2+離子濃度可顯著影響出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，過低則酶活性顯著下降。應(yīng)用無核酸酶的及5mmol的二硫蘇糖醇（DTT）對(duì)酶有一定的保護(hù)作用。
6.PCR循環(huán)的溫度
預(yù)變性：起始變性的時(shí)間應(yīng)該長些，以使變性充分。一般為不完全時(shí)，DNA雙鏈會(huì)很快復(fù)性，影響PCR反應(yīng)，但若變性溫度太高（不宜超過會(huì)影響Taq酶的活性。
變性：一般為94℃ 30s或95℃ 20s。
引物退火：應(yīng)根據(jù)具體反應(yīng)中引物與模板的堿基配對(duì)情況及實(shí)驗(yàn)的目的確定。一般為50-72℃。退火溫度增高會(huì)增強(qiáng)對(duì)不正確退火引物的識(shí)別，還能降低引物酸的錯(cuò)誤延伸。
延伸：一般為72℃ 60-90s。最后一個(gè)循環(huán)后應(yīng)在物合成的完整性。
7．平臺(tái)效應(yīng)和PCR循環(huán)的次數(shù)
dNTPsPCR反應(yīng)中（PCR的產(chǎn)量及產(chǎn)物特異性。BSA 72℃保留該類酶的最-模板的非特異延
dNTP濃度。Mg2+的濃度，所以dNTP濃度200umol/L），濃度高則Tween-20(0.05%～0.1%)94℃ 3-5min。變性95℃），3，端不正確核苷5min，以保證PCR產(chǎn)應(yīng)等當(dāng)量。濃度、在PCR基因擴(kuò)增的后期，由于產(chǎn)物的堆積，將使原來產(chǎn)物以指數(shù)增加的速度變?yōu)槠教骨€，即所謂平臺(tái)效應(yīng)。它的出現(xiàn)是由于PCR原料的不斷消耗、酶的穩(wěn)定性的降低、終產(chǎn)物的阻滯效應(yīng)及非特異性產(chǎn)物等多種因素造成的，所以選擇合理的循環(huán)次數(shù)，既能得到足夠量的PCR產(chǎn)物，又不要無意義地增加循環(huán)次數(shù)。
8.操作環(huán)境
避免環(huán)境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目標(biāo)DNA的污染等。
實(shí)驗(yàn)九 瓊脂糖凝電泳分離與純化目的一、實(shí)驗(yàn)原理
不同大小的片段分離位于不同的位置，的片段。有許多型號(hào)的低熔點(diǎn)瓊脂糖可在雙鏈DNA的解鏈溫度高于收DNA片段。該法的優(yōu)點(diǎn)是可直接在熔化的凝膠中進(jìn)行各種酶反應(yīng)，如合成同位素探針、進(jìn)行限制酶切割和連接反應(yīng)等。
二、儀器及試劑：
1.儀器
電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、移液器、離心管、吸頭等。
2.試劑：
低熔點(diǎn)瓊脂糖、待純化的
三、操作步驟：
1.配制1％的瓊脂糖凝膠，在適當(dāng)?shù)奈恢们幸粭l與加樣槽平行的槽，換低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠。
2.加樣，100V
DNA DNA酶切片段是基因工程中常用的手段。在電泳過程中切下目的片段并采用低熔點(diǎn)瓊脂糖回收法即可獲得目65℃時(shí)熔化成液體，在65℃，所以可以熔化凝膠而 DNA、凝膠回收試劑盒、去離子水或38
30℃時(shí)凝固成凝膠。由于DNA并不變性，在凝膠成液態(tài)時(shí)回TE（pH7.6）
分離和純化。
電泳，觀察所需片段是否移至低熔點(diǎn)膠內(nèi)。3.在紫外燈下切含有DNA的低熔點(diǎn)膠，置1.5 ml離心管中，于70℃熱水中熔化。
4.按凝膠回收試劑盒說明書操作。
12.取適量純化好的目的DNA在 GeneQuant 中檢測(cè)，確定純度和濃度，其余樣品于-20℃保存。
四、注意事項(xiàng)：
1.配凝膠的三角瓶、電泳槽和配膠板要先沖洗干凈
實(shí)驗(yàn)十
DNA重組
一、實(shí)驗(yàn)原理
外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這種重新組合的DNA在體外的連接重組是基因工程操作的核心技術(shù)之一，其本質(zhì)是一個(gè)酶促反應(yīng)過程。即在一定的條件下，DNA連接酶催化兩個(gè)雙鏈DNA用，形成磷酸二酯鍵的過程。常用的DNA連接酶有兩種：菌DNA連接酶。其中T4噬菌體DNA連接酶對(duì)底物的要求低，能更有效地連接末端，應(yīng)用更廣泛。
T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分連接酶通過ATP的磷酸與連接酶的賴氨酸的氨基形成酶―隨后從賴氨酸殘基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的51端的磷酸基團(tuán)上，形成磷酸―磷酸鍵。③鏈31端的羥基被活化，取代ATP后與DNA51端的磷酸根形成磷酸二酯鍵，完成DNA之間的連接。T4噬菌體DNA連接酶需要鎂離子和溫度和pH條件下進(jìn)行連接反應(yīng)。
二、儀器及試劑：
1.儀器：
臺(tái)式離心機(jī)、移液器、吸頭、恒溫水浴鍋等。
2.試劑：
T4 DNA連接酶、10×T4 DNA連接酶緩沖液、載體
三、操作步驟
1.外源DNA片段和載體DNA的連接
DNA51端磷酸和31端羥基之間相互作T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿3步：①首先，ATP與T4ATP復(fù)合物。②被激活的并釋放出ATP作為輔助因子，DNA、外源DNA。DNA的平DNAAMPDNAAMP，在一定的 叫做重組子。片段的噬菌體
取1只無菌Ep管、用微量進(jìn)樣器按下列順序加入各成分。
10×T4 DNA Ligase Buffer
2.5 ul
酶切后的DNA片段
*1
約0.3 pmol
酶切后的載體DNA *2
約0.03pmol
T4 DNA Ligase
ddH2O
*1 DNA片段的摩爾數(shù)應(yīng)控制在載體
*2 相同末端的載體與DNA自身環(huán)化。
2.蓋好蓋子，用手指輕彈Ep
3.將反應(yīng)管放入16℃過夜反應(yīng)（4.取出約25ng的DNA連接液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，片段和酶切DNA片段作電泳。
5.用0.1×TE將連接混合物稀釋至
四、注意事項(xiàng)
1.連接產(chǎn)物經(jīng)鑒定后應(yīng)迅速做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
2.根據(jù)具體情況調(diào)節(jié)酶的用量。平端連接或接頭連接都比黏端連接慢得多，而且酶的用量也增大。
3.單價(jià)陽離子或低濃度的聚乙二醇可提高平端連接的效率。
4.防止載體DNA自身環(huán)化，常用堿性磷酸酶處理線性載體，去掉載體的DNA片段的自身環(huán)化。
5.正確調(diào)整載體DNA和外源
五、相關(guān)問題
1.連接反應(yīng)的影響因素
1ul
加至 25ul DNA摩爾數(shù)的3－12～16h）。鑒定連接結(jié)果，50ul，使用10～20ul DNA之間的比例有助于獲得高產(chǎn)量的重組產(chǎn)物。40
10倍。2s 以集中溶液。以未經(jīng)連接的質(zhì)粒 51?CDNA
片段進(jìn)行連接時(shí)，應(yīng)首先將載體進(jìn)行去磷酸化處理，以防止其管數(shù)次，并于臺(tái)式離心機(jī)離心轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。磷酸以抑制
除了載體、供體的濃度及其比例等因素外，影響連接反應(yīng)的因素還有很多，如緩沖液組分、連接溫度與時(shí)間、酶濃度、DNA濃度及片段末端的堿基序列等。
（1）連接緩沖液的影響
不同的公司提供的連接緩沖液可能有所不同，但大體上都含有以下組分：20-100mmol/L的Tris-HCl，較多用50mmol/L，pH的范圍在7.4-7.8，較多用7.8，目的是提供合適酸堿度的連接體系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反應(yīng)；1-20mmol/L的DTT，較多用10mmol/L，作用是維持還原性環(huán)境，穩(wěn)定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白質(zhì)的濃度，防止因蛋白濃度過稀而造成酶的失活。與限制酶緩沖液不同的是連接酶緩沖液還含有0.5-4mmol/L的ATP，現(xiàn)多用1mmol/L，是酶反應(yīng)所必需的。
（2）pH的影響
一般將緩沖液的pH調(diào)節(jié)到7.4-7.8，較多用7.8。有實(shí)驗(yàn)表明，若把pH為7.5-8.0時(shí)的酶活力定為100%，那么體系偏堿（pH為8.3）時(shí)僅為全部活力的65%；當(dāng)體系偏酸（PH為6.9）時(shí)僅為全部活力的40%。
（3）ATP濃度的影響
連接緩沖液中ATP的濃度在0.5-4mmol/L之間，較多用1mmol/L。研究發(fā)現(xiàn)，ATP的最適濃度為0.5-1mmol/L，過濃會(huì)抑制反應(yīng)。例如，5mmol/L的ATP會(huì)完全抑制平末端連接，黏端的連接也有10%被抑制；還有報(bào)道，當(dāng)ATP的濃度為0.1mmol/L時(shí)，去磷酸載體的自環(huán)比例最大。由于ATP極易分解，所以當(dāng)連接反應(yīng)失敗時(shí)，除了DNA與酶的問題外，還應(yīng)考慮ATP的因素。含有ATP的緩沖液應(yīng)于-20℃保存，溶化取用后立即放回。連接緩沖液體積較大時(shí)最好分小管貯存，防止反復(fù)凍融引起ATP分解。與限制酶緩沖液不同的是，含ATP的連接緩沖液長期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的緩沖液（可長期保存），臨用時(shí)加入新配制的ATP母液。
（4）連接溫度與時(shí)間的影響
因?yàn)轲ば阅┒说腄NA雙鏈間有氫鍵的作用，所以溫度過高會(huì)使氫鍵不穩(wěn)定，但連接酶的最適溫度又恰為37℃。為了解決這一矛盾，在經(jīng)過綜合考慮后，傳統(tǒng)上將連接溫度定為16℃，時(shí)間為4-16h。現(xiàn)經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于一般的黏性末端來說，20℃ 30min就足以取得相當(dāng)好的連接效果，當(dāng)然如果時(shí)間充裕的話，20℃ 60min能使連接反應(yīng)進(jìn)行得更完全一些。對(duì)于平末端是不用考慮氫鍵問題的，可使用較高的溫度，使酶活力得到更好的發(fā)揮。
（5）酶濃度的影響
根據(jù)New England Biolabs公司對(duì)T4 DNA連接酶的定義，1U的酶可在16℃ 30min內(nèi)連接20ul體系中Hind Ⅲ酶切片段（黏性末端為0.12umol/L 5,末端，此時(shí)DNA質(zhì)量濃度約為300ng/ul）的50%。日常使用的DNA濃度比酶單位定義狀態(tài)低10-20倍，連接平末端時(shí)酶用量要比連接黏端大10-100倍，廠商為了滿足這一要求，又往往提供高濃度的酶（幾百個(gè) 41 單位/ul），所以進(jìn)行黏末端連接時(shí)需先行稀釋。除了立即用于反應(yīng)的部分可用酶反應(yīng)緩沖液稀釋外，其余都應(yīng)使用廠商提供的稀釋液。稀釋液的成分與酶保存緩沖液相同或類似，稀釋液中的酶能在長時(shí)間保持活力，也便于隨時(shí)取用。
（6）DNA濃度的影響
盡管有的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)上推薦使用0.1-1nmol/L的DNA濃度，但考慮到用質(zhì)粒作為載體克隆時(shí)，最后要求得到環(huán)化的有效連接產(chǎn)物，所以DNA濃度不可過高，一般不會(huì)超過20nmol/L。相比較而言，以噬菌體、cosmid質(zhì)粒為載體的克隆過程最后要求線性化的連接產(chǎn)物，所以，DNA的濃度可以高些，至少是接近推薦的濃度。此外，在用大質(zhì)粒載體進(jìn)行大片段克隆時(shí)，以及在雙酶切片段的連接反應(yīng)中，DNA濃度還應(yīng)降低，甚至是DNA的總濃度低至幾個(gè)nmol/L。另據(jù)研究，T4 DNA連接酶對(duì)DNA末端的表觀Km值為1.5nmol/L，所以，連接時(shí)DNA濃度不應(yīng)低于1nmol/L。即應(yīng)具有2nmol/L的末端濃度。
2.三種連接酶單位定義
（1）Weiss單位
連接酶單位最早是1968年由Weiss提出的Weiss單位，現(xiàn)也稱PPi單位。他的單位定義為：37℃ 20min內(nèi)將1nmol的32P從焦磷酸根上置換到ATP分子上所需的酶量。現(xiàn)在大多數(shù)廠商仍使用這種單位。
（2）d（A-T）環(huán)化單位
由于Weiss單位定義中測(cè)試的是T4 DNA連接酶中除連接功能外的另一種磷交換功能，并且測(cè)試溫度高達(dá)30℃，與實(shí)際連接反應(yīng)相比無論在哪一方面都有一定的差距，于是，1970年Modrich與Lehman提出了真正度量連接功能的d(A-T)環(huán)化單位，又稱外切酶抗性檢測(cè)。d（A-T）環(huán)化單位的定義為：30℃ 30min 內(nèi)將100nmol/L的d（A-T）（約2kb長）轉(zhuǎn)化成抗外切酶的形式。
（3）黏性末端單位
與Weiss單位相比，d（A-T）環(huán)化單位更接近實(shí)際，但仍有一定的問題，例如，環(huán)化單位測(cè)試中用的是純AT片段，與實(shí)際連接中4種堿基隨機(jī)排列不符；再說，如果連接酶將片段連接成多聚體而末環(huán)化時(shí)，仍可能被外切酶組所切；除此之外，與實(shí)際上大多數(shù)連接反應(yīng)使用的溫度16℃相比，30℃仍顯得偏高。為了衡量實(shí)際連接條件下的酶活力，New England Biolabs公司提出了最實(shí)用的黏性末端單位，它的單位定義為：16℃ 30min內(nèi)將5,末端濃度為0.12umol/Lλ-HindⅢ 酶切片段的50%連接上。
實(shí)驗(yàn)十一 動(dòng)物組織細(xì)胞總RNA的提取
一、實(shí)驗(yàn)原理
RNA是基因表達(dá)的中間產(chǎn)物，存在于細(xì)胞質(zhì)與核中。對(duì)中占有重要地位。獲得高純度和完整的RNA 是很多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)所必需的，如雜交、cDNA合成及體外翻譯等實(shí)驗(yàn)的成敗，在很大程度上取決于內(nèi)的大部分RNA是以核蛋白復(fù)合體的形式存在，所以在提取質(zhì)變性劑，迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與RNA分離，釋放出機(jī)溶劑處理、離心，使RNA與其他細(xì)胞組分分離，得到純化的總抑制內(nèi)源和外源的RNase活性，保護(hù)RNA分子不被降解。中進(jìn)行。可使用RNase抑制劑，如DEPC是RNase的強(qiáng)抑制劑，常用來抑制外源性。提取緩沖液中一般含SDS、酚、氯仿、胍鹽等蛋白質(zhì)變性劑，也能抑制并有助于除去非核酸成分。
本實(shí)驗(yàn)介紹異硫氰酸胍法和TRIzol法提取動(dòng)物組織總
二、儀器和試劑
1.儀器：
超凈工作臺(tái)、高速冷凍離心機(jī)、電泳儀、紫外分光光度計(jì)、吸頭、Ep管、玻璃勻漿器、試管、玻璃器皿洗凈后置180℃烘烤8h；不耐高溫的器皿（如塑料制品）應(yīng)用2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高壓20min，再70～80
2.試劑：
(1)細(xì)胞裂解液：
異硫氰酸胍
4mol/L
檸檬酸鈉（pH7.0）
25mmol/L
十二烷基肌氨酸鈉
0.5%
RNA進(jìn)行操作在分子生物學(xué)NorthernRNA的質(zhì)量。由于細(xì)胞RNA時(shí)要利用高濃度的蛋白R(shí)NA。再通過酚、氯仿等有RNA。在提取的過程中要RNase的環(huán)境RNase活RNase活性。RNA并通過電泳 進(jìn)行鑒定。振蕩器、移液器、0.1% DEPC浸泡 因此提取必須在無凝膠成像系統(tǒng)、℃烘烤干燥方可使用。
β-巰基乙醇
0.1mol/L
稱取檸檬酸鈉0.64g，十二烷基肌氨酸鈉0.415g，吸取β-巰基乙醇0.7ml，用無Rnase的蒸餾水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，異硫氰酸胍 25g,混合，完全溶解后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
(2)10×凝膠緩沖液：
嗎啉代丙璜酸（MOPS）（pH7.0）
200mmol/L
NaAc
EDTA(pH 8.0)
過濾除菌后避光保存。
（3）5×變性上樣緩沖液：
水飽和的溴酚藍(lán)
500mmol/LEDTA(pH 8.0)
甲醛（37%）
甘油
甲酰胺
10×凝膠緩沖液
加無RNase水至10ml，4℃可保存
（4）TRIzol RNA抽提試劑
（5）2mol醋酸鈉
（6）0.1% DEPC
(7)平衡酚：氯仿：異戊醇（（8）平衡酚、氯仿
（9）無水乙醇、70%乙醇、異丙醇
100mmol/L
10mmol/L
16μl
80μl
720μl
2ml
3084μl
4ml 3個(gè)月。25：24：1）
(10)無RNase水
三、操作步驟
（一）異硫氰酸胍法（PLT）
1.取新鮮動(dòng)物組織0.1～0.2g置于組織勻漿器中，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液1ml,在冰浴中迅速勻漿15～30s，以充分研碎組織。然后將細(xì)胞懸浮液吸入另一試管中。
2.加入2mol醋酸鈉（pH4.0）120μl，充分混勻。
3.加入1.2ml酚：氯仿：異戊醇，充分混勻搖振10s，冰浴15min。
4.將混合物轉(zhuǎn)移至1.5ml Ep管中，4℃，離心10 000r/min,20min.5.移取上層水相至另一Ep管中，加入等體積的異丙醇，靜置?C20℃，30min沉淀RNA.6.4℃，離心12 000r/min，15min.7.棄上清液，加入70%乙醇400μl,洗滌RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被懸浮，則4℃離心10 000r/min，10min。
8.棄上清液，自然干燥，但應(yīng)避免沉淀完全干燥，否則RNA難以溶解。
9.加入100μl無RNase水重懸RNA，或加1ml無水乙醇和1/10體積3mol醋酸鈉（pH4.0），?C70℃保存。
（二）TRIzol試劑提取RNA
1.取新鮮動(dòng)物組織0.1～0.2g置于組織勻漿器中，加入預(yù)冷的Trizol液 1ml 于玻璃勻漿器中，在冰浴中迅速勻漿15～30s，以充分研碎組織。然后將細(xì)胞懸浮液吸入另一1.5ml Ep管中，于室溫下靜置5min。
2.加入200μl氯仿，劇烈振搖15s混勻后，室溫靜置3min。
3.4℃，10 000r/min離心15min，RNA分布于水相中。
4.將上層無色水相轉(zhuǎn)移到另一Ep管中，加入500μl 異丙醇，室溫靜置10min。
5.4℃，10 000r/min離心10min。
6.棄上清液，用1ml 75%乙醇洗滌RNA沉淀物，4℃，7500r/min離心5min。
7.棄上清液，室溫干燥15min.45
8.向干燥過的沉淀物中加入200μl DEPC處理水（無核水）溶解沉淀物，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
（三）RNA檢測(cè)
1.在紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)RNA濃度及純度。
方法同實(shí)驗(yàn)四，用DEPC處理水校正零點(diǎn)；用DEPC處理水稀釋RNA樣品；讀取OD260、OD280值及OD260/OD280的比值。
2.瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳檢測(cè)
（1）制備凝膠（1.2%）。稱1.2g瓊脂糖，加72ml DEPC處理水，加熱熔化。冷卻至60℃，在通風(fēng)櫥內(nèi)加入10×凝膠緩沖液10ml，甲醛（37%）18ml，混勻后，倒膠。
（2）制備樣品。在離心管中，將RNA樣品與5×變性上樣緩沖液以4：1溫育5～10min，迅速在冰上冷卻5min，離心數(shù)秒。
（3）上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品卷入上樣孔。以5V/cm的電壓電泳2h.。
（4）待溴酚藍(lán)遷移至凝膠長度的2/3～4/5處結(jié)束電泳。將凝膠置于溴化乙啶溶液μg/ml，用0.1mol/L乙酸胺配制）中染色約30min。
（5）在凝膠成像系統(tǒng)觀察并分析。
四、注意事項(xiàng)
1.RNA是極易降解的核酸分子。因此提取總RNA必須在無RNase 環(huán)境中，戴口罩、手套、使用無RNase污染的試劑、材料、容器。
2.所有溶液應(yīng)加DEPC至0.05%～0.1%，室溫處理過夜，然后高壓處理或加熱至小時(shí)或60℃過夜，以除去石油殘留的DEPC。
3.所用的化學(xué)試劑應(yīng)為新包裝，稱量時(shí)使用干烤處理的稱量勺，所有操作均應(yīng)在冰浴中進(jìn)行，低溫條件可減低RNA酶活性。
4.根據(jù)RNA樣品的紫外吸收OD值，可計(jì)算出RNAd 濃度。
單鏈RNA [ssRNA]=40×（OD260-OD310）×稀釋倍數(shù)
純RNA OD260 / OD280比值通常在1.7～2.0。若比值低于1.7,說明有蛋白質(zhì)等污染，/氯仿在抽提。若比值低于2.0,表明有鹽、胍、糖可用LiCL選擇沉淀RNA以除去雜質(zhì)。
65℃1.5～（0.570℃ 1 應(yīng)用酚 混勻。
5.RNA樣品電泳后，可見28S、18S及5S小分子RNA條帶，則說明完整性好。若有降解可能是操作不當(dāng)或污染了RNase.。28S和18S RNA比值約為2：1,表明RNA無降解。如比值逆轉(zhuǎn)，則表明RNA降解。電泳中如果在28S 后方還有條帶，表明有DNA污染，應(yīng)用DNase處理后再進(jìn)行純化。
主要參考書：
1..金冬雁等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.第二版.北京：科學(xué)出版社，1995
2.子穎等譯.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南
3.周俊宜編.分子生物學(xué)基本技能和策略
4.姜泊等編.分子生物學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法
5.劉進(jìn)元等編.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)
.科學(xué)出版，.科學(xué)出版社.北京：人民軍醫(yī)出版社，.北京：清華大學(xué)出版社，47
1996.2002.
第三篇：現(xiàn)代分子生物學(xué)總結(jié)
醫(yī)學(xué)細(xì)胞與分子生物學(xué)習(xí)題庫
一、名詞解釋
1．基因組
2．基因文庫
3．衛(wèi)星DNA
4．SD序列
5．分子克隆
6．載體
7．反式作用因子
8．粘性末端
9．限制性內(nèi)切酶
10．cDNA文庫
11．轉(zhuǎn)化率
12．質(zhì)粒拷貝數(shù)
13．體外重組
14．感受態(tài)細(xì)胞
15．探針
16．核酸雜交
17．陽性克隆
18．固相雜交
19．解鏈溫度
20．C值悖理
21．基因家簇
22．反義RNA
23．RNA干擾
24．魔斑
25．順式作用元件
二．填空題
1.真核生物基因組DNA序列可分為（）、（）和（）。
2.真核生物基因組高度重復(fù)序列包括（）、（）、（）和（）四種。
5.原核生物轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的方式有（）和（）兩種方式；前者又可分為（）和（）；后者可分為（）和（）。
6.真核生物基因表達(dá)調(diào)控包括（）、（）、（）、（）和（）五個(gè)層次。
7.真核生物基因組DNA水平的調(diào)控包括（）、（）、（）、（）和（）五種方式。
8.反式作用因子可劃分為（）、（）和（）三類。
12.影響雜交的因素有（）、（）、（）、（）和（）。
15.逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，具有（）、（）、（）三種功能，但無（）作用。
16.DN的損傷突變類型有（）、（）、（）、（）和（）。
17.引起DNA損傷突變的因素是（）、（）、（）、（）和（）。
18.DNA的損傷修復(fù)方式有（）、（）、（）和（）。
20.病毒基因組可由（）或（）組成；細(xì)菌基因組由一條（）組成；真核生物基因組由（）和（）形成（）。
21.原核生物基因表達(dá)調(diào)控的方式有（）和（）；其中（）是主要的方式。
22.、操縱子由（）、（）和（）組成；受（）產(chǎn)物的調(diào)控。
23．順式作用元件按功能可劃分為（）、（）、（）和（）。
24．分子克隆技術(shù)的操作包括（）、（）、（）和（）等四個(gè)基本過程。
25．限制性內(nèi)切酶分為（）、（）、（）三種，其中只
有（）在基因工程操作中被應(yīng)用。
26.限制性內(nèi)切酶識(shí)別（）序列； DNA分子在該酶切割下可產(chǎn)生（）、（）或（）末端。
27．分子克隆中常用的工具酶有（）、（）、（）和（）。
28．分子克隆中常用的載體有（）、（）、（）和（）。
29．目的基因制備的常用方法有（）、（）、（）。
30．體外重組常用方法有（）、（）、（）和（）。
31．重組體導(dǎo)入原核生物細(xì)胞中的常用方法有（）和（）；重組體導(dǎo)入真核生物細(xì)胞中的常用方法有（）、（）和（）。
32．重組體的篩選方法有（）、（）、（）、（）。
33．cDNA文庫的構(gòu)建步驟是（）、（）（）、（）。
34．常用的核酸探針包括（）、（）和（）。
35．放射性同位素標(biāo)記常用的標(biāo)記方法有（）、（）、（）。
36．分子克隆中常用的非放射性同位素標(biāo)記物有（）、（）、（）等；常用的標(biāo)記方法有（）、（）。
37．核酸雜交技術(shù)可分為（）和（）兩種類型；后者又可分為（）和（）。
39．PCR技術(shù)的基本過程是（）、（）、（）。
40．影響PCR的因素有（）、（）、（）、（）、（）。
41．PCR反應(yīng)的特點(diǎn)是（）、（）、（）、（）。
45．限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點(diǎn)是（）、（）、（）、（）。
50．DNA切除修復(fù)需要的酶有（）、（）和（）。
三、判斷題
1、生物越高度，基因組越龐大，基因數(shù)目就越多。（）
2、真核生物結(jié)構(gòu)基因都是單拷貝，rRNA基因?yàn)槎嗫截悺＃ǎ?/p>
3、同基因是一類結(jié)構(gòu)上完全相同，表達(dá)產(chǎn)物功能也相同的一組基因。（）
4、真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。（）
5、原核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為多順反子。（）
6、真核生物基因組中不編碼的區(qū)域多于編碼的區(qū)域。（）
7、衛(wèi)星DNA實(shí)際上是出現(xiàn)在非編碼區(qū)的串聯(lián)重復(fù)序列。
8、串聯(lián)重復(fù)序列是形成衛(wèi)星DNA 的基礎(chǔ)。
9、所有真核生物基因組中都有α衛(wèi)星DNA。
10、高度重復(fù)序列在真核生物細(xì)胞基因組中重復(fù)出現(xiàn)可達(dá)106次以上。
11、中度重復(fù)序列的長度和拷貝數(shù)很不均一。
12、短分散片段重復(fù)順序的平均長度約為3500-5000bp。
13、長分散片段重復(fù)順序的平均長度約為300bp。
14、中度重復(fù)序列大多不編碼蛋白質(zhì)。
15、高度重復(fù)序列中有一些可編碼蛋白質(zhì)。
16、中度重復(fù)順序一般具有種特異性。
17、每種組蛋白的基因在同一種生物中拷貝數(shù)是相同的。
18、不同生物中組蛋白基因在基因組中的排列不一樣。
19、端粒是所有生物染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)。
20、以RNA為模版合成出的DNA鏈叫負(fù)股鏈。
21、顛換是指原為嘧啶突變后變?yōu)猷堰省?/p>
22、置換是指原為嘧啶突變后變?yōu)猷堰省?/p>
23、重組修復(fù)也叫復(fù)制后的修復(fù)。
24、原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中許多mRNA都是多順反子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
25、限制性內(nèi)切酶切割的DNA片段都具有粘性末端。
26、原核生物中mRNA一般不需要轉(zhuǎn)錄后加工。
27、增強(qiáng)子并沒有啟動(dòng)子活性，卻具有增強(qiáng)啟動(dòng)子活性，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始的效能。
28、在雙向復(fù)制中一條鏈按5′→3′的方向合成，另一條鏈按3′→5′的方向合成。
29、原核細(xì)胞和真核細(xì)胞復(fù)制在多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)起始進(jìn)行。
30、真核細(xì)胞的基因是不連續(xù)的，轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA都必須經(jīng)過加工。（31、生物DNA分子的大小等于基因的總和。（）
32、所有多肽鏈經(jīng)核糖體翻譯出來即有正常生理功能。
33、核糖體是蛋白質(zhì)和rRNA構(gòu)成的功能復(fù)合體。
34、機(jī)體的各種細(xì)胞中含有相同的遺傳信息，所以有相同的表達(dá)，35、在負(fù)控誘導(dǎo)系統(tǒng)中，阻遏蛋白不與效應(yīng)物結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。
36、在負(fù)控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白不與效應(yīng)物結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。
37、CAP結(jié)合在啟動(dòng)子上時(shí)，能促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。）
38、CAP首先與cAMP形成復(fù)合物才能與啟動(dòng)子結(jié)合。
39、RBS是指mRNA起始密碼AUG前的一段非翻譯區(qū)。
40、反義RNA由反義基因轉(zhuǎn)錄而來。
41、轉(zhuǎn)錄后基因沉默被稱為RNAi。
42、細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成旺盛時(shí)，mRNA鏈上核糖體數(shù)量就多，poly（A）也較長。
43、限制性核酸內(nèi)切酶是原核生物所特有的酶。
44、只有Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶在分子生物學(xué)中被應(yīng)用。
45、COS區(qū)是指λ噬菌體粘性末端構(gòu)成的區(qū)域。
53、基因擴(kuò)增是指某些基因的拷貝數(shù)大量增加的現(xiàn)象。
54、基因重排是DNA水平調(diào)控的重要方式之一
55、所有核酸的合成都是以堿基配對(duì)為基礎(chǔ)的。
56、甲基化程度與基因的表達(dá)一般呈反比關(guān)系。
57、基因的甲基化程度愈高，其表達(dá)則降低。
58、去除組蛋白基因轉(zhuǎn)錄活性降低。
59、常染色質(zhì):結(jié)構(gòu)松散，基因不表達(dá)。
60、異染色質(zhì):結(jié)構(gòu)緊密，基因表達(dá)。
61、有基因表達(dá)活性的染色質(zhì)DNA對(duì)DNaseⅠ更敏感。
62、真核生物基因調(diào)控主要也是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的。
四、選擇題：
1.原核生物基因組中的復(fù)制起始點(diǎn)有（）
A．1個(gè)B．2個(gè)C．多個(gè)D．1000個(gè)以上
2．真核生物基因組中的復(fù)制起始點(diǎn)有（）
A．1個(gè)B．2個(gè)C．多個(gè)D．1000個(gè)以上
3.真核生物基因之間的間隔區(qū)與基因組大小（）
A．有關(guān)B．無關(guān)C．成正比E．成反比
４.衛(wèi)星DNA的長度一般為()
A．5-10bpB．300bpC．100bpD．500-1000bp
５.在大腸桿菌細(xì)胞中DNA復(fù)制的保真性主要是下列哪個(gè)酶的作用（A．DNA聚合酶ⅠB．DNA聚合酶Ⅱ
C．DNA聚合酶ⅢD．DNA連接酶
６.既有內(nèi)切酶活力，又有連接酶活力的是
A．拓?fù)洚悩?gòu)酶B．DNA聚合酶Ⅱ
C．解螺旋酶D．DNA連接酶）
7.轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息的轉(zhuǎn)遞方向是()
A．DNA→RNAB．RNA→DNAC．DNA→DNAD．RNA→RNA
8.hnRNA是()
A．存在于細(xì)胞核內(nèi)的tRNA前體B.存在于細(xì)胞核內(nèi)的mRNA前體
C.存在于細(xì)胞核內(nèi)的rRNA前體D.存在于細(xì)胞核內(nèi)的snRNA前體
9.以RNA為模板合成DNA的酶是（）
A．DNA聚合酶ⅢB．DNA聚合酶ⅠC．RNA聚合酶D．反轉(zhuǎn)錄酶
10.蛋白質(zhì)的生物合成中肽鏈延伸方向是（）
A．5→3B．從N端到C端C．3→5D．從C端到N端，，11.蛋白質(zhì)翻譯后的加工主要包括（）。
A．氨基酸側(cè)鏈修飾B．水解修飾
C．二硫鍵的形成D． 上述各種修飾都包括
12.操縱子調(diào)控系統(tǒng)屬于哪一種水平的調(diào)控（）
A．復(fù)制水平的調(diào)節(jié)B。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)
C．翻譯水平的調(diào)節(jié)D。轉(zhuǎn)錄后加工的調(diào)控
13.與乳糖操縱子操縱基因結(jié)合的物質(zhì)是（）
A．RNA聚合酶B．DNA聚合酶C．阻遏蛋白D．誘導(dǎo)物
14、參與線粒體DNA復(fù)制的酶是（）
A．polαB．polδC．polβD．polγ
15、參與領(lǐng)頭鏈DNA復(fù)制的酶是（）
A．polαB．polδC．polβD．polγ
16、端粒酶是一種()
A．逆轉(zhuǎn)錄酶B．RNA聚合酶C．DNA聚合酶D．DNA酶
17.含稀有堿基最多的RNA是（）
A．mRNAB、rRNAC．5S-rRNAD．tRNA
18.大腸桿菌DNA連接酶需要下列哪一種輔助因子？（）
A．FAD作為電子受體B．NADP+作為磷酸供體
C．NAD+形成活性腺苷酰酶D．NAD+作為電子受體
19.真核生物RNA聚合酶I催化轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物是（）
A．mRNAB．45S-rRNAC．5S-rRNAD．tRNA
20.魔斑是指（）
A．ppGppB．cAMPC．cGMPD．7mGppp
21.CAP復(fù)合體與操縱子結(jié)合的部位是（）
A．啟動(dòng)子B．操縱基因C．結(jié)構(gòu)基因D．調(diào)節(jié)基因
22.基因的甲基化修飾一般發(fā)生在（）
A．CpGB．ApGC．GpTD．TpG
23.有基因表達(dá)活性的染色質(zhì)DNA對(duì)下列那個(gè)酶敏感性增加？（）
A．DNaseⅠB．DNA polⅠC．DNA polⅡD.Rnase H
24.真核生物的RNA聚合酶識(shí)別的是（）
A．啟動(dòng)子B．增強(qiáng)子C．TF-DNA復(fù)合體D．RF
25.在分子生物學(xué)中被應(yīng)用的限制性核酸內(nèi)切酶是（）
A．Ⅰ型B．Ⅱ型C．Ⅲ型D．以上都沒用
26.限制性核酸內(nèi)切酶錯(cuò)位切割產(chǎn)生（）
A．粘性末端B．平頭末端C．3’-磷酸D．5’-羥基
27.大腸桿菌DNA連接酶只能連接（）
A．粘性末端B．平頭末端C．3’-磷酸D．5’-羥基
28.pBR322是（）
A．復(fù)制型載體B．表達(dá)型載體C．穿梭載體D．噬菌體載體
29、pUC載體是（）
A．復(fù)制型載體B．表達(dá)型載體C．穿梭載體D．噬菌體載體
30.M13噬菌體是（）
A．單鏈DNA噬菌體B．雙鏈DNA噬菌體
C．RNA噬菌體D．都不是
31、B．表達(dá)型載體C．穿梭載體D．噬菌體載體
五．問答題
1．分子克隆中常用的工具酶有哪些？各有何用途？
2．何謂載體？分子克隆中常用的載體有哪些？理想的載體應(yīng)具備哪些條件？
3．何謂PCR？試述PCR基本技術(shù)原理和影響因素。
4．常用的核酸探針有哪些類型？各有何優(yōu)缺點(diǎn)？
5．將目的DNA與載體DNA連接起來的方法有哪些？并用文或圖表示各種連接過程。
6．簡述原核生物與真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。
9．體外重組常用的連接方法有哪些？各有何優(yōu)缺點(diǎn)？
13．何謂核酸雜交？常用的雜交方法有哪些？
28.何謂宿主細(xì)胞？分子克隆中常用的宿主細(xì)胞有哪些？宿主細(xì)胞應(yīng)具備哪些條件？
31.簡述重組體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法
35、DNA損傷修復(fù)有哪些類型？試述各類型的修復(fù)方式。
第四篇：現(xiàn)代分子生物學(xué)總結(jié)
第一章、基因的結(jié)構(gòu)和功能實(shí)體及基因組
1、基因定義
基因（遺傳因子）是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，是DNA（脫氧核糖核酸）分子上具有遺傳信息的特定核苷酸序列的總稱，攜帶有遺傳信息的DNA序列，是具有遺傳效應(yīng)的DNA分子片段，是控制性狀的基本遺傳單位，通過指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成來表達(dá)自己所攜帶的遺傳信息，從而控制生物個(gè)體的性狀表現(xiàn)。
2、DNA修復(fù)
DNA修復(fù)（DNA repairing）是細(xì)胞對(duì)DNA受損傷后的一種反應(yīng)，這種反應(yīng)可能使DNA結(jié)構(gòu)恢復(fù)原樣，重新能執(zhí)行它原來的功能；但有時(shí)并非能完全消除DNA的損傷，只是使細(xì)胞能夠耐受這DNA的損傷而能繼續(xù)生存。也許這未能完全修復(fù)而存留下來的損傷會(huì)在適合的條件下顯示出來（如細(xì)胞的癌變等），但如果細(xì)胞不具備這修復(fù)功能，就無法對(duì)付經(jīng)常在發(fā)生的DNA損傷事件，就不能生存。對(duì)不同的DNA損傷，細(xì)胞可以有不同的修復(fù)反應(yīng)。
3、DNA損傷
DNA損傷是復(fù)制過程中發(fā)生的DNA核苷酸序列永久性改變，并導(dǎo)致遺傳特征改變的現(xiàn)象。情況分為：substitutation（替換）deletion（刪除）insertion（插入）exon skipping（外顯子跳躍）。
DNA損傷的改變類型：a、點(diǎn)突變：指DNA上單一堿基的變異。嘌呤替代嘌呤（A與G之間的相互替代）、嘧啶替代嘧啶（C與T之間的替代）稱為轉(zhuǎn)換（transition）；嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤則稱為顛換（transvertion）。b、缺失：指DNA鏈上一個(gè)或一段核苷酸的消失。c、插入：指一個(gè)或一段核苷酸插入到DNA鏈中。在為蛋白質(zhì)編碼的序列中如缺失及插入的核苷酸數(shù)不是3的整倍數(shù)，則發(fā)生讀框移動(dòng)（reading frame shift），使其后所譯讀的氨基酸序列全部混亂，稱為移碼突變（frame-shift mutaion）。d、倒位或轉(zhuǎn)位：（transposition）指DNA鏈重組使其中一段核苷酸鏈方向倒置、或從一處遷移到另一處。e、雙鏈斷裂：對(duì)單倍體細(xì)胞一個(gè)雙鏈斷裂就是致死性事件。
4、同源重組 同源重組，（Homologus Recombination)是指發(fā)生在姐妹染色單體（sister chromatin)之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合。同源重組需要一系列的蛋白質(zhì)催化，如原核生物細(xì)胞內(nèi)的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物細(xì)胞內(nèi)的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重組反應(yīng)通常根據(jù)交叉分子或holiday結(jié)構(gòu)（Holiday Juncture Structure)的形成和拆分分為三個(gè)階段，即前聯(lián)會(huì)體階段、聯(lián)會(huì)體形成和Holiday 結(jié)構(gòu)的拆分。a、基因敲除
基因敲除（geneknockout），是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測(cè)相應(yīng)基因的功能。這與早期生理學(xué)研究中常用的切除部分-觀察整體-推測(cè)功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表達(dá)外，還包括引入新基因及引入定點(diǎn)突變。既可以是用突變基因或其它基因敲除相應(yīng)的正常基因，也可以用正常基因敲除相應(yīng)的突變基因。b、因轉(zhuǎn)移法
同源重組(homologousrecombination)是將外源基因定位導(dǎo)人受體細(xì)胞染色體上的方法，因?yàn)樵谠撟挥信c導(dǎo)人基因同源的序列，通過單一或雙交換，新基因片段可替換有缺陷的基因片段，達(dá)到修正缺陷基因的目的。位點(diǎn)特異性重組是發(fā)生在兩條DNA鏈特異位點(diǎn)上的重組，重組的發(fā)生需一段同源序列即特異性位點(diǎn)(又稱附著點(diǎn)；attachmentsite，att)和位點(diǎn)特異性的蛋白因子即重組酶參與催化。重組酶僅能催化特異性位點(diǎn)間的重組，因而重組具有特異性和高度保守性。
5、堿基錯(cuò)配對(duì)修復(fù)
錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）：在含有錯(cuò)配堿基的DNA分子中，使正常核苷酸序列恢復(fù)的修復(fù)方式；主要用來糾正DNA雙螺旋上錯(cuò)配的堿基對(duì)，還能修復(fù)一些因復(fù)制打滑而產(chǎn)生的小于4nt的核苷酸插入或缺失。MMR的過程需要區(qū)分母鏈和子鏈，做到只切除子鏈上錯(cuò)誤的核苷酸，而不會(huì)切除母鏈上本來就正常的核苷酸。修復(fù)的過程是：識(shí)別出正確的鏈，切除掉不正確的部分，然后通過DNA聚合酶III和DNA連接酶的作用，合成正確配對(duì)的雙鏈DNA。
6、基因組學(xué)
基因組學(xué)（英文genomics），研究生物基因組和如何利用基因的一門學(xué)問。用于概括涉及基因作圖、測(cè)序和整個(gè)基因組功能分析的遺傳學(xué)分支。該學(xué)科提供基因組信息以及相關(guān)數(shù)據(jù)系統(tǒng)利用，試圖解決生物，醫(yī)學(xué)，和工業(yè)領(lǐng)域的重大問題。基因組研究應(yīng)該包括兩方面的內(nèi)容：以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)（structural genomics）和以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)（functional genomics)，又被稱為后基因組（postgenome）研究，成為系統(tǒng)生物學(xué)的重要方法。基因組學(xué)的主要工具和方法包括： 生物信息學(xué)，遺傳分析，基因表達(dá)測(cè)量和基因功能鑒定。第二章、基因的結(jié)構(gòu)實(shí)體
1、核酸分子
核酸（Nucleic Acids）是一種主要位于細(xì)胞核內(nèi)的生物大分子，其充當(dāng)著生物體遺傳信息的攜帶和傳遞。DNA分子含有生物物種的所有遺傳信息，為雙鏈分子，其中大多數(shù)是鏈狀結(jié)構(gòu)大分子，也有少部分呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，分子量一般都很大。RNA主要是負(fù)責(zé)DNA遺傳信息的翻譯和表達(dá)，為單鏈分子，分子量要比DNA小得多。核酸存在于所有動(dòng)植物細(xì)胞、微生物和病毒、噬菌體內(nèi)，是生命的最基本物質(zhì)之一，對(duì)生物的生長、遺傳、變異等現(xiàn)象起著重要的決定作用。核酸大分子可分為兩類：脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），在蛋白質(zhì)的復(fù)制和合成中起著儲(chǔ)存和傳遞遺傳信息的作用。核酸不僅是基本的遺傳物質(zhì)，而且在蛋白質(zhì)的生物合成上也占重要位置，因而在生長、遺傳、變異等一系列重大生命現(xiàn)象中起決定性的作用。
2、DNA的結(jié)構(gòu)
DNA即脫氧核糖核酸（英文Deoxyribonucleic acid的縮寫）,又稱去氧核糖核苷酸，是染色體主要組成成分，同時(shí)也是組成基因的材料。DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)是相對(duì)穩(wěn)定的。這是因?yàn)樵贒NA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)的內(nèi)側(cè),通過氫鍵形成的堿基對(duì),使兩條脫氧核苷酸長鏈穩(wěn)固地并聯(lián)起來。另外,堿基對(duì)之間縱向的相互作用力也進(jìn)一步加固了DNA分子的穩(wěn)定性。各個(gè)堿基對(duì)之間的這種縱向的相互作用力叫做堿基堆集力,它是芳香族堿基π電子間的相互作用引起的。現(xiàn)在普遍認(rèn)為堿基堆集力是穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu)的最重要的因素。再有,雙螺旋外側(cè)負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)同帶正電荷的陽離子之間形成的離子鍵,可以減少雙鏈間的靜電斥力,因而對(duì)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)也有一定的穩(wěn)定作用。DNA分子由于堿基對(duì)的數(shù)量不同,堿基對(duì)的排列順序千變?nèi)f化,因而構(gòu)成了DNA分子的多樣性。例如,一個(gè)具有4 000個(gè)堿基對(duì)的DNA分子所攜帶的遺傳信息是4種,即10種。不同的DNA分子由于堿基對(duì)的排列順序存在著差異,因此,每一個(gè)DNA分子的堿基對(duì)都有其特定的排列順序,這種特定的排列順序包含著特定的遺傳信息,從而使DNA分子具有特異性。
3、DNA的拓?fù)鋵W(xué)
首先以一260 bp雙鏈線形B-DNA為例，此DNA在松弛時(shí)，螺旋數(shù)為25（260/10.4），首尾連接成環(huán)形后，為一松弛環(huán)形DNA，并處于最穩(wěn)定狀態(tài)。若將此線形DNA先擰松2個(gè)連環(huán)再連成環(huán)形，則可以形成兩種環(huán)形DNA，一種稱為松弛解鏈環(huán)形DNA；另一種環(huán)形DNA稱為超螺旋DNA，其螺旋周數(shù)為25，有2個(gè)負(fù)超螺旋。由此引入拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)： 1.連環(huán)數(shù)（Linking number）：在雙螺旋DNA中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)，以L 表示（或以α表示），其計(jì)數(shù)方法為處于松弛環(huán)形DNA時(shí)的螺旋周數(shù)，肯定為整數(shù)，右手螺旋為正、左手螺旋為負(fù)。2.纏繞數(shù)（Twisting number）：即DNA分子中的Watson-Crick螺旋周數(shù)，以T 表示(或以β表示)，其數(shù)值可直接在處于最穩(wěn)定狀態(tài)下的雙鏈環(huán)形（或超螺旋形式）DNA中的實(shí)際螺旋周數(shù)計(jì)數(shù)得到，不一定是整數(shù)，右手螺旋為正，左手螺旋為負(fù)。但必須注意T僅針對(duì)于形成雙螺旋區(qū)域而言，解鏈部分的bp數(shù)就不涉及T的計(jì)算。對(duì)于一定長度的DNA雙鏈，一旦出現(xiàn)解鏈T值就減少。如260bp B-DNA雙鏈自然狀態(tài)下T=25，解鏈20%時(shí)的T=20。3.超螺旋數(shù) 或 紐數(shù)（Writhing number）：其數(shù)值有公式L=T+W 計(jì)算得到，以W表示（或以τ表示），不一定為整數(shù)。左手超螺旋為正，右手超螺旋為負(fù)（此點(diǎn)解釋見后）。4.比連環(huán)差：為雙鏈DNA的超螺旋密度。用σ表示，由公式σ = Lβ /β 表示。
4、染色體和核小體
染色體（Chromosome），是細(xì)胞內(nèi)具有遺傳性質(zhì)的物體，易被堿性染料染成深色，又叫染色質(zhì)。其本質(zhì)是脫氧核甘酸，是細(xì)胞核內(nèi)由核蛋白組成、能用堿性染料染色、有結(jié)構(gòu)的線狀體，是遺傳物質(zhì)基因的載體。在無性繁殖物種中，生物體內(nèi)所有細(xì)胞的染色體數(shù)目都一樣；而在有性繁殖大部分物種中，生物體的體細(xì)胞染色體成對(duì)分布，稱為二倍體。性細(xì)胞如精子、卵子等是單倍體，染色體數(shù)目只是體細(xì)胞的一半。哺乳動(dòng)物雄性個(gè)體細(xì)胞的性染色體對(duì)為XY，雌性則為XX。鳥類和蠶的性染色體與哺乳動(dòng)物不同：雄性個(gè)體的是ZZ，雌性個(gè)體為ZW。
染色體是細(xì)胞核中載有遺傳信息的物質(zhì)，在顯微鏡下呈圓柱狀或桿狀，主要由脫氧核糖核酸和蛋白質(zhì)組成，在細(xì)胞發(fā)生有絲分裂時(shí)期容易被堿性染料（例如龍膽紫和醋酸洋紅）著色，因此而得名。在無性繁殖物種中，生物體內(nèi)所有細(xì)胞的染色體數(shù)目都一樣；而在有性繁殖大部分物種中，生物體的體細(xì)胞染色體成對(duì)分布，稱為二倍體。性細(xì)胞如精子、卵子等是單倍體，染色體數(shù)目只是體細(xì)胞的一半。哺乳動(dòng)物雄性個(gè)體細(xì)胞的性染色體對(duì)為XY，雌性則為XX。鳥類和蠶的性染色體與哺乳動(dòng)物不同：雄性個(gè)體的是ZZ，雌性個(gè)體為ZW。
核小體（英語：Nucleosome，也譯作核體或核仁小體等）是組成真核生物染色質(zhì)（除精子染色質(zhì)外）的基本單位。核小體是由DNA與四對(duì)組織蛋白（共8個(gè)）的復(fù)合物，其中有H2A和H2B的二聚體兩組以及H3和H4的二聚體兩組。另外還有一種H1負(fù)責(zé)連結(jié)兩個(gè)核小體之間的DNA。核小體假說是在1974年，由Don Olins、Ada Olins與羅杰·科恩伯格等人首次提出的。核小體是染色體的基本結(jié)構(gòu)單位，由DNA和組蛋白（histone）構(gòu)成，是染色質(zhì)（染色體）的基本結(jié)構(gòu)單位。由4種組蛋白H2A、H2B、H3和H4，每一種組蛋白各二個(gè)分子，形成一個(gè)組蛋白八聚體，約200bp的DNA分子盤繞在組蛋白八聚體構(gòu)成的核心結(jié)構(gòu)外面，形成了一個(gè)核小體。
5、染色質(zhì)的構(gòu)象狀態(tài)
(chromosome conformation capture，3C)通過一種定量手段(PCR產(chǎn)物的有和無、產(chǎn)量的高和低)對(duì)DNA之間是否存在相互作用這一定性問題進(jìn)行研究。主要經(jīng)過甲醛交聯(lián)、限制性酶切、稀釋和連接、解交聯(lián)、DNA純化與PCR鑒定。通過一對(duì)分別與選定的2段DNA配對(duì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過PCR產(chǎn)物的有無、產(chǎn)量的高低等，就可以對(duì)是否存在相互作用進(jìn)行判斷。
6、常染色質(zhì)和異染色質(zhì)
常染色質(zhì)：常染色質(zhì)是指間期核內(nèi)染色質(zhì)纖維折疊壓縮程度低，處于伸展?fàn)顟B(tài)，用堿性染料染色時(shí)著色淺的那些染色質(zhì)。在常染色質(zhì)中，DNA包裝比約為1/2000-1/1000，即DNA實(shí)際長度為染色質(zhì)纖維長度的1000-2000倍。構(gòu)成常染色質(zhì)的DNA主要是單一序列DNA和中度重復(fù)序列DNA（如組蛋白基因和tRNA基因）。常染色質(zhì)并非所有基因都具有轉(zhuǎn)錄活性，處于常染色質(zhì)狀態(tài)只是基因轉(zhuǎn)錄的必要條件，而不是充分條件。
異染色質(zhì)：在細(xì)胞周期中，間期、早期或中、晚期，某些染色體或染色體的某些部分的固縮常較其他的染色質(zhì)早些或晚些，其染色較深或較淺，具有這種固縮特性的染色體稱為異染色質(zhì)（heterochromatin）。具有強(qiáng)嗜堿性，染色深，染色質(zhì)絲包裝折疊緊密，與常染色質(zhì)相比，異染色質(zhì)是轉(zhuǎn)錄不活躍部分，多在晚S期復(fù)制。異染色質(zhì)分為結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)和功能異染色質(zhì)兩種類型。結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)是指各類細(xì)胞在整個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)處于凝集狀態(tài)的染色質(zhì)，多定位于著絲粒區(qū)、端粒區(qū)，含有大量高度重復(fù)順序的脫氧核糖核酸（DNA），稱為衛(wèi)星DNA（satel-lite DNA）。第三章、基因的功能實(shí)體
1、基因的功能
基因有控制遺傳性狀和活性調(diào)節(jié)的功能。基因通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代，并通過控制酶的合成來控制代謝過程，從而控制生物的個(gè)體性狀表現(xiàn)。基因還可以通過控制結(jié)構(gòu)蛋白的成分，直接控制生物性狀。、生物體細(xì)胞中的DNA分子上有很多基因，但并不是每一基因的特征都表現(xiàn)出來。即使是由同一受精卵發(fā)育分化而來的同一人體不同組織中的細(xì)胞，如肌肉細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、紅細(xì)胞、和胃黏膜細(xì)胞等。它們的細(xì)胞形狀都是各不相同的。為什么會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象呢？原來，細(xì)胞核中的基因在細(xì)胞的一生中并非始終處于活性狀態(tài)，它們有的處于轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，即活性狀態(tài)，這時(shí)基因打開，有的處于非轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，即基因關(guān)閉。在生物體的不同發(fā)育期，基因的活性是不同的，而且基因的活性有嚴(yán)格的程序。基因活性的嚴(yán)格程序是生命周期穩(wěn)定的基礎(chǔ)。各種不同的生物因其細(xì)胞內(nèi)的基因具有獨(dú)特的活性調(diào)節(jié)而呈現(xiàn)不同的形態(tài)特征。
2、順反因子
順式作用元件（cis-acting element）能影響基因表達(dá)，但不編碼RNA和蛋白質(zhì)的DNA序列
反式作用因子（trans-actingfactor）能識(shí)別和結(jié)合特定的順式作用元件,并影響基因轉(zhuǎn)錄的一類蛋白質(zhì)或RNA
3、順式調(diào)控元件
有順式調(diào)控元件(cis-regulatory element)，或順式作用元件是調(diào)節(jié)位于相同的DNA分子(通常是一個(gè)染色體)的基因的表達(dá)的DNA或RNA的區(qū)域。這個(gè)詞是從拉丁詞順，這意味著“在同一側(cè)的”構(gòu)建。可能有順式元件位于控制(或什至更上游的啟動(dòng)子區(qū)域)的基因的編碼序列的上游，在一個(gè)內(nèi)含子，或該基因的編碼序列的下游，無論是在非翻譯或未轉(zhuǎn)錄區(qū)域。
4、非編碼RNA分子的調(diào)控作用 非編碼RNA（Non-coding RNA）是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA。其中包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA 和microRNA 等多種已知功能的 RNA，還包括未知功能的RNA。這些RNA的共同特點(diǎn)是都能從基因組上轉(zhuǎn)錄而來，但是不翻譯成蛋白，在RNA 水平上就能行使各自的生物學(xué)功能了。非編碼RNA 從長度上來劃分可以分為3類:小于50 nt，包括microRNA，siRNA，piRNA；50 nt到500 nt，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，SLRNA，SRPRNA 等等；大于500 nt，包括長的mRNA-like 的非編碼RNA，長的不帶polyA 尾巴的非編碼RNA等等。
5、基因在細(xì)胞核內(nèi)的地域分布 第四章、基因組的組織結(jié)構(gòu)
1、基因組
在生物學(xué)中，一個(gè)生物體的基因組是指包含在該生物的DNA（部分病毒是RNA）中的全部遺傳信息，又稱基因體(genome)。基因組包括基因和非編碼DNA。1920年，德國漢堡大學(xué)植物學(xué)教授漢斯.溫克勒（Hans Winkler）首次使用基因組這一名詞。更精確地講，一個(gè)生物體的基因組是指一套染色體中的完整的DNA序列。
2、原核生物基因組的特點(diǎn)
a、基因組較小，通常只有一個(gè)環(huán)形或線形的DNA分子。
b、基因組的大部分序列是用來編碼蛋白質(zhì)的，基因之間的間隔序列很短。
c、功能相關(guān)的序列常串連在一起，由共同的調(diào)控元件調(diào)控，并轉(zhuǎn)錄成同一mRNA分子，可指導(dǎo)多種蛋白質(zhì)的合成，這種結(jié)構(gòu)稱操縱子。
3、真核生物基因組的特點(diǎn) a、基因組較大。真核生物的基因組由多條線形的染色體構(gòu)成，每條染色體有一個(gè)線形的DNA分子，每個(gè)DNA分子有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。
b、不存在操縱子結(jié)構(gòu)。真核生物的同一個(gè)基因簇的基因，不會(huì)像原核生物的操縱子結(jié)構(gòu)那樣，轉(zhuǎn)錄到同一個(gè)mRNA上。
c、存在大量的重復(fù)序列。真核生物的基因組里存在大量重復(fù)序列，通過其重復(fù)程度可將其分成高度重復(fù)序列、中度重復(fù)序列、低度重復(fù)序列和單一序列。
d、有斷裂基因。大多數(shù)真核生物為蛋白質(zhì)編碼的基因都含有“居間序列”，即不為多肽編碼，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在mRNA前體的加工過程中被切除的成分。
4、基因的拷貝數(shù)
拷貝數(shù)就是指某基因（可以是質(zhì)粒）在某一生物的基因組中的個(gè)數(shù).單拷貝就是該基因在該生物基因組中只有一個(gè),多則指有多個(gè)。
(一)在細(xì)菌細(xì)胞中，某種特定質(zhì)粒的數(shù)目。根據(jù)復(fù)制特性，質(zhì)粒分嚴(yán)緊型和松弛型兩類，前者在細(xì)胞中只含1～2個(gè)，而后者含10～15個(gè)以上。恒定的拷貝數(shù)與質(zhì)粒復(fù)制控制系統(tǒng)、宿主細(xì)胞遺傳背景及生長條件有關(guān)。質(zhì)粒復(fù)制控制系統(tǒng)首先通過調(diào)節(jié)復(fù)制的起始點(diǎn)來控制拷貝數(shù)，調(diào)節(jié)因素包括阻遏蛋白、反義RNA和某些順向重復(fù)序列。有些質(zhì)粒還有其他控制系統(tǒng)，如有分配功能的par系統(tǒng)和確保質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳的ccd系統(tǒng)。一旦質(zhì)粒上與調(diào)控有關(guān)的基因或位點(diǎn)突變，可使拷貝數(shù)明顯增加或減少。(二)在細(xì)菌細(xì)胞中，某種特定基因的數(shù)目。
5、線粒體DNA 線粒體中的遺傳物質(zhì)，線粒體能為細(xì)胞產(chǎn)生能量，是在細(xì)胞線粒體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的脫氧核糖核酸特殊形態(tài)。線粒體DNA（mtDNA）呈雙鏈環(huán)狀，在哺乳動(dòng)物中大小一般在15kb～18kb之內(nèi)。一個(gè)線粒體中一般有多個(gè)DNA分子。
與核基因組相比，線粒體基因組有如下有趣的性質(zhì)： 所有的基因都位于一個(gè)單一的環(huán)狀DNA分子上。遺傳物質(zhì)不為核膜所包被。DNA不為蛋白質(zhì)所壓縮。
基因組沒有包含那么多非編碼區(qū)域（垃圾DNA或“內(nèi)含子”）。一些密碼子與通用密碼子不同。相反，與一些紫色非硫細(xì)菌相似。一些堿基為兩個(gè)不同基因的一部分：某堿基作為一個(gè)基因的末尾，同時(shí)作為下一個(gè)基因的開始。
線粒體DNA比DNA存活時(shí)間長得多，而且遺傳自母親，因此用來確認(rèn)家庭關(guān)系十分理想。第五章、基因的自身維護(hù)
1、DNA復(fù)制
DNA復(fù)制是指DNA雙鏈在細(xì)胞分裂以前的分裂間期進(jìn)行的復(fù)制過程，復(fù)制的結(jié)果是一條雙鏈變成兩條一樣的雙鏈（如果復(fù)制過程正常的話），每條雙鏈都與原來的雙鏈一樣。這個(gè)過程通過邊解旋邊復(fù)制和半保留復(fù)制機(jī)制得以順利完成。DNA復(fù)制主要包括引發(fā)、延伸、終止三個(gè)階段。
2、DNA復(fù)制的特點(diǎn)
A、半保留復(fù)制：DNA在復(fù)制時(shí)，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代DNA，每個(gè)子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復(fù)制。DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M.Meselson 和 F.Stahl 所完成的實(shí)驗(yàn)所證明。
B、有一定的復(fù)制起始點(diǎn)：DNA在復(fù)制時(shí)，需在特定的位點(diǎn)起始，這是一些具有特定核苷酸排列順序的片段，即復(fù)制起始點(diǎn)（復(fù)制子）。在原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)通常為一個(gè)，而在真核生物中則為多個(gè)。
C、需要引物（primer)：DNA聚合酶必須以一段具有3'端自由羥基（3'-OH）的RNA作為引物，才能開始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小，在原核生物中通常為50～100個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為10個(gè)核苷酸。
D、雙向復(fù)制：DNA復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制。但在低等生物中，也可進(jìn)行單向復(fù)制。
E、半不連續(xù)復(fù)制：由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA鏈，因此兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時(shí)的方式是不同的。以3'→5'方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在聚合時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)行的，這一條鏈被稱為領(lǐng)頭鏈（leading strand)。而以5'→3'方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在聚合時(shí)則是不連續(xù)的，這條鏈被稱為隨從鏈（lagging strand)。DNA在復(fù)制時(shí)，由隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段（Okazaki fragment)。岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為100個(gè)核苷酸。
3、DNA復(fù)制的忠實(shí)性維護(hù)
DNA聚合酶高度選擇性、DNA聚合酶的自我校對(duì)、錯(cuò)配修復(fù)
4、連接體和去連接體
5、幾種特殊形式的DNA合成
誘導(dǎo)型穩(wěn)定DNA復(fù)制、DNA重組依賴的DNA復(fù)制、組成型穩(wěn)定DNA復(fù)制、DNA的跨損傷復(fù)制。
6、DNA復(fù)制的多種形式
滾環(huán)復(fù)制：滾環(huán)式復(fù)制(rolling circle replication)是噬菌體中常見的DNA復(fù)制方式。滾環(huán)式復(fù)制的一個(gè)特點(diǎn)是以一條環(huán)狀單鏈DNA為模板，進(jìn)行新的DNA環(huán)狀分子合成。噬菌體的雙鏈DNA環(huán)狀分子先在一條單鏈的復(fù)制起點(diǎn)上產(chǎn)生一個(gè)切口(nick)，然后以另一條單鏈為模板不斷地合成新的單鏈。釋放出的新合成的單鏈或是先復(fù)制成雙鏈DNA，被酶切割成單位長度后，再形成環(huán)狀雙鏈DNA分子；或是釋放出的新合成的單鏈DNA，先被酶切割成單位長度形成單鏈環(huán)狀DNA分子后再復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DNA分子。
D環(huán)復(fù)制：雙螺旋的兩條鏈并不同時(shí)進(jìn)行復(fù)制，重鏈先開始復(fù)制，稍后輕鏈再開始復(fù)制，當(dāng)復(fù)制沿輕鏈開始時(shí)，重鏈上產(chǎn)生了D環(huán)，隨環(huán)形輕鏈復(fù)制的進(jìn)行，D環(huán)增大，輕鏈后亦開始復(fù)制，最后兩條鏈完成復(fù)制形成兩條新的DNA雙螺旋。第六章、綜合
1、DNA的損傷和修復(fù)
DNA損傷修復(fù)是在細(xì)胞中多種酶的共同作用下，使DNA受到損傷的結(jié)構(gòu)大部分得以恢復(fù)，降低了突變率，保持了DNA分子的相對(duì)穩(wěn)定性。DNA分子的損傷類型有多種。UV照射后DNA分子上的兩個(gè)相鄰的胸腺嘧啶(T)或胞嘧啶(C)之間可以共價(jià)鍵連結(jié)形成環(huán)丁酰環(huán)，這種環(huán)式結(jié)構(gòu)稱為二聚體。胸腺嘧啶二聚體的形成是 UV對(duì)DNA分子的主要損傷方式。
Χ射線、γ射線照射細(xì)胞后，由細(xì)胞內(nèi)的水所產(chǎn)生的自由基既可使DNA分子雙鏈間氫鍵斷裂,也可使它的單鏈或雙鏈斷裂。化學(xué)物中的博萊霉素、甲基磺酸甲烷等烷化劑也能造成鏈的斷裂。
絲裂霉素C可造成DNA分子單鏈間的交聯(lián)，這種情況常發(fā)生在兩個(gè)單鏈的對(duì)角的鳥嘌呤之間。鏈的交聯(lián)也往往帶來DNA分子的斷裂。
DNA分子還可以發(fā)生個(gè)別堿基或核苷酸的變化。例如堿基結(jié)構(gòu)類似物5-溴尿嘧啶等可以取代個(gè)別堿基，亞硝酸能引起堿基的氧化脫氨反應(yīng)，原黃素（普魯黃）等吖啶類染料和甲基氨基偶氮苯等芳香胺致癌物可以造成個(gè)別核苷酸對(duì)的增加或減少而引起移碼突變（見基因突變）。
一種 DNA損傷劑往往可以同時(shí)引起幾種類型的損傷，其損傷效應(yīng)的大小和類型與劑量及細(xì)胞所處的周期狀態(tài)有關(guān)。
2、基因重組與重排
基因重排是指通過基因的轉(zhuǎn)座，DNA的斷裂錯(cuò)接而使正常基因順序發(fā)生改變。
基因組重排技術(shù)結(jié)合了傳統(tǒng)誘變技術(shù)和細(xì)胞融合技術(shù),是一項(xiàng)對(duì)整個(gè)微生物基因組重排的新型育種技術(shù)。基因組重排技術(shù)通過多親本原生質(zhì)體遞歸融合,可以使工程菌快速獲得多樣復(fù)雜優(yōu)良表型,并且無須了解其基因組學(xué)、代謝組學(xué)等具體背景。介紹了基因組重排技術(shù)的過程及應(yīng)用,展現(xiàn)了基因組重排技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),并給出了基因組重排技術(shù)的發(fā)展在未來的應(yīng)用情景。
3、細(xì)胞周期控制及細(xì)胞死亡控制
細(xì)胞周期分為：合成DNA的時(shí)期稱為DNA合成期（S期），進(jìn)行DNA拷貝分配和細(xì)胞分裂的時(shí)期稱為有絲分裂期（M期），在M期結(jié)束后和S期開始前的一段間隙稱為G1期，而在S期結(jié)束后和M期開始前的間隙則稱為G2期。真核細(xì)胞內(nèi)有一個(gè)調(diào)控機(jī)構(gòu)，使細(xì)胞周期能有條不紊地依次進(jìn)行。細(xì)胞周期的準(zhǔn)確調(diào)控對(duì)生物的生存、繁殖、發(fā)育和遺傳均是十分重要的，細(xì)胞周期各時(shí)相中有各自特異性的細(xì)胞周期蛋白控制細(xì)胞周期有序地進(jìn)行。細(xì)胞是有機(jī)體的基本結(jié)構(gòu)單位和功能單位，而細(xì)胞周期則是保證細(xì)胞進(jìn)行生命活動(dòng)的基本過程。細(xì)胞周期分為：合成DNA的時(shí)期稱為DNA合成期（S期），進(jìn)行DNA拷貝分配和細(xì)胞分裂的時(shí)期稱為有絲分裂期（M期），在M期結(jié)束后和S期開始前的一段間隙稱為G1期，而在S期結(jié)束后和M期開始前的間隙則稱為G2期。真核細(xì)胞內(nèi)有一個(gè)調(diào)控機(jī)構(gòu)，使細(xì)胞周期能有條不紊地依次進(jìn)行。細(xì)胞周期的準(zhǔn)確調(diào)控對(duì)生物的生存、繁殖、發(fā)育和遺傳均是十分重要的，細(xì)胞周期各時(shí)相中有各自特異性的細(xì)胞周期蛋白控制細(xì)胞周期有序地進(jìn)行。細(xì)胞死亡是生命現(xiàn)象不可逆停止及生命的結(jié)束，正常的組織中經(jīng)常發(fā)生細(xì)胞死亡，是維持組織機(jī)能和形態(tài)所必須的，包括細(xì)胞主動(dòng)死亡-程序性死亡和細(xì)胞被動(dòng)死亡即細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡。
細(xì)胞的死亡方式有兩種A被動(dòng)死亡——細(xì)胞壞死，它是指細(xì)胞受到環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致細(xì)胞死亡的病理過程。B主動(dòng)死亡（細(xì)胞編程性死亡）——即細(xì)胞凋亡，為了維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，細(xì)胞發(fā)生主動(dòng)的，由基因控制的自我消亡過程，此過程需要消耗能量。
第五篇：分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)總結(jié)
分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)
1.TOMY全自動(dòng)滅菌鍋的使用
（1）檢查排放蒸汽的水壺，腔體內(nèi)的水位與托板齊平。（2）SET鍵設(shè)置溫度和時(shí)間（121℃，20min）（3）關(guān)閉排氣閥，Start機(jī)器開始運(yùn)行，Check Heat檢查設(shè)置的溫度，Stop鍵終止機(jī)器運(yùn)行。（4）程序運(yùn)行結(jié)束，旋開排氣閥或機(jī)器自行排氣至壓力為0。溫度降至80℃以下壓力為0時(shí)方可開蓋。運(yùn)行過程中勿接觸蓋子。（5）腔體內(nèi)經(jīng)常清潔。2.LB液體培養(yǎng)基（1000mL）
將胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g完全溶解在950mL去離子水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，加入去離子水至總體積為1000mL，121℃濕熱滅菌20min。冷卻后4℃保存?zhèn)溆谩９腆w還要再加瓊脂。3.堿裂解法
堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們的。在pH值介于12.0～12.5這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的氫鍵會(huì)斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此纏繞，仍會(huì)緊密的結(jié)合在一起。當(dāng)加入 pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液，恢復(fù)pH至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此完全分開，復(fù)性就不會(huì)那么迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA，蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。
溶液Ⅰ：葡萄糖，Tris-HCl，EDTA 葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受機(jī)械作用而降解。EDTA可螯合Mg2+、Ca2+等金屬離子，抑制DNase對(duì)DNA的降解作用。溶液Ⅱ：氫氧化鈉，SDS 氫氧化鈉加入后堿性環(huán)境12-12.5促使染色體DNA與質(zhì)粒的變性解離成單鏈。SDS是一種陰離子去垢劑，它的主要作用有：①溶解細(xì)胞膜上的脂肪與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜；②解聚細(xì)胞中的核蛋白，使蛋白質(zhì)與DNA分開；③SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀；④SDS能抑制核酸酶的作用，防止對(duì)DNA的降解。
溶液Ⅲ：乙酸鉀。用pH4.2的KAc溶液是為了調(diào)整溶液pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3mol/L醋酸鉀(KAc)有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物凝聚而沉淀。4.loading buffer 電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油組成上樣緩沖液。作用：①增加樣品比重，以確保DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。②形成肉眼可見的指示帶，預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置。③使樣品呈色，使加樣操作更方便。5.限制性內(nèi)切酶（I型）限制性內(nèi)切酶：能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機(jī)的。
(II型)限制性內(nèi)切酶：能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。這類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割的核苷酸都是專一的，因此，這種限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。
（III型）限制性內(nèi)切酶：也有專一的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱的回文順序,在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此不能應(yīng)用于基因克隆。6.引物設(shè)計(jì)和選擇目的DNA序列區(qū)域時(shí)遵循下列原則： 引物長度約為16～30bp；引物中G+C含量通常為40%～60%，可按Tm＝4(G+C)+2(A+T)粗略估計(jì)引物的解鏈溫度；四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3’端不存在連續(xù)3個(gè)G或C，因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤；引物3’端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對(duì)應(yīng)，以減少由于密碼子擺動(dòng)產(chǎn)生的不配對(duì)；在引物內(nèi)，尤其在3’端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)；兩引物之間尤其在3’端不能互補(bǔ)，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產(chǎn)量；引物5’端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，可引入酶切位點(diǎn)或突變位點(diǎn)；引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)；簡并引物應(yīng)選用簡并程度低的密碼子；引物的濃度一般為0.1～0.5μmol/L，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，引物濃度偏低則降低產(chǎn)量。7.dNTP 常用的濃度為20～200μmol/L，而且4種dNTP的終濃度相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足而出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入；dNTP濃度過高雖可加快反應(yīng)速度，但會(huì)增加堿基的錯(cuò)誤摻入率，同時(shí)會(huì)抑制Taq DNA聚合酶的反應(yīng)活性；適當(dāng)?shù)牡蜐舛葧?huì)提高反應(yīng)的精確度；注意協(xié)調(diào)Mg2+濃度和dNTP濃度之間的關(guān)系。8.感受態(tài)
處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)菌經(jīng)低溫CaCl2處理后接受外源DNA的能力顯著增加。細(xì)菌處于容易吸收外源 DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。在自然條件下，很多質(zhì)粒都可通過細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi)，但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob 基因，因此不能自行完成從一個(gè)細(xì)胞到另一個(gè)細(xì)胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài),以攝取外源DNA。9.轉(zhuǎn)化
轉(zhuǎn)化是將外源DNA 分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R-,M-)，它可以容忍外源DNA 分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。10.DNA連接酶
有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶；DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法，為了防止載體本身的自連，可以通過牛小腸堿性磷酸酶CIP處理克服； 連接反應(yīng)的溫度在37℃時(shí)有利于連接酶的活性。但是在這個(gè)溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此人們找到了一個(gè)折中的溫度，即12～16℃，連接12～16h（過夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定；
pMD18-T Vector 是一種高效克隆PCR 產(chǎn)物（TA Cloning）的專用載體，該載體由pUC18 載體改建并在其3’端添加“T”而成
大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)都有在PCR產(chǎn)物的3’末端添加一個(gè)“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率；
轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程 11.α互補(bǔ)
重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，還需對(duì)轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行篩選鑒定。利用α互補(bǔ)現(xiàn)象進(jìn)行篩選是最常用的一種鑒定方法； α互補(bǔ)：質(zhì)粒載體上lacZ’基因編碼的α肽段與失去了正常氨基端的β-半乳糖苷酶突變受體菌之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象，由α互補(bǔ)而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用Xgal顯色測(cè)定出來；任何攜帶著lacZ’基因的質(zhì)粒載體在轉(zhuǎn)化β半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細(xì)胞后，在含有Xgal的培養(yǎng)基平板上形成藍(lán)色菌落，而含有重組質(zhì)粒載體的克隆往往是白色菌落。
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