第一篇：實驗十四水中總大腸桿菌的測定

實驗十四水中總大腸桿菌的測定

1原理

總大腸桿菌群可用多管發酵法或濾膜法檢測。多管發酵法的原理是根據大腸菌群細菌能發酵乳糖，產酸產氣以及具備革蘭氏染色陰性，無芽孢，呈桿狀等有關特性，通過三個步驟進行檢驗，求得水樣中的總大腸菌群數，實驗結果以最可能數（most probable number），簡稱MPN表示。儀器

2.1 高壓蒸汽滅菌器。

2.2 恒溫培養箱，冰箱。

2.3 生物顯微鏡，載玻片。

2.4 酒精燈，鎳鉻絲接種棒。

2.5 培養皿(直徑100mm)，試管(5×150mm)，小倒管，吸管(1，5，10ml)，燒杯(200，500，2000ml)，錐形瓶(500，1000ml)，采樣瓶。

3培養基及染色劑的制備

3.1乳糖蛋白胨培養液：

將10g蛋白胨、3g牛肉浸膏、3g乳糖和5g氯化鈉加熱溶于1000mL蒸餾水中，調節pH為7.2－7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混勻，分裝于試管（內有倒管）中，于121℃高壓滅菌器中滅菌15min，貯存于冷暗處備用。

3.2三倍濃縮蛋白胨溶液：

按上述乳糖蛋白胨培養液的制備方法制備。除蒸餾水外，各組分用量增加至三倍。

3.3品紅亞硫酸鈉培養基

3.3.1貯備培養基的制備

于2000mL燒杯中，先將20-30g瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，然后加入

3.5g磷酸氫二鉀及10g蛋白胨，混勻，使其溶解，再用蒸餾水補充到1000mL調節溶液pH至7.2-7.4。趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加10g乳糖，混勻，定量分裝于250或500mL

錐形瓶內，置于高壓滅菌器中，在121℃滅菌15min，貯存與冷暗處備用。

3.3.2平皿培養基的制備

將上法制備的貯備培養基加熱融化。根據錐形瓶內培養基的容量，用滅菌吸管按1：50比例吸取5%堿性品紅乙醇溶液，置于滅菌空試管中；再按1：200比例稱取無水亞硫酸鈉，置于另一滅菌空試管內，加滅菌水少許使其溶解，再置于沸水浴中煮沸10min（滅菌）。用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶液內至深紅色再褪至淡紅色為止（不宜加多）。將此混合液全部加入已融化的貯備培養基內，并充分混勻（防止產生氣泡）。立即將此培養基適量（約15mL）傾入已滅菌的平皿內，再冷卻凝固后置于冰箱內備用，但保存時間不宜超過2周。如培養基由淡紅色變成深紅色則不能再用。

3.4伊紅美藍培養基制備

于2000mL燒杯中，先將20g瓊脂加到900mL蒸餾水中，加熱溶解，再加入2g磷酸二氫鉀及10g蛋白胨，混合使之溶解，用蒸餾水補充至1000mL，調節溶液pH值至7.2-7.4，趁熱用脫脂棉或絨布過濾，加入2%伊紅水溶液（0.4g伊紅溶于20mL水中）20ml和0.5%美藍水溶液（0.065g美藍溶于13mL水中）13ml，再加入10g乳糖，混勻后定量分裝于250或500mL錐形瓶內，于121℃高壓滅菌15min，放冷至45℃左右，無菌操作下將此培養基適量傾入已滅菌的空平皿內，待冷卻凝固后，置于冰箱內備用。

3.5革蘭氏染色劑 3.5.1結晶紫染色液：

將20mL結晶紫乙醇飽和溶液（稱取4-8g結晶紫溶于100mL95%乙醇中）和80mL1%草酸銨溶液混合并過濾。該溶液放置過久會產生沉淀，不能再用。

3.5.2助染劑：

將1g碘與2g碘化鉀混合后，加入少許蒸餾水，充分振蕩，待完全溶解后，用蒸餾水補充至300mL。此溶液2周內有效。當溶液由棕黃色變為淡黃色時應棄去。為易于貯備，可將上述碘與碘化鉀溶于30mL蒸餾水中，臨用前再加水稀釋。

3.5.3脫色劑：95%乙醇。

3.5.4復染劑：將0.25g沙黃加到10mL95%乙醇中待完全溶解后，加90mL蒸餾水。4 測定步驟

4.1生活飲用水

4.1.1初發酵實驗：在兩個裝有已滅菌的50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養液的大試管或燒瓶中（內有倒管），以無菌操作加入充分混勻的水樣10mL，混勻后置于37℃恒溫箱內培養24h。

4.1.2平板分離：上述各發酵管經培養24h后，將產酸，產氣及只產酸的發酵管分別接種于伊紅美藍培養基或品紅亞硫酸鈉培養基上，置于37℃培養箱內培養24h，挑選符合下列特征的菌落。

a.伊紅美藍培養基上：深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落：淡紫紅色，中心色較深的菌落。

b.品紅亞硫酸鈉培養基上：紫紅色，具有金屬光澤的菌落；深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紅色，中心顏色較深的菌落。

4.1.3取有上述特特征的群落進行革蘭氏染色 a、用已培養18－24h的培養物涂片，涂層要薄。

b、將涂片在火焰上加溫固定，待冷卻后滴加結晶紫溶液，1min后用水洗去。c、滴加助染劑，1min后用水洗去。

d、滴加脫色劑，搖動玻片，直至無紫色脫落為止（約20－30s），用水洗去。e、滴加復染劑，1min后用水洗去，晾干、鏡檢，呈紫色者為革蘭氏陽性菌，呈紅

色者為陰性菌。

4、復發酵實驗：上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌，則挑選該菌落的另一部分接種于裝有普通濃度乳糖蛋白胨培養液的試管中（內有倒管），每管可接種分離自同一初發酵管（瓶）的最典型菌落1－3個，然后置于37℃恒溫箱中培養24h，有產酸、產氣者（不論倒管內氣體多少皆作為產氣論），即證實有大腸菌群存在。根據證實有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數查表2-5“大腸菌群檢數表”，報告每升水樣中的大腸菌群數。

4.2 水源水

4.2.1 于各裝有5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培養液的5個試管中（內有倒管），分別加入10ml水樣；于各裝有10ml乳糖蛋白胨培養液的5個試管中（內有倒管），分別加入

1ml水樣；再于各裝有10ml乳糖蛋白胨培養液的5個試管中（內有倒管），分別加入1ml 1：10稀釋的水樣。共計15管，三個稀釋度。將各管充分混勻，置于37℃恒溫箱內培養24h。

4.2.2平板分離和復發酵試驗的檢驗步驟同“生活飲用水檢驗方法”。

4.2.3根據證實總大腸菌群存在的陽性管數，查附表2-6“最可能數（MPN）表”，即求得每100ml水樣中存在的總大腸菌群數。我國目前系以1L為報告單位，故MPN值再乘以10，即為1L水樣中的總大腸菌群數。

對污染嚴重的地表水和廢水，初發酵試驗的接種水樣應作1：

10、1：100、1：1000或更高倍數的稀釋，檢驗步驟同“水源水”檢驗方法。

如果接種水的水樣量不是10ml、1ml和0.1ml，而是較低或較高的三個濃度的水樣量，也可查表求得MPN指數，再經下面公式換算成每100ml的MPN值。

MPN值＝MPN指數×10（ml）/接種量最大的一管（ml）

表2-5大腸菌群檢數表

接種水樣總量300ml（100ml 2份，10ml 2份）

100mL水量的陽性瓶數

10mL水量的陽性管數

1L水樣中大腸菌群數

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 103 7 11 14 18 22 27 31 36 40

1L水樣中大腸菌群數8 13 18 24 30 36 43 51 60 69

1L水樣中大腸菌群數18 27 38 52 70 92 120 161 230 230

表2-6 最可能數（MPN）表

（接種5份10ml水樣、5份0.1ml水樣時，不同陽性及陰性情況下100ml水樣中細

菌數的最可能數和95％可信限值）

出現陽性份數 10ml 1ml 0.1ml 管 0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4

管 0 0 1 2 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 3 0 0 1 1 2 2 3 0 0 1 1 1 2

管 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 2 0

每100ml水樣中 95％可信

細菌數的 最可能數 <2 2 2 4 2 4 4 6 6 5 7 7 9 9 12 8 11 11 14 14 17 17 13 17 17 21 26 22

<0.5 <0.5 <0.57 7

出現陽性份數 管 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

管 2 3 3 4 0 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5

管 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5

每100ml水樣中 95％可信限值

細菌數的 最可能數 26 27 33 34 23 34 43 33 46 63 49 70 94 79 110 140 180 130 170 220 280 350 240 350 540 920 1600 ≥2400

下限9 9 11 12 7 11 15 11 16 21 17 23 28 25 31 37 44 35 43 57 90 120 68 120 180 300 640

上限78 80 93 93 70 89 110 93 120 150 130 170 220 190 250 310 500 300 190 700 850 1000 750 1000 1400 3200 5800

下限 上限 10ml 1ml 0.1ml

<0.5 11 <0.5 11 <0.5 11 <0.5 15 <0.5 15 <0.5 13 1 1 2 2 3 1 2 2 4 4 5 5 3 5 5 7 9 717 21 21 28 19 25 25 34 34 46 46 31 46 46 63 78 67

第二篇：水中大腸桿菌的檢測(多管發酵法)

水中大腸桿菌群書的檢測（發酵法）

一、試驗目的：

1.了解和學習水中大腸桿菌的測定原理和測定意義。

2.學習和掌握水中大腸桿菌的檢測方法。

二、試驗原理：

水的微生物學的檢驗，特別是大腸桿菌的檢驗，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時也是評價水質狀況的重要指標。國家飲用水的標準規定飲用水中大腸桿菌群書每升中不超過3個，細菌總數每毫升不超過100個。

水中大腸桿菌的檢驗方法，常用多管發酵發和濾膜法。多管發酵發可運用于各種水樣的檢驗，但操作繁瑣，需要時間長。濾膜法僅用于自來水和深井水。操作簡潔快速，但不適用于雜質較多，易于阻塞濾孔的水樣。

三、實驗器材：

1.水樣：自來水

2.試劑 ：乳糖蛋白胨發酵管內有倒置小套管三倍濃縮乳糖蛋白胨發酵管瓶內有倒置小套管

伊紅美藍或復紅亞硫酸鈉瓊脂平板革蘭氏染液。3.儀器及其它用品：載玻片滅菌帶玻璃塞空瓶滅菌吸管滅菌試管革蘭氏染液顯微鏡香柏油二甲苯擦鏡紙吸水紙滅菌三角瓶等

四、實驗步驟：

第一步：

1.水樣的采集

自來水洗將自來水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌，在開放水龍頭取水流5ｍｈ，以滅菌山角瓶接水取樣以備分析。

2.用發酵法檢查大腸桿菌

（1）生活飲用水的檢驗

①初步發酵試驗：在2個各裝有50ｍｈ的3倍乳糖蛋白胨培養液的三角瓶中，以無菌操作各自加水樣10ｍｈ。搖勻后，37℃培養24ｈ

第二步：

②平板分離：經24ｈ培養后。特產酸產氣及只產酸的發酵管，分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板（EMD培養基上），37℃培養18～24ｈ。大腸桿菌群在EMD平板上，菌落呈紫黑色，具有或略帶或不帶有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深，挑取符合上述特征的菌落進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。

第三步 ：

③復發酵試驗：將革蘭氏陰性無芽孢桿菌的菌落的剩余部分接于單倍乳糖發酵管中，為防止遺漏，每管可接種來自同一初發酵管的平板上同一類型菌群1～3個，37℃培養24ｈ，如果產酸又產氣者，即證實有大腸菌群存在。

第四步 ：

④報告：根據證實有大腸菌群存在的復發酵管的陽性管，查表，報告每升水樣品中大腸菌群數（MPN）.

第三篇：5.水中大腸桿菌的檢測(多管發酵法)

水中大腸桿菌群書的監測（發酵法）

一、試驗目的：

1.了解和學習水中大腸桿菌的測定原理和測定意義。

2.學習和掌握水中大腸桿菌的監測方法。

二、試驗原理：

水的微生物學的檢驗，特別是大腸桿菌的檢驗，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時也是評價水質狀況的重要指標。國家飲用水的標準規定飲用水中大腸桿菌群書每升中不超過3個，細菌總數每毫升不超過100個。

水中大腸桿菌的檢驗方法，常用多管發酵發和濾膜法。多管發酵發可運用于各種水樣的檢驗，但操作繁瑣，需要時間長。濾膜法僅用于自來水和深井水。操作簡潔快速，但不適用于雜質較多，易于阻塞濾孔的水樣。

三、試驗材料：

1.培養基：乳糖蛋白胨培養基，伊紅美藍培養基

2.器材：滅菌三角瓶、無菌平皿、無菌吸管、無菌試管等。

四、試驗內容

第一天 ：

1.水樣的采集

自來水洗將自來水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌，在開放水龍頭取水流5ｍｈ，以滅菌山角瓶接水取樣以備分析。

2.用發酵法檢查大腸桿菌

（1）生活飲用水的檢驗

①初步發酵試驗：在2個各裝有50ｍｈ的3倍乳糖蛋白胨培養液的三角瓶中，以無菌操作各自加水樣10ｍｈ。搖勻后，37℃培養24ｈ

第二天 ：

②平板分離：經24ｈ培養后。特產酸產氣及只產酸的發酵管，分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板（EMD培養基上），37℃培養18～24ｈ。大腸桿菌群在EMD平板上，菌落呈紫黑色，具有或略帶或不帶有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深，挑取符合上述特征的菌落進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。

第三天 ：

③復發酵試驗：將革蘭氏陰性無芽孢桿菌的菌落的剩余部分接于單倍乳糖發酵管中，為防止遺漏，每管可接種來自同一初發酵管的平板上同一類型菌群1～3個，37℃培養24ｈ，如果產酸又產氣者，即證實有大腸菌群存在。第四天 ：

④報告：根據證實有大腸菌群存在的復發酵管的陽性管，查附錄1或2，報告每升水樣品中大腸菌群數（MPN）

五、思考題

記錄試驗結果，并對所測樣品作出評價。

第四篇：《儀器分析實驗》(離子選擇性電極測定水中氟含量)

離子選擇性電極測定水中氟含量

一、實驗目的

1、掌握直接電位法的基本原理。

2、了解加入總離子強度調節緩沖溶液的意義和作用。

3、掌握用標準曲線法和標準加入法測定水中微量F離子的方法和實驗操作。

二、實驗原理

將兩電極與酸度計相連，氟離子選擇性電極為指示電極，雙液接甘汞電極為參比電極，插入試液中組成工作電池。

在一定的條件下，電池電動勢與氟離子活度的對數成線性關系：

2.303RT

E電池?K?lgaF F當保持待測液離子強度為一定值時

2.303RT

E電池?K?lgcF F本實驗采用標準曲線法（標準加入法）進行測定。

??

三、儀器與試劑

1、試劑：

①.1×10-1mol/L氟離子標準溶液 ②.總離子強度調節緩沖溶液TISAB ③.未知水樣

2、儀器： ①.精密酸度計或離子計 ②.氟電極 ③.飽和甘汞電極 ④.塑料燒杯、攪拌子和容量瓶等

四、實驗步驟

1、儀器準備

2、水樣中氟離子濃度測定（標準曲線法）

3、水樣中氟離子濃度測定（標準加入法）

五、數據處理

六、思考題

1、氟電極在使用時應注意哪些問題？

2、本實驗中加入總離子強度調節緩沖溶液的目的是什么？

3、為什么要把氟電極的空白電位洗至-300mv(視電極生產廠家不同數據略有差別)？

4、標準系列的測定為什么一定要由稀至濃？

5、電極響應時間是什么？如何縮短電極的響應時間？

離子選擇性電極測定水中氟含量

6、標準加入法進行定量分析時應滿足的條件是什么？

附：思考題答案

2、本實驗中加入總離子強度調節緩沖溶液的目的是什么？

惰性電解質

TISAB

pH緩沖劑

(總離子強度調節緩沖溶

掩蔽劑

4、標準系列的測定為什么一定要由稀至濃？ 避免遲滯效應。

5、電極響應時間是什么？如何縮短電極的響應時間？

響應時間：從兩電極剛接觸溶液時起，到電池電動勢達到穩定數值(E變化在±1mV之內)所需時間。

攪拌是縮短響應時間的有效方法。

6、標準加入法進行定量分析時應滿足的條件是什么？

①Vx>>Vs ②Cs>>Cx

{

附：使用飽和甘汞電極的注意事項

1、使用前取下電極小膠帽

2、檢查飽和KCl的液位和晶體

3、檢查電極內有無氣泡

4、檢查多孔性物質是否暢通

5、電極插入液面位置要適中

6、電極應在一定溫度下使用

7、為避免干擾可使用雙液接型飽和甘汞電極

8、使用完畢電極應按要求保存

附：標準加入法

Ex = k + SlgCx

Cx, Vx 加入標準溶液Cs, Vs后

和并得

E?k?SlgCxVx?CsVsVs?Vx

?E?|E?EX|?SlgCxVx?CsVs(Vs?Vx)Cx

離子選擇性電極測定水中氟含量

當Vx>>Vs時

Cx?10?E/S?CxVx?CsVs(Vs?Vx)Cx?E/SCsVsVs?Vx(10?VxVx?Vs)?1

Cx?CsVsVx(10?E/S?1)?1

第五篇：水中揮發酚測定注意事項（最終版）

《生活飲用水衛生規范》中揮發酚的測定方法是4-氨基安替比林（4-AAP）分光光度法，樣品處理需經過蒸餾，蒸餾樣品量大，費時費電，而且顯色后用氯仿萃取，氯仿毒性大，操作繁鎖 ［1］用乙醚萃取，4-氨基安替比林直接分光光度法測定揮發酚，檢出限完全滿足生活飲用水衛生標準要求，而且操作簡便快速，適用于日常檢測工作的需要。

材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 分光光度計。

1.1.2 試劑 酚標準溶液:1000mg/L（苯酚計），購買國家標準物質中心生產的酚標準溶液;酚標準應用溶液為臨用前用無酚水稀釋成1.00μg/ml;氫氧化鈉溶液（2mol/L）;4-氨基安替比林溶液（20g/L），臨用新配;鐵氰化鉀溶液（80g/L），臨用新配;氨水-氯化銨緩沖溶液（pH9.8）:20g氯化銨，溶于100ml氨水中。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線繪制 取8個500ml分液漏斗，每個分液漏斗中加入純水250ml，然后分別加入酚標準應用溶液0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00ml，加入5ml硫酸（1+1）溶液混勻，分別以30、10、10ml乙醚萃取，合并乙醚液于100ml分液漏斗中，分別以2.0ml、2.0ml、2.0ml氫氧化鈉溶液（2mol/L）進行反提取，合并氫氧化鈉于25ml比色管中，用硫酸溶液中和至中性后供測定。

1.2.2 測定 于標準及樣品提取液（提取方法同標準品提取法）中各加入1.0ml氨水-氯化銨緩沖溶液（pH9.8）搖勻。加入1.0ml4-AAP溶液，搖勻.最后加入1.0ml鐵氰化鉀溶液，搖勻。用純水稀釋至10.0ml，混勻。放置10min，于510nm波長處，用2cm比色皿，空白管作參比，測量吸光度值A。以吸光度值A為縱坐標，酚標準含量值M（μg）為橫坐標作線性回歸。

1.2.3 結果計算

X=M V

X為水中揮發酚的含量（mg/L）;M為標準曲線上查得樣品中揮發酚的含量（μg）;V為取水樣的體積（ml）。結果與討論

2.1 方法的精密度、回收率 在已知濃度（0.002mg/L）樣品中分別加入不同量的酚標準溶液，用上述方法重復測定6次，計算方法的精密度，結果見表1。在濃度為0.002mg/L的水樣分別加入不同量的酚標準溶液，進行加標回收率測定，結果見表2。

表1 加標水樣測定的精密度（n=6）（略）

表2 加標水樣的回收率（略）

2.2 方法的線性范圍和最小檢出限 該方法在檢出范圍為0.002～0.04mg/L內繪制標準曲線，結果表明該范圍內有良好的線性關系，檢出限為0.002mg/L，結 果見表3。

表3 標準曲線的回歸方程及相關系數（略）

2.3 實際應用 利用乙醚萃取4-AAP直接分光光度法（新方法）測定102份井水、生活飲用水、水源水及地面水中的揮發酚，其中有10份檢測結果值>0.002mg/L，與《生活飲用水衛生規范》中揮發酚的測定方法4-氨基安替比林萃取分光光度法（國標法）所測定的結果比較，經統計配對檢驗，結果見表4。

表4 兩種方法測定結果（略）

2.4 樣品萃取條件控制 酚類為弱酸性物質，在堿性條件下，以各種鹽的形式存在于水中，幾乎不溶于乙醚;在酸性條件下，以酸的形式存在，在水中溶解度很小，用乙醚幾乎可以完全萃取。以硫酸調節樣品呈酸性（pH<1.0）后，用乙醚萃取，以氫氧化鈉水溶液調節pH>12再進行反提取，操作簡便，避免蒸餾帶來的耗時耗電。

2.5 4-AAP的凈化 4-AAP經過苯凈化處理后的空白測定值大為降低，能提高低濃度標準測定的精密度和準確度。

2.6 標準溶液的稀釋及試劑配制用水必須用無酚的純水，以便降低空白測定值。

參考文獻:

［1］中華人民共和國衛生部衛生法制與監督司.生活飲用水衛生規范［S］.2001.酚類為原生質毒物，屬高毒類物質，在人體富集時出現頭痛、貧血，水中酚濃度達5g/L時，水生生物中毒。酚類污染物主要來自煉油廠、洗煤廠和煉焦廠等。

根據酚類能否與水蒸氣一起蒸出，分為揮發酚（沸點在230度以下）與不揮發酚（沸點在230度以上）。

揮發酚類的測定方法有容量法、分光光度法、色譜法等。尤以4-氨基安替比林分光光度法應用最廣，對高濃度含酚廢水可采用溴化容量法。無論哪種方法，當水樣中存在氧化劑、還原劑、油類及某些金屬離子時，均應設法消除并進行預蒸餾。預蒸餾作用有二，一是分離出揮發酚，二是消除顏色、渾濁和金屬離子等的干擾。

溴化容量法

測定原理：在含過量溴（由溴酸鉀和KBr產生）的溶液中，酚與溴反應生成三溴酚，進一步生成溴代三溴酚。剩余的溴與KI作用放出游離碘，與此同時，溴代三溴酚也與KI反應生成游離碘，用硫代硫酸鈉標準溶液滴定釋出的游離碘，并根據其耗量，計算出以苯酚計的揮發酚含量。

計算公式：

揮發酚（以苯酚計，mg/L）=（V1-V2）×C × 15.68 × 1000/V

水中揮發酚測定注意事項

揮發酚的測定有很多種方法, 通常有蒸餾后的4-氨基安替比林比色法及蒸餾后溴化容量法紫外法、氣相色譜法等，4-氨基安替比林氯仿萃取法適用于低濃度揮發酚的測定，該方法選擇性高且穩定，市環境監測分析人員經過長期實驗比對，在前人工作的基礎上總結了水中揮發酚測定注意事項； 1.樣品保存：酚類化合物在水中不穩定尤其是低濃度樣品，所以必須加磷酸和硫酸銅固定劑，保證樣品存儲運輸的有效性。

2.顯色劑4-氨基安替比林容易受光照氧化變色，進而影響試劑空白，使測量空白偏高，須對配制好的4-氨基安替比林溶液進行純化處理，可使用氯仿萃取法提純，遵循少量多次萃取原則，每次使用5ml左右氯仿萃取三次，因為4-氨基安替比林易溶于氯仿，氯仿用量過大會大幅降低溶液中4-氨基安替比林的濃度影響顯色；

3.蒸餾完后樣品，需加入氯化銨緩沖溶液、4-氨基安替比林顯色劑、鐵氰化鉀三種試劑進行反應顯色，必須先加氯化銨緩沖溶液是樣品保持溶液呈堿性pH約10±0.2，在鐵氰化鉀的存在下，4-氨基安替比林與酚類化合物反應，如果先加入4-氨基安替比林和鐵氰化鉀，兩種試劑會在非堿性條件下反應，使實驗失敗;4.萃取結束后在分液漏斗底部加入一小塊棉花，可防止收集萃取液過程中水溶液流入比色皿中,影響比色結果.