第一篇：基因工程技術(shù)應(yīng)用綜述

綜述

----基因工程技術(shù)應(yīng)用

摘要:從 20 世紀(jì) 70 年代初發(fā)展起來(lái)的基因工程技術(shù)，經(jīng)過(guò) 30 多年來(lái)的進(jìn)步與發(fā)展，已成為生物技術(shù)的核心內(nèi)容。許多科學(xué)家預(yù)言，生物學(xué)將成為21世紀(jì)最重要的學(xué)科，基因

工程及相關(guān)領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)將成為21世紀(jì)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一。因工程研究和應(yīng)用范圍涉及農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥、能源、環(huán)保等許多領(lǐng)域。

關(guān)鍵詞:基因工程技術(shù)；現(xiàn)狀；發(fā)展；應(yīng)用；存在問(wèn)題

基因工程應(yīng)用于植物方面從20世紀(jì)80年代每個(gè)科學(xué)家獲得第一株轉(zhuǎn)基因植物到現(xiàn)在的十

幾年時(shí)間內(nèi)，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的發(fā)展日新月異，大量的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入了大田試驗(yàn)，有不少轉(zhuǎn)

基因作物被批準(zhǔn)進(jìn)入商品化生產(chǎn)。農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的研究主要集中在美國(guó)、加拿大和歐洲的一

些發(fā)達(dá)國(guó)家以及南美和亞洲的一些國(guó)家。從1987年到1999年1月，美國(guó)共批準(zhǔn) 4779 項(xiàng)基

因工程作物進(jìn)入大田試驗(yàn)。從基因工程作物大田試驗(yàn)的種類(lèi)來(lái)看，試驗(yàn)次數(shù)最多的是抗除草

劑的基因作物，其次是抗病蟲(chóng)害的農(nóng)作物；從作物品種來(lái)看，已經(jīng)進(jìn)入大規(guī)模測(cè)試的農(nóng)作物

有玉米、土豆、番茄、大豆、棉花、瓜類(lèi)，水稻、小麥等已進(jìn)入中型規(guī)模的大田 試驗(yàn)。至 1999

年，轉(zhuǎn)基因玉米、番茄、土豆、棉花、大豆等均已批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球消費(fèi)的農(nóng)

產(chǎn)品中，大豆的 60%、棉花的 40%、玉米的 30%都是經(jīng) 過(guò)基因工程改造過(guò)農(nóng)業(yè)領(lǐng)域是目前

轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域之一。農(nóng)作物生物技術(shù)的目的是提高作物產(chǎn)量，改善品質(zhì)，增強(qiáng)作物抗逆性、抗病蟲(chóng)害的能力。基因工程在這些領(lǐng)域已取得了令人矚目的成就。由于植

物病毒分子生物學(xué)的發(fā)展，植物抗病基因工程也也已全面展開(kāi)。自從發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒(TMV)的外殼蛋 白基因?qū)霟煵葜校谵D(zhuǎn)基因植株上明顯延遲發(fā)病時(shí)間或減輕病害的癥狀，通過(guò)

導(dǎo)入植物病毒外殼蛋白來(lái)提高植物抗病毒的能力，已用多種植物病毒進(jìn)行了試 驗(yàn)。在利用

基因工程手段增強(qiáng)植物對(duì)細(xì)菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大進(jìn)展。植物對(duì)逆境的抗性

一直是植物生物學(xué)家關(guān)心的問(wèn)題。由于植物生理學(xué)家、遺 傳學(xué)家和分子生物學(xué)家協(xié)同作戰(zhàn)，耐澇、耐鹽堿、耐旱和耐冷的轉(zhuǎn)基因作物新品 種(系)也已獲得成功。植物的抗寒性對(duì)其生

長(zhǎng)發(fā)育尤為重要。科學(xué)家發(fā)現(xiàn)極地的 魚(yú)體內(nèi)有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增長(zhǎng)，從而免

受低溫的凍害并正常地生活 在寒冷的極地中。將這種抗凍蛋白基因從魚(yú)基因組中分離出來(lái)，導(dǎo)入植物體可獲 得轉(zhuǎn)基因植物。隨著生活水平的提高，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注口味、口感、營(yíng)養(yǎng)

成分、欣賞價(jià)值等品質(zhì)性狀。實(shí)踐證明，利用基因工程可以有效地改善植物的品質(zhì)，而 且

越來(lái)越多的基因工程植物進(jìn)入了商品化生產(chǎn)領(lǐng)域，近幾年利用基因工程改良作 物品質(zhì)也取

得了不少進(jìn)展, 如美國(guó)國(guó)際植物研究所的科學(xué)家們從大豆中獲取蛋白 質(zhì)合成基因，成功地

導(dǎo)入到馬鈴薯中，培育出高蛋白馬鈴薯品種，其蛋白質(zhì)含量接近大豆，大大提高了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，得到了農(nóng)場(chǎng)主及消費(fèi)者的普遍歡迎。在花色、花香、花姿等性狀的改良上也作了大量的研究。

基因工程應(yīng)用于醫(yī)藥方面目前基因工程應(yīng)用于醫(yī)藥方面。以基因工程藥物為主導(dǎo)的基因工

程應(yīng)基因工程應(yīng)用于醫(yī)藥方面用產(chǎn)業(yè)已成為全球發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)之一,發(fā)展前景非常廣闊。

基因工程藥物主要包括細(xì)胞因子、抗體、疫苗、激素和寡核甘酸藥物等。它們對(duì)預(yù)防人類(lèi)的腫瘤、心血管疾病、遺傳病、糖尿病、包括艾滋病在內(nèi)的各種傳染病、類(lèi)風(fēng)濕疾病等有重要

作用。在很多領(lǐng)域特別是疑難病癥上，基因工程工程藥物起到了傳統(tǒng)化學(xué)藥物難以達(dá)到的作

用。我們最為熟悉的干擾素(IFN)就是一類(lèi)利用基因工程技術(shù)研制成的多功能細(xì)胞因子，在臨床上已用于治療白血病、乙肝、丙肝、多發(fā)性硬化癥和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種疾病。目前，應(yīng)用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中試，并進(jìn)入臨床驗(yàn)證階段；專(zhuān)門(mén)用于治療腫瘤的“腫瘤基因?qū)棥币矊⒃诓痪猛瓿裳兄疲捎心康牡貙ふ也⑺滥[瘤，將使癌癥的治愈成為可能.由中國(guó)、美國(guó)、德國(guó)三國(guó)科學(xué)家及中外六家研究機(jī)構(gòu)參與研制的專(zhuān)門(mén)用于治療乙肝、慢遷肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的體細(xì)胞基因生物注射劑，最終解決了從剪切、分離到吞食肝細(xì)胞內(nèi)肝炎病毒，修復(fù)、促進(jìn)肝細(xì)胞再生的全過(guò)程。經(jīng) 4 年臨床試驗(yàn)已在全國(guó) 面向肝炎患者。此項(xiàng)基因?qū)W研究成果在國(guó)際治肝領(lǐng)域中，是繼干擾素等藥物之后的一項(xiàng)具有革命性轉(zhuǎn)變的重大醫(yī)學(xué)成果。

基因工程應(yīng)用于環(huán)保方面.工業(yè)發(fā)展以及其它人為因素造成的環(huán)境污染已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了自然界微生物的凈化能力，已成為人們十分關(guān)注的問(wèn)題。基因工程技術(shù)可提高微生物凈化環(huán)境的能力。美國(guó)利用 DNA 重組技術(shù)把降解芳烴、多環(huán)芳烴、脂肪烴的 4 種菌體基因鏈接，轉(zhuǎn)移到某一菌體中構(gòu)建出可同時(shí)降解 4 種有機(jī)物的“超級(jí)細(xì)菌”，用之清除石油污染，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可將水上浮油中的 2/3 烴類(lèi)降解完，而天然菌株需 1 年之久。也有人把 Bt 蛋白基因、球形芽孢桿菌表達(dá)成功。它能釘死蚊蟲(chóng)與害蟲(chóng)，而對(duì)人畜無(wú)害，不污染環(huán)境。現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出的基因工程菌有凈化農(nóng)藥的 DDT 的細(xì)菌、降解水中的染料、環(huán)境中有機(jī)氯苯類(lèi)和氯酚類(lèi)、多氯聯(lián)苯的工程菌、降解土壤中的 TNT 炸藥的工程菌及用于吸附無(wú)機(jī)有毒化合物(鉛、汞、鎘等)的基因工程菌及植物等。90 年代后期問(wèn)世的 DNA 改 組技術(shù)可以創(chuàng)新基因，并賦予表達(dá)產(chǎn)物以新的功能，創(chuàng)造出全新的微生物，如可 將降解某一污染物的不同細(xì)菌的基因通過(guò) PCR 技術(shù)全部克隆出來(lái)，再利用基因重組技術(shù)在體外加工重組，最后導(dǎo)入合適的載體，就有可能產(chǎn)生一種或幾種具有 非凡降解能力的超級(jí)菌株，從而大大地提高降解效率。

前景展望。由于基因工程運(yùn)用 DNA 分子重組技術(shù)，能夠按照人們預(yù)設(shè)的前景展望的設(shè)計(jì)創(chuàng)造出許多新的遺傳結(jié)合體，具有新奇遺傳性狀的新型產(chǎn)物，增強(qiáng)了人們改造動(dòng)植物的主觀能動(dòng)性、預(yù)見(jiàn)性。而且在人類(lèi)疾病的診斷、治療等方面具有革命性的推動(dòng)作用，對(duì)人口素質(zhì)、環(huán)境保護(hù)等作出具大貢獻(xiàn)。所以,各國(guó)政府及一些大公司都十分重視基因工程技術(shù)的研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用，搶奪這一高科技制高點(diǎn)。其應(yīng)用前景十分廣闊。我國(guó)基因工程技術(shù)尚落后于發(fā)達(dá)國(guó)家，更應(yīng)當(dāng)加速發(fā)展，切不可坐失良機(jī)。但是，任何科學(xué)技術(shù)都是一把“雙刃劍”，在給人類(lèi)帶來(lái)利益 的同時(shí),也會(huì)給人類(lèi)帶來(lái)一定的災(zāi)難。比如基因藥物，它不僅能根治遺傳性疾病、惡性腫瘤、心腦血管疾病等，甚至人的智力、體魄、性格、外表等亦可隨意加以改造；還有，克隆技術(shù)如果不加限制，任其自由發(fā)展，最終有可能導(dǎo)致人類(lèi)的毀滅。還有，盡管目前的轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物還未發(fā)現(xiàn)對(duì)人類(lèi)有什么危害，但不等于說(shuō)轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物就是十分安全的，畢竟這些東西還是新生事物，需要實(shí)踐慢慢地檢驗(yàn)。轉(zhuǎn)基因生物和常規(guī)繁殖生長(zhǎng)的品種一樣，是在原有品種的基礎(chǔ)上對(duì)其部分性狀進(jìn)行修飾或增加新性狀，或消除原來(lái)的不利性狀，但常規(guī)育種是通過(guò)自然選擇，而且是近緣雜交，適者生存下來(lái)，不適者被淘汰掉。而轉(zhuǎn)基因生物遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了近緣的范圍，人們對(duì)可能出現(xiàn)的新組合、新性狀會(huì)不會(huì)影響人類(lèi)健康和環(huán)境，還缺乏知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，按目前的科學(xué)水平還不能完全精確地預(yù)測(cè)。所以，我們要在抓住機(jī)遇，大力發(fā)展基因工程技術(shù)的同時(shí)，需要嚴(yán)格管理，充分重視轉(zhuǎn)基因生物的安全性。

我國(guó)基因技術(shù)發(fā)展中存在的問(wèn)題

1、研究開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品跟蹤和模仿國(guó)外的多，自己創(chuàng)新的少。我國(guó)的生物技術(shù)主要是跟蹤國(guó)外而發(fā)展起來(lái)的，基本上是國(guó)外研究開(kāi)發(fā)什么，我們也研究開(kāi)發(fā)什么，因此很少有創(chuàng)新產(chǎn)品。這種狀況在新藥研制中尤為突出。

2、尚未形成社會(huì)化發(fā)展格局。在討論生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展時(shí)，很多人已注意到了所面臨的國(guó)際化問(wèn)題，但卻很少注意社會(huì)化問(wèn)題。由于缺乏社會(huì)化的意識(shí)和氛圍，以及其他各種各樣的原因，我國(guó)新興的一些生物技術(shù)企業(yè)，不少是從研究開(kāi)發(fā)到生產(chǎn)銷(xiāo)售一條道走到底，做得非常辛苦。事實(shí)上，由研究到產(chǎn)品銷(xiāo)售，這中間有許多環(huán)節(jié)都是可以社會(huì)化的。

3、一哄而起、重復(fù)研究、重復(fù)建設(shè)的現(xiàn)象大量存在，導(dǎo)致研究力量十分分散。現(xiàn)在國(guó)內(nèi)搞農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究的單位很多，有農(nóng)業(yè)科學(xué)院系統(tǒng)、中科院系統(tǒng)、高校系統(tǒng)，還地方單位等，但大多數(shù)是低水平重復(fù)。

4、是缺乏產(chǎn)業(yè)化的接軌機(jī)制。國(guó)外的經(jīng)驗(yàn)表明，高新技術(shù)只有通過(guò)資本市場(chǎng)的商業(yè)運(yùn)作才能加速它的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。而國(guó)內(nèi)很少有公司參與基因技術(shù)的研究與成果轉(zhuǎn)化，使基因成果的研究與開(kāi)發(fā)受到很大影響。

5、軟件建設(shè)與硬件不配套，導(dǎo)致資源的效益得不到充分的發(fā)揮。企業(yè)的軟件主要有兩個(gè)方面，一是各種管理規(guī)范，二是人員的素質(zhì)，二者缺一不可。生物制藥作為高技術(shù)產(chǎn)業(yè)，不僅對(duì)硬件設(shè)備的要求高，對(duì)軟件的要求更高。我國(guó)目前的現(xiàn)狀是先進(jìn)的儀器設(shè)備大多從國(guó)外進(jìn)口，而人員及由人員制訂的規(guī)章制度卻是土生土長(zhǎng)的，二者不配套的直接后果就是產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差，硬件資源浪費(fèi)嚴(yán)重。

參考文獻(xiàn):1樓士林，楊盛昌，龍敏南，等.基因工程[M].北京：科學(xué)出 版社，2002.2李慶軍，董艷桐，施冰.植物抗蟲(chóng)基因的研究進(jìn)展[J].林業(yè)科技,2002CHU Qi-ren, CAO Hua-xin, FAN Hui-qin, et al..Preliminary report on transienexpression of gus gene in transgene rice protoplast-derived calli via PEG-mediated DNA transformation［J］.shanghai nongye xue bao,1995

4.（日）內(nèi)宮博文編著；孫崇榮，李育慶譯 :1987植物基因工程技術(shù), 1987

5.基因克隆技術(shù)在制藥中的應(yīng)用, 2004

6.丁勇等編著基因工程與農(nóng)業(yè)1994.07

第二篇：基因工程技術(shù)在廢水處理中的應(yīng)用

基因工程技術(shù)在廢水處理中的應(yīng)用

李孟 廖改霞

（武漢理工大學(xué)市政工程系，湖北 武漢 430070）

【摘要】基因工程技術(shù)是在DNA分子水平上按照人們的意愿進(jìn)行的定向改造生物的新技術(shù)。利用基因工程技術(shù)提高微生物凈化環(huán)境的能力是用于廢水治理的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。本文介紹了基因工程技術(shù)的原理、特點(diǎn)和主要研究?jī)?nèi)容，重點(diǎn)闡述了基因工程技術(shù)在廢水處理中的應(yīng)用,并對(duì)其研究方向作了展望。關(guān)鍵詞：基因工程 技術(shù) 廢水處理 應(yīng)用

The application of gene engineering technique to wastewater treatment

Li Meng

Liao Gaixia(Department of Municipal Engineering, Wuhan University of Technology, Hubei Wuhan 430070)Abstract: Gene engineering technique was the new technique for modifying living beings according to human wishes on the DNA molecular level and the key technique for wastewater treatment by improving the purifying environment ability of microbes.The paper introduced the principle, characteristic, main research content of gene engineering technique, emphasized on formulating the application of gene engineering technique in wastewater treatment, and discussed its research orientation in the end.Key words: gene engineering

technique

wastewater treatment

application

利用基因工程技術(shù)提高微生物凈化污染物的能力是現(xiàn)代生物技術(shù)用于廢水治理的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。20世紀(jì)50年代初,由于分子生物學(xué)和生物化學(xué)的發(fā)展,對(duì)生物細(xì)胞核中存在的脫氧核糖核酸(DNA)的結(jié)構(gòu)和功能有了比較清晰的闡述。20世紀(jì)70年代初實(shí)現(xiàn)了DNA重組技術(shù),逐步形成了以基因工程為核心內(nèi)容,包括細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程的生物技術(shù)。這一技術(shù)發(fā)展到今天,正形成產(chǎn)業(yè)化并列為世界領(lǐng)先專(zhuān)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域之一,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、能源和國(guó)防等許多部門(mén),并日益顯示出其巨大的潛力,將為世界面臨的水污染等問(wèn)題的解決提供廣闊的應(yīng)用前景[1]。基因工程技術(shù)概述

基因工程技術(shù)是一種按照人們的構(gòu)思和設(shè)計(jì),在體外將一種生物的個(gè)別基因插入病毒、質(zhì)粒或其他載體分子,構(gòu)成遺傳物質(zhì)的重組,然后導(dǎo)入到原先沒(méi)有這類(lèi)分子的受體細(xì)胞內(nèi)，能持續(xù)穩(wěn)定地進(jìn)行無(wú)性繁殖,使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá),產(chǎn)生出人類(lèi)所需要的基因產(chǎn)品的操作技術(shù)。基因工程技術(shù)是一項(xiàng)極為復(fù)雜的高新生物技術(shù),它具有高效、經(jīng)濟(jì)、清潔、低耗、可持續(xù)發(fā)展、預(yù)見(jiàn)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)[2]。一個(gè)完整的基因工程技術(shù)流程一般包括目的基因的獲得、載體的制備、目的基因與載體的連接、基因的轉(zhuǎn)移、陽(yáng)性克隆的篩選、基因的表達(dá)、基因工程產(chǎn)品的分離提純等過(guò)程[1]。基因工程技術(shù)在廢水處理中的應(yīng)用

基因工程技術(shù)應(yīng)用于廢水處理是水處理領(lǐng)域一項(xiàng)具有廣泛應(yīng)用前景的新興技術(shù)。常規(guī)的廢水處理方法有物化法、生物法等。由于一般的物化方法只是污染物的轉(zhuǎn)移，不能從根本上治理，且容易造成二次污染，成本也較高，生物法逐漸成為廢水處理的主要方法。但是由于廢水的多樣性及其成分的復(fù)雜性，自然進(jìn)化的微生物降解污染物的酶活性往往有限，如果能利用基因工程技術(shù)對(duì)這些菌株進(jìn)行遺傳改造，提高微生物酶的降解活性，并可大量繁殖，就可以定向獲得具有特殊降解性狀的高效菌株，方便有效地應(yīng)用于水污染處理。因此，構(gòu)建基因工程菌成為現(xiàn)代廢水處理技術(shù)的一個(gè)重要研究方向，且日益受到人們的重視。

2.1 利用基因工程菌富集廢水中的重金屬離子

近幾十年來(lái),經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展導(dǎo)致各種有毒、有害金屬污染物,經(jīng)生產(chǎn)和使用過(guò)程中的各種渠道進(jìn)入環(huán)境。高穩(wěn)定性和高脂溶性使其在環(huán)境中具有停留時(shí)間長(zhǎng)、能沿著食物鏈富集等特點(diǎn),嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康和生存。隨著國(guó)家對(duì)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)的要求日益嚴(yán)格,單純使用傳統(tǒng)生物法處理這類(lèi)重金屬?gòu)U水在適應(yīng)性和高效性等方面存在局限性。針對(duì)這一問(wèn)題,一些新型生物處理技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生,其中利用基因工程菌代替普通微生物處理重金屬是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。此法采用生物工程技術(shù)將微生物細(xì)胞中參與富集的主導(dǎo)性基因?qū)敕敝沉?qiáng)、適應(yīng)性能佳的受體菌株內(nèi),大大提高了菌體對(duì)重金屬的適應(yīng)性和處理效率。

X.W.Zhao等[3]研究發(fā)現(xiàn),宿主菌在Hg2+濃度為1mg/L的LB培養(yǎng)液中生長(zhǎng)嚴(yán)重受抑,而基因工程菌E.coliJM109在Hg2+濃度為7.4mg/L時(shí)仍能增殖,且Hg2+富集量為2.97mg/g(細(xì)胞干重),去除率達(dá)96%以上。

Carolina Sousa等[4]構(gòu)建了表達(dá)酵母金屬硫蛋白(CUP1)、哺乳動(dòng)物金屬硫蛋白(HMT-1A)和外膜蛋白LamB的融合蛋白的基因工程菌E.coli,該菌種的Cd2+富集能力比原始宿主菌提高15～20倍。K.Kuroda[5]等在釀酒酵母細(xì)胞壁處的凝集素蛋白中表達(dá)了含His的寡肽,增強(qiáng)了酵母對(duì)Cu2+的抗性和吸附能力,其Cu2+富集能力比對(duì)比菌株提高了8倍多。

X.Deng等[6]構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)鎳轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和金屬硫蛋白的基因重組菌E.coliJM10,將其用于處理含鎳廢水的試驗(yàn)研究時(shí),發(fā)現(xiàn)其對(duì)Ni2+的富集能力比原始宿主菌增加了6倍多。

趙肖為等[7]利用基因工程菌E.coli SE5000 對(duì)水體中的鎳離子進(jìn)行富集研究。菌體細(xì)胞對(duì)Ni2+的富集速率很快,富集過(guò)程滿(mǎn)足Langmuir 等溫線模型。經(jīng)基因改造的基因工程菌不僅最大鎳富集容量與原始宿主菌相比增加了4倍多,而且對(duì)pH值的變化呈現(xiàn)出更強(qiáng)的適應(yīng)性。袁建軍等[8]利用構(gòu)建的高選擇型基因工程菌生物富集模擬電解廢水中的汞離子。模擬電解廢水中除含有3.0 mg·L-1的汞離子外, 還含有十種以上的其它金屬離子。實(shí)驗(yàn)表明,與重組菌對(duì)只含汞離子的水溶液的處理結(jié)果比較, 電解廢水中其它組份的存在意外地增大了重組菌富集汞離子的作用速率, 但同時(shí)卻使細(xì)菌的最大汞富集量降低了約30%。

張迎明等[9]利用基因重組技術(shù)構(gòu)建出基因工程菌Staphylococcus aureusATCC6538，該工程菌在IPTG用量為1.00mmol·L-1,誘導(dǎo)時(shí)間為4 h的條件下培養(yǎng)對(duì)鎳離子的富集能力最高。在不同鎳離子濃度時(shí),基因工程菌對(duì)溶液中Ni2+的平衡富集量為11.33mg·g-1,與原始宿主菌相比提高了3倍。對(duì)基因工程菌吸附鎳和鈷的實(shí)驗(yàn)表明,Staphylococcus aureusATCC6538的NiCoT對(duì)鎳具有較高的特異性和富集容量,屬于第Ⅲ類(lèi)鎳鈷轉(zhuǎn)運(yùn)酶。

2.1 利用基因工程菌降解廢水中的有機(jī)污染物

生物處理法是廢水中有機(jī)污染物降解的主要方法，但是部分難降解有機(jī)污染物需要不同降解菌之間的協(xié)同代謝或共代謝等復(fù)雜機(jī)制才能最終得以降解,這無(wú)疑降低了污染物的降解效率。首先,污染物代謝產(chǎn)物在不同降解菌間的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是耗能過(guò)程,對(duì)細(xì)菌來(lái)說(shuō)這是一種不經(jīng)濟(jì)的營(yíng)養(yǎng)方式；其次,某些污染物的中間代謝產(chǎn)物可能具有毒性，對(duì)代謝活性有抑制作用；此外,將不同種屬、來(lái)源的細(xì)菌的降解基因進(jìn)行重組,把分屬于不同菌體中的污染物代謝途徑組合起來(lái)以構(gòu)建具有特殊降解功能的超級(jí)降解菌,可以有效地提高微生物的降解能力[10]。

Satoshi Soda等[11]將基因工程菌P.putidaBH(pSl0-45)接種到SBR反應(yīng)器的活性污泥中,用于處理500mg/L的苯酚廢水,在大大提高苯酚去除率的同時(shí)改善了污泥沉降性能。南京大學(xué)、揚(yáng)子石油化工有限責(zé)任公司、香港大學(xué)、國(guó)家環(huán)保總局南京環(huán)境科學(xué)研究所聯(lián)合完成了跨界融合構(gòu)建基因工程菌處理石化廢水的生物工程技術(shù)。在優(yōu)化調(diào)控技術(shù)的基礎(chǔ)上,該菌株對(duì)二甲苯、苯甲酸、鄰苯二甲酸、4-羧基苯甲醛和對(duì)苯二甲酸的降解率分別高達(dá)86%、94%、99%、97%和94%,比原工藝提高了20%～30%,總有機(jī)碳去除率達(dá)到了94%；污水經(jīng)過(guò)處理后,銅、錳、鋅、硒的濃度符合國(guó)家規(guī)定排放標(biāo)準(zhǔn),生物毒性明顯降低。

劉春等[12]以生活污水為共基質(zhì),考察了基因工程菌在MBR和活性污泥反應(yīng)器中對(duì)阿特拉津的生物強(qiáng)化處理效果,以及生物強(qiáng)化處理對(duì)污泥性狀的影響。結(jié)果表明,基因工程菌在MBR中對(duì)阿特拉津具有很好的生物強(qiáng)化處理效果,阿特拉津平均出水濃度為0.84 mg/L,平均去除率為95%,最大去除負(fù)荷可以達(dá)到70mg/(L·d)。生物強(qiáng)化的MBR對(duì)生活污水中COD的平均去除率為71%,COD平均出水濃度65mg/L。

陳俊等[13]采用跨界原生質(zhì)融合技術(shù),構(gòu)建基因工程特效菌Fhhh,實(shí)現(xiàn)廉價(jià)工業(yè)化生產(chǎn)Fhhh菌劑,在10m3/d精對(duì)苯二甲酸廢水處理實(shí)驗(yàn)裝置中,容積負(fù)荷率達(dá)到3.0 kg/(L·d)以上,生物負(fù)荷率達(dá)到1.42d-1,出水水質(zhì)達(dá)到國(guó)家一類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),與國(guó)內(nèi)外同類(lèi)裝置相比,生物負(fù)荷率處于先進(jìn)水平。

蔣建東等[14]采用同源重組法成功構(gòu)建了分別含1個(gè)和2個(gè)mpd 基因插入到rDNA位點(diǎn)且不帶入外源抗性的多功能農(nóng)藥降解基因工程菌株CDS2mpd和CDS22mpd。基因工程菌遺傳穩(wěn)定,能同時(shí)降解甲基對(duì)硫磷和呋喃丹。甲基對(duì)硫磷水解酶(MPH)的比活在各生長(zhǎng)時(shí)期均高于原始出發(fā)菌株,比活最高達(dá)6.22mu/μg。

劉智等[15]采用基因工程技術(shù)構(gòu)建出具有耐鹽、降解苯乙酸和水解甲基對(duì)硫磷的功能的基因工程菌H2pKT2MP和H2pBBR2MP,其中H2pBBR2MP水解酶活性與親本菌株甲基對(duì)硫磷降解菌(Pseudomonas putida)DLL2E4相當(dāng),而H2pKT2MP水解酶活性要提高1倍左右。

呂萍萍等[16]研究發(fā)現(xiàn)，克隆有苯降解過(guò)程中的關(guān)鍵基因——甲苯加雙氧酶的基因工程菌E.coli.JM109(pKST11)對(duì)苯具有較高的降解效率和降解速度,應(yīng)用于固定化細(xì)胞反應(yīng)器中效果突出。在較短的水力停留時(shí)間內(nèi),可以將1500mg/L苯降解70%,降解速度為1.11mg/(L·s),延長(zhǎng)水力停留時(shí)間,可以使去除率達(dá)到95%以上。該反應(yīng)器對(duì)高濃度的苯具有突出的處理效果。同時(shí)所得到的產(chǎn)物為環(huán)己二烯雙醇,可以被野生非高效菌W3快速利用。展望

隨著基因工程菌的出現(xiàn),基因工程技術(shù)將不斷應(yīng)用于更多的廢水治理工程中。培養(yǎng)出新的特效物種并進(jìn)一步提高其應(yīng)用效率、降低應(yīng)用成本；運(yùn)用各種相關(guān)技術(shù)加以?xún)?yōu)化組合,尤其是高效、低能耗、易普及的特種微生物與特殊工藝的最佳結(jié)合；加強(qiáng)不同專(zhuān)業(yè)、不同學(xué)科之間的合作,如將毒理學(xué)和微生物學(xué)和環(huán)境工程學(xué)相結(jié)合；從根本上消除污染源,充分協(xié)調(diào)人與自然之間的關(guān)系,充分實(shí)現(xiàn)廢水資源化,引入DNA 擴(kuò)增和其它生物技術(shù)的環(huán)境監(jiān)測(cè)方法等將是基因工程技術(shù)研究的側(cè)重方向。基因工程技術(shù)作為一種新興技術(shù)以極快的速度發(fā)展。以下兩方面的研究將對(duì)水資源保護(hù)有著重要意義。一是對(duì)基因工程菌的深入研究,如基因工程菌對(duì)污染物的代謝途徑、控制目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子基因序列、降解基因表達(dá)的調(diào)控條件的優(yōu)化等方面的研究；二是對(duì)環(huán)境中微生物的習(xí)性及基因工程菌與環(huán)境中微生物和污染物之間的相互作用進(jìn)行研究。目前的研究主要是利用單一的基因工程菌對(duì)污染物進(jìn)行處理,隨著研究的不斷深入,利用多種基因工程菌相結(jié)合對(duì)污染物進(jìn)行處理,將對(duì)水資源保護(hù)起到更為重要的作用。

參考文獻(xiàn)

[1]楊 林,聶克艷,楊曉容,高紅衛(wèi).基因工程技術(shù)在環(huán)境保護(hù)中的應(yīng)用.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2007,20(5):1130 [2]邢雁霞,劉斌鈺.基因工程技術(shù)的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用前景.大同醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校學(xué)報(bào),2006年第3期:48

[3]Zhao, X.W., M.H.Zhou, Q.B.Li, et al.Simultaneous mercury bioaccumulation and cell propagation by genetically engineered Escherichia coli[J].Process Biochemistry,2005, 40(5):1 611-1 616 [4]Carolina,S., K.Pavel,R.Tomas,et al.Metalloadsorption by escherichia colicells displaying yeast and mammalian metallo thioneins anchored to the outer membrane protein lamb[J].Journal of Bacteriology,1998,180(9):2 280-2 284 [5]Kuroda,K.,S.Shibasaki,M.Ueda,et al.Cell surface-engineered yeast displaying a histidine oligopeptide(hexa-His)has enhanced adsorption of and tolerance to heavy metal ions[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2001,57(5—6):697-701 [6]Deng,X.,Q.B.Li,Y.H.Lu,et al.Bioaccumulation of nickel from aqueous solutions by genetically engineered Escherichia coli[J].Water Research,2003,37(10):2 505-2 511 [7]趙肖為,李清彪,盧英華,等.高選擇性基因工程菌E.coli SE5000生物富集水體中的鎳離子.環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào).2004年3月,第24卷,第2期:231-232 [8]袁建軍,盧英華.高選擇性重組基因工程菌治理含汞廢水的研究.泉州師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)).2003年11月,第21卷,第6期:71-72 [9]張迎明,尹華,葉錦韶,等.鎳鈷轉(zhuǎn)運(yùn)酶NiCoT基因的克隆表達(dá)及基因工程菌對(duì)鎳離子的富集.環(huán)境科學(xué), 2007年4月,第28卷,第4期:918-923 [10]郭 楊,王世和.基因工程菌在重金屬及難降解廢水處理中的應(yīng)用.安全與環(huán)境工程.2007年12月,第14卷,第4期:58-59 [11]Satoshi, S., I.Michihiko.Effects of inoculation of a genetically engineered bacterium on performance and indigenous bacteria of a sequencing batch activated sludge process

treating phenol[J].Journal of Fermentation and Bioengineering,1998,86(1):90-96.[12]劉春,黃霞,孫煒,王慧.基因工程菌生物強(qiáng)化MBR工藝處理阿特拉津試驗(yàn)研究.環(huán)境科學(xué),2007年2月,第28卷,第2期:417-421 [13]陳俊,程樹(shù)培,王洪麗,等.基因工程菌在精對(duì)苯二甲酸廢水處理中的應(yīng)用.工業(yè)用水與廢水,2006年2月,37(1):32-35 [14]蔣建東,顧立鋒,孫紀(jì)全,等.同源重組法構(gòu)建多功能農(nóng)藥降解基因工程菌研究.生物工程學(xué)報(bào).2005年11月,21(6):884-891 [15]劉智,洪青,徐劍宏,等.耐鹽及苯乙酸、甲基對(duì)硫磷降解基因工程菌的構(gòu)建.微生物學(xué)報(bào),2003年10月,43(5):554-559 [16]呂萍萍,王慧,施漢昌,等.基因工程菌強(qiáng)化芳香化合物的處理工藝.中國(guó)環(huán)境科學(xué)

2003,23(1)：12-15

第三篇：淺析基因工程技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景發(fā)展

題目：

《生物技術(shù)概論》論文

淺析基因工程技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景發(fā)展

學(xué)號(hào)：

班級(jí)：

姓名：

淺析基因工程技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景發(fā)展

【摘要】從20世紀(jì)70年代初發(fā)展起來(lái)的基因工程技術(shù)，經(jīng)過(guò)30多年來(lái)的進(jìn)步與發(fā)展，已成為生物技術(shù)的核心內(nèi)容。許多科學(xué)家預(yù)言，生物學(xué)將成為21世紀(jì)最重要的學(xué)科，基因工程及相關(guān)領(lǐng)域的產(chǎn)業(yè)將成為21世紀(jì)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一。基因工程研究和應(yīng)用范圍涉及農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥、能源、環(huán)保等許多領(lǐng)域。本文就基因工程的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景分析進(jìn)行綜合闡述。

【關(guān)鍵詞】基因工程技術(shù)；應(yīng)用現(xiàn)狀；前景 1.引言

基因工程技術(shù)是一項(xiàng)極為復(fù)雜的高新生物技術(shù), 它利用現(xiàn)代遺傳學(xué)與分子生物學(xué)的理論和方法, 按照人類(lèi)所需, 用DNA 重組技術(shù)對(duì)生物基因組的結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行人為修飾或改造, 從而改變生物的結(jié)構(gòu)和功能, 使之有效表達(dá)出人類(lèi)所需要的蛋白質(zhì)或人類(lèi)有益的生物性狀。基因工程從誕生至今, 僅有30 年的歷史, 然而, 無(wú)論是在基礎(chǔ)理論研究領(lǐng)域, 還是在生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用方面, 都已取得了驚人的成績(jī)。首先,基因工程給生命科學(xué)自身的研究帶來(lái)了深刻的變化。目前科學(xué)家已完成了多種細(xì)胞器的基因組全序列測(cè)定工作。其次, 基因工程具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值, 能為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)開(kāi)辟新途徑。2.基因工程 2.1概念

基因工程(又稱(chēng)DNA 重組技術(shù)、基因重組技術(shù)), 是20 世紀(jì)70 年代初興起的技術(shù)科學(xué), 是用人工的方法將目的基因與載體進(jìn)行DNA重組, 將DNA 重組體送入受體細(xì)胞, 使它在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯, 獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。這種跨越天然物種屏障, 把來(lái)自任何生物的基因置于毫無(wú)親緣關(guān)系的新的寄主生物細(xì)胞之中的能力, 是基因工程技術(shù)區(qū)別于其他技術(shù)的根本特征。

2.2基因工程研究的內(nèi)容

(1)從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中, 經(jīng)過(guò)酶切消化或PCR 擴(kuò)增等步驟, 分離出帶有目的基因的DNA 片段。(2)在體外, 將帶有目的基因的外源DNA 片段連接到能夠自我復(fù)制并具有選擇記號(hào)的載體分子上, 形成重組DNA分子。

(3)重組DNA 分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞, 并與之一起增殖。

(4)從大量的細(xì)胞繁殖群體中, 篩選出獲得了重組DNA 分子的受體細(xì)胞克隆。

(5)從這些篩選出來(lái)受體細(xì)胞克隆, 提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因, 供進(jìn)一步分析研究使用。

(6)將目的基因克隆到表達(dá)載體上, 導(dǎo)入寄主細(xì)胞, 使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá), 產(chǎn)生出人類(lèi)所需要的物質(zhì)。

3基因工程的廣泛應(yīng)用

3.1基因工程應(yīng)用于植物方面

農(nóng)業(yè)領(lǐng)域是目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域之一。農(nóng)作物生物技術(shù)的目的是提高作物產(chǎn)量，改善品質(zhì)，增強(qiáng)作物抗逆性、抗病蟲(chóng)害的能力。基因工程在這些領(lǐng)域已取得了令人矚目的成就。

由于植物病毒分子生物學(xué)的發(fā)展，植物抗病基因工程也也已全面展開(kāi)。自從發(fā)現(xiàn)煙草花葉病毒(TMV)的外殼蛋白基因?qū)霟煵葜校谵D(zhuǎn)基因植株上明顯延遲發(fā)病時(shí)間或減輕病害的癥狀，通過(guò)導(dǎo)入植物病毒外殼蛋白來(lái)提高植物抗病毒的能力，已用多種植物病毒進(jìn)行了試驗(yàn)。在利用基因工程手段增強(qiáng)植物對(duì)細(xì)菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大進(jìn)展。植物對(duì)逆境的抗性一直是植物生物學(xué)家關(guān)心的問(wèn)題。由于植物生理學(xué)家、遺傳學(xué)家和分子生物學(xué)家協(xié)同作戰(zhàn)，耐澇、耐鹽堿、耐旱和耐冷的轉(zhuǎn)基因作物新品種(系)也已獲得成功。植物的抗寒性對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育尤為重要。科學(xué)家發(fā)現(xiàn)極地的魚(yú)體內(nèi)有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增長(zhǎng)，從而免受低溫的凍害并正常地生活在寒冷的極地中。將這種抗凍蛋白基因從魚(yú)基因組中分離出來(lái)，導(dǎo)入植物體可獲得轉(zhuǎn)基因植物，目前這種基因已被轉(zhuǎn)入番茄和黃瓜中。

隨著生活水平的提高，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注口味、口感、營(yíng)養(yǎng)成分、欣賞價(jià)值等品質(zhì)性狀。實(shí)踐證明，利用基因工程可以有效地改善植物的品質(zhì)，而且越來(lái)越多的基因工程植物進(jìn)入了商品化生產(chǎn)領(lǐng)域，近幾年利用基因工程改良作物品質(zhì)也取得了不少進(jìn)展，如美國(guó)國(guó)際植物研究所的科學(xué)家們從大豆中獲取蛋白質(zhì)合成基因，成功地導(dǎo)入到馬鈴薯中，培育出高蛋白馬鈴薯品種，其蛋白質(zhì)含量接近大豆，大大提高了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，得到了農(nóng)場(chǎng)主及消費(fèi)者的普遍歡迎。在花色、花香、花姿等性狀的改良上也作了大量的研究。

3.2基因工程應(yīng)用于醫(yī)藥方面

目前，以基因工程藥物為主導(dǎo)的基因工程應(yīng)用產(chǎn)業(yè)已成為全球發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)之一，發(fā)展前景非常廣闊。基因工程藥物主要包括細(xì)胞因子、抗體、疫苗、激素和寡核甘酸藥物等。它們對(duì)預(yù)防人類(lèi)的腫瘤、心血管疾病、遺傳病、糖尿病、包括艾滋病在內(nèi)的各種傳染病、類(lèi)風(fēng)濕疾病等有重要作用。在很多領(lǐng)域特別是疑難病癥上，基因工程工程藥物起到了傳統(tǒng)化學(xué)藥物難以達(dá)到的作用。我們最為熟悉的干擾素(IFN)就是一類(lèi)利用基因工程技術(shù)研制成的多功能細(xì)胞因子，在臨床上已用于治療白血病、乙肝、丙肝、多發(fā)性硬化癥和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種疾病。

目前，應(yīng)用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中試，并進(jìn)入臨床驗(yàn)證階段；專(zhuān)門(mén)用于治療腫瘤的“腫瘤基因?qū)棥币矊⒃诓痪猛瓿裳兄疲捎心康牡貙ふ也⑺滥[瘤，將使癌癥的治愈成為可能。由中國(guó)、美國(guó)、德國(guó)三國(guó)科學(xué)家及中外六家研究機(jī)構(gòu)參與研制的專(zhuān)門(mén)用于治療乙肝、慢遷肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的體細(xì)胞基因生物注射劑，最終解決了從剪切、分離到吞食肝細(xì)胞內(nèi)肝炎病毒，修復(fù)、促進(jìn)肝細(xì)胞再生的全過(guò)程。經(jīng)4年臨床試驗(yàn)已在全國(guó)面向肝炎患者。此項(xiàng)基因?qū)W研究成果在國(guó)際治肝領(lǐng)域中，是繼干擾素等藥物之后的一項(xiàng)具有革命性轉(zhuǎn)變的重大醫(yī)學(xué)成果。3.3基因工程應(yīng)用于環(huán)保方面

工業(yè)發(fā)展以及其它人為因素造成的環(huán)境污染已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了自然界微生物的凈化能力，已成為人們十分關(guān)注的問(wèn)題。基因工程技術(shù)可提高微生物凈化環(huán)境的能力。美國(guó)利用DNA重組技術(shù)把降解芳烴、萜烴、多環(huán)芳烴、脂肪烴的4種菌體基因鏈接，轉(zhuǎn)移到某一菌體中構(gòu)建出可同時(shí)降解4種有機(jī)物的“超級(jí)細(xì)菌”，用之清除石油污染，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可將水上浮油中的2/3烴類(lèi)降解完，而天然菌株需1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢桿菌、且表達(dá)成功。它能釘死蚊蟲(chóng)與害蟲(chóng)，而對(duì)人畜無(wú)害，不污染環(huán)境。現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出的基因工程菌有凈化農(nóng)藥的DDT的細(xì)菌、降解水中的染料、環(huán)境中有機(jī)氯苯類(lèi)和氯酚類(lèi)、多氯聯(lián)苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸藥的工程菌及用于吸附無(wú)機(jī)有毒化合物(鉛、汞、鎘等)的基因工程菌及植物等。90年代后期問(wèn)世的DNA改組技術(shù)可以創(chuàng)新基因，并賦予表達(dá)產(chǎn)物以新的功能，創(chuàng)造出全新的微生物，如可將降解某一污染物的不同細(xì)菌的基因通過(guò)PCR技術(shù)全部克隆出來(lái)，再利用基因重組技術(shù)在體外加工重組，最后導(dǎo)入合適的載體，就有可能產(chǎn)生一種或幾種具有非凡降解能力的超級(jí)菌株，從而大大地提高降解效率。4.前景展望

由于基因工程運(yùn)用DNA分子重組技術(shù)，能夠按照人們預(yù)先的設(shè)計(jì)創(chuàng)造出許多新的遺傳結(jié)合體，具有新奇遺傳性狀的新型產(chǎn)物，增強(qiáng)了人們改造動(dòng)植物的主觀能動(dòng)性、預(yù)見(jiàn)性。而且在人類(lèi)疾病的診斷、治療等方面具有革命性的推動(dòng)作用，對(duì)人口素質(zhì)、環(huán)境保護(hù)等作出具大貢獻(xiàn)。所以，各國(guó)政府及一些大公司都十分重視基因工程技術(shù)的研究與開(kāi)發(fā)應(yīng)用，搶奪這一高科技制高點(diǎn)。其應(yīng)用前景十分廣闊。我國(guó)基因工程技術(shù)尚落后于發(fā)達(dá)國(guó)家，更應(yīng)當(dāng)加速發(fā)展，切不可坐失良機(jī)。

但是，任何科學(xué)技術(shù)都是一把“雙刃劍”，在給人類(lèi)帶來(lái)利益的同時(shí)，也會(huì)給人類(lèi)帶來(lái)一定的災(zāi)難。比如基因藥物，它不僅能根治遺傳性疾病、惡性腫瘤、心腦血管疾病等，甚至人的智力、體魄、性格、外表等亦可隨意加以改造；還有，克隆技術(shù)如果不加限制，任其自由發(fā)展，最終有可能導(dǎo)致人類(lèi)的毀滅。還有，盡管目前的轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物還未發(fā)現(xiàn)對(duì)人類(lèi)有什么危害，但不等于說(shuō)轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物就是十分安全的，畢竟這些東西還是新生事物，需要實(shí)踐慢慢地檢驗(yàn)。轉(zhuǎn)基因生物和常規(guī)繁殖生長(zhǎng)的品種一樣，是在原有品種的基礎(chǔ)上對(duì)其部分性狀進(jìn)行修飾或增加新性狀，或消除原來(lái)的不利性狀，但常規(guī)育種是通過(guò)自然選擇，而且是近緣雜交，適者生存下來(lái)，不適者被淘汰掉。而轉(zhuǎn)基因生物遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了近緣的范圍，人們對(duì)可能出現(xiàn)的新組合、新性狀會(huì)不會(huì)影響人類(lèi)健康和環(huán)境，還缺乏知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，按目前的科學(xué)水平還不能完全精確地預(yù)測(cè)。所以，我們要在抓住機(jī)遇，大力發(fā)展基因工程技術(shù)的同時(shí)，需要嚴(yán)格管理，充分重視轉(zhuǎn)基因生物的安全性。

【參考文獻(xiàn)】

[1]樓士林，楊盛昌，龍敏南，等.基因工程[M].北京：科學(xué)出版社，2002.[2]李慶軍，董艷桐，施冰.植物抗蟲(chóng)基因的研究進(jìn)展[J].林業(yè)科技，2002，27(2)：22 26.[3] 陳渝軍, 林晶.基因工程技術(shù)在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用及發(fā)展.藥品評(píng)價(jià),2005, 2(2): 144-145.[4] 童克中.基因及其表達(dá).北京: 科學(xué)出版社, 2001.[5] 朱寶泉.基因工程技術(shù)在醫(yī)學(xué)工業(yè)中的應(yīng)用及進(jìn)展 [6] 方鵬.基因工程應(yīng)用簡(jiǎn)述[ J].遼寧師專(zhuān)學(xué)報(bào).2004.6(2): 29-30.[7] 王俊杰21 世紀(jì)基因工程在腫瘤防治中的應(yīng)用[ J] 2000.6(6):62-67.

第四篇：霉菌的基因工程技術(shù)

霉菌的基因工程技術(shù)

課程：食品生物技術(shù) 專(zhuān)業(yè)： 班級(jí)： 學(xué)號(hào)： 姓名：

完成時(shí)間：2011 年5月26日

霉菌的基因工程技術(shù)

摘要：霉菌在自然界中分布廣泛，與人們的日常生活極為密切。自從弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素以來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)霉菌的研究引起眾多學(xué)者的關(guān)注，本文對(duì)目前霉菌的應(yīng)用現(xiàn)狀作一綜述，并介紹了利用基因工程改良霉菌菌種常用的幾種方法。

關(guān)鍵詞：霉菌 基因工程 菌種改良 應(yīng)用

0前言

霉菌是能引起物種霉變的絲狀真菌的統(tǒng)稱(chēng)，是真菌的一部分。凡是生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上呈絨毛狀、蜘蛛網(wǎng)狀或絮狀菌絲體的菌落，都稱(chēng)之為霉菌。霉菌在自然界中分布非常廣泛，與人們的日常生活極為密切，用途很多，如用于傳統(tǒng)的釀酒、制醬和制作副食品及其他的發(fā)酵食品，并可從中提取藥物、色素等。總之霉菌在農(nóng)業(yè)、紡織、食品、醫(yī)藥、皮革及促進(jìn)自然界的物質(zhì)循環(huán)等方面都起著極為重要的作用。當(dāng)然它對(duì)人類(lèi)也有有害的方面，如可使人、畜、農(nóng)作物患病，使食品、紡織品霉變等。1霉菌的應(yīng)用 1.1抗生素

抗生素是微生物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的能選擇性地抑制其它種微生物生長(zhǎng)和活動(dòng)，甚至殺滅它種微生物的生物活性物質(zhì)。隨著青霉素的發(fā)現(xiàn)和由此研制而成的多種抗生素使人類(lèi)得以治愈傳染病、有效地控制傳染病的流行。除了青霉素，還有許多抗生素來(lái)源于霉菌，例如灰黃霉素、頭孢霉素等。1.2 生物農(nóng)藥

自然界中有很多生物合成的天然物質(zhì)具有農(nóng)藥功能，提取其有效成分加工為農(nóng)藥應(yīng)用,這是制取生物農(nóng)藥的主要途徑。目前包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家還大量應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥，已普遍導(dǎo)致了對(duì)環(huán)境的污染，致使農(nóng)產(chǎn)品安全衛(wèi)生問(wèn)題嚴(yán)重，品種下降，并頻繁危及人類(lèi)身體健康。生物農(nóng)藥有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):能有效的控制害蟲(chóng)，不殺傷天敵，不破壞生態(tài)平衡，不污染環(huán)境，因而有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。目前從霉菌著手尋找生物農(nóng)藥的研究也很深入廣泛，例如：木霉菌是一類(lèi)具有廣譜性、拮抗性生物防治菌。1.3天然色素

食品及化妝品生產(chǎn)領(lǐng)域中都離不開(kāi)色素，但多使用化學(xué)合成色素，其毒性問(wèn)題已逐步引起人們的關(guān)注，國(guó)內(nèi)外在其用量及使用范圍方面均有限制。從生物中提取的天然食用色素?zé)o毒性，食用安全性好，但大多數(shù)因原料來(lái)源少，價(jià)格高限制了其廣泛應(yīng)

用。目前用霉菌生產(chǎn)色素的例子也很多，例如:紅曲霉菌，是用于提取色素最多的霉菌，中國(guó)利用紅曲已有上千年的歷史，用于紅腐乳、酒類(lèi)和其他食品中。1.4抗腫瘤

在霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中還發(fā)現(xiàn)有能抑制缺氧信號(hào)傳遞的小分子物質(zhì)，很多類(lèi)型的人類(lèi)腫瘤細(xì)胞都處在嚴(yán)重缺氧的狀態(tài)下，它們?yōu)榱松妫⒘艘幌盗械募?jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)緩解缺氧。Pladienolides是一類(lèi)由普拉特鏈霉菌 Mer2 11107發(fā)酵產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和缺氧信號(hào)傳遞，它在小鼠異種皮移植入腫瘤的模型中表現(xiàn)出了強(qiáng)大的抗腫瘤效果。可見(jiàn)它有望成為新型的抗腫瘤藥物。1.5具有特殊活性的酶

木霉菌能產(chǎn)生纖維素酶，它可直接作用于纖維素使其斷裂分解為低分子的化合物及葡萄糖等被動(dòng)物所利用，另一方面，纖維素酶可使粗纖維素分解從而可使更多的植物細(xì)胞內(nèi)容物分離出來(lái)，提高了這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化率。此外，木霉菌還可產(chǎn)生半纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、果膠酶，這些酶的共同作用可提高對(duì)碳水化合物、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)的消化吸收率，促進(jìn)吸收[1]。1.6食品發(fā)酵

腐乳是我國(guó)獨(dú)特的傳統(tǒng)發(fā)酵食品之一，系用豆腐坯經(jīng)毛霉菌培養(yǎng)釀制而成。毛霉菌種的質(zhì)量好壞關(guān)系到腐乳的形狀、色澤滋味及理化質(zhì)量，目前經(jīng)過(guò)菌種選育，已獲得一株生長(zhǎng)快速、菌絲旺盛、蛋白酶活性強(qiáng)的毛霉菌株，用它制成的接種劑可用于腐乳和臘八生產(chǎn)，其產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)良、穩(wěn)定[2]。此外，常用于腐乳的霉菌還有黑根霉、米曲霉、紅曲霉等[3]。2基因工程

2.1基因工程的涵義

用酶學(xué)方法，將異源基因與載體DNA在體外進(jìn)行重組，將形成的重組子DNA導(dǎo)入宿體細(xì)胞，使異源基因在宿體細(xì)胞中復(fù)制表達(dá)，從而達(dá)到改造生物品種或性狀，大量生產(chǎn)出人類(lèi)所需要的生物品種和產(chǎn)物。[4]2.2基因工程操作的主要步驟：

（1）采用cDNA文庫(kù)人工合成或PCR擴(kuò)增，分離制取目的基因片段（2）采用核酸限制性?xún)?nèi)切酶Ⅱ同時(shí)剪切目的基因和克隆載體

（3）在T1DNA連接酶的作用下將目的基因與基因載體連接而成重組DNA（4）把重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在一起擴(kuò)增而成克隆子（5）標(biāo)記分析和篩選出獲得重組DNA分子的克隆受體細(xì)胞

（6）進(jìn)一步了擴(kuò)增、轉(zhuǎn)化、表達(dá)，最終生成新的優(yōu)良性狀的菌種或人類(lèi)所需要的產(chǎn)品

2.3基因工程的工具酶

酶在基因工程操作中是不可缺少的工具，在基因工程中應(yīng)用的酶統(tǒng)稱(chēng)為工具酶。要取得所需的目的基因DNA并與載體DNA連接在一起形成DNA重組體，首先要提供限制性?xún)?nèi)切酶和DNA連接酶。此外，還有其他工具酶，如T1多聚核苷酸激酶、堿性磷酸酯酶、核酸酶S1、反向轉(zhuǎn)錄酶和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶等。到目前為止，常用的工具酶已有3000多種。2.4基因工程的載體

目前，在基因工程中應(yīng)用的基因載體主要是質(zhì)粒、病毒和噬菌體。載體的具備以下幾個(gè)性能：

（1）分子較小，可攜帶比較大的ＤＮＡ片段。

（2）能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。

（3）要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn)，但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)。（4）有適合的標(biāo)記，易于選擇。

（5）有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，并且盡可能是高效的表達(dá)。

（6）從安全角度考慮，要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移，僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。3霉菌的基因工程改良 3.1目的基因的制備

3.1.1限制酶法 用限制性?xún)?nèi)切酶消化含有目的基因的外源，使其獲得目的基因,并使之產(chǎn)生粘性或平頭末端 ,以與載體連接。限制酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種類(lèi)型,常用的為Ⅱ型酶 ,因?yàn)樗刑禺愋宰R(shí)別位點(diǎn) ,切口有規(guī)律 ,只要有鎂離子即可激活,且效率極高。

3.1.2cDNA法 由于真核生物的基因中含有非編碼間隔區(qū) ,在原核生物中無(wú)法正常表達(dá) ,必須除去內(nèi)含子。mRNA是經(jīng)轉(zhuǎn) 錄加工過(guò) 的RNA,無(wú)內(nèi)含子 ,在反轉(zhuǎn)錄酶下,以mRNA為模板合成出互補(bǔ)DNA再加上接頭,即可與載體連接。

3.1.3 PCR擴(kuò)增技術(shù)實(shí)際是體外DNA合成放大技術(shù)。其基本原理是依據(jù)細(xì)胞分裂中DNA合成半保留機(jī)制，及在體外DNA分子于同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì) ,人為控制體外合成系統(tǒng)的溫度,使雙鏈變成單鏈。單鏈DNA和人工引物退火。以

及在dNTP存在下 ,耐高溫的DNA 聚合酶使引物沿單鏈模板延升雙鏈DNA高溫變性,低溫退火,適溫延升等三步循環(huán)使DNA 擴(kuò)增。

3.1.4鳥(niǎo)槍法 鳥(niǎo)槍法實(shí)質(zhì)上是采用基因工程手段把染色體DNA用限制性?xún)?nèi)切酶切割，將所有的片段都連接到某種載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中增值。再用適當(dāng)方法來(lái)篩選含該基因的重組體菌落，從重組體細(xì)菌提取DNA，經(jīng)酶切后即可制取該基因。對(duì)真核細(xì)胞基因，因酶切后形成大小不等的成千上萬(wàn)DNA片段，若采用此法則難于篩選出所需要的基因。因此，可采用凝膠電泳、密度梯度離心法或液相層析等方法。先把DNA片段按大小分成幾個(gè)組，然后，在采用鳥(niǎo)槍法分離目的基因。

3.2選擇適當(dāng)?shù)妮d體 載體是用于傳遞外源DNA序列進(jìn)人宿主細(xì)胞,其本身也為DNA分子。

合適的載體有如下要求：必須能 自我復(fù)制。有可克隆位點(diǎn) ,供外源DNA插人。有可供選擇的遺傳標(biāo)記 ,如抗藥性基因、酶基因、營(yíng)養(yǎng)缺陷型等。載體應(yīng)盡量小 ,抗剪切力。表達(dá)型載體應(yīng)具備與宿住基因相應(yīng)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、前導(dǎo)序列。常用的載體有：質(zhì)粒載體、入噬菌體、粘粒、絲狀噬菌體、病毒載體、酵母人工染色體卡粒載體。

3.3目的基因的體外重組

目的基因的體外重組即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來(lái)，得到重新組合后的DNA分子。重組有如下方法：:粘粒末端法 ,且常用雙標(biāo)記法。平頭末端連接法 ,用T4DNA連接法。人工接頭法,其大小應(yīng)為8─12bp。用同聚物接尾法 ,常用cDNA法。

3.3.1粘性末端連接法：當(dāng)載體DNA和目的基因均用同一種限制酶進(jìn)行切斷時(shí)，二者即可帶有相同的粘性末端。如將載體與目的基因混合在一起，二者即可通過(guò)粘性末端進(jìn)行互補(bǔ)粘合，再加入DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。較少的情況下，對(duì)產(chǎn)生的平端也可直接進(jìn)行連接。

3.3.2人工接尾法：即同聚物加尾連接法。當(dāng)載體和目的基因無(wú)法采用同一種限制酶進(jìn)行切斷，無(wú)法得到相同得粘性末端時(shí)，采用此方法。首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的3'-端，如載體上添加一段polyG，則可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通過(guò)堿基互補(bǔ)進(jìn)行粘合，再由DNA連接酶連接。

3.3.3人工接頭連接法：將人工連接器（即一段含有多種限制酶切點(diǎn)的DNA片段）連接到載體和目的基因上，即有可能使用同一種限制酶對(duì)載體和目的基因進(jìn)行切斷，得到可以互補(bǔ)的粘性末端。3.4重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞

重組子構(gòu)建后 ,必須送人宿主細(xì)胞使之發(fā)揮作用 ,常用物理方法、化學(xué)方法和生物方法。其一般過(guò)程為：

（1）將細(xì)菌用CaCl2處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。（2）使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。

（3）目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非常快，在很短的時(shí)間內(nèi)就能獲得大量的目的基因。3.4.1物理方法

3.4.1.1基因槍法 該方法是利用一種物理儀器裝置，將鎢、金等金屬微粒加速?zèng)_擊細(xì)胞，把細(xì)胞擊孔，使目的基因進(jìn)入受體。

3.4.1.2電激法 是利用高壓電脈沖的作用對(duì)原生質(zhì)體或細(xì)胞擊出微孔而使基因轉(zhuǎn)移的一種新方法。

3.4.1.3激光微束法，此方法是利用直徑很小、能量很高的激光微束引起細(xì)胞膜可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下找出合適的細(xì)胞，然后用激光光源代替熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成膜穿孔，處于細(xì)胞周?chē)耐庠碊NA分子隨之進(jìn)入細(xì)胞。

3.1.4.4超聲波法基本原理：是利用低聲強(qiáng)脈沖超聲波的物理作用，擊穿細(xì)胞膜造成通道，使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞。3.4.2化學(xué)方法

3.4.2.1PEG法(聚乙二醇)PEG是細(xì)胞融合劑，它可以使細(xì)胞膜之間或DNA與膜之間形成分子橋，促使相互之間的接觸和粘連；還可以引起膜表面電荷的紊亂，干擾細(xì)胞間的識(shí)別，從而有利于細(xì)胞膜之間的融合和外源DNA進(jìn)入原生質(zhì)體。

3.4.2.2脂質(zhì)體法

脂質(zhì)體是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜結(jié)構(gòu)，可將DNA包在其內(nèi)，并通過(guò)脂質(zhì)體與原生質(zhì)體的融合或由于原生質(zhì)體的吞噬過(guò)程，把外源DNA轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)。3.4.3生物方法

3.4.3.1轉(zhuǎn)化 以質(zhì)粒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程 3.4.3.2轉(zhuǎn)染 以病毒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程 3.4.3.3轉(zhuǎn)導(dǎo) 以噬菌體作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程 3.5重組DNA的篩選與鑒定

基因工程的最終目的是通過(guò)載體將外源基因?qū)牒线m的宿主細(xì)胞中高效表達(dá)，產(chǎn)生有重要價(jià)值的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。

3.5.1克隆基因表達(dá)有三個(gè)條件： ⑴ 基因的編碼區(qū)不能被插入序列中斷

⑵ 基因轉(zhuǎn)錄要有啟動(dòng)子，而啟動(dòng)子必須能被宿主細(xì)胞的RNA聚合酶有效地識(shí)別 ⑶ mRNA必須相當(dāng)穩(wěn)定，并有效地被翻譯，產(chǎn)生的外源蛋白質(zhì)必須不為宿主細(xì)胞的蛋白酶所降解。

3.5.2篩選含重組體的陽(yáng)性菌落的方法：平板篩選、限制酶切圖譜篩選、PCR篩選重組體、原位雜交技術(shù)。

3.5.2.1平板篩選

平板篩選是指利用載體的遺傳性標(biāo)記在平板上直接篩選的方法。具有抗藥性標(biāo)記的載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，能在含抗生素的培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)；未轉(zhuǎn)化的則不能生長(zhǎng)。

(1)插入失活 當(dāng)外源DNA序列插入質(zhì)粒中某一抗藥基因內(nèi)，使該基因失活，轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生長(zhǎng)在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上。

(2)藍(lán)-白篩選 利用藍(lán)色化合物的形成作為指示劑，篩選帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌。當(dāng)外源片段插入到pBS質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)上后會(huì)導(dǎo)致讀碼框架改變,表達(dá)蛋白失活,產(chǎn)生的氨基酸片段失去α-互補(bǔ)能力,含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。而沒(méi)有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生α-互補(bǔ)，在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。

3.5.2.2原位雜交技術(shù)

原位雜交技術(shù)的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè)DNA或RNA互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成專(zhuān)一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測(cè)手段將待測(cè)核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來(lái)。

3.5.2.3限制酶切圖譜篩選

所謂的限制性酶切圖譜法就是對(duì)載體上插入的外源DNA片段進(jìn)行酶切圖譜分析，并以此與目的基因的已知圖譜對(duì)比，因此利用這種方法不僅能區(qū)分重組子與非重組子，而且還能鑒定目的重組子。但這種方法在用于數(shù)千規(guī)模的轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)，工作量極大，實(shí)驗(yàn)成本也高。

4用基因工程獲得抗生素高產(chǎn)菌株的實(shí)例

青霉素G酞化酶活力的提高[5] 青霉素G酞化酶可把青霉素G轉(zhuǎn)化為 6一APA,它是新合成或半合成青霉素的有用原料 ,在抗生素工業(yè)中有著重要作用 ,因大腸桿 菌ATC-CL105菌株可產(chǎn)生青霉素G酞化酶,可將這種酶基因連接于一個(gè)多拷貝質(zhì)粒載體上 ,通過(guò)基因測(cè)量應(yīng)提高青霉素G酞化酶活力水平,用裝配型質(zhì)粒克隆系統(tǒng)進(jìn)行青霉素G酞化酶基因的克隆,ATC-CL105菌株DNA用 ΗindⅢ切開(kāi)并插人裝配型質(zhì)粒上 ,得到由3000個(gè)克隆組成的ATC-CL105的基因文庫(kù),克隆帶有青霉素G酞化酶基因被生物測(cè)試系統(tǒng)選得 ,文庫(kù)的單菌落涂布于含有青霉素G和一株對(duì)6一APA敏感的粘質(zhì)少母氏菌菌株的軟瓊脂上,產(chǎn)生青霉G酞化酶的克隆通過(guò)對(duì)敏感性測(cè)試菌抑制 圈來(lái)識(shí)別 ,篩選文庫(kù)中的 10000個(gè)菌落,獲得一個(gè)陽(yáng)性克隆,把亞克隆青霉素G酞化酶基因轉(zhuǎn)移于PBR322質(zhì)粒上,該質(zhì)粒在每個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增約50個(gè)拷貝,但酞化酶只增產(chǎn)6倍,大腸桿菌中PBR322質(zhì)粒上的克隆青霉素G酞化酶基因在發(fā)酵條件下使用相當(dāng)穩(wěn)定。

參考文獻(xiàn)：

[1]吳裕本,林潘平.某些木霉菌株的產(chǎn)酶高峰及其纖維素酶制劑飼喂兔的試驗(yàn)〔J〕.福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 1994, 23(3)[2]鄧芳席,劉素純.腐乳毛霉菌種選育及產(chǎn)酶條件研究〔J.湖南農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào) 1995,21(1)[3] 潭周進(jìn),喻科,李仲?gòu)?qiáng),等.霉菌腐乳品質(zhì)的影響因素研究〔J.食品與機(jī)械 2002，(2)[4]彭志英主編.食品生物技術(shù)導(dǎo)論.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2010，（9）[5]王獄 ,方金瑞 ·抗生素 科學(xué) 出版社1988,220-111,

第五篇：基因工程技術(shù)在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展

基因工程技術(shù)在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展

吳蘇亞

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，08藥學(xué)一班，042008118）

摘要：基因工程技術(shù)又稱(chēng)基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù),是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ),以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段將不同來(lái)源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖,在體外構(gòu)建雜種DNA分子,然后導(dǎo)入活細(xì)胞,以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品。經(jīng)過(guò)30多年來(lái)的進(jìn)步與發(fā)展,已成為生物技術(shù)的核心內(nèi)容。本文簡(jiǎn)述了近年來(lái)基因工程技術(shù)在制藥技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。其中主要從基因工程制藥和基因工程藥物的治療進(jìn)展兩方面來(lái)呈現(xiàn)基因工程技術(shù)在制藥領(lǐng)域的杰出貢獻(xiàn)以及在整個(gè)生物領(lǐng)域的強(qiáng)大生命力和廣闊的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：基因工程技術(shù)，基因工程制藥，基因工程藥物

Genetic engineering applications in the pharmaceutical sector

and development

Wu Suya Abstract: The genetic engineering technique known as gene splicing and recombinant DNA technology, is based on the theoretical basis of molecular genetics, molecular biology and microbiology, as a means of modern methods of genes from different sources according to pre-designed blueprint, in the in vitro Hybrid DNA molecules into living cells and then to change the genetic characteristics of the original bio, access to new varieties, production of new products.After 30 years of progress and development, has become the core of biotechnology.This paper describes the genetic engineering technology in recent years in the pharmaceutical technology and development.Mainly from the pharmaceutical and genetic engineering, genetic engineering of drugs both to render the treatment of advanced genetic engineering technology in the pharmaceutical field, and outstanding contribution to the field in the biological application of strong vitality and broad prospects.Key words: genetic engineering, genetic engineering, pharmaceuticals, genetic engineering drugs 所謂基因工程是指將所得的目的基因節(jié)基因、載體相結(jié)合，然后將它引進(jìn)受體細(xì)胞，使之進(jìn)行復(fù)制并產(chǎn)生相應(yīng)基因產(chǎn)物的技術(shù)。實(shí)質(zhì)上，基因工程是一種對(duì)不同種類(lèi)生物的DNA進(jìn)行切割和連接，使之形成雜種DNA的技術(shù)。今年來(lái)基因工程技術(shù)在制藥領(lǐng)域發(fā)揮著重大作用。

1、基因工程制藥

基因工程制藥是指按照人們的意圖,將外源基因整合入宿主基因組中,表達(dá)具有生物學(xué)活性的蛋白藥物。1.1大分子的分離

基因大分子的分離主要指質(zhì)粒(plasmid DNA)和基因組DNA的分離。質(zhì)粒分離的常用方法有堿變性抽提法、煮沸法、去污劑裂解法、質(zhì)粒DNA釋放法、酸酚法等。質(zhì)粒在基因工程中最常用來(lái)做成各種克隆載體(cloning vector)或表達(dá)載體(expressionvector)。質(zhì)粒載體還可用于RNA干擾(RNA inter-ference)的研究。基因組DNA的分離通常采用酚-氯仿法、基因文庫(kù)(gene library)、Southern雜交以及PCR擴(kuò)增技術(shù)等。最近又有研究者利用名為chum-RNA的小分子RNA建立非PCR擴(kuò)增的單細(xì)胞cDNA文庫(kù)。1.2聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是一種在體外模擬天然DNA復(fù)制過(guò)程的核酸擴(kuò)增技術(shù)。PCR技術(shù)可分為定性PCR和定量PCR。定性PCR技術(shù)包括:反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)、多重PCR(multiplex PCR)、反向PCR(inverse PCR)、錨定PCR(an-chored PCR)。定量PCR技術(shù)以實(shí)時(shí)PCR(real time PCR)為代表,其基本原理是在PCR反應(yīng)體系中引入熒光標(biāo)記分子,對(duì)每一反應(yīng)時(shí)刻的熒光信號(hào)積累進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),計(jì)算出PCR產(chǎn)物量,或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法得出初始模板量。1.3基因芯片

基因芯片技術(shù)是建立在基因探針和雜交測(cè)序技術(shù)上的一種高效快速的核酸序列分析手段。基因芯片是伴隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的實(shí)施而發(fā)展起來(lái)的前沿生物技術(shù),又稱(chēng)DNA微陣列。它的突出特點(diǎn)是高通量、高集成、微型化和自動(dòng)化。根據(jù)用途不同可分為表達(dá)譜芯片(expression profile chip)、測(cè)序芯片和診斷芯片。其中表達(dá)譜芯片的應(yīng)用最為廣泛,可用于基因功能分析、疾病發(fā)生機(jī)制的探討及藥物研究和篩選。1.4外源基因的表達(dá)

導(dǎo)入宿主細(xì)胞的外源基因,通過(guò)基因表達(dá)得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。根據(jù)宿主細(xì)胞的不同可分為原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。在外源基因表達(dá)時(shí),通常把一個(gè)報(bào)告蛋白的基因與一個(gè)目的蛋白的基因融合在一起,形成融合蛋白,用于目的蛋白的檢測(cè)與純化。常用的報(bào)告蛋白有β-半乳糖苷酶(β-gal-actosidase)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione s-transfer-ase,GST)、綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)以及硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)等。

2、基因工程藥物

基因工程藥物就是先確定對(duì)某種疾病有預(yù)防和治療作用的蛋白質(zhì),然后將控制該蛋白質(zhì)合成過(guò)程的基因取出來(lái),經(jīng)過(guò)一系列基因操作,最后將該基因放入可以大量生產(chǎn)的受體細(xì)胞中去,這些受體細(xì)胞包括細(xì)菌、酵母菌、動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞、植物或植物細(xì)胞,在受體細(xì)胞不斷繁殖過(guò)程中,大規(guī)模生產(chǎn)具有預(yù)防和治療這些疾病的蛋白質(zhì),即基因疫苗或藥物。

基因工程藥物主要包括細(xì)胞因子、抗體、疫苗、激素和寡核甘酸藥物等。它們對(duì)預(yù)防人類(lèi)的腫瘤、心血管疾病、遺傳病、糖尿病、包括艾滋病在內(nèi)的各種傳染病、類(lèi)風(fēng)濕疾病等有重要作用。在很多領(lǐng)域特別是疑難病癥上,基因工程工程藥物起到了傳統(tǒng)化學(xué)藥物難以達(dá)到的作用。2.1類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

腫瘤壞死因子(TNF)a在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)病理性炎癥反應(yīng)中起核心作用，不僅參與了滑膜炎癥反應(yīng)，而且還誘發(fā)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞，故有效地阻斷TNFa對(duì)RA的治療有著重要的臨床意義。目前通過(guò)給予可溶性受體以及通過(guò)TNFa抗體治療等方法可顯著降低TNFa活性，1998年上市的etanercept(Enbrel)是首個(gè)重組人TNF可溶性受體(p75)與人IgGI分子Fc部分結(jié)合的融合蛋白，而2000年批準(zhǔn)的infliximab是首個(gè)治療RA的TNFa抗體，可用于緩解甲氨蝶吟治療無(wú)效的RA病人。2.2心血管疾病

接受經(jīng)皮經(jīng)腔冠脈成形術(shù)的病人雖然于術(shù)前、術(shù)中及術(shù)后給予阿司匹林或肝素等藥物，但急性冠脈綜合征發(fā)生率仍較高，而血小板糖蛋白(oP)nb/Illa受體拮抗劑能有效治療該綜合征，并改善不穩(wěn)定型心絞痛和急性心肌梗死(MI)病人的長(zhǎng)期預(yù)后，除輕微誘發(fā)出血外，未見(jiàn)其它嚴(yán)重不良反應(yīng)。2.3病毒性疾病

干擾素(IFN)臨床廣一泛用于抗病毒感染治療，90年代以來(lái)FoA先后批準(zhǔn)了xFNaZb(IntronA)、IFNaZa(RoferonA)和IFNal(Infergen)用于丙型肝炎治療。目前通過(guò)在IFN結(jié)構(gòu)中加入聚乙二醇(PEG)鏈后產(chǎn)生PEG化IFN，使療效提高。其由IFNa和附著的PEG組成，PEG呈長(zhǎng)毛狀圍繞IFN，使其避開(kāi)人體代謝系統(tǒng)而使藥物代謝延遲，不僅能提高半衰期，達(dá)到1周給藥1次的目的，而且減少血藥濃度的峰谷變化頻率，從而降低不良反應(yīng)。如阿昔單抗起先用于預(yù)防血栓，作為血管成形術(shù)的輔助治療，目前其適應(yīng)證擴(kuò)展至心臟病發(fā)作、不穩(wěn)定型心絞痛及中風(fēng)的治療。2.4糖尿病

與健康人餐后即刻出現(xiàn)的血漿胰島素峰值不同，短效胰島素注射45~120分鐘后會(huì)出現(xiàn)血藥峰值，存在時(shí)滯現(xiàn)象，故糖尿病患者必須餐前30~45分鐘及時(shí)注射胰島素，但每天多次注射產(chǎn)生的不適感使病人順應(yīng)性降低。因此，制備垂組胰島素類(lèi)似物并子找方便的給藥系統(tǒng)成為日前研究熱點(diǎn)。如 2000年批準(zhǔn)的速效胰島素較普通胰島素制劑具有吸收快、起效快、作用時(shí)間短、可餐前立即注射等特點(diǎn)，尤其適合需進(jìn)行嚴(yán)密血糖控制的病人。2.5器官免疫排斥反應(yīng)

目前有daclizumab(Zenapax)和basiliximab(Simulect)等IL一2細(xì)胞表面受體的單抗用于預(yù)防器官移植免疫排斥反應(yīng)。1998年首次在美國(guó)上市的Zenapax能消除被激活的T細(xì)胞，可預(yù)防腎移植后免疫排斥反應(yīng)，且不抑制其他免疫反應(yīng)。與其它抗免疫排斥藥物合用有協(xié)同作用而不會(huì)增加不良反應(yīng)。1998年上市的basiliximab(Simuleet)能抑制IL一2誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖，可使急性排斥反應(yīng)發(fā)生率減少三分之一。從來(lái)源上，Zenapax更近似于天然人抗體，因?yàn)閆enaPax是人源化單抗，而Simulect為人鼠嵌合單抗；從療效上兩者相當(dāng)，Simuleet相對(duì)給藥方便，因?yàn)镾imuleet的tl/2較Zenapax長(zhǎng)。

3、結(jié)語(yǔ) 健康是人類(lèi)永遠(yuǎn)關(guān)注的話題，新世紀(jì)人類(lèi)賴(lài)以防病治病的最好藥物無(wú)疑是基因藥物。人類(lèi)基因組計(jì)劃的成功,使得基因工程成為非常熱門(mén)的話題。基因工程技術(shù)被引入藥學(xué)領(lǐng)域并應(yīng)用于各種研究,從上面的分析可以發(fā)現(xiàn)基因工程技術(shù)在藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用取得了巨大的成績(jī)。相信隨著科技的發(fā)展,制藥技術(shù)的不斷完善,基因工程在藥學(xué)領(lǐng)域會(huì)發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

然而任何科學(xué)技術(shù)都是一把“雙刃劍”,在給人類(lèi)帶來(lái)利益的同時(shí),也會(huì)給人類(lèi)帶來(lái)一定的災(zāi)難。比如基因藥物,它不僅能根治遺傳性疾病、心腦血管疾病等,甚至人的智力、體魄、性格、外表等亦可隨意加以改造。所以，我們要在抓住機(jī)遇,大力發(fā)展基因工程技術(shù)的同時(shí),需要嚴(yán)格管理,充分重視轉(zhuǎn)基因生物的安全性，讓基因工程技術(shù)為人類(lèi)做出更大的貢獻(xiàn)。參考文獻(xiàn)：

[1]Cho NH, Jeong JK, et al·Genotyping of 22 human papillom a virus types by DNA chip in Korean woman: comprison with cytologic diagnosis [J]·Am J O bstet Gynecol, 2003, 188 [2]李軼女,胡英考,沈桂芳,等·轉(zhuǎn)基因植物基因工程疫苗[J]·生物技術(shù)通報(bào), 2002, 2: 11-15 [3]胡晉紅,張立起·基因工程藥物的治療進(jìn)展[J]·國(guó)外醫(yī)學(xué)-合成藥生化藥制劑分冊(cè), 2001, 22(6): 346·

[4]徐國(guó)華·基因工程藥物臨床應(yīng)用分析[J]·藥物生物技術(shù), 2003, 10(5): 336-338·

[5]Tougan T, OkuzakiD, NojimaH.Chum-RNA allows prep-aration of a high-quality cDNA library from a single-celquantity ofmRNA withoutPCR amplification [J].NucleiAcidsResearch, Online, 2008, 36: e92.[6]Haddad F, Qin AX, Giger JM,et al.Potential pitfalls in the accuracy of analysis of natural sense-antisense RNA pairs by reverse transcription-PCR [ J].BMC Biotechnolo-gy, 2007, 7: 21-35 [7]CallejaV, AlcorD, LaguerreM,et al.Intramolecular and Intermolecular Interactions of Protein Kinase B Define Its Activationin vivo[J].PLoS Bio,l 2007, 5: 780-791.[8]Xu XH, Meier-Schellersheim M, Yan JS,et al.Locally controlled inhibitorymechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing [ J].J Cell Bio,l 2007,178: 141-153.[9]Dudda-Subramanya R, Lucchese G, Kanduc D, et al.Clinical ap-plications of DNA microarray analysis.J Exp Ther Oncol, 2003, 3(6): 297-304.[10]江禾,王友群.基因芯片技術(shù)與藥物的研究和開(kāi)發(fā)[J].世界臨床藥, 2008, 29: 104-10 [11]鄧雪柯,殷建華,曹毅.3種5′-RACE技術(shù)的比較與優(yōu)化[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 2: 20-25.[12]李杰芬.從基因表達(dá)調(diào)控水平探討中藥作用機(jī)理的研究.廣州中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994；11（2）；115 [13]謝經(jīng)武.基因工程的應(yīng)用前景.青海師專(zhuān)學(xué)報(bào)，1990；5（2）；138 [14]王嬌.基因工程技術(shù)的現(xiàn)狀和前景發(fā)展.河南化工，003-3467(2010)04-0003-02 [15]謝元昊,胡 豪,譚 睿,等·基因工程技術(shù)與中藥藥效評(píng)價(jià)[J]·中國(guó)天然藥物, 2009,(7)6: 476-480·