血清γ-球蛋白的分離純化

一、目的與要求

1、掌握分離純化蛋白質(zhì)的基本原理和基本過程。

2、熟悉鹽析、離心、層析、電泳等生化基本技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化中的綜合應用。

3、學會設(shè)計和制定分離純化蛋白質(zhì)的實驗方案，技術(shù)路線，質(zhì)量監(jiān)控和保證措施。

二、實驗原理

血清蛋白有300多種，可粗略的分為清、球蛋白兩大類，γ球蛋白只是球蛋白中的一個亞類。欲用常規(guī)方法獲得，可先用半飽和硫酸銨從血清中鹽析出球蛋白，接著用葡萄糖凝膠G-25脫去球蛋白中的鹽分最后用DEAE纖維素陰離子交換柱便可直接從脫鹽的球蛋白溶液中分離純化出γ球蛋白,其反應機理如下：

C2H5

H

纖維素-O-(CH2)2-N(C2H5)2

纖維素-O-(CH2)2-N+……H2PO4

H++H2PO4

DEAE纖維素離子交換柱

COOH

C2H5

α、β、γ球蛋白

NH2

COO

H

經(jīng)過鹽析和脫鹽的球蛋白液

纖維素-O-(CH2)2-N+…α和β

G

PH6.3

NH2

交換到柱上的α和β-球蛋白

H2PO4

COOH

γ-球蛋白

NH3+

被DEAE柱分離純化的γ-球蛋白

被柱層析交換結(jié)合的α球蛋白和β球蛋白，可通過增加洗脫液的離子強度或降低洗脫的pH值（也可兩者同時改變），使其分部洗脫下來而被純化。純化前后的γ球蛋白可用電泳方法進行比較鑒定。

三、儀器和材料

儀器：離心機，1.5×40cm層析柱，層析架或滴定臺，核酸-蛋白檢測儀，部分收集器，紫外分光光度計，色譜柱，電泳槽，電泳儀。

材料：馬血清，Sephadex

G-25×200g，DEAE-32×200g。

四、實驗步驟

（一）分離純化步驟

1、取3mL,4℃預冷血清，加入3mL

4℃預冷的飽和硫酸銨。邊滴邊搖。

2、靜置大于10min后，3500rpm離心15min，棄去上清液，將沉淀溶于少量的生理鹽水。從中取0.5mL用于測定蛋白質(zhì)含量。

3、將剩余的樣品上Sephadex

G-25柱，用0.02

mol/L

pH6.5的NH4AC緩沖液洗脫，每管收集3

mL，用于繪制洗脫曲線，選擇顏色最深（即濃度最高管）的取0.5mL留待電泳用。

4、將剩余的蛋白質(zhì)溶液上已平衡好的DEAE-32柱（裝一半的柱子），用0.02

mol/L

pH6.5

NH4AC緩沖液洗脫，用干凈的試管收集，并用20%磺基水楊酸檢測是否有蛋白流出，并繪制洗脫曲線，收集的蛋白質(zhì)溶液即為γ球蛋白（留少量電泳用，0.5ml測[Pr]）。

5、柱子再生。先用0.3mol/L高鹽緩沖液，再用0.02mol/L緩沖液平衡。

（二）電泳步驟

1、安裝垂直板電泳槽，按表配制分離膠溶液。用滴管吸取分離膠溶液，沿管壁注入玻璃板至距上端3cm處(插梳為準)

2、立即用滴管沿凝膠管壁加人蒸餾水約0.5cm高度，加水時應注意減少膠液表面的震動與擴散。加蒸餾水的目的，隔離空氣中的氧和消除凝膠柱表面的彎月面，使凝膠表面平坦（加水時切勿呈滴狀滴入膠液）。

3、靜置30分鐘，在凝膠表面與水之間出現(xiàn)清晰的界面，表示聚合已完成（注：剛加水時看出有界面，后逐漸消失，等再看出清晰界面時，表明凝膠已聚合）。用滴管吸去凝膠管的水層，并用濾紙條（無毛邊）輕輕吸去凝膠表面殘留的水分，注意不要損傷已聚合的凝膠表面。

4、按表制備濃縮膠，沿管壁加入濃縮膠，插上梳子，靜置15分鐘，待凝膠聚合后，待用。

5、加入10倍稀釋的甘氨酸一Tris緩沖溶液于電泳槽中，用注射針排除樣品孔中的氣泡，樣品與樣品處理液1：1混合后，用微量注射器上樣。

6、將上電泳槽的電極接至電泳儀的負極，下電泳槽的電極接至電泳儀的正極，接通電源，剛開始5分鐘內(nèi)6-7

mA／板，待示蹤染料遷移到下口約0.5cm處時，就可停止電泳，切斷電源（電泳時間約為

2／小時左右）。

7、剝膠

取下玻璃板，用帶有10cm長的注射針頭，內(nèi)盛蒸餾水作潤滑劑。將針頭插人膠與玻璃板之間，邊注水邊慢慢推針前進，靠水流壓力和潤滑作用使玻璃板與凝膠分開。

8、固定，染色與脫色

固定染色液染色過夜，用脫色液脫色.9、染色，加入染色液，染色過夜。

10、拍照，記錄結(jié)果。

五、實驗結(jié)果與分析

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血清樣由于蛋白質(zhì)種類較多，區(qū)帶不清。脫鹽后，樣品中剩余蛋白質(zhì)為α、β、γ-球蛋白，從結(jié)果中可以看到幾條較為明顯的區(qū)帶。γ-球蛋白的電泳結(jié)果顯示其分離的較為純凈。

六、注意事項

1、上樣前要將使用過的柱子重生。

2、上樣時要注意3個相切：緩沖液與柱床表面相切；樣品與柱床表面相切；洗樣時緩

沖液與柱床表面相切。

3、用瓊脂糖封膠時一定要封延時，防止漏膠。

4、配膠時要按照順序加樣，配完后要立刻混勻。

5、剝膠時要在水沖洗的情況下進行。