第一篇：免疫細胞的分離和保存技術

免疫細胞的分離和保存技術

用體外方法對機體各種具有免疫反應的細胞分別作鑒定、計數和功能測定，是觀察機體免疫狀態的一種重要手段。為此，須將各種參與免疫反應的細胞從血液或臟器中分離出來。參與免疫反應的細胞主要包括淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等。由于檢測的目的和方法有同，分離細胞的需求和技術也異。有的僅需分離白細胞，有的則需分離單個核細胞（mononuclearcell），其中含淋巴細胞和單核細胞（monocyte），有的則需分離T細胞和B細胞以及其亞群。分離細胞選用的方法應力求簡便可行，并能獲得高純度、高獲得率、高活力的細胞。現用分離細胞群的原則，一是根據各類細胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以組分，另一則按照各類細胞的表面標志，包括細胞表面的抗原和受體加以選擇性分離。

一、白細胞的分離

（一）血液中紅細胞與白細胞比例約600～1000:1，兩者的比重不同其沉降速度亦異，通常用兩種方法加以分離。

本法是利用血細胞自然沉降率的分離法，采集血液后應及時抗凝，通常選用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原轉化為凝血酶，從而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白而防止血液凝固。操作原則是將含抗凝血的試管直立靜置室溫30～60min后，血液分成明顯三層，上層為淡黃色血漿，底層為紅細胞，緊貼紅細胞層上面的灰白層為白細胞，輕輕吸取即得富含白細胞的細胞群，離心洗滌后加入少量蒸餾水或含氯化銨的Gey溶液，經短時間的低滲處理，使紅細胞裂解，經過反復洗滌可得純度較高的白細胞懸液。

（二）聚合物加速沉淀法

本法是利用高分子量的聚合物如明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使紅細胞凝集成串，加速紅細胞沉降，使之與白細胞分離。本法的細胞獲得率比自然沉降法高。

二、外周血單個核細胞的分離

外周血中單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，其體積、形態和密度與其他細胞不同，紅細胞和多核白細胞密度較大，為1.090左右，而淋巴細胞和單核細胞密度為1.075～1.090，血小板為1.030～1.035。為此利用一種密度介于1.075～1.092之間而近于等滲的溶液（分層液）做密度梯度離心，使一定密度的細胞按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。

（一）Ficoll分層液法

主要用于分離外周血中的單個核細胞，是一種單次密度梯度離心分離法。聚蔗糖－泛影葡胺是一種較理想的細胞分層液，其主要成分是一種合成的蔗糖聚合物稱聚蔗糖（商品名為Ficoll），分子量為40kD，具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點。高濃度的Ficoll溶液粘性高，易使細胞聚集，故通常使用60g/L的低濃度溶液，密度為1.020，添加比重為1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度。國外常用商品Isopaque或Hypaque，故又稱Ficoll-Hypaque分層液，將適量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合適分層液。分離人外周淋巴細胞以密度為1.077±0.001的分層液最佳，因為人的紅細胞密度為1.093，粒細胞密度為1.092，單個核細胞在1.076～1.090之間。而不同動物血中的單個核細胞對分離液的密度要求各不相同，如小鼠為1.088，馬為1.090。分離時先將分層液置試管底層，然后將肝素化全血以Hanks液或PBS液作適當稀釋后，輕輕疊加在分層液上面，使兩者形成一個清晰的界面。水平式離心后，離心管中會出現幾個不同層次的液體和細胞帶（圖20-1）。

紅細胞和粒細胞密度大于分層液，同時因紅細胞遇到Ficoll而凝集成串錢狀而沉積于管底。血小板則因密度小而懸浮于血漿中，唯有與分層液密度相當的單個核細胞密集在血漿層和分層液的界面中，呈白膜狀，吸取該層細胞遞經洗滌高心重懸。本法分離單個核細胞純度可達95％，淋巴細胞約占90％～95％，細胞獲得率可達80％以上，其高低與室溫有關，超過25℃時會影響細胞獲得率。

（二）Percoll分層液法

這是一種連續密度梯度離心分離法。Percoll是一種經聚乙烯吡喀烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒，對細胞無毒性。利用Percoll液經高速離心后形成一個連續密度梯度的原理，將密度不等的細胞分離純化。用Percoll原液(密度1.135)與約等量雙離子強度的磷酸緩沖液均勻混合，高速離心后，使分層液形成一個從管底到液面密度逐漸遞減的連續密度梯度，再將已制備的單個核細胞懸液輕輕疊加在液面上，低速離心后，便得四個細胞層。表層為死細胞殘片和血小板，底層為粒細胞和紅細胞，中間有兩層，上層富含單個核細胞(75％)，下層富含淋巴細胞(98％)(圖-2)。該法是純化單核細胞和淋巴細胞的一各較好的方法，但操作流程較長，手續較多。

圖-2 連續密度梯度離心法分離單個核細胞中各細胞成分的分布示意圖

三、淋巴細胞及其亞群的分離

為研究免疫細胞的功能，常需高純度的淋巴細胞或其亞群，分離方法介紹如下。

（一）、純淋巴細胞群的采集

通常利用單核細胞在37℃和Ca2+存在條件下，能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的特性，據此建立許多從單個核細胞懸液中去除單核細胞的方法，藉以獲得高純度的淋巴細胞群。

（1）粘附貼壁法

將已制備的單個核細胞懸液傾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃溫箱靜置1h左右，單核細胞和粒細胞均貼于平皿壁上，而未貼壁的非粘附細胞幾乎為純淋巴細胞，繼用橡皮刮下貼壁的細胞即為純單核細胞群。因B細胞也有貼壁現象，用本法分離的淋巴細胞群中B細胞有所損失。

（2）吸附柱過濾法

將單個核細胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG10的柱層中，凡有粘附能力的細胞絕大部分被吸附而粘滯在柱層中，從柱上洗脫下來的細胞主要是淋巴細胞。此法簡單易行，對細胞極少損害。

（3）磁鐵吸引法

利用單核細胞具有吞噬的特性，在單個核細胞懸液中加直徑為3μm的羰基鐵顆粒，置37℃溫箱內短時旋轉搖動，待單核細胞充分吞噬羰基鐵顆粒后，用磁鐵將細胞吸至管底，上層液中含較純的淋巴細胞。

（二）、淋巴細胞亞群的分離

分離相當純化的淋巴細胞亞群是細胞免疫檢驗的基本技術。其原則是根據相應細胞的特性和不同的標志加以選擇性純化。凡根據細胞的特性和標志選擇純化所需細胞的方法是陽性選擇法；而選擇性去除不要的細胞，僅留下所需的細胞是為陰性選擇。常用以下幾種方法：

（1）E花環沉降法

本法是將淋巴細胞與一定比例的綿羊紅細胞混合，待淋巴細胞形成E花環后，繼用淋巴細胞分層液分離細胞。浮懸在分層界面而不形成E花環的群則富含B細胞，而沉降在管底的形成E花環的細胞用低滲法處理，使圍繞細胞周圍的綿羊紅細胞快速裂解，則獲得純的T細胞。

（2）尼龍毛分離法

本法利用B細胞和單核細胞具有易粘附于尼龍纖維表面的特性，可將T和B細胞分開。操作原則是取松散而經過處理的尼龍毛（聚酰胺纖維），均勻充填在內徑5～6nm的聚乙烯塑料管（飲料管即可）內，經Hanks液浸透保溫，將單個核細胞懸液加入柱內，放37溫箱靜置1～2h。用預溫的含10％～20％小牛血清培養液灌洗，洗脫液內含有非粘附的T細胞，重復灌洗幾次以除去管內殘留的T細胞。再用冷或溫培養液邊沖邊洗邊擠壓塑料管，此時洗脫液內富含B細胞。如此得到的T細胞純度在90％以上，B細胞純度可達80％。

（3）親和板結合分離法

利用親和層析法分離淋巴細胞亞群，其原理是各種淋巴細胞亞群具有不同的抗原性，將相應抗體結合于塑料平板上，繼加細胞懸液，凡抗原陽性的細胞則與相應抗體結合，抗原陰性的細胞可從未吸附的細胞懸液中獲取（圖-3）。同樣若用特異性抗原交聯在塑料板上，則可分離得具有特異抗原受體的淋巴細胞。淋巴細胞受體與特異抗原或抗體接觸，可引起細胞激活，因此，凡欲去除細胞懸液內某一細胞亞群時，本法更適用。如要分離CD4+或CD8+細胞，則可用抗CD4或CD8單克隆抗體吸附。用抗Ig抗體則可分離B細胞。同樣，用活化的C3包被，可分離出有C3受體的細胞。

圖-3 親和分離法圖解

（4）熒光激活細胞分離儀分離法

熒光激活細胞分離儀（fluorescenceactivatedcellsorter，FACS）主要由4部分組成：①細胞流動系統及氣壓流速控制系統，②激光系統，③檢測與訊號處理系統，④細胞分選系統。其主要原理是細胞經熒光染色后，通過高速流動系統，細胞排成單行，逐個流經檢測區進行測定。當細胞從流動室噴嘴處流出時，超聲振蕩攪動液流，使液流斷裂成一連串的均勻小滴（40000個/s），每小滴內最多含一個細胞（其中只有百分之幾的液滴中含細胞），細胞經激光束照射產生熒光和散射光，由光電倍增管接收，轉換成脈沖信號，數據經電腦處理，分辨細胞的類型。如識別的是預計所需的細胞時（如T細胞、B細胞要其亞群），在細胞樣品流斷裂成小滴時，使液滴瞬即感應陽電荷、陰電荷或不帶電荷，使所需的細胞在電場偏轉下進入不同的收集管（圖-4）。用FACS分離細胞準確快速，能保持細胞活力，并可在無菌條件下進行，但儀器昂貴，極少用于常規，而多數僅作為研究的手段。

圖-4 熒光激活細胞分離儀簡圖

四、吞噬細胞的分離和收集

人外周血中單核－巨噬細胞可通過Pecoll密度梯度分離法獲取，但數量較少，用血量多。用斑蝥敷貼法可從人體組織液中獲取較純的巨噬細胞，不需作進一步體外分離，細胞量損失較少。該法是用濾紙蘸取10％中藥斑蝥酒精浸出液，貼敷在臂內側皮膚表面，4～5h后皮膚局部充血，48h后局部形成水皰，吸取皰中的組織液，內含巨噬細胞。但此法對病人皮膚有一定損傷，有時可引起局部感染，應慎用。

欲獲取小鼠、大鼠、豚鼠等小動物的巨噬細胞，可經腹腔內注入少許石蠟油，3～4天后沖洗出腹腔滲出液，所得細胞懸液中70％～80％為巨噬細胞。

五、淋巴細胞的保存和活力測定

（一）、分離細胞的保存

在某些情況下，分離所得細胞需要加以保存，否則活力迅速下降，甚至死亡。

（1）短期保存技術

將分離到的細胞用適量含10％～20％滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培養液稀釋重懸。所用培養液要求等滲，具緩沖作用，并對細胞無毒性。通常置4℃保存較好，可減低細胞代謝活動。要注意不要迅速改變細胞所處的溫度，以免造成細胞“溫度”休克。

（2）長期冷凍保存技術

利用液氮深低溫（－196℃）環境保存細胞，是當前世界上通用的細胞長期保存技術。其原理在于深低溫環境可中斷細胞的代謝，但在降溫過程由于冰晶的形成和滲透壓的改變均可導致細胞的損傷和部分死亡，所以在冷凍過程中一定要加用冷凍保護劑，常用的保護劑為二甲亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）。冷凍時的降溫速度和細胞解凍時的升溫速度對細胞活力的保存有很大影響。條件合適時，凍存細胞一旦復蘇，恢復37℃培養，其形態和代謝活動均可恢復正常。操作的原則是先對需凍存的細胞作活細胞計數，低速離心后，取沉積細胞用含10％二甲亞砜的小牛血清配制成適當濃度的細胞懸液，分裝于凍存管內，速即放入降溫過渡站中，避免二甲亞砜對細胞的損傷。繼而進行降溫冷凍，目前常用兩步降溫法，即迅速降溫至一選擇好的臨界溫作為過渡站，如－80℃低溫冰箱過夜，或在液氮罐液面以上的一層空間放置片刻，然后再放入液氮中。如需復蘇細胞，則需迅速解凍以恢復細胞的活力，要求在20s以內完全融化。將凍存管自液氮中取出，立即放入40℃溫水中，融化后即從水中取出，吸出細胞懸液，加入10倍的培養液中混勻，繼而低速離心，盡快洗去保護劑，再懸于新培養液中，計數并檢查細胞活力，然后置37℃培養箱內培養。

（二）、細胞活力測定

細胞活力常用百分比表示，活力的大小對試驗結果有很大影響。細胞活力的測定有許多方法，最簡便常用的方法是臺盼藍（trypanblue）染色法。臺盼藍又稱錐藍，是一種陰離子型染料，這種染料不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色，但死亡細胞的細胞膜通透性增加，可使染料通過細胞膜進入細胞內，使死細胞著色呈藍色。免疫檢測試劑中常用的防腐劑有硫柳汞、疊氮鈉、抗生素等。

1.疊氮鈉是HRP的抑制劑，凡是和HRP接觸的試劑，一定不能用；

2.硫柳汞在ELISA試劑中可普遍使用，但因其有毒，較少使用；

3.市面許多試劑盒產品，用抗生素做防腐劑較多，如慶大。

4.如果試劑僅在實驗室短期使用，其實并不需加防腐劑，常規試劑放4度冰箱，抗體、酶等加甘油分裝凍存即可。

5.梅里埃生產的HIV診斷試劑中提到：對照血清的防腐用0.1g/L硫酸慶大霉素和0.2ml/L肉桂醛。

6.防污染可添加0.02%的疊氮鈉，或0.01%的硫柳汞。疊氮鈉在多數情況下有用且有效，但在有些實驗中卻不合適，因為它能阻斷細胞的電子傳遞鏈，對許多生物體都有毒醫學 教育網 搜 集整理性，因此不能用于活體實驗；因為含有氨基而能干擾許多標記方法；不能用于辣根過氧化物酶標記的抗體。而硫柳汞不含氨基，不影響基質的穩定性。如果將抗體應用于生物活性檢測、體內實驗，一般不使用任何防腐劑，這些實驗用的抗體應少量分裝冷存，切忌反復凍融。

7.吐溫-20是作為穩定劑，可減少非特異性黏合。甘油是防止凍融過程中的固-液相變而引起蛋白變性，能有效地增強蛋白質的穩定性，-20度凍存時甘油的濃度可以在20~30%。

第二篇：細胞免疫療法最新調研

細胞免疫療法最新調研

一、以下為調研查到的確定開展細胞免疫療法的醫院（1）對細胞免疫療法極力推薦的三甲醫院：

1、廣州復大腫瘤醫院

? 國內首批開展生物治療衛生機構 ? 國內率先開展聯合免疫療法治療方案醫院 ? 同時開展T-plus腫瘤免疫治療的研究與治療 ? 作術后及放化療后的配合使用細胞免疫治療

? 多應用于：胰腺癌，肝癌，肺癌，食管癌，胃癌，乳腺癌

2、廣州醫學院附屬腫瘤醫院 ? 國內首批開展生物治療的衛生機構 ? 研究：DC-CIK療法 ? 多應用于：肝癌、胃癌 ? 應用病例已達幾千余例（保留）

3、北京武警總隊第二醫院

? 中華醫學會腫瘤生物治療課題定點醫院 ? 國內首家多細胞免疫治療醫院

? 研究：CIK細胞、NK細胞、CD3AK細胞 ? 多應用于：食道癌、肺癌、乳腺癌

? 應用超過3000例

4、解放軍458醫院（廣州）? 細胞治療作為放化療的支持治療 ? 多應用于：肺癌、乳腺癌、肝癌 ? 研究：DC細胞、CIK細胞、CAPRI細胞

5、天津醫科大學附屬腫瘤醫院

? 到2008年9月，應用CIK細胞對腫瘤患者實施免疫治療，已進行300余例肺癌患者的治療。

6、解放軍第123醫院（安徽）? 安徽領先的腫瘤治療醫院 ? 研究：DC-CIK療法

? 多應用：肝癌、食道癌、肺癌

7、漳州市醫院（福建）

? 生物免疫治療中心：一天接待不超過5名患者

8、解放軍第454醫院（南京）? 研究：DC-CIK療法 ? 多應用：食道癌、膽癌

9、吉林省人民醫院

? 吉林省生物免疫治療最高可報90% ? 肺癌、胃癌

10、天津市人民醫院

? 多應用：黑色素瘤、食道癌

? 研究：DC細胞、CIK細胞、NK細胞、CD3AK細胞、γδT細胞

11、遼寧省人民醫院

? 多應用：直腸癌、宮頸癌、乳腺癌 ? 研究：CIK細胞

12、上海仁濟醫院

? 應用：乳腺癌、肺癌

13、遵義醫學院附屬醫院 ? 多應用：鼻咽癌、乳腺癌

14、海口市人民醫院

? 海南生物診療報銷比例可達90% ? 研究：DC-CIK療法

? 應用：胃癌、乳腺癌、肝癌、結腸癌

15、洛陽市中心醫院

? 研究：NK細胞、T細胞（CLS生物療法）

16、哈爾濱醫科大學附屬第四醫院

? 應用：肝癌、胃癌

? 生物治療中心每日限制最多6人就診

17、解放軍漳州175醫院

18、武警山東省總隊醫院

? 應用：肺癌、胃癌、腎癌、黑色素瘤

19、重慶市腫瘤醫院

? 研究：DC-CIK療法

? 應用：肺癌，曾應用于左腮腺米庫林氏病

20、山西醫科大學第二醫院

（2）簡單提及有開展細胞免疫治療的醫院

1、中山大學附屬第一醫院：簡單提及

2、廣州市第一人民醫院：生物免疫治療，“近期開展”。

3、廣東省第二人民醫院：免疫細胞治療，腫瘤二科。

4、廣州市紅十字會醫院：詳細提及，腫瘤生物治療。

5、廣州軍區總醫院：生物治療

6、中山大學腫瘤醫院：簡單提及。

7、南方醫院：有生物治療中心

8、廣東藥學院附屬第一醫院：自體細胞免疫治療技術取得實質性進展

9、粵北人民醫院：提及生物治療。

10、深圳市人民醫院：擁有生物治療室。

11、佛山市第一人民醫院：晚期肺癌和晚期胃腸癌的細胞免疫治療。

12、中國醫科院腫瘤醫院（北京）

13、第二軍醫大學東方肝膽外科醫院（上海）

（3）全國腫瘤排名較前并開展了細胞免疫治療的醫院：

1、中山大學腫瘤醫院（排名第一）

2、中國醫學科學院腫瘤醫院（排名第二）

3、天津市腫瘤醫院（排名第三）

4、第二軍醫大學東方肝膽外科醫院（排名第五）

5、南方醫院（排名第八）

——相信還有很多已開展了細胞免疫療法，而未在官網或其他渠道宣傳的三甲醫院。

二、估算：

1、細胞免疫治療現行應用較多的腫瘤類型為：肺癌、胃癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、乳腺癌。相關規定，三甲醫院才能資格開展細胞免疫療法。

2、開展生物細胞免疫治療的三甲醫院的比例：以廣東65家三甲醫院（2011年），可查的在官方網站記載有生物免疫療法的，共有13家，比例達到20%，若按照這個比例，全國共有超過1000家三甲醫院，則大約有200家三甲在開展生物細胞免疫治療腫瘤。

3、治療費用：綜合幾家明確給出價格參考的醫院為依據，有治療胃癌在2.5至5萬一個療程，肝癌在3萬/療程，另有2.6萬/療程。我們保守估計以2.5萬/療程作為參考值。

4、療程的時間：可查的細胞免疫治療過程為：采血、培養、回輸三大塊，送GMP實驗室進行體外誘導6-7天，然后分5-6天，每天2次回輸，約2周一個療程。

5、市場容量的估算：以現時細胞免疫療法的普及程度，按保守每家醫院5例/月，廣東省13家三甲1年約780例：2.5萬/療程* 780例=1950萬左右；全國約12000例，市場容量在2.7億到3億間。

第三篇：人體免疫細胞閱讀答案

閱讀短文，完成7～8題。（共4分）

人體免疫細胞能發現并殺死被感染的細胞而不傷害健康的細胞，其機理一直困惑著人們。科學家最近初步揭開了其中的奧秘，原來被感染的細胞能發出信號向免疫細胞求救。

美國馬里蘭大學的一個科研小組最近在英國《自然》雜志上發表論文指出，人體細胞中大都含有肽，它是細胞健康狀態的標志物。細菌或病毒侵入細胞后會破壞該細胞，同時自己也分解繁殖。這時肽分子就會與細菌或病毒碎片結合。這樣，附近的免疫細胞就得到該細胞受感染的信號，然后通知其他免疫細胞一同將受感染的細胞及其中的感染物殺死。

該科研小組是利用X射線晶體分析法發現這一奧秘的。他們選用了能誘發某些白血病的HTLV病毒作為研究對象，并在免疫細胞T細胞中發現了這一病毒的受體。當肽分子與該病毒殘片結合后，就會激發附近的T細胞上該病毒的受體，從而使T細胞發揮作用。科學家說，T細胞上含有上百萬個不同的受體，利用它可發現大量細菌或病毒并將受其感染的細包殺死。

7．第二段中,它（肽）是細胞健康狀態的標志物的意思是（▲）（2分）

A．人體細胞在健康狀態下，其中才會有肽分子存在。

B.肽在細菌或病毒入侵后能發生求救信號，維護人體健康。

C．人體在健康的狀態下，細胞內含有的肽相對較多。

D．肽分子能將入侵的細菌或病毒分解并與其碎片結合。

8．下列說法不符合原文意思的一項是（▲）（2分）

A．向免疫細胞發生求救信號的是人體細胞中的肽分子。

B．肽分子與細菌或病毒的碎片結合后，會激發T細胞內肽的受體。

C．最終殺死細菌或病毒的是T細胞中的細菌或病毒的受體。

D．T細胞中的受體，不僅殺死了細菌或病毒，還殺死了受感染的細胞。

參考答案：

7、B [解題思路］

它（肽）是細胞健康狀態的標志物的意思是肽在細菌或病毒入侵后能發出求救信號，維護人體健康。

A項把因果關系倒轉了。是肽維護人體健康，而不是在健康狀態下才會有肽分子存在。

C項也是犯了同樣的錯誤，應是有肽在，人體才會健康，而不是相反。

D項是從肽分子的功能方面說的，不是對題目中那句話的直接的解釋。

8、B項肽分子與細菌或病毒的碎片結合后，激發的是T細胞內病毒的受體，而非肽的受體。

第四篇：食品分離技術

食品分離技術的現狀及研究進展 分離操作在食品工業中的作用

隨著食品工業的發展，化工單元操作不斷向食品工業滲透并在食品加工領域內實踐和提高，形成了適應食品加工特殊要求的新的單元操作。由于食品加工所用的動植物性原料幾乎都為固態和液態，為了使固體和液體原料成為多種美味可口、營養豐富的食品，首先必須提取其精華，揚棄其糟粕，分離出不同成分并組合成不同種類的制品。同時為了做到有益無毒，風味別致，又必須反復提純和精制。因此分離操作已在食品工業中占有相當重要的地位，研究分離技術在食品加工中的應用，對食品加工的科學化具有重要意義[1]。

食品分離技術在食品工業中具有相當重要的地位。其重要性表為以下幾個方面:(1)食品分離技術是食品工業的基礎[2]。絕大多數食品工業都分離不開食品分離技術，其中不少行業都是以分離工程為主要生產工序的。例如植物油的提取，淀粉的分離，糖制品的分離以及精練提純等等。(2)食品分離技術能提高食品原料的綜合利用程度。在食品加工工程中運用分離技術可以有效的利用食品原料中的各種成分，提高原料的綜合利用程度，就提高了食品原料的利用價值。例如采用有效的分離方法可以從茶葉下腳料中分離出茶多酚、茶堿等，從柑橙中分離甘橙油、果膠等，使原料利用率大為增值。制糖行業中色譜分離技術的應用使得產糖率大大提高。(3)食品分離技術能保持和改進食品的營養和風味。采用現代分離技術可以將一些需在高溫下完成的工藝改為在常溫下進行，這樣就可以大大地改善食品的色、香、味及營養。如用膜分離技術代替常規的蒸發濃縮和真空濃縮咖啡、果汁、茶汁等[3-4]。

(4)食品分離技術使產品符合食品衛生要求。食品分離技術包括提取原料中的有益組分和去除其中的有害成分。如花生、玉米等油制品易受黃曲霉污染而產生黃曲霉素，所以在加工過程中必須用適當的方法將其去除。（5）現代食品分離技術能改變食品行業的生產面貌。現代分離技術在食品工業中的應用，往往可以使行業的生產面貌大為改觀。例如過去利用太陽能將海水濃縮后結晶制食鹽，如今利用食品分離技術制食鹽，使得整個行業生產面貌大大改觀。2 食品工業中的分離操作方法

分離技術在工農業生產中具有重要作用，并且與我們的日常生活息息相關，同時分離機技術也在不斷促進其它學科的發展[5]。由于采用了有效的分離技術，能夠分離和提純較純的物質，大大的推進了化學學科的發展。又由于各種層析技術、超離心技術和電泳技術的發展和應用，使生物化學等生命科學得到了迅猛的發展。

分離操作包括機械分離和傳質分離兩大類，機械分離是指被分離的混合物由多于一相的物料所組成，分離設備只是簡單地將混合物進行相分離，它屬于非均相物系的分離，如沉降，過濾等。另一種分離操作是指依靠組分的擴散和傳質來完成的分離過程，故又稱擴散分離或傳質分離[6]。如蒸餾，吸收，萃取或膜分離等，適用于多組分均相混合物的分離以及非均相混合物的分離[7]。3 傳統的機械分離技術

在食品工業中，經常會遇到需要將懸浮液或乳濁液中的兩相加以分離。即全部或部分地將這種非均相系的分散介質和分散質相分開。如奶油的制取，葡萄糖品體食品的獲得，以及澄清果蔬汁的制取都是兩相分離結果。3.1過濾

過濾過程是指分散介質相對于分散質的遷移過程。過濾操作的基本原理是利用一種能將懸浮固體微粒截留而使液體自由通過的多孔介質，達到懸浮液中固體與液體分離的目的。此多孔介質稱為過濾介質。因此過濾只適用于懸浮液。

過濾設備在食品工業上的應用非常廣泛:(1)作為一般固一液系的分離手段:如蔗掂榨汁中會有許多固形雜質，除用澄清法外還須過濾精制。在食用油的浸取與精煉上，用板框壓濾機，箱式壓濾機和加壓葉濾機等設備可除去種子碎片和組織細胞，還可用于油類脫色后濾去漂白土等[8];(2)作為澄清設備:如對啤酒，葡萄酒，果汁，搪漿等用陶質管濾機進行過濾澄清。如制品含有極細固體微粒或呈膠泥狀，則過濾時一般以預授形式應用助濾劑或將助濾劑加人漿液中混合后再送人過濾機進行過濾;(3)用過濾法除去微生物:管濾機常用于葡萄酒、啤酒和果汁的過濾以降低微生物的數目。3.2沉降

沉降過程是分散質相對于分散介質的相對遷移過程。在重力場中:使混合物中密度不同的兩相獲得分離的操作，稱重力沉降。根據分散質集態的不同，可分為懸浮液沉降和乳濁液沉降。

實現重力沉降分離的設備稱為沉降器，按操作方式可分為間歇式，半連續式和連續式，無論是何種方式的沉降器，其生產能力Q都取決于沉降面積和沉降速度的乘積，而與沉降器的高度無關。故現代化的沉降器的結構特點都是截面大，高度低[9]。

沉降在食品工業中的應用主要有三個方面：(1)以澄清為目的。如果汁、酒類等制品的澄清處理以除去懸浮液中的混濁雜質。(2)以增稠為目的。如淀粉制造，首先利用沉降達到懸浮液的沉淀增濃。(3)以分級或分離為目的利用同一物質的粒徑或不同物質粒子的密度不同而使它們得到分離故沉降也是食品加工的常見手段。4 新型的分離技術

科學技術的不斷發展導致了對分離技術的要求越來越高，分離的難度也越來越大[10]。特別是隨著各種天然資源的不斷開采使用，含有用物質的資源逐步減少，迫使人們從含量較少的資源中去分離、提取有用物質。所有這些，促進了分離技術的不斷發展，舊的分離方法不斷改進完善，新的分離方法不斷發現，如近幾十年來發展起來的一些新型傳質分離技術，如膜分離技術，超臨界萃取技術及泡沫吸附分離技術等已引起了食品工業界的重視并已嶄露頭角[11]。4.1 膜分離技術

反滲透、超濾、微濾、電滲析這四大過程在技術上已經相當成熟，已有大規模的工業應用，形成了相當規模的產業，有許多商品化的產品可供不同用途使用[12]。（1）反滲透是利用反滲透膜(一般為均質膜或表面致密的復合膜)選擇地透過溶劑的性質，對溶液施加壓力，克服溶劑的滲透壓，使溶劑通過膜而從溶質中分離出來的過程，這種技術可用于海水淡化、果蔬汁的濃縮、茶葉抽提液的濃縮等[13]。

（2）超濾應用孔徑為10一ZOOA的超濾膜來過濾含有大分子或微細粒子的溶液，使之從溶液中分離的過程。與反滲透不同的是小分子溶質與溶劑一起通過超濾膜[14]。這種分離過程可用于果蔬汁的濃縮和澄清、天然色素和食品添加劑的分離和濃縮、奶的分離和濃縮、酒和醋的澄清與提純等。

（3）微濾以孔徑小于10四的多孔膜過濾含有微粒的溶液將微粒從溶液中除去。可用于食糖的精制、澄清、過濾及啤酒的冷過濾除菌等。

（4）實質上，電滲析可以說是一種除鹽技術，因為各種不同的水（包括天然水、自來水、工業廢水）中都有一定量的鹽分，而組成這些鹽的陰、陽離子在直流電場的作用下會分別向相反方向的電極移動[15]。如果在一個電滲析器中插入陰、陽離子交換膜各一個，由于離子交換膜具有選擇透過性，即陽離子交換膜只允許陽離子自由通過，陰離子交換膜只允許陰離子以通過，這樣在兩個膜的中間隔室中，鹽的濃度就會因為離子的定向遷移而降低，而靠近電極的兩個隔室則分別為陰、陽離子的濃縮室，最后在中間的淡化室內達到脫鹽的目的。

膜分離共同的優點是：①節約能源；②在常溫下進行，特別適用于熱敏性物質的處理，能夠防止食品品質的惡化和營養成分及香味物質的損失；③ 食品的色澤變化小，能保持食品的自然狀態；④設備體積小且構造簡單，費用較低，效率較高；⑤適用范圍廣，有機物和無機物都可濃縮，可用于分離、濃縮、純化、澄清等工藝。

膜分離的缺點是：①產品被濃縮的程度有限；②有時其適用范圍受到限制，因加工溫度、食品成分、pH、膜的耐藥性、膜的耐溶劑性等的不同，有時不能使用分離膜；③ 規模經濟的優勢較低，一般需與其他工藝相結合[16]。

由于膜分離過程不需要加熱，可防止熱敏物質失活、雜茵污染，無相變，集分離、濃縮、提純、殺菌為一體，分離效果高，操作簡單、費用低，特別適合食品工業的應用[17]。4.2 超臨界萃取技術

超臨界萃取是利用超臨界流體這種在臨界點附近具有特殊性能的物質作為溶劑進行萃取的一種分離方法。超臨界流體是指超過臨界溫度與臨界壓力的氣體[18]。如果某種氣體處于臨界溫度以上，無論壓力多高，也不能液化，仍然是氣體，這時稱此氣體是超臨界流體。超臨界流體具有這樣的物理性質:其密度與液體較接近，粘度和自擴散能力卻接近于氣體。因此超臨界流體對液體、固體物質的溶解度與液體溶劑相接近，且在臨界點附近，壓力和溫度的微小變化會引起其溶解能力的極大變化[19]。利用超臨界流體的這些特性，通過改變溫度或壓力可在近臨界點附近實現萃取劑與待分離物質的分離。

(1)由于在臨界點附近，流體溫度或壓力的微小變化會引起溶解能力的極大變化，這種極強的選擇性對分離溶解度相接近的兩種成分非常有利，且萃取后溶劑與溶質的分離很容易。

(2)由于超臨界流體具有與液體相接近的溶解能力，同時它又保持了氣體所具有的傳遞性，這種具有液體與氣體雙重性能的流體能使傳質很快地達到平衡，有利于高效分離的實現。

(3)超臨界流體如CO2(Tc=31.1℃，Pc=7.38Mp)適合于食品工業中一些熱敏性物質的萃取。

當然，超臨界萃取的缺點是設備和操作都要求在高壓下進行，設備投資費用高。在食品工業方面，利用超臨界萃取技術可從咖啡豆和茶葉中脫除咖啡因，還可用于提取啤酒花中的有用成分及從煙草中脫除尼古丁等。超臨界流體萃取技術作為一種新的分離技術，正越來越受到人們的重視，將在各個領域中得到廣泛的應用[20]。4.3 泡沫吸附分離技術

泡沫分離是根據表面吸附的原理，借助鼓泡使溶液中的表面活性物質聚集在氣-液界面，隨氣泡上浮至溶液主體上方，形成泡沫層，將泡沫和液相主體分開，從而達到濃縮表面活性物質（在泡沫層），凈化液相主體的目的。從液相主體中濃縮分離的既可以是表面活性物質，也可以是能與表面活性物質相互親和的任何溶質，比如金屬陽離子、蛋白質、酶、染料等等。另外，一些固體粒子（沉淀微粒或礦石小顆粒），也可以被表面活性物質吸附，從溶液中分離出來。

泡沫吸附分離技術是近幾十年發展比較快的的新興分離技術，通常把凡是利用氣體在溶液中鼓泡，以達到分離或濃縮的這類方法，總稱為泡沫分離技術[21]。泡沫分離必須具備兩個基本條件，首先，所需分離的溶質應該是表面活性物質，或者是可以和某些活性物質相絡合的物質，它們都可以吸附在氣-液界面上；其次，富集質在分離過程中借助氣泡與液相主體分離，并在塔頂富集。因此，它的傳質過程在鼓泡區中是在液相主體和氣泡表面之間進行，在泡沫區中是在氣泡表面和間隙液之間進行。所以，表面化學和泡沫本身的結構和特征是泡沫分離的基礎[22]。

隨著人們對環境污染的日益重視，要求治理污染的呼聲越來越高，政府對企業污染的控制也越來越嚴格，泡沫分離技術作為一種新興的分離技術，越來越受到人們廣泛的關注，它的優點就在于適合低濃度的分離回收，能在很低濃度下十分有效地除去表面活性物質；設備簡單，投資少、能耗小，并且操作方便。5 分離技術的展望

目前，各種新型分離技術比傳統分離法已有了突破性進展，這對于進一步提純功能性食品成分，開發功能性產品，更大限度地發揮銀杏資源優勢具有推動作用。隨著高精度、高靈敏度分析技術的應用，天然產物活性成分的提取純化和結構鑒定尤其是在產品的應用領域顯示了更為廣闊的前景，同時這也促進了植物有效物質的結構、藥理、藥效等方面的深入研究。銀杏葉加工集成優化工藝的探究，微量天然產物成分的高效快速高純分離和鑒定的集成系統技術的建立，都將提高銀杏葉及其特色藥用資源的利用率，有利于實現資源優勢向技術優勢的轉化，從而產生更大的經濟效益、社會效益和環境效益[23]。分離操作在食品加工中占有非常重要的地位。分離技術的發展方興未艾，研究掌握各種分離技術的原理和技術，尤其是一些新叮的傳質分離技術可以提高現有的分離技術冰平，是一項非常重要的工作，對食品加工的科學化具有重要的意義。

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第五篇：分子分離技術

目錄

摘要................................................1 關鍵詞..............................................1 1 前言..............................................1 2 傳統分離方法......................................2 3 現代分離方法......................................3 3.1 色譜方法.......................................................................................3 3.2 電泳技術及其它...........................................................................6 展望..............................................8 參考文獻............................................9

生物大分子分離技術的發展現狀

姓名：陳紹勇

學號：20124016016

專業：動物學 摘要: 生物大分子包括多肽、酶、蛋白質、核酸(DNA 和RNA)以及多糖等。生物大分子分離技術是生命科學研究中的關鍵技術之一。當前, 各學科之間的交叉滲透為生物大分子分離技術的發展提供了更多的契機。對以沉淀、透析、超濾和溶劑萃取為代表的傳統分離技術, 以及色譜, 電泳等現代分離技術的發展概況、原理、特點及應用進行了綜述。并結合生命科學的發展現狀, 展望了生物大分子分離技術的發展前景。

關鍵詞: 生物大分子,傳統分離方法,現代分離方法 1 前言

生物大分子包括多肽、酶、蛋白質、核酸(DNA和RNA)以及多糖等。生命科學的發展給生物大分子分離技術提出了新的要求。各種生化、分子研究都要求得到純的, 以及結構和活性完整的生物大分子樣品, 這就使得其分離技術在各項研究中起著舉足輕重的作用。對生物大分子分離技術的研究和開發也就應運而生。而且隨著各學科之間的交叉滲透, 材料化學、自動化技術等學科的發展也為生物大分子分離技術的發展提供了更多的契機。生物大分子的制備具有如下主要特點: 生物材料的組成極其復雜;許多生物大分子在生物材料中的含量極微, 分離純化的步驟繁多, 流程長;許多生物大分子一旦離開了生物體內的環境就極易失活(因此分離過程中如何防止其失活, 就是生物大分子提取制備最困難之處);生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進行的, 溫度、pH 值、離子 強度等各種參數對溶液中各種組成的綜合影響, 很難準確估計和判斷[1]。這些都要求生物大分子的分離技術以此為依據, 突破這些難點, 優化分離程序, 以獲得符合要求的生物大分子樣品。傳統分離方法

常用的傳統生物大分子分離方法有沉淀、透析、超濾和溶劑萃取等。它們都是一些較早就建立起來的分離方法, 至今仍然被廣泛應用。如在蛋白質領域, 應用鹽析法使蛋白質沉淀出來已有80 多年的歷史。其突出的優點是成本低, 不需要特別昂貴的設備;操作簡單、安全;對許多生物活性物質具有穩定作用[2]。該法雖然分辨能力不高,但在粗級分離中仍然被經常采用。有機溶劑沉淀法也是較早使用的沉淀方法之一。有機溶劑對于許多蛋白質、核酸、多糖和小分子生化物質都能產生沉淀作用。其引起沉淀的主要原因在于改變介質的介電常數, 以及類似鹽析的爭奪水化水現象[2]。等電點沉淀法利用具有不同等電點的兩性電解質, 在達到電中性時溶解度最低, 易發生沉淀, 從而實現分離的方法。氨基酸、蛋白質、酶和核酸都是兩性電解質, 可以利用此法進行初步的沉淀分離, 此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白[3], 而不用于沉淀目的物。非離子型多聚物是20 世紀60 年代發展起來的一類重要的沉淀劑, 它們具有很強的親水性和較大的溶解度, 在溶液中可通過空間位置排斥作用使生物大分子、病毒和細菌等聚集沉淀。該法溫和的操作條件和較高的沉淀效能, 使得其經常被用于細菌、病毒、核酸和蛋白質的分離, 其中應用最多的多聚物是聚乙二醇[4,5]。

自Thomas Graham 1861 年發明透析方法至今已有140 多年, 透析已 成為生物化學實驗中最簡便最常用的分離純化技術之一, 在生物大分子的制備過程中, 除鹽、少量有機溶劑、生物小分子雜質和濃縮樣品等都要用到透析的技術, 同時半透膜的材料也更加多樣化、透析方式也更加豐富。超濾是一種加壓膜分離技術, 自20 世紀20 年代問世后, 直至60 年代以來其發展迅速, 很快由實驗室規模的分離手段發展成重要的工業單元操作技術[6]。超濾作為一種高效分離技術, 廣泛用于含有各種小分子溶質的各種生物大分子的脫鹽、濃縮和分級分離。溶劑萃取法(是用一種溶劑將產物自另一種溶劑(如水)中提取出來, 以達到濃縮和提純的目的)是20世紀40 年代興起的一項化工分離技術, 并很快應用到了生物分子的提取和分離上。最初是用于抗生素、有機酸、維生素等生物小分子的提取。最近幾十年來隨著與其它技術的結合而產生了一系列新的分離技術, 如逆膠束萃取、超臨界萃取、液膜萃取等, 可以用于生物大分子如核酸、蛋白質、多肽等的提取和精制。現代分離方法 3.1 色譜方法

1903 年俄國植物學家Tswett, 在一填有碳酸鈣的玻璃柱中注入用石油醚萃取的植物色素, 在室溫下展層, 得到不同的色素區帶, 后來稱之為色譜[7]。色譜分離又稱層析。最初, 層析技術并未得到關注。20 世紀50 年代, 氣液層析得到發展, 并在石油、化工、制藥等領域得到應用。到60 年代, 由于開發出適用于生物物質分離純化的層析固定相, 層析技術才被用于生物物質的分離純化并得到迅速發展[7]。至今, 已有豐富的色譜技術被用于生物大分子的分離。液相色譜法是分析化學中發展最快, 應用最廣的分析方法, 它在許多領域成為必不可少的手段,其中高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)更是以其獨特的優點占據突出地位。HPLC 用于生物化學樣品分析始于20 世紀70年代中期, 80 年代針對生命科學領域分離和制備而設計的生物色譜填料為HPLC 在生命科學研究領域的地位奠定了堅實的基礎;90 年代, 隨著生物醫藥研究與開發的迅速發展, 各種類型的高通量及手性色譜柱紛紛出現[8]。HPLC 是目前最通用、最有力和最多能的層析形式, 在生物大分子的分離分析中,HPLC 分離模式主要有反相色譜（RPC), 空間排阻色譜(SEC), 離子交換色譜(IEC), 疏水作用色譜(HIC), 親和色譜(AC)等。反相液相色譜柱效高、分離能力強、重復性好、操作簡便、保留機理清楚, 是液相色譜分離模式中使用最為廣泛的一種。它與多數其它形式的層析不同之處在于固定相基本上是惰性的, 固定相與被分離物之間只可能有疏水作用。它吸引人的地方在于流動相的小小變化, 例如加入鹽, 改變pH 或有機溶劑的量就能成功地影響分離特性。它在20 世紀50 年代就已用于許多有機小分子的分離和分析,80 年代后逐步應用于生物大分子如蛋白質、多肽、核酸的鑒定,并用于制備規模的分離[8]。半個世紀前, 隨著交聯聚苯乙烯的出現和發展, 離子交換色譜成為一種重要的分離工具。離子交換色譜的填料及含鹽的緩沖流動相系統類似于蛋白質穩定存在的生理條件, 有利于保持生物分子的活性和構象。因此, 它在解決生物學中許多難于分離的問題上起到了重大作用。隨著HPLC 的飛速發展, 以及各種新型離子交換材料的出現, 離子交換色譜在氨基酸、蛋白質、核酸、有機酸、糖類及藥物等方面的應用越來越廣。空間排阻色譜所用 的固定相是具有一定孔徑范圍的多孔性物質凝膠, 是按溶質分子大小進行分離的色譜技術, 又稱尺寸排阻色譜或凝膠色譜。按流動相類型不同分為凝膠滲透色譜和凝膠過濾色譜。十多年來該法在凝膠制備, 儀器技術性能, 數據處理和理論研究上取得的進展, 促進了該技術在許多領域的應用。親和層析是60 年代發展起來的一種高效、快速的分離純化技術。它是一種利用生物大分子能夠通過范德華力、疏水力、空間和靜電相互作用,與配體特異、可逆地結合在一起的生物學特性, 從復雜的生物樣品中分離得到目標產物的液相色譜技術。親和層析容量大, 選擇性強, 分離效率高, 且對目標產物的生物活性起到一定的保護作用, 最先被用于酶的純化, 現在已廣泛地用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受體、細胞器甚至完整細胞的純化[3]。科學的發展使得分離分析的對象越來越復雜,從而提高了對分離分析技術的要求, 促進了各種新技術的發展。二維液相分離方法, 二維液相分離/ 質譜分析方法等多種自動化二維系統均得到了開發利用, 如Lundell 和Markides采用離子交換和反相色譜二維液相模式分離了復雜生物樣品中的肽;Bushey 和Jorgenson設計了用陽離子交換和體積排除分離模式的自動化二維系統等。HPLC 與光譜或波譜技術的在線聯用也成為了解決復雜樣品體系的有力手段。目前最常用最有效的是高效液相色譜-質譜(mass spectroscopy, MS)聯用技術, 高效液相色譜-核磁共振(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)等也在研究開發中。與此同時,快速分離技術也得到了迅猛發展, 在20 世紀70 和80 年代需要1h 分離的樣品現在可能只要幾分鐘甚至幾秒鐘即可完成, 有關快速HPLC 及其應用也多有報道, 如Unger 等最早 采用緩沖溶液鹽濃度梯度, 以4mL/min 流速在2.5min 內分離了8 種蛋白質。近年來, 隨著生物技術和醫藥工業的發展, 傳統的分離手段已經不能滿足對大量樣品高純度分離的要求, 液相制備色譜的發展研究為解決實際應用中出現的問題帶來希望。20 世紀70 年代初開發出的模擬移動床色譜具備分離能力強,設備體積小,投資成本低, 便于實現自動控制并特別有利于分離熱敏性及難以分離的物系等優點, 在制備色譜技術中最適含用于進行連續性大規模工業化生產, 其應用范圍也不斷擴大, 已出現采用該技術分離氨基酸、單克隆抗體和蛋白質的研究[17]。超臨界流體色譜(supercritical fluid chromatography,(SFC)是以超臨界流體(supercritical fluid, SF)作為流動相的一種新穎的色譜技術, 具有分析速度快、選擇性好、分離效率高、分析條件溫和等優點,可分析氣相色譜不宜分析的高沸點、高分子量、低揮發性和熱不穩定試樣, 又比高效液相色譜有更快的分析速度和更高的柱效。自60 年代起逐漸出現一些有關該技術的研究報道。超臨界流體色譜應用領域十分廣泛, 可用于分離分析熱敏性物質、非揮發性高分子、生物大分子、極性物質和手性對映體等。目前, SFC 與MS、FT-IR(fourier transform infraredspectrometer, 傅里葉變換紅外光譜儀)、NMR等聯用技術也逐漸得到開發。

3.2 電泳技術及其它

電泳現象于1808 年被發現, 在1937 年由瑞典科學家Tiselius A 首次將其作為一種分離技術所應用。隨著電泳支持物的改進, 電泳條件的完善,區帶電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳等技術逐漸建立起來。同時, 在 電泳模式上也有了極大的發展, 先后出現了圓盤電泳、垂直板電泳、脈沖電泳等, 電泳分辨率也隨之得到提高。1956 年Smithies 和Poulik最早引入雙向電泳技術, 他們將紙電泳和淀粉凝膠電泳結合起來分離血清蛋白, 隨后雙向電泳技術得到很快的發展。目前所應用的雙向電泳體系由O’Farrell 等于1975 年發明, 第一向為等電聚焦電泳, 第二向為變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。這是目前唯一能將數千種蛋白質同時分離與展示的分離技術。該技術的應用與發展對開展“蛋白質組”的研究具有重要意義。同時,針對雙向電泳技術的某些缺陷, 相應的改進技術也得以應用, 如窄范圍pH 膠條的使用, 膠上差示電泳(differential in-gel electrophoresis, DIGE)技術。然而, 由于蛋白質二維凝膠分離、染色體轉移等環節操作困難, 且十分費時, 已被公認為是蛋白質組研究的技術“瓶頸”。因此, 發展快速、高效、高通量、在線的分離監督方法已成為蛋白質組學研究的重大科學問題之一。誰率先取得突破, 誰將占據蛋白質組學研究的有利地位。毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)是20世紀80 年代初期迅速發展起來的一種新型分離分析技術, 是經典電泳技術和現代微柱分離有機結合的產物。與傳統的分離方法相比, CE 具有分離效率高、分析速度快、樣品及試劑用量少等特點, 使其成為極為有效的分離技術, 廣泛應用于分離蛋白質、糖類、核酸等多種物質。目前, 不同分離模式的毛細管電泳技術已成為最重要的生物樣品分離分析手段, 如毛細管區帶電泳、毛細管膠束電動色譜、毛細管凝膠電泳、毛細管等速電泳、毛細管等電聚焦等。近來, 許多有關多維毛細管電泳分離技術的設想已被提出, 有些還得到了初步的嘗試, 其分離的優勢也 得到人們的關注[9]。毛細管電色譜(CEC)是利用電滲流或電滲流結合壓力來推動流動相移動的一種液相色譜分離法。它集CE 和HPLC的優勢與一身, 既有CE 水平的高柱效, 同時還具有HPLC 的高選擇性。近年來其應用已引起廣泛關注。目前, 毛細管電色譜的研究主要側重于方法本身的完善和發展, 以及與質譜等定性分析技術聯用的研究開發。微流控芯片于20 世紀90 年代初由瑞士的Manz 和Widmer 提出, 它是通過微細加工技術將微通道、微泵、微閥、微儲液器、微電極、微檢測元件窗口和連接器等功能元件像集成電路一樣, 使它們集成在芯片材料上的微全分析系統。近10 年來,隨著微制造技術和電子技術的不斷進步, 微流控芯片得到了迅速的發展, 并成為生物樣品分離分析的重要手段和研究熱點, 先后出現了毛細管電泳芯片、毛細管電色譜芯片、樣品制備和分離的集成系統等。展望

生命科學的發展決定了追求高效、快速、高通量、集成化的生物樣品分離分析方法必將成為未來的發展方向。分子生物學中一個眾所周知的事實是蛋白質生物活性和功能多是在溶液中顯現的, 因此液相色譜的強大功能使得其在生命科學及其它領域的重要地位不會動搖, 面對復雜體系的分離任務, 它仍在不斷完善發展。芯片系統將不斷發展建立更多的實用體系, 開發更廣泛的應用價值。多通道毛細管電色譜儀器也將被開發。對超臨界流體性質的認識深入, 將推動超臨界流體色譜技術的發展和應用。各種分離模式相結合構成的多維分離方法也將得到進一步的研究開發, 以實現將一根色譜柱上未分開的組分在另一根柱上用不同的 分離原理加以完全分離。各種分離設備將與光譜、波譜這類提供結構信息的儀器進行在線連接, 建立起更多的聯用方式, 以實現分離, 定性定量分析一體化。

隨著生物技術成果的不斷積累和生物技術產業化進程的不斷推進, 生物制品的分離與純化技術已成為實現生物高技術產業化的關鍵, 在理論和技術研究上都得到了長足的發展。發展層析柱和凝膠過濾柱的放大技術, 大規模分離過程的自動控制,下游工程的集成優化技術等成為工業化生產中的關鍵。液相色譜是工業生產上常用的有效方法,而模擬移動床色譜和徑向色譜等將在生物工程領域發揮越來越重要的作用。在研究和完善一些適用于生化工程的新型分離技術的同時, 進行各種分離技術的高效集成化, 可以達到提高產品收率、降低過程能耗和增加生產效益的目標。在這個各學科快速發展, 并相互影響的時代,生物大分子分離技術必將不斷的推陳出新, 以更加方便、高效、快捷的方式應用于科研和生產領域。參考文獻

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