第一篇：MTT法總結(jié)

MTT法總結(jié)

一： 所用儀器和試劑

1.所用細(xì)胞

EA.hy926人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞融合細(xì)胞

2.材料

96孔板、離心管、1.5ml滅菌EP管

3.主要試劑

DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（3g碳酸氫鈉、100mg氨芐青霉素、50mg鏈霉素、DMEM高糖培養(yǎng)基）、重組人VEGF、MTT粉末、DMSO、胎牛血清、25%胰蛋白酶

4.主要儀器

超凈操作臺(tái)、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀多功能酶標(biāo)儀CO2培養(yǎng)箱平板離心機(jī)倒置顯微鏡微量振蕩器。

二、實(shí)驗(yàn)過程

1、MTT溶液配制；

250mg MTT溶于50 mL PBS中，待完全溶解后（本次實(shí)驗(yàn)為促進(jìn)溶解，將試劑瓶放入超聲清洗儀中超聲，溶解效果良好，有無負(fù)面作用有待驗(yàn)證），過濾除菌，分裝，-20℃貯存；（MTT應(yīng)避光貯存，用錫箔紙包著）

2、實(shí)驗(yàn)步驟

1、制備單細(xì)胞懸液

將細(xì)胞放在37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞均呈鐮刀狀，分布較密，棄去瓶中原有的培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次，棄去，加入2ml 0.25%胰蛋白酶溶液于37℃培養(yǎng)箱中消化3min，轉(zhuǎn)入刻度離心管中1000rpm離心3min，再加入2ml新鮮完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS）重懸后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)6.81×105cells/ml。

2、鋪板

將重懸后的細(xì)胞稀釋至4×10cells/ml，96孔板中每孔加100ul同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（即不含細(xì)胞，只加培養(yǎng)基），邊緣孔用PBS補(bǔ)齊，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后加待測(cè)物。

3、加不同濃度的VEGF溶液 4

用DMEM+1%FBS培養(yǎng)基將自制的30ug/ml VEGF分別稀釋到：5000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml。

用槍吸出96孔板中原有培養(yǎng)基，加入適量的PBS清洗一次，加入不同濃度的VEGF溶液，每孔100ul，每個(gè)濃度設(shè)置三個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和陽性對(duì)照（含細(xì)胞，及已知有效的avastin溶液）、陰性對(duì)照（含細(xì)胞，但不含所制抗體藥物），放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng)72h后，每孔加入5mg/ml MTT溶液12ul，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后于平板離心機(jī)中離心，之后吸出孔中溶液，加入150ul /孔DMSO溶液，再于微量振蕩器上振蕩10min，之后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)570nm和630nm處的孔板的吸光度值，則每個(gè)孔的吸光度值即為A570減去A630。

第二篇：MTT方法總結(jié)詳解

MTT方法總結(jié)

1.MTT原理

MTT比色法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和增殖的方法，所用的顯色劑是一種能接受氫原子的化合物MTT，原理是，活細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶能將淡黃色的MTT還原為藍(lán)紫色的結(jié)晶formazan(甲瓚）后者的產(chǎn)量與活細(xì)胞數(shù)成正相關(guān)。formazan可用DMSO、無水乙醇或酸化異丙醇等溶解，在酶標(biāo)儀上以波長(zhǎng)490nm和570nm處進(jìn)行比色。所檢測(cè)的OD值的大小可反應(yīng)細(xì)胞代謝活性的強(qiáng)弱。2.優(yōu)點(diǎn)

（1）有靈敏度高，重復(fù)性好，（2）操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速、易自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，（3）而且沒有3H—TdR摻入試驗(yàn)放射性污染，（4）還可以減少如細(xì)胞計(jì)數(shù)法、軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)中的人為性因素 缺點(diǎn)：影響因素多，重復(fù)性較差。MTT有毒性致突變性，操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù) 3.步驟

(1)接種細(xì)胞：用0.25％胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含 10％胎牛血清的RPMI1604培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每 孔5×103~1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200ul。

(2)培養(yǎng)細(xì)胞；將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37℃、5％CO2及濕度條件下，培養(yǎng)4h以上（至細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定）．加藥物干預(yù)24~48h(培養(yǎng)時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵淝?(3)呈色：加MTT時(shí)一定要避光，測(cè)24h細(xì)胞增殖率時(shí)，于加藥干預(yù)20h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20ul，37℃，繼續(xù)孵育4h；測(cè)48h細(xì)胞增值率時(shí)，于加藥干預(yù)44h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20uL，繼續(xù)孵育4h。

終止培養(yǎng)后，對(duì)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，需離心,(2000rpm．15min)；對(duì)貼壁細(xì)胞最好也離心（2000rpm,3min).然后用1mL或3mL注射器小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150uL DMSO振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。

(4)比色：選擇490nm和570nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上調(diào)定各孔收值，記錄結(jié)果。以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生線。4.注意事項(xiàng)

(1)選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，接種前需計(jì)數(shù)，根據(jù)查閱文獻(xiàn)決定不同細(xì)胞的接種個(gè)數(shù)，一般以每 孔5×103~1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200uL。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，對(duì)每一種細(xì)胞都其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。

（2）實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對(duì)照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對(duì)照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對(duì)照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。

(2)避免血清干擾。用含15％胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，高的血清物質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會(huì)試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于l0％胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。

（3）加藥時(shí)，每種藥5個(gè)濃度（每個(gè)濃度相差10倍），一個(gè)濃度設(shè)4個(gè)副孔。（4）設(shè)空白對(duì)照和正常對(duì)照，每塊板設(shè)空白復(fù)孔,內(nèi)加培養(yǎng)液，不含細(xì)胞與藥物，各做4~6個(gè)復(fù)孔，取平均值，主要目的是為了減少培養(yǎng)基含有的酚紅對(duì)比色的影響。每種細(xì)胞設(shè)4~6個(gè)正常對(duì)照孔,含細(xì)胞不含藥物，每孔加樣100μL/孔。（對(duì)照，不含細(xì)胞，含藥物和培養(yǎng)基？）

（5）細(xì)胞鋪板時(shí)，要充分分散，而且要加幾個(gè)孔就重新吹散一次，否則，細(xì)胞濃度就會(huì)不同。（我曾經(jīng)試驗(yàn)過，用后加的孔作試驗(yàn)組與用先加的孔作對(duì)照組，結(jié)果有些差異，也許是我的熟練程度不行！）另外，吹散次數(shù)過多也會(huì)影響細(xì)胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。

（6）培養(yǎng)后，細(xì)胞的培養(yǎng)既要吸干凈，否則，殘留的蛋白會(huì)對(duì)MTT有一定的吸附作用，影響就過準(zhǔn)確性。我使用的是翻轉(zhuǎn)法，將培養(yǎng)液倒掉，這樣做很簡(jiǎn)便，又很快潔。重復(fù)性也不錯(cuò)。

（7）測(cè)吸光度值要有一定的時(shí)間范圍，在測(cè)定是你會(huì)發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移沒空都會(huì)變深些，（這可能是由于MTT在空氣中氧化的結(jié)果，我記不清了，你再找找書，另外，具體時(shí)間我也沒有記清）

（8）陽性藥物的選擇，要選擇經(jīng)典的，有說服力的，又對(duì)你的細(xì)胞有很好的殺傷了力的藥物。別認(rèn)為簡(jiǎn)單，我就曾經(jīng)因?yàn)殛栃运幬镞x擇錯(cuò)誤而重新做試驗(yàn)，慘

痛的教訓(xùn)呀！

（9）如果用96孔板，周圍一圈孔的值由于液體蒸發(fā)和溫度梯度原因，會(huì)誤差很大，盡量不用。

（10）溶解甲臢時(shí)，如果是懸浮細(xì)胞或細(xì)胞貼壁不牢，盡量用酸性SDS溶解，不要棄去培養(yǎng)液，以免細(xì)胞損失。這還要求最后加入藥物和MTT時(shí)，血清濃度低于10%。

6.如何計(jì)算IC50

用抑制率作為Y，加藥濃度的對(duì)數(shù)作為X，進(jìn)行線形回歸，根據(jù)得到的方程求抑制率是50%時(shí)的加藥濃度，也就是IC50。

IC50的計(jì)算和LD50的計(jì)算很相似，可以用SPSS計(jì)算。以劑量為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)（Y）。進(jìn)行回歸分析也可以，即用抑制率作為Y，加藥濃度的對(duì)數(shù)作為X，進(jìn)行線形回歸，根據(jù)得到的方程求抑制率是50%時(shí)的加藥濃度，也就是IC50。但是這有要求：抑制率最好在30-70％之間才能采用回歸，因?yàn)檫@一段幾乎是直線關(guān)系。

我的經(jīng)驗(yàn)是，因?yàn)樗幬锏淖饔猛ǔＪ且粭lS型曲線，在藥物濃度很高或很低的時(shí)候就接近一個(gè)平臺(tái)，所以加藥劑量的選取非常重要，在不知道藥物大概的IC50的時(shí)候，可以各個(gè)劑量之間10倍稀釋，這樣加藥的范圍就比較寬，可以摸索到合適的劑量，如果已經(jīng)有參考的劑量，也可以等倍稀釋。如果你得到的抑制率能夠分布在50%上下各有幾個(gè)點(diǎn)，那么以線形回歸法得到的結(jié)果一般是比較準(zhǔn)確的。

MTT法本身并不是非常準(zhǔn)確，一般要重復(fù)3次，得到的結(jié)果差不多才可信。

MTT大匯總 實(shí)驗(yàn)前應(yīng)明確的問題

1.選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)約有105個(gè)細(xì)胞。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。

2.藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個(gè)比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時(shí)間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時(shí)間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時(shí)間。

3.時(shí)間點(diǎn)的設(shè)定。在不同時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定OD值，輸入excel表，最后得到不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時(shí)候變得平坦了（到了平臺(tái)期）那個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該就是最好的時(shí)間點(diǎn)（因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候的細(xì)胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。

4.培養(yǎng)時(shí)間。200ul的培養(yǎng)液對(duì)于10的4～5次方的增殖期細(xì)胞來說，很難維持68h，如果營(yíng)養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞會(huì)由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48h換液的。

5.MTT法只能測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。做MTT時(shí)，盡量無菌操作，因?yàn)榧?xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的升高。

6.理論未必都是對(duì)的。要根據(jù)自己的實(shí)際情況調(diào)整。

7.實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對(duì)照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對(duì)照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對(duì)照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。

8.避免血清干擾。用含15％胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，高的血清物質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會(huì)試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10％胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。

實(shí)驗(yàn)步驟 貼壁細(xì)胞：

1.收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。

2.5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況

3.5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。

5.終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。

6.每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。

7.同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）

懸浮細(xì)胞：

1）收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 l?g/ml，需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測(cè)物10ul；④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對(duì)照（加100?(儲(chǔ)存液100 1640）。

2）置37℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值）

4）離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值。

5）同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。

MTT的配制

MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4oC避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多,尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對(duì)不能再用了。

MTT有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉.配制MTT時(shí)用用PBS

溶解,也有人用生理鹽水配，60℃水浴助溶。PBS配方: Nacl 8g Kcl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g 調(diào)ph 7.4 定容1L

關(guān)于細(xì)胞的接種(鋪板)

細(xì)胞過了30代以后就不要用了,因?yàn)闋顟B(tài)不好了;培養(yǎng)板要用好的（最好進(jìn)口板），不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實(shí)驗(yàn)。

接種時(shí)最好按照預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出的密度接種, 因?yàn)榧?xì)胞密度在10000/ml左右時(shí)，所測(cè)得的OD值的區(qū)間即細(xì)胞抑制率（或者增值率）的所呈現(xiàn)的線性關(guān)系最好，結(jié)果最可信。如果鋪的太稀細(xì)胞的殺傷不會(huì)很明顯，太密細(xì)胞可能都會(huì)凋亡，因?yàn)榧?xì)胞長(zhǎng)的太快營(yíng)養(yǎng)會(huì)不夠，最后導(dǎo)致死亡。且而細(xì)胞過密或者過少，增殖都會(huì)過快或者過慢，其增值率線性關(guān)系不佳。故而MTT細(xì)胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。

細(xì)胞密度要根據(jù)不同細(xì)胞的特點(diǎn)來定.如果你做的藥品對(duì)細(xì)胞具有刺激作用那么取小點(diǎn)的細(xì)胞濃度，如果你做的藥品對(duì)細(xì)胞具有抑制作用那么取大點(diǎn)的細(xì)胞濃度，這樣與對(duì)照的區(qū)別更明顯，數(shù)據(jù)更好。懸浮細(xì)胞每孔的細(xì)胞數(shù)可達(dá)到105,貼壁細(xì)胞可為103-104.其它的聲音：

1.首先細(xì)胞的接種密度一定不能過大，一般每孔1000個(gè)左右就夠了，我認(rèn)為寧少勿多。尤其是對(duì)于腫瘤細(xì)胞。10000/孔是太高了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現(xiàn)不出的，最佳點(diǎn)板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會(huì)很大。

2.MTT本身就是比較粗的實(shí)驗(yàn)，增殖率10%左右的波動(dòng)都不算奇怪。特別是新手，20％的波動(dòng)也是常見的，所以很可能是技術(shù)原因引起的，特別是種板技術(shù)一定要過關(guān)。

3.我做的是腫瘤細(xì)胞的MTT實(shí)驗(yàn),這種細(xì)胞長(zhǎng)的很快一開始我是用100000/ML的濃度來接種的,結(jié)果細(xì)胞長(zhǎng)的太滿結(jié)果是沒有梯度也沒有線性關(guān)系.后來調(diào)整濃度,用過40000~80000/ML的濃度都做過MTT實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)做的結(jié)果比較好點(diǎn)的是60000~70000/ML的濃度組的.用40000/M的濃度的組,由于細(xì)胞少,藥物作用的梯度還是有,只是沒有很好的線性關(guān)系.還有根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度以及藥物的特性(有時(shí)間依賴性和濃度依賴性的藥物)來確定培養(yǎng)時(shí)間是48小時(shí)還是72小時(shí).注意細(xì)胞懸液一定要混勻，已避免細(xì)胞沉淀下來，導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不等，可以每接幾個(gè)就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管精確得多，但是如果操作不熟，CV會(huì)在8%左右。另外，吹散次數(shù)過多也會(huì)影響細(xì)胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。

首先說說我的一點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)：

1.吹打時(shí)懸液總量不能太多，達(dá)到吸管吸液量的3到4倍，可能比較容易混勻。10ml的離心管里面最好裝3~4ml的懸液：懸液太少容易吹起很多氣泡，懸液太多又不容易吹成單細(xì)胞懸液。。

2.吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量過多的話，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過少，吹打的力度就不夠，吹打就會(huì)不均勻。如果是吸液量1ml多的吸管，總液量在5ml左右為益

3.吸的時(shí)候要在懸液底部，然后提起來一點(diǎn)，但是吹下去的時(shí)候不要離開液面，否則容易吹打出氣泡。

4.吹打次數(shù)100左右，就可以吹打均勻了（有人認(rèn)為加細(xì)胞前吹打30－50次基本就差不多均勻了。加細(xì)胞的時(shí)候每接種2孔反復(fù)吹打3次，每吹打3次后槍頭垂懸與細(xì)胞懸液中5秒鐘，然后再以一定的速度吸取懸液。）

5.向每孔中用槍頭加入細(xì)胞時(shí)不要太快，否則你會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在加入的瞬間會(huì)由于槍頭的沖力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周邊很少，這種不均勻的分散會(huì)產(chǎn)生接觸抑制，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。所以速度不能太快也不能太慢。我習(xí)慣每塊板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回復(fù)3下移動(dòng)，目的是使得細(xì)胞能分散的均勻些。（鋪板技術(shù)是MTT實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，也是基礎(chǔ)，一定要練好。曾經(jīng)有同學(xué)用漩渦振蕩器混勻細(xì)胞，最后細(xì)胞全死了，建議不要采用這種方法混勻細(xì)胞。

加入MTT

個(gè)人認(rèn)為MTT最關(guān)鍵的是你的細(xì)胞數(shù)目和你加入真正起作用的的MTT的適當(dāng)比例，具體細(xì)胞數(shù)目和真正起作用的的MTT之間的關(guān)系確實(shí)不好確定，我認(rèn)為MTT多加一些比少加好一些

MTT的量各家報(bào)道不同，一般是過量的，所以10ul即夠了。如果不使用96孔板，培養(yǎng)基超過100ul，MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振蕩一下讓MTT與培養(yǎng)基混勻，不過這個(gè)應(yīng)該關(guān)系不大。

如加入MTT后都有個(gè)別孔立即變?yōu)樗{(lán)黑色，則污染的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細(xì)胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的

因?yàn)檠逯邪椎鞍讓?duì)大部分的藥物都有結(jié)合效應(yīng)，所以可以單獨(dú)將藥物和MTT加在一起，看會(huì)不會(huì)起反應(yīng)。如果不起反應(yīng)，就不用去除含藥物的培液，直接加MTT即可。

如何清除上清 百家爭(zhēng)鳴：

1.加DMSO前要把液體吸掉，但培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶可能會(huì)吸去，可在這之前先用平板離心機(jī)離心96孔板，2000r，5分鐘，然后吸掉上清(如果是懸浮細(xì)胞，則推薦此法,懸浮細(xì)胞要離心2500rpm×10min.且其做MTT最好用圓底型96孔板,清除上清時(shí)注意不要把下面的結(jié)晶顆粒吸掉,建議各孔吸棄150-160ul即可)。

2.我每次將MTT加入后，再孵育四個(gè)小時(shí)，然后用離心機(jī)離心1000G,5min。但是用槍小心地吸上清，還是會(huì)將一小部分藍(lán)色結(jié)晶吸出。所以還是建議翻轉(zhuǎn)倒扣的方法吧！

3.另外，可以直接將板翻轉(zhuǎn)倒扣（墊幾層濾紙）2－3次，比用―吸‖的辦法更不容易使細(xì)胞脫離出來。可以輕拍，或者傾斜一點(diǎn)幫助吸液，發(fā)現(xiàn)紫色結(jié)晶幾乎沒有肉眼可見的掉脫，但前提是你本身細(xì)胞貼壁要比較牢，半貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞容易脫離。假如藥物作用時(shí)間長(zhǎng)的話，陰性對(duì)照組可能由于細(xì)胞過多而使加入ＭＴＴ后形成的結(jié)晶漂起來，這樣就不能直接倒掉上清。

4.做MTT時(shí)，這一步驟一定要小心，不要采用倒的方式。因?yàn)橘N壁不牢的細(xì)胞會(huì)被倒掉，從而影響OD值。懸浮細(xì)胞，不要翻板，離心后也不要翻板，這個(gè)方法害死人。

5.加完MTT反應(yīng)3－4h后，從培養(yǎng)箱取出96孔板的動(dòng)作要輕柔，避免振蕩結(jié)晶,使其滑落.你可以試著將96孔板傾斜30度角，然后用槍尖慢慢吸，有的細(xì)胞可以用排槍一起吸，有的則要耐心的一個(gè)個(gè)用槍頭吸，槍尖的力度和方向要保證每個(gè)孔都一致。不要讓槍頭接觸到孔底，且一旦傾斜孔板后就不要反復(fù)傾斜放平，這樣也會(huì)使結(jié)晶脫落。

6.用醫(yī)用的注射器加上針頭吸取液體的，吸取時(shí)要把板子斜放，沿著壁吸取就好了！這次MTT我用1ml針頭仔細(xì)吸培養(yǎng)液,覺得比其它方法可靠,一般不會(huì)吸走紫色結(jié)晶.避免清除上清而改進(jìn)的方法

由于一般可離心96孔板的離心機(jī)不好找。既使是貼壁細(xì)胞做MTT時(shí)，用DMSO溶解得到結(jié)果也不好，不是得不到預(yù)期結(jié)果就是可重復(fù)性差。

解決方法1:用以下文獻(xiàn)方法：周建軍等，評(píng)價(jià)抗癌物質(zhì)活性的改良MTT方法，中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，1993，24（10）：455-457

具體方法：

配三聯(lián)溶解液：10%SDS，5%異丁醇，0.012mol/LHCL，蒸餾水溶解。

三聯(lián)溶解液：SDS10g，異丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用雙蒸水溶解配成100ml溶液

操作：在培養(yǎng)板上加一定密度的細(xì)胞懸液，90ul／孔；如需給藥，則再于同時(shí)(懸浮細(xì)胞)或4h后(貼壁細(xì)胞)加入不同濃度的藥物10ul／孔，均設(shè)三復(fù)孔。另外，每塊板上另沒一個(gè)調(diào)零孔(只加培養(yǎng)液，不含細(xì)胞和藥物)。培養(yǎng)2d后，加入MTT溶液20ul／孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后加入上述三聯(lián)液100ul／孔，于37度放置過夜后，用酶標(biāo)儀測(cè)各孔A570值。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)化操作，提高了可靠性。

解決方法2：日本同仁有一種新試劑CCK-8試劑，CCK-8試劑可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)

確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST–8[其化學(xué)名稱為：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲 染料（Formazan dye）。生成的甲 物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。CCK-8試劑中已預(yù)先配入了進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析所需的成分，無需再用緩沖液或培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋；同時(shí)，CCK-8試劑無需任何放射性同位素和有機(jī)溶劑。因此，無需特別的技巧，就可使每一位使用者準(zhǔn)確、快速地得到重現(xiàn)性好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。★優(yōu) 點(diǎn)

1、簡(jiǎn) 便 只需一步即可得到結(jié)果

2、省 時(shí) 毋需預(yù)制，即開即用

3、安 全 毋需放射性同位素和有機(jī)溶劑

4、快 速 省去了溶解除沉操作

5、靈敏度高 靈敏度高于MTT

6、重現(xiàn)性好 步驟少；無損失；結(jié)果準(zhǔn)確

就是比較貴，如果經(jīng)費(fèi)充足，用這個(gè)是不錯(cuò)的。

★進(jìn)行細(xì)胞增殖分析的使用方法:

1、接種細(xì)胞懸液100μl于96孔板內(nèi)，預(yù)先置于37℃，5% CO 2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2、在每個(gè)孔內(nèi)加入10μl的CCK-8試劑。

3、把培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1-4小時(shí)*。

4、在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，參比波長(zhǎng)為600nm或600nm以上。

解決方法3：使用MTS

解決方法4：

加入DMSO

在同一批實(shí)驗(yàn)中最好不要更換DMSO。加DMSO前把孔中液體盡量棄干凈，沒有去掉上清直接加DMSO，一是沉淀會(huì)很難溶解.二培養(yǎng)液的顏色在檢測(cè)時(shí)也能被測(cè)到,會(huì)對(duì)最后結(jié)果造成影響。但前提是不能把細(xì)胞也一起吸掉，因?yàn)檫@樣帶來的誤差要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于培養(yǎng)液沒棄干凈帶來的誤差,所以要在保證細(xì)胞不被吸掉的前提下，盡量把培養(yǎng)液吸掉。如果培養(yǎng)液沒棄干凈，空白孔也要留有等量的培養(yǎng)液，這樣在檢測(cè)時(shí)可以盡量去除培養(yǎng)液的影響，DMSO的量也可為100ul或150ul.1.加了DMSO后用振蕩器輕輕振蕩5－10min, 時(shí)間控制盡量嚴(yán)格一點(diǎn),放置時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)影響結(jié)果,值會(huì)偏大,且結(jié)果不可信.2.加入DMSO后可用排槍反復(fù)抽吸助溶，溶解后盡快檢測(cè)。如果實(shí)驗(yàn)孔不多，建議用此法，因其比振蕩溶解效果好。

3.或放入37度放孵箱15分鐘溶解結(jié)晶。

振蕩是為了讓甲臜溶解，這樣才能更好的測(cè)量吸光度，振蕩96孔板有專的振蕩器，目的:扎破氣泡.有氣泡存在時(shí),由于其對(duì)光的反射與折射作用(酶標(biāo)儀的原理是通過測(cè)定特定波長(zhǎng)透過樣品的吸光度推測(cè)樣品內(nèi)特定物質(zhì)的濃度),會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏移.OD值的測(cè)定

至于測(cè)定波長(zhǎng)的選擇是因顯色溶液而異的，對(duì)于DMSO，溶解后呈紫（紅）色，490nm有最大吸收值,而ATCC公司的MTT試劑盒用的不是DMSO，它的測(cè)定波長(zhǎng)是570。(就如ELISA實(shí)驗(yàn)選用OPD作底物測(cè)定波長(zhǎng)是492，選用TMB顯色液則用450);而對(duì)于SDS和酸化異丙醇，則選用570nm，并且建議以655nm作為參考波長(zhǎng)。

DMSO溶后10分鐘內(nèi)測(cè)，越放顏色越深，而ＳＤＳ做為溶解液測(cè)吸收光值，其值可在三天內(nèi)保持不變.細(xì)胞密度偏大測(cè)出的吸光度也會(huì)偏大，細(xì)胞密度小吸光度也會(huì)偏小；另外跟細(xì)胞狀態(tài)也有關(guān)系，細(xì)胞狀態(tài)不好的話，吸光度值也會(huì)低的；細(xì)胞數(shù)目少，或者是培養(yǎng)的時(shí)間短，OD值也會(huì)偏低。如果各個(gè)孔的孔間差異性特別明顯的話說明有可能存在污染,空白孔的OD值太高，很可能是細(xì)菌污染。

復(fù)孔直接的OD值差別一般應(yīng)在0.1－0.15，差別太大考慮：1.接種細(xì)胞數(shù)不均勻，或是接種太多，應(yīng)保證每孔一致，一般是每孔1000－10000個(gè)。可以細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)后，加入細(xì)胞懸液，再補(bǔ)培養(yǎng)基到預(yù)定體積，并輕輕吹打幾次，使細(xì)胞均勻分布，這樣比直接加入預(yù)定體積的細(xì)胞懸液要好，接種時(shí)應(yīng)加含血清培養(yǎng)基。2.貼壁時(shí)間：18－24h，如果不夠，未懸浮的細(xì)胞會(huì)被吸掉。

一般為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確，每個(gè)濃度可以設(shè)5－6個(gè)復(fù)孔，可以最后統(tǒng)計(jì)時(shí)，可以除去一個(gè)最高值和一個(gè)最低值，或者除去其中數(shù)據(jù)離譜的值，這些離譜數(shù)字的出現(xiàn)與細(xì)胞是否污染，細(xì)胞是否在培養(yǎng)期間死去，是否培養(yǎng)液蒸發(fā)過多，加MTT液是否準(zhǔn)確，在37℃，5％二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育時(shí)間是否一定（1－4小時(shí)）等有密切的關(guān)系，當(dāng)然測(cè)定OD值的儀器工作狀態(tài)是否正常也非常重要！(一般開機(jī)預(yù)熱20min)。

MTT方法的吸收度在0.2～0.8之間誤差較小。這和分析化學(xué)中的ｌａｍｂｅｒｔ-beer定律有關(guān)，對(duì)朗伯-比爾定律的偏離在吸光光度分析中，經(jīng)常出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不呈直線的情況，特別是當(dāng)吸光物質(zhì)濃度較高時(shí)，明顯地看到通過原點(diǎn)向濃度軸彎曲的現(xiàn)象（吸光度軸彎曲)。這種情況稱為偏離朗伯-比爾定律。若在曲線彎曲部分進(jìn)行定量，將會(huì)引起較大的誤差。在吸光光度分析中，儀器測(cè)量不準(zhǔn)確也是誤差的主要來源。任何光度計(jì)都有一定的測(cè)量誤差。這些誤差可能來源于光源不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)條件偶然變動(dòng)，讀數(shù)不準(zhǔn)確等。

在光度計(jì)中，透射比的標(biāo)尺刻度均勻。吸光度標(biāo)尺刻度不均勻。對(duì)于同一儀器，讀數(shù)的波動(dòng)對(duì)透射比為一定值；而對(duì)吸光度讀數(shù)波動(dòng)則不再為定值。吸光度越大，讀數(shù)波動(dòng)所引起的吸光度誤差也越大透射比很小或很大時(shí)，濃度測(cè)量誤差都較大，即光度測(cè)量最好選吸光度讀數(shù)在刻度尺的中間而不落兩端。待測(cè)溶液的透射比T在15%~65%之間，或使吸光度A在0.2~0.8之間，才能保證測(cè)量的相對(duì)誤差較小。當(dāng)A=0.434(或透射比T=36.8%)時(shí)，測(cè)量的相對(duì)誤差最小。

其它的聲音：

1.最好用570nm波長(zhǎng)的濾光片，因?yàn)镸TT在這個(gè)波長(zhǎng)的吸光度是峰值，換句話說靈敏度高。用其它波長(zhǎng)的也有，一般是490nm，但我的經(jīng)驗(yàn)靈敏度降低一半。

2.我們用的BIO-TEK公司的ELx800,一般值在2以下都是可靠的,如果復(fù)孔之間值相差太大就要考慮是否是實(shí)驗(yàn)過程中的誤差.我曾經(jīng)看到園子的有些帖子報(bào)道說OD值大概在0.2-1.2范圍內(nèi)與活細(xì)胞數(shù)有較好的線性關(guān)系，但OD值在0.3-0.9范圍內(nèi)可能更佳，若你的OD值不在這個(gè)范圍內(nèi)則你實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)可能不太合適，應(yīng)調(diào)整你的細(xì)胞數(shù)。

邊緣效應(yīng)

96孔板四周一圈的孔一般只做空白，不養(yǎng)細(xì)胞，否則這四行的數(shù)據(jù)會(huì)偏高或偏低,96孔板在培養(yǎng)箱中，由于濕度不夠，而培養(yǎng)箱由于具有一定的溫度，由于溫度梯度使得邊緣的孔水分蒸發(fā)較快，導(dǎo)致培養(yǎng)基中各種成分濃度變化增大，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)不同。對(duì)于這種現(xiàn)象，要保證培養(yǎng)箱中的濕度，減少開關(guān)培養(yǎng)箱的次數(shù)和時(shí)間。解決方法:將孔板周圍的一圈孔全部不用，影響非常大，而且最外一圈一定要加水、PBS或者培養(yǎng)液，只要能防止蒸發(fā)就可以.關(guān)于如何計(jì)算IC50

(1)改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大劑量

I:lg(最大劑量/相臨劑量)P:陽性反應(yīng)率之和 Pm:最大陽性反應(yīng)率 Pn:最小陽性反應(yīng)率

舉個(gè)例子：各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數(shù)為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 計(jì)算公式： Pm=0.95 Pn=0.06 P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1 lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025 IC50=0.00025

(2)Bliss法:自己查閱書籍

(3)IC50計(jì)算軟件，見下面附件

（4）自己用EXCEL做趨勢(shì)線來求IC50，關(guān)于LD50的方法與此相似！（5）在線求IC50或EC50：http://chiryo.phar.nagoya-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm

結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)值以x±s表示，應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，p<0.05時(shí)為相差顯著，p<0.01時(shí)為相差非常顯著。可以以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生線，專門公式求IC50。或計(jì)算抑制率。細(xì)胞死亡率%=OD對(duì)照組-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組 excel表中可以做兩兩比較的T-test,這個(gè)你可以參考一下；你的數(shù)據(jù)應(yīng)該用多個(gè)樣本均數(shù)的T-test，方差分析也可。用的軟件是SPSS或者SAS。

孔板的重復(fù)利用:

培養(yǎng)板要用好的（最好進(jìn)口板），不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實(shí)驗(yàn)。一般貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用重復(fù)利用的培養(yǎng)板效果不是很好，因?yàn)榕囵B(yǎng)板表層在生產(chǎn)時(shí)涂有一層促進(jìn)細(xì)胞貼壁的物質(zhì)，在清洗后多半會(huì)失去。懸浮或是半懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞還可以。建議不要用太多次，即使是進(jìn)口的板子使用次數(shù)也不要超過3次,底值最好在測(cè)得值的1/3一下。

強(qiáng)烈建議培養(yǎng)板不要重復(fù)使用:

1、泡酸是可以，但是泡完酸的板子很不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)帖壁不好，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢等情況.2、這樣的板子消毒滅菌很不徹底，如果有萬一,則因小失大.3、重復(fù)用的板子洗不干凈在培養(yǎng)過程中易出現(xiàn)雜質(zhì).重復(fù)利用時(shí)

做法1：

洗凈后用2％NaoH浸泡4小時(shí)，再用1％稀鹽酸浸泡4小時(shí)，沖洗15遍，蒸餾水沖洗3遍，烘干，UV照射過夜(紫外2小時(shí)以上消毒即可)

做法2: 泡酸2－4小時(shí)，老師讓我們別超過4小時(shí)，（普通的玻璃儀器是過夜）。撈出，沖洗干凈，烘干后，UV 照射過夜。估計(jì)跟其他收集在一起，鈷60照射消毒.做法3: 1.做完ＭＴＴ后用大水流盡量將板沖凈，然后用洗衣粉水泡幾個(gè)小時(shí)（小心最好讓洗衣粉先化開）。2.用自來水沖凈洗衣粉水，倒扣晾干.3.重鉻酸鉀加濃硫酸配成的酸液中浸泡過夜泡洗液(六小時(shí)以上即可)后自來水洗凈（20次左右）每個(gè)孔都要處理4.用去離子水沖洗3遍，雙蒸水沖洗3遍，烤干5.超凈臺(tái)中紫外線照射2個(gè)小時(shí)左右，就可以用了，不可以高壓。

做法4:

1、測(cè)完值的96孔板甩掉孔內(nèi)培養(yǎng)液，放入超聲中超10-30分鐘，晾干(或烘干)備用。

此步驟可最大程度的洗去污垢及細(xì)胞。

2、每孔加入50-100ul的胰酶(0.05%)，我一般加60ul，加完胰酶后水平振蕩96孔板以使胰酶均勻覆蓋于細(xì)胞表面，室溫下放置至細(xì)胞被消化脫落為止。假如你想消化快一點(diǎn)的話可將96孔板放到37度培養(yǎng)箱內(nèi)(胰酶在37度時(shí)的活力最大)。對(duì)于頑固貼附在壁上的細(xì)胞，此步驟最為有效。

3、甩掉胰酶，自來水下沖洗，晾干(或烘干)備用。

如果不烘干就泡酸，那么96孔板殘留的水分將稀釋酸液，長(zhǎng)期以往泡酸的效果下降。

4、將晾干的96孔板泡酸(中強(qiáng)酸)過夜，撈起后自來水下沖洗10遍；雙蒸水沖洗3遍。三蒸水沖洗3遍。烘干備用。泡酸時(shí)特別注意時(shí)間不要太長(zhǎng)了，否則板子變黃，影響最后的OD值的測(cè)定。

5、做實(shí)驗(yàn)前，96孔板至少在紫外燈下照射30分鐘，但不能長(zhǎng)期照射。紫外線長(zhǎng)期照射可使板變黃，我的兩塊板放在超靜臺(tái)上忘了拿出來，一直照了兩個(gè)星期，等我從超靜臺(tái)上取出板已經(jīng)變成黃色。

注：

1、在實(shí)驗(yàn)中若你測(cè)得某一個(gè)孔的數(shù)值偏高，雖然有很多因素會(huì)導(dǎo)致數(shù)值偏高，但是如果是板底的污點(diǎn)引起的話你可以消除。拿出96孔板擦一擦值偏大孔的板底部，再測(cè)值。你會(huì)發(fā)現(xiàn)孔高的值又會(huì)到正常水平。因?yàn)樵蹅冏鰧?shí)驗(yàn)時(shí)手不可避免的接觸96孔板板底留下痕跡，這些痕跡就會(huì)使吸光度升高。2、96孔板洗的次數(shù)多了，板底自然留下劃痕，這就會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)的不均而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。你不妨在做實(shí)驗(yàn)前測(cè)一次96孔板的值(此值為初值)，實(shí)驗(yàn)測(cè)得的為后值。后值減去初值就接近實(shí)驗(yàn)的真實(shí)值。

第三篇：【整理總結(jié)】關(guān)于MTT實(shí)驗(yàn)總結(jié)--心血啊!

【整理總結(jié)】關(guān)于MTT實(shí)驗(yàn)總結(jié)－－心血啊！

MTT分析法以活細(xì)胞代謝物還原劑3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT噻唑藍(lán)為基礎(chǔ)。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開裂，生成藍(lán)色的formazan結(jié)晶，formazan結(jié)晶的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比（死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。還原生成的formazan結(jié)晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。也可以用DMSO來溶解。

MTT粉末和溶液保存時(shí)都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。實(shí)驗(yàn)的時(shí)候我一般關(guān)閉超凈臺(tái)上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。

MTT

步驟如下：

1：接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔

1000－10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul.2:培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3－5天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）。

3：呈色：培養(yǎng)3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS

配)20ul.繼續(xù)孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。

4：比色：選擇490nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

注意事項(xiàng)：

（1）選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。

（2）避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。

（3）設(shè)空白對(duì)照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。

MTT實(shí)驗(yàn)吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的時(shí)候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計(jì)算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，然后得到50％抑制率時(shí)候的藥品濃度，就是IC50。要點(diǎn)：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點(diǎn)線圖即可！

舉個(gè)例子：各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數(shù)為10，最大濃

度為0.1，抑制率為0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入計(jì)算公式： Pm=0.95 Pn=0.06

P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1 Xm=lg0.1=-1 lgI=lg0.1/0.01=1

lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025 IC50=0.00025

有一個(gè)公式可供參考;lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg 最大劑量 I:lg(最大劑量/相臨劑量)P:陽性反應(yīng)率之和 Pm:最大陽性反應(yīng)率 Pn:最小陽性反應(yīng)率

抑制率=1-加藥組OD值/對(duì)照組OD值

公式中的最大最小陽性反應(yīng)率就是最大最小抑制率例：

用96孔板培養(yǎng)SMMC-7721肝癌做MTT測(cè)細(xì)胞活力,應(yīng)該加多少1640培養(yǎng)基,多少M(fèi)TT和DMSO合適?根據(jù)書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測(cè)定

一般每孔4000個(gè)細(xì)胞為宜，既細(xì)胞濃度在20000個(gè)/ml，MTT加20ul，作用四小時(shí)后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測(cè)吸光值。

一般要低于IC50，避免非調(diào)亡性殺傷的細(xì)胞太多，造成流式細(xì)胞儀檢測(cè)碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用時(shí)間為36h。一般腫瘤細(xì)胞系空白處理的調(diào)亡率應(yīng)低于1%，用藥后一般為5-10%（Annexin V），細(xì)胞周期的亞G0峰比較明顯.呵呵，寫得不錯(cuò)，頂一個(gè)

謝謝樓主辛苦了～

寫的好，謝謝

樓主說細(xì)胞放進(jìn)９６孔板后培養(yǎng)３～５天，這樣好象不行，細(xì)胞經(jīng)過那么長(zhǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)早就長(zhǎng)滿了，會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞之間的生長(zhǎng)抑制，我覺的細(xì)胞再生長(zhǎng)一天就可以了，還有利用酶標(biāo)儀測(cè)定５７０nm處的光密度OD值也可以．

多謝樓主的辛勤勞動(dòng)。

我是新手想做MTT和IC50。請(qǐng)同行多指點(diǎn)

感謝，共同努力！

不錯(cuò),正好用的上.呵呵，貌似不是你的心血？網(wǎng)上到處都是

不錯(cuò)，很有幫助！

我覺得就算網(wǎng)上到處都是,樓主也是將好的經(jīng)驗(yàn)和大家分享,這就是我們園子所倡導(dǎo)的我?guī)腿巳?人人幫我啊!還是要感謝樓主工作的!

八錯(cuò)！

謝謝樓主了

不錯(cuò)不錯(cuò)~辛苦啦

謝謝樓主！

致謝！

要學(xué)習(xí)一下 謝謝LZ

不易！

對(duì)于我這種新人來說真是太好了!我長(zhǎng)本事后也要這樣！嘿嘿 謝謝摟主！

“MTT實(shí)驗(yàn)吸光度最后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系”請(qǐng)問摟主你這是針對(duì)波長(zhǎng)490而言還是對(duì)所有的波長(zhǎng)而言呢 我的測(cè)定值就有1以上的，是不是不對(duì)啊

第四篇：MTT方法總結(jié)

MTT方法總結(jié) 1.MTT原理

MTT比色法是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和增殖的方法，所用的顯色劑是一種能接受氫原子的化合物MTT，原理是，活細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶能將淡黃色的MTT還原為藍(lán)紫色的結(jié)晶formazan(甲瓚）后者的產(chǎn)量與活細(xì)胞數(shù)成正相關(guān)。formazan可用DMSO、無水乙醇或酸化異丙醇等溶解，在酶標(biāo)儀上以波長(zhǎng)490nm和570nm處進(jìn)行比色。所檢測(cè)的OD值的大小可反應(yīng)細(xì)胞代謝活性的強(qiáng)弱。2.優(yōu)點(diǎn)

（1）有靈敏度高，重復(fù)性好，（2）操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速、易自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，（3）而且沒有3H—TdR摻入試驗(yàn)放射性污染，（4）還可以減少如細(xì)胞計(jì)數(shù)法、軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)中的人為性因素

缺點(diǎn)：影響因素多，重復(fù)性較差。MTT有毒性致突變性，操作時(shí)應(yīng)注意防護(hù) 3.步驟

(1)接種細(xì)胞：用0.25％胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含 10％胎牛血清的RPMI1604培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔5×103~1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200ul。(2)培養(yǎng)細(xì)胞；將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，在37℃、5％CO2及濕度條件下，培養(yǎng)4h以上（至細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定）．加藥物干預(yù)24~48h(培養(yǎng)時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵淝?(3)呈色：加MTT時(shí)一定要避光，測(cè)24h細(xì)胞增殖率時(shí)，于加藥干預(yù)20h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20ul，37℃，繼續(xù)孵育4h；測(cè)48h細(xì)胞增值率時(shí)，于加藥干預(yù)44h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20uL，繼續(xù)孵育4h。

終止培養(yǎng)后，對(duì)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，需離心,(2000rpm．15min)；對(duì)貼壁細(xì)胞最好也離心（2000rpm,3min).然后用1mL或3mL注射器小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150uL DMSO振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。

(4)比色：選擇490nm和570nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上調(diào)定各孔收值，記錄結(jié)果。以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生線。注意事項(xiàng)

(1)選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。一般情況下，接種前需計(jì)數(shù)，根據(jù)查閱文獻(xiàn)決定不同細(xì)胞的接種個(gè)數(shù)，一般以每孔5×103~1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200uL。但由于不同細(xì)胞貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，對(duì)每一種細(xì)胞都其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞過滿。這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞數(shù)呈的線性關(guān)系。（2）實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對(duì)照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對(duì)照孔和加藥孔都要加細(xì)胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對(duì)照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。

(2)避免血清干擾。用含15％胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，高的血清物質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會(huì)試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于l0％胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。

（3）加藥時(shí)，每種藥5個(gè)濃度（每個(gè)濃度相差10倍），一個(gè)濃度設(shè)4個(gè)副孔。

（4）設(shè)空白對(duì)照和正常對(duì)照，每塊板設(shè)空白復(fù)孔,內(nèi)加培養(yǎng)液，不含細(xì)胞與藥物，各做4~6個(gè)復(fù)孔，取平均值，主要目的是為了減少培養(yǎng)基含有的酚紅對(duì)比色的影響。每種細(xì)胞設(shè)4~6個(gè)正常對(duì)照孔,含細(xì)胞不含藥物，每孔加樣100μL/孔。（對(duì)照，不含細(xì)胞，含藥物和培養(yǎng)基？）（5）細(xì)胞鋪板時(shí)，要充分分散，而且要加幾個(gè)孔就重新吹散一次，否則，細(xì)胞濃度就會(huì)不同。（我曾經(jīng)試驗(yàn)過，用后加的孔作試驗(yàn)組與用先加的孔作對(duì)照組，結(jié)果有些差異，也許是我的熟練程度不行！）另外，吹散次數(shù)過多也會(huì)影響細(xì)胞活力。所以要熟練鞋、快些上板。（6）培養(yǎng)后，細(xì)胞的培養(yǎng)既要吸干凈，否則，殘留的蛋白會(huì)對(duì)MTT有一定的吸附作用，影響就過準(zhǔn)確性。我使用的是翻轉(zhuǎn)法，將培養(yǎng)液倒掉，這樣做很簡(jiǎn)便，又很快潔。重復(fù)性也不錯(cuò)。

（7）測(cè)吸光度值要有一定的時(shí)間范圍，在測(cè)定是你會(huì)發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移沒空都會(huì)變深些，（這可能是由于MTT在空氣中氧化的結(jié)果，我記不清了，你再找找書，另外，具體時(shí)間我也沒有記清）

（8）陽性藥物的選擇，要選擇經(jīng)典的，有說服力的，又對(duì)你的細(xì)胞有很好的殺傷了力的藥物。別認(rèn)為簡(jiǎn)單，我就曾經(jīng)因?yàn)殛栃运幬镞x擇錯(cuò)誤而重新做試驗(yàn)，慘痛的教訓(xùn)呀！

（9）如果用96孔板，周圍一圈孔的值由于液體蒸發(fā)和溫度梯度原因，會(huì)誤差很大，盡量不用。

（10）溶解甲臢時(shí)，如果是懸浮細(xì)胞或細(xì)胞貼壁不牢，盡量用酸性SDS溶解，不要棄去培養(yǎng)液，以免細(xì)胞損失。這還要求最后加入藥物和MTT時(shí)，血清濃度低于10%。

6.如何計(jì)算IC50 用抑制率作為Y，加藥濃度的對(duì)數(shù)作為X，進(jìn)行線形回歸，根據(jù)得到的方程求抑制率是50%時(shí)的加藥濃度，也就是IC50。

IC50的計(jì)算和LD50的計(jì)算很相似，可以用SPSS計(jì)算。以劑量為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)（Y）。進(jìn)行回歸分析也可以，即用抑制率作為Y，加藥濃度的對(duì)數(shù)作為X，進(jìn)行線形回歸，根據(jù)得到的方程求抑制率是50%時(shí)的加藥濃度，也就是IC50。但是這有要求：抑制率最好在30-70％之間才能采用回歸，因?yàn)檫@一段幾乎是直線關(guān)系。我的經(jīng)驗(yàn)是，因?yàn)樗幬锏淖饔猛ǔＪ且粭lS型曲線，在藥物濃度很高或很低的時(shí)候就接近一個(gè)平臺(tái)，所以加藥劑量的選取非常重要，在不知道藥物大概的IC50的時(shí)候，可以各個(gè)劑量之間10倍稀釋，這樣加藥的范圍就比較寬，可以摸索到合適的劑量，如果已經(jīng)有參考的劑量，也可以等倍稀釋。如果你得到的抑制率能夠分布在50%上下各有幾個(gè)點(diǎn)，那么以線形回歸法得到的結(jié)果一般是比較準(zhǔn)確的。

MTT法本身并不是非常準(zhǔn)確，一般要重復(fù)3次，得到的結(jié)果差不多才可信。

第五篇：mtt數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)一急性毒性試驗(yàn)（改進(jìn)寇氏法）

一、目的與要求

1、學(xué)習(xí)急性毒性試驗(yàn)的方法，掌握LD50的測(cè)定方法。

2、觀察馬錢子的毒性反應(yīng)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

急性毒性試驗(yàn)是指受試動(dòng)物在一次大劑量給藥后所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和死亡情況。藥物毒性的大小，常用動(dòng)物的致死量來表示，因?yàn)閯?dòng)物生與死的生理指標(biāo)較其他指標(biāo)明顯、客觀、容易掌握。致死量的測(cè)定也較準(zhǔn)確。在測(cè)定致死量的同時(shí)，還應(yīng)仔細(xì)觀察動(dòng)物是否出現(xiàn)聳毛、倦臥、耳殼蒼白或充血、突眼、步履蹣跚、肌肉癱瘓、呼吸困難、昏迷、驚厥、大小便失禁等不良反應(yīng)。

致死量的測(cè)定常以半數(shù)致死量為標(biāo)準(zhǔn)。半數(shù)致死量是指能夠引起試驗(yàn)動(dòng)物一半死亡的劑量，媽藥物致死量對(duì)數(shù)值，用符號(hào)LD50表示。由于LD50的測(cè)定較簡(jiǎn)便、可靠，而且穩(wěn)定，現(xiàn)已成為標(biāo)志動(dòng)物急性中毒程度的重要常數(shù)。LD50測(cè)定的方法有多種，如Bliss法、改進(jìn)寇氏法、簡(jiǎn)化機(jī)率單位法、累積插值法、機(jī)率單位-加權(quán)直線加歸法等等。以上方法雖各有特點(diǎn)，但都有共同的要求：

（1）動(dòng)物：均選用體重17～22克健康小鼠（同次試驗(yàn)體重相差不得超過4克），或選用體重120～150克（同次試驗(yàn)體重相差不得超過10克）健康大鼠作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。性別相同或雌雄各半。

（2）給藥途徑：要求采用兩種給藥途徑，其中必須有一種與臨床所采用的相同。溶于水的藥物沿須測(cè)定靜脈注射的LD50。值得提出的是，臨床上雖然不用腹腔注射，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)因腹腔注射給藥方便，吸收迅速，頗為常用。若供試藥物在腹腔內(nèi)不引起強(qiáng)烈刺激或局部變化（如纖維性病變等），那么嚙齒類動(dòng)物腹腔注射的LD50，參數(shù)很接近于靜脈給藥的LD50。口服制劑無法通過注射給藥途徑時(shí)，可只用胃腸給藥。

(3)試驗(yàn)周期和觀察指標(biāo)：給藥后至少觀察7天。觀察期間應(yīng)逐日記錄動(dòng)物的毒性反應(yīng)情況和死亡動(dòng)物的分布。

（4）正式試驗(yàn)前，均須先用少量動(dòng)物進(jìn)行預(yù)試試驗(yàn)，大致測(cè)出受試藥物引起0%和100%死亡率的致死量范圍，然后安排正式試驗(yàn)。正式試驗(yàn)組數(shù)不得少于三個(gè)劑量組，一般選用4～5個(gè)劑量組，每組動(dòng)物數(shù)為10～20只。

（5）報(bào)告LD50時(shí)需注明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬及品系、性別、體重范圍、給藥途徑及每個(gè)劑量組動(dòng)物數(shù)等，還需注明受試藥物的配制方法、給藥劑量、各組劑量間的比值（一般以0.65～0.85為宜）、給藥容積、觀察時(shí)間及計(jì)算方法。還須標(biāo)出LD50的95%可信限。

三、實(shí)驗(yàn)材料和試劑

動(dòng)物：小鼠 藥品：馬錢子水煎液

器材：注射器、灌胃針頭、鼠籠

四、操作方法

1、預(yù)試實(shí)驗(yàn)：預(yù)試實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菫榱苏页鲆饎?dòng)物0%（Dn）和100%（Dm）死亡的劑量，以便安排正式實(shí)驗(yàn)。預(yù)試實(shí)驗(yàn)一般采用少量動(dòng)物（6～9只小鼠）進(jìn)行，將動(dòng)物隨機(jī)分為3組，組間劑量比值一般以1：0.5或1：0.7為宜。灌服或腹腔注射量以0.2ml/10g體重為度。預(yù)試實(shí)驗(yàn)應(yīng)進(jìn)行到找出Dn和Dm后方可安排正式實(shí)驗(yàn)。

2、正式實(shí)驗(yàn)：在預(yù)試實(shí)驗(yàn)測(cè)得Dn和Dm的劑量范圍內(nèi)設(shè)4～6個(gè)劑量組，最多10組。最理想的結(jié)果是使LD50的上下各有2～3組。組數(shù)愈少，準(zhǔn)確性愈差。各劑量組的動(dòng)物要求相等，至少10只動(dòng)物（分組時(shí)應(yīng)注意分層隨機(jī)均勻化的原則）。本實(shí)驗(yàn)要求最大反應(yīng)率為100%，最小反應(yīng)率為0%，或至少反應(yīng)率接近100%或0%。組間劑量比值（1：K），常用1：0.8或1：0.75。如實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)相鄰劑量有重復(fù)的100%和0%反應(yīng)率時(shí)，應(yīng)將靠邊的組棄去不計(jì)，使大劑量組只有一個(gè)100%的反應(yīng)率，小劑量組也只有一個(gè)0%的反應(yīng)率。

分組完畢和各組劑量算出后，分組灌服或注射不同劑量的受試藥物。為能得到理想的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)最好從中間劑量開始，以便從最初幾個(gè)劑量組動(dòng)物接受藥物后的反應(yīng)來判斷兩端劑量是否合適，便于調(diào)整劑量和組數(shù)。為了提高實(shí)驗(yàn)的精確度和節(jié)省藥物，受試藥物可按“低比稀釋法”配置。即使每只動(dòng)物的用藥體積相等（0.2ml/10g），而溶質(zhì)不等。給藥后逐日觀察并記錄中毒反應(yīng)、死亡率和死亡情況。

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄與計(jì)算

馬錢子水煎液對(duì)小鼠死亡率的影響

組別

劑量g/kg(d)2 3 4

Logd(X)

死亡數(shù) 死亡率（P）

P2

P-P2

公式1:（logLD50）X50=Xm-i(ΣP-0.5)

則LD50=log-1 X50

公式2：Sx50=i*(p?p2)/(n?1)公式3：LD50的95%可信限=lg-1（X50±1.96S X50）LD50的平均可信限= LD50±（LD50高限-LD50低限）/2 Xm：最大劑量組劑量的對(duì)數(shù)值

i：相鄰兩組劑量（d）對(duì)數(shù)值之差，或相鄰兩組高劑量與低劑量之比的對(duì)數(shù)。P：各組動(dòng)物的死亡率，用小數(shù)表示。ΣP：為各組動(dòng)物死亡率的總和。n：每組動(dòng)物數(shù)。Sx50：logLD50的標(biāo)準(zhǔn)誤。