第一篇：研究人員揭開艾滋病毒如何“劫持”人體免疫細胞

研究人員揭開艾滋病毒如何“劫持”人體免疫細胞

更多相關新聞時間:2014-3-26 9:50:49,點擊:111

哈爾濱工業大學生命學院黃志偉教授課題組，在世界上首次揭示了艾滋病病毒毒力因子（Vif）的結構，闡明了Vif如何“劫持”人免疫細胞的分子機制，為研制全新艾滋病藥物提供了結構基礎。相關論文日前在《自然》雜志上在線發表。

艾滋病病毒猶如一把鎖，其內部結構如何，始終困擾著廣大學者。在艾滋病病毒的9大基因中，Vif是其毒力因子，可以視為針對人類進化而生的，作用就是在人體免疫細胞內進行病毒生成和復制。30多年來，人類對艾滋病一直缺少有效療法，關鍵在于Vif自身或其功能性復合物的原子水平結構圖未被解析和繪出。“換句話解釋，艾滋病病毒Vif通過‘劫持’人免疫細胞內蛋白降解系統來弱化人免疫細胞，從而逃避免疫細胞對艾滋病病毒的識別和防御。”黃志偉說。

黃志偉課題組的研究自2012年7月開始，在1年多的時間里，他們弄清了Vif五元復合物結構，顯示出Vif結構自身形成與目前所有已知蛋白結構不一樣的折疊，同時揭示了Vif如何“劫持”人CBF-β以及CUL5 E3連接酶復合物的分子機制。

黃志偉說，揭示Vif的結構為未來艾滋病治療從雞尾酒式的混合用藥方式，轉向研制靶向治療藥物提供了一個新思路。目前，黃志偉課題組正在和國內相關高校實驗室密切合作，進行艾滋病新藥的研發和攻關。

第二篇：人體免疫細胞閱讀答案

閱讀短文，完成7～8題。（共4分）

人體免疫細胞能發現并殺死被感染的細胞而不傷害健康的細胞，其機理一直困惑著人們。科學家最近初步揭開了其中的奧秘，原來被感染的細胞能發出信號向免疫細胞求救。

美國馬里蘭大學的一個科研小組最近在英國《自然》雜志上發表論文指出，人體細胞中大都含有肽，它是細胞健康狀態的標志物。細菌或病毒侵入細胞后會破壞該細胞，同時自己也分解繁殖。這時肽分子就會與細菌或病毒碎片結合。這樣，附近的免疫細胞就得到該細胞受感染的信號，然后通知其他免疫細胞一同將受感染的細胞及其中的感染物殺死。

該科研小組是利用X射線晶體分析法發現這一奧秘的。他們選用了能誘發某些白血病的HTLV病毒作為研究對象，并在免疫細胞T細胞中發現了這一病毒的受體。當肽分子與該病毒殘片結合后，就會激發附近的T細胞上該病毒的受體，從而使T細胞發揮作用。科學家說，T細胞上含有上百萬個不同的受體，利用它可發現大量細菌或病毒并將受其感染的細包殺死。

7．第二段中,它（肽）是細胞健康狀態的標志物的意思是（▲）（2分）

A．人體細胞在健康狀態下，其中才會有肽分子存在。

B.肽在細菌或病毒入侵后能發生求救信號，維護人體健康。

C．人體在健康的狀態下，細胞內含有的肽相對較多。

D．肽分子能將入侵的細菌或病毒分解并與其碎片結合。

8．下列說法不符合原文意思的一項是（▲）（2分）

A．向免疫細胞發生求救信號的是人體細胞中的肽分子。

B．肽分子與細菌或病毒的碎片結合后，會激發T細胞內肽的受體。

C．最終殺死細菌或病毒的是T細胞中的細菌或病毒的受體。

D．T細胞中的受體，不僅殺死了細菌或病毒，還殺死了受感染的細胞。

參考答案：

7、B [解題思路］

它（肽）是細胞健康狀態的標志物的意思是肽在細菌或病毒入侵后能發出求救信號，維護人體健康。

A項把因果關系倒轉了。是肽維護人體健康，而不是在健康狀態下才會有肽分子存在。

C項也是犯了同樣的錯誤，應是有肽在，人體才會健康，而不是相反。

D項是從肽分子的功能方面說的，不是對題目中那句話的直接的解釋。

8、B項肽分子與細菌或病毒的碎片結合后，激發的是T細胞內病毒的受體，而非肽的受體。

第三篇：人體免疫教案

七年級生物下冊《人體免疫》教案北師大版 “人體免疫”一節的教學設計 1教材分析

“人體免疫”是北師大版七年級下冊第四單元第13章第3節“人體免疫”第二節的內容。學生通過第13章1、2節的學習養成健康的生活習慣，拒絕吸煙、酗酒、吸毒，為人類創建健康的生活環境，以及預防傳染病等的知識，本節課的知識比較抽象，而且“抗原”、“抗體”、“特異性免疫”、“非特異性免疫”的概念都比較難理解，我們從人健康的生活、學習開始，結合人們身邊存在傳染病的實際例子，從學生自己曾經患過的病或家里人患的病等，讓學生親身體驗，激發學生的學習興趣和求知欲，同時，結合前面11章學習過的皮膚以及在第9章學習過的血液，使得我們更直觀地認識特異性免疫與非特異性免疫，使我們更容易進入“人體的免疫”的學習。

本節課內容不多，所以安排了一個課時。2 教學目標 【知識目標】：

（1）描述人體的免疫功能。

（2）理解特異性免疫對人體的主要作用。（3）區別特異性免疫和非特異性免疫（4）說出計劃免疫的意義。【能力目標】：

（1）通過收集資料，培養收集信息以及分析判斷的思維能力。（2）通過交流,增強團結協作的能力。

（3）通過對知識的歸納提高自我總結的能力。【情感態度與價值觀】：

（1）結合自身打預防針的親身經歷，深刻認識到黨和國家關心下一代健康成長，為提高人口素質所進行的計劃免疫的重要性，特別是改革開放20年來我國在醫藥衛生事業和傳染病的預防方面所取得的偉大成就，增強愛國精神。（2）培養關愛生命的情感，并提高學習關注社會生活的主人翁意識及理論聯系實際的情感。3教學重點和難點： 重點：特異性免疫與非特異性免疫的區別是本節課的重點。因為主要內容是特異性免疫和非特異性免疫，而且特異性免疫與非特異性免疫之間有聯系又有區別，學生不容易區分，因此將特異性免疫與非特異性免疫確定為本節課重點。

難點：非特異性免疫的概念以及非特異性免疫所涉及的抗體、抗原的概念都比較抽象，是本節課的難點七年級生物下冊《人體免疫》教案北師大版七年級生物下冊《人體免疫》教案北師大版。

我會采用生活實例與教材緊密結合，合理運用掛圖、課件和課本上水痘的例子讓抽象知識具體化。4 學情分析

學生通過第13章1、2節的學習養成健康的生活習慣，拒絕吸煙、酗酒、吸毒，為人類創建健康的生活環境，以及預防傳染病等的知識。同時，也在前面第九章、第十一章學習過了白細胞、皮膚，為這節人體免疫的學習打下了基礎。學生從幼兒起已經接種疫苗，學生對打預防針有一定的了解，學生學習積極性高，他們非常希望學習人體免疫的知識。通過調察、比較、討論和總結等學習方法，可以比較輕松地完成學習目標。5 教學過程

5.0課前準備：教師準備---皮膚掛圖、白細胞吞噬病毒掛圖、小腸上皮粘膜的掛圖。學生準備---做好老師布置的調查表 流感水痘其他 爸爸 媽媽 自己

5.1情境導入（2min）

1、現在準備進入秋天時，正是感冒流行的季節，有的人始終很健康的生活，工作，學習，而有的人卻未能幸免？

2、同學們是否還記得打預防針的經歷，這些事實與人體的什么功能有關？

3、請大家拿出課前做的調查表，討論和交流一下。

設計意圖：通過情境導入，設置懸念，激發學生的學習興趣，讓大家思考而且學生在課前經過一次自己的小小調查，更能吸引學生對本節課的學習興趣，讓大家帶著興趣，進而更深入了解，進入課堂正題。

5.2非特異性免疫(15min)采用“科學探究模式”，具體步驟：準備——初探——交流——總結。課前老師將學生分成幾個小組，結合教材，進行討論，得出問題答案，每當一個小組說完后，教師都會提問：“還有無其他小組有其他答案？”讓學生各抒己見，再向全班同學交流，得出正確結論。

1、探究一：看看下圖，結合課本P112第一段話，思考以下問題：

(1)人體完整的皮膚為什么有保護和屏障的作用？為什么擦破了的皮膚又會發炎呢？

(2)我們在呼吸時難免會吸進細菌或塵埃，為什么大部分吸進的細菌或塵埃不能對人體構成傷害呢？(3)總結（1）（2）問題的答案說說人體第一道防線有什么？

學生活動一：4個同學為一個小組，結合圖片與課本討論老師提出的問題。然后小組代表回答問題。

（1）完整的皮膚組織細胞相連在一起，使細胞無法逾越。細菌侵入擦破了的皮膚導致感染（2）呼吸道粘膜上有纖毛，有清掃異物的作用。（3）人體第一道防線包括皮膚和粘膜

2、探究二：看看下圖，結合課本P112第二段話，思考以下問題：

(1)感染后的皮膚為什么會出現紅腫現象，有時還會化膿，為什么有時自己會痊愈？(2)人體的口腔有很多細菌，口腔上皮受傷后很快愈合，人體的唾液是否有殺菌作用？(3)總結（1）（2）問題答案說說人體第二道防線包括了什么？

學生活動二：4個同學為一個小組，結合圖片與課本討論老師提出的問題。然后小組代表回答問題。

（1）體液中的殺菌物質和吞噬細胞能殺死細菌，消除炎癥（2）唾液有溶菌酶具有殺菌作用。

（3）人體第二道防線包括了白細胞的吞噬作用和唾液中的溶菌酶的殺菌作用。

教師總結：總結這兩道防線在人體中的作用特：人人天生就有的，對多數病菌起作用的，而不是病原體侵染后才產生的，它的作用沒有特異性七年級生物下冊《人體免疫》教案北師大版學習總結。包括了皮膚和粘膜的屏障作用、白細胞的吞噬作用、唾液中溶菌酶的殺菌作用。這就是非特異性免疫5.3特異性免疫（15min）教師以情境導入到方式進入特異性免疫的教學。

教師：小時候大人跟我們說，不要和得了腮腺炎或得了水痘的人玩，但是，如果得了一次以后就再也不會得了。那時，我就天天盼著自己得腮腺炎，因為得了以后就再也不會得了。這是為什么呢？ 學生：有免疫力了。學生：抵抗力增強 學生：??

教師：人體除了非特異性免疫外，還有更重要的特異性免疫。教師：患過水痘的人體內能產生一種特殊的蛋白—抗體，這種抗體具有抵抗水痘病毒的能力，使人不再患水痘。而引起人體產生抗體的物質叫做抗原。老師先播放感染水痘病毒的動畫，讓學生有一個感性的認識。

然后，教師再展示感染水痘病毒示意圖，并分步詳細解說產生抗體的過程。促進 結合 病原體（抗原）刺激吞噬細胞 淋巴細胞

使抗原失去致病性 抗體 產生

教師：有些同學會混淆了抗原與抗體的概念，大家可以通過抗原一般是病原體，病原體有一個原字，所以就是抗原，抗體一般在我們身體體內，所以，為我們人體排除和消滅病原微生物，維護人體健康的就是抗體。

教師：特異性免疫是后天獲得的，專一的，免疫系統接受抗原刺激后產生抗體，抗體被清除后身體仍

保持產生相應抗體的能力。當同樣的抗原再次侵入人體，人體就會產生大量抗體。這種免疫就是特異性免疫七年級生物下冊《人體免疫》教案北師大版七年級生物下冊《人體免疫》教案北師大版。

教師：非特異性免疫和特異性免疫都是排除和消滅人體的病原微生物，維護人體的健康。免疫還能及時清除體內衰老的、死亡的損傷的細胞；隨時識別和清除體內產生的異常細胞（如腫瘤細胞）。

設計意圖：利用水痘等生活中的實例，啟發學生思考特異性免疫的過程，并結合圖片，教師一步一步演示病毒侵入人體的過程，運用動畫的形式，讓抽象的知識直觀化，形象化。5.4特異性免疫與非特異性免疫的區別（5min）

探究三：結合剛剛學過的知識和課本上P112-P113上的內容，填寫下表 特異性免疫非特異性免疫 不同點范圍 特性 形成 作用 相同點：

學生活動：獨立完成表格，并派9位同學到黑板上完成表格。特異性免疫非特異性免疫

不同點范圍對體外異物都有反應只對一種異物有反應 特性非專一性專一性

形成先天形成的后天形成的 作用弱強

相同點排除和消滅人體的病原微生物，維護人體的健康 討論：運用本節課知識討論剛剛在情境導入時提出的問題。5.5計劃免疫和課堂拓展（3min）5.51教師設疑：（1）什么叫計劃免疫，計劃免疫有什么意義？

（2）給剛出生的嬰兒接種卡介苗的目的是什么？接種百日破聯合疫苗的目的是什么？（3）你有打過預防針嗎？打過哪些？是預防什么病的？ 學生結合課本，得出正確結論。學生活動：（1）計劃免疫是依據國家對消滅傳染病的要求，在易感人群中，有計劃地進行預防接種。意義：能有效地增強人體的免疫了。

（2）接種卡介苗的目的是預防結核病，接種百日破聯合疫苗的目的是預防百日咳、白喉、破傷風。5.52課堂拓展

（1）免疫功能是不是越強越好呢？過強的免疫會導致什么結果呢？

不是，過強的免疫會導致過敏現象（2）醫生給病人移植別人的肝臟，結果這肝臟沒成活，為什么呢？ 人體的排異作用

（3）課本P114人接痘

（4）艾滋病 人體免疫 6 教學反思：

通過教學使學生認識到人體的保護功能是人體的免疫，其中非特異性免疫是人體的屏障，認識到皮膚損傷感染后自然痊愈的道理，人體的重要保護功能之一是特異性免疫，理解計劃免疫的重要意義。學生在課堂上通過掛圖、圖片、動畫演示等，充分認識到免疫的重要性。

本節課教學內容抽象，如抗體―抗原、特異性免疫的基本過程，學生學習后還是有一部分難理解，教材提供的實物資料少。在計劃免疫這部分，學生雖然對預防接種有比較直觀的認識，但是認識還是停留在表面現象。我認為，本節課的教學在預習時讓學生從家長處了解預防接種的基本情況，如果有多媒體，教學效果會更好。

第四篇：細胞免疫療法最新調研

細胞免疫療法最新調研

一、以下為調研查到的確定開展細胞免疫療法的醫院（1）對細胞免疫療法極力推薦的三甲醫院：

1、廣州復大腫瘤醫院

? 國內首批開展生物治療衛生機構 ? 國內率先開展聯合免疫療法治療方案醫院 ? 同時開展T-plus腫瘤免疫治療的研究與治療 ? 作術后及放化療后的配合使用細胞免疫治療

? 多應用于：胰腺癌，肝癌，肺癌，食管癌，胃癌，乳腺癌

2、廣州醫學院附屬腫瘤醫院 ? 國內首批開展生物治療的衛生機構 ? 研究：DC-CIK療法 ? 多應用于：肝癌、胃癌 ? 應用病例已達幾千余例（保留）

3、北京武警總隊第二醫院

? 中華醫學會腫瘤生物治療課題定點醫院 ? 國內首家多細胞免疫治療醫院

? 研究：CIK細胞、NK細胞、CD3AK細胞 ? 多應用于：食道癌、肺癌、乳腺癌

? 應用超過3000例

4、解放軍458醫院（廣州）? 細胞治療作為放化療的支持治療 ? 多應用于：肺癌、乳腺癌、肝癌 ? 研究：DC細胞、CIK細胞、CAPRI細胞

5、天津醫科大學附屬腫瘤醫院

? 到2008年9月，應用CIK細胞對腫瘤患者實施免疫治療，已進行300余例肺癌患者的治療。

6、解放軍第123醫院（安徽）? 安徽領先的腫瘤治療醫院 ? 研究：DC-CIK療法

? 多應用：肝癌、食道癌、肺癌

7、漳州市醫院（福建）

? 生物免疫治療中心：一天接待不超過5名患者

8、解放軍第454醫院（南京）? 研究：DC-CIK療法 ? 多應用：食道癌、膽癌

9、吉林省人民醫院

? 吉林省生物免疫治療最高可報90% ? 肺癌、胃癌

10、天津市人民醫院

? 多應用：黑色素瘤、食道癌

? 研究：DC細胞、CIK細胞、NK細胞、CD3AK細胞、γδT細胞

11、遼寧省人民醫院

? 多應用：直腸癌、宮頸癌、乳腺癌 ? 研究：CIK細胞

12、上海仁濟醫院

? 應用：乳腺癌、肺癌

13、遵義醫學院附屬醫院 ? 多應用：鼻咽癌、乳腺癌

14、海口市人民醫院

? 海南生物診療報銷比例可達90% ? 研究：DC-CIK療法

? 應用：胃癌、乳腺癌、肝癌、結腸癌

15、洛陽市中心醫院

? 研究：NK細胞、T細胞（CLS生物療法）

16、哈爾濱醫科大學附屬第四醫院

? 應用：肝癌、胃癌

? 生物治療中心每日限制最多6人就診

17、解放軍漳州175醫院

18、武警山東省總隊醫院

? 應用：肺癌、胃癌、腎癌、黑色素瘤

19、重慶市腫瘤醫院

? 研究：DC-CIK療法

? 應用：肺癌，曾應用于左腮腺米庫林氏病

20、山西醫科大學第二醫院

（2）簡單提及有開展細胞免疫治療的醫院

1、中山大學附屬第一醫院：簡單提及

2、廣州市第一人民醫院：生物免疫治療，“近期開展”。

3、廣東省第二人民醫院：免疫細胞治療，腫瘤二科。

4、廣州市紅十字會醫院：詳細提及，腫瘤生物治療。

5、廣州軍區總醫院：生物治療

6、中山大學腫瘤醫院：簡單提及。

7、南方醫院：有生物治療中心

8、廣東藥學院附屬第一醫院：自體細胞免疫治療技術取得實質性進展

9、粵北人民醫院：提及生物治療。

10、深圳市人民醫院：擁有生物治療室。

11、佛山市第一人民醫院：晚期肺癌和晚期胃腸癌的細胞免疫治療。

12、中國醫科院腫瘤醫院（北京）

13、第二軍醫大學東方肝膽外科醫院（上海）

（3）全國腫瘤排名較前并開展了細胞免疫治療的醫院：

1、中山大學腫瘤醫院（排名第一）

2、中國醫學科學院腫瘤醫院（排名第二）

3、天津市腫瘤醫院（排名第三）

4、第二軍醫大學東方肝膽外科醫院（排名第五）

5、南方醫院（排名第八）

——相信還有很多已開展了細胞免疫療法，而未在官網或其他渠道宣傳的三甲醫院。

二、估算：

1、細胞免疫治療現行應用較多的腫瘤類型為：肺癌、胃癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、乳腺癌。相關規定，三甲醫院才能資格開展細胞免疫療法。

2、開展生物細胞免疫治療的三甲醫院的比例：以廣東65家三甲醫院（2011年），可查的在官方網站記載有生物免疫療法的，共有13家，比例達到20%，若按照這個比例，全國共有超過1000家三甲醫院，則大約有200家三甲在開展生物細胞免疫治療腫瘤。

3、治療費用：綜合幾家明確給出價格參考的醫院為依據，有治療胃癌在2.5至5萬一個療程，肝癌在3萬/療程，另有2.6萬/療程。我們保守估計以2.5萬/療程作為參考值。

4、療程的時間：可查的細胞免疫治療過程為：采血、培養、回輸三大塊，送GMP實驗室進行體外誘導6-7天，然后分5-6天，每天2次回輸，約2周一個療程。

5、市場容量的估算：以現時細胞免疫療法的普及程度，按保守每家醫院5例/月，廣東省13家三甲1年約780例：2.5萬/療程* 780例=1950萬左右；全國約12000例，市場容量在2.7億到3億間。

第五篇：免疫細胞的分離和保存技術

免疫細胞的分離和保存技術

用體外方法對機體各種具有免疫反應的細胞分別作鑒定、計數和功能測定，是觀察機體免疫狀態的一種重要手段。為此，須將各種參與免疫反應的細胞從血液或臟器中分離出來。參與免疫反應的細胞主要包括淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等。由于檢測的目的和方法有同，分離細胞的需求和技術也異。有的僅需分離白細胞，有的則需分離單個核細胞（mononuclearcell），其中含淋巴細胞和單核細胞（monocyte），有的則需分離T細胞和B細胞以及其亞群。分離細胞選用的方法應力求簡便可行，并能獲得高純度、高獲得率、高活力的細胞。現用分離細胞群的原則，一是根據各類細胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以組分，另一則按照各類細胞的表面標志，包括細胞表面的抗原和受體加以選擇性分離。

一、白細胞的分離

（一）血液中紅細胞與白細胞比例約600～1000:1，兩者的比重不同其沉降速度亦異，通常用兩種方法加以分離。

本法是利用血細胞自然沉降率的分離法，采集血液后應及時抗凝，通常選用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原轉化為凝血酶，從而抑制纖維蛋白原形成纖維蛋白而防止血液凝固。操作原則是將含抗凝血的試管直立靜置室溫30～60min后，血液分成明顯三層，上層為淡黃色血漿，底層為紅細胞，緊貼紅細胞層上面的灰白層為白細胞，輕輕吸取即得富含白細胞的細胞群，離心洗滌后加入少量蒸餾水或含氯化銨的Gey溶液，經短時間的低滲處理，使紅細胞裂解，經過反復洗滌可得純度較高的白細胞懸液。

（二）聚合物加速沉淀法

本法是利用高分子量的聚合物如明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使紅細胞凝集成串，加速紅細胞沉降，使之與白細胞分離。本法的細胞獲得率比自然沉降法高。

二、外周血單個核細胞的分離

外周血中單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，其體積、形態和密度與其他細胞不同，紅細胞和多核白細胞密度較大，為1.090左右，而淋巴細胞和單核細胞密度為1.075～1.090，血小板為1.030～1.035。為此利用一種密度介于1.075～1.092之間而近于等滲的溶液（分層液）做密度梯度離心，使一定密度的細胞按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。

（一）Ficoll分層液法

主要用于分離外周血中的單個核細胞，是一種單次密度梯度離心分離法。聚蔗糖－泛影葡胺是一種較理想的細胞分層液，其主要成分是一種合成的蔗糖聚合物稱聚蔗糖（商品名為Ficoll），分子量為40kD，具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點。高濃度的Ficoll溶液粘性高，易使細胞聚集，故通常使用60g/L的低濃度溶液，密度為1.020，添加比重為1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度。國外常用商品Isopaque或Hypaque，故又稱Ficoll-Hypaque分層液，將適量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合適分層液。分離人外周淋巴細胞以密度為1.077±0.001的分層液最佳，因為人的紅細胞密度為1.093，粒細胞密度為1.092，單個核細胞在1.076～1.090之間。而不同動物血中的單個核細胞對分離液的密度要求各不相同，如小鼠為1.088，馬為1.090。分離時先將分層液置試管底層，然后將肝素化全血以Hanks液或PBS液作適當稀釋后，輕輕疊加在分層液上面，使兩者形成一個清晰的界面。水平式離心后，離心管中會出現幾個不同層次的液體和細胞帶（圖20-1）。

紅細胞和粒細胞密度大于分層液，同時因紅細胞遇到Ficoll而凝集成串錢狀而沉積于管底。血小板則因密度小而懸浮于血漿中，唯有與分層液密度相當的單個核細胞密集在血漿層和分層液的界面中，呈白膜狀，吸取該層細胞遞經洗滌高心重懸。本法分離單個核細胞純度可達95％，淋巴細胞約占90％～95％，細胞獲得率可達80％以上，其高低與室溫有關，超過25℃時會影響細胞獲得率。

（二）Percoll分層液法

這是一種連續密度梯度離心分離法。Percoll是一種經聚乙烯吡喀烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒，對細胞無毒性。利用Percoll液經高速離心后形成一個連續密度梯度的原理，將密度不等的細胞分離純化。用Percoll原液(密度1.135)與約等量雙離子強度的磷酸緩沖液均勻混合，高速離心后，使分層液形成一個從管底到液面密度逐漸遞減的連續密度梯度，再將已制備的單個核細胞懸液輕輕疊加在液面上，低速離心后，便得四個細胞層。表層為死細胞殘片和血小板，底層為粒細胞和紅細胞，中間有兩層，上層富含單個核細胞(75％)，下層富含淋巴細胞(98％)(圖-2)。該法是純化單核細胞和淋巴細胞的一各較好的方法，但操作流程較長，手續較多。

圖-2 連續密度梯度離心法分離單個核細胞中各細胞成分的分布示意圖

三、淋巴細胞及其亞群的分離

為研究免疫細胞的功能，常需高純度的淋巴細胞或其亞群，分離方法介紹如下。

（一）、純淋巴細胞群的采集

通常利用單核細胞在37℃和Ca2+存在條件下，能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠的特性，據此建立許多從單個核細胞懸液中去除單核細胞的方法，藉以獲得高純度的淋巴細胞群。

（1）粘附貼壁法

將已制備的單個核細胞懸液傾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃溫箱靜置1h左右，單核細胞和粒細胞均貼于平皿壁上，而未貼壁的非粘附細胞幾乎為純淋巴細胞，繼用橡皮刮下貼壁的細胞即為純單核細胞群。因B細胞也有貼壁現象，用本法分離的淋巴細胞群中B細胞有所損失。

（2）吸附柱過濾法

將單個核細胞懸液注入裝有玻璃纖維或葡聚糖凝膠SephadexG10的柱層中，凡有粘附能力的細胞絕大部分被吸附而粘滯在柱層中，從柱上洗脫下來的細胞主要是淋巴細胞。此法簡單易行，對細胞極少損害。

（3）磁鐵吸引法

利用單核細胞具有吞噬的特性，在單個核細胞懸液中加直徑為3μm的羰基鐵顆粒，置37℃溫箱內短時旋轉搖動，待單核細胞充分吞噬羰基鐵顆粒后，用磁鐵將細胞吸至管底，上層液中含較純的淋巴細胞。

（二）、淋巴細胞亞群的分離

分離相當純化的淋巴細胞亞群是細胞免疫檢驗的基本技術。其原則是根據相應細胞的特性和不同的標志加以選擇性純化。凡根據細胞的特性和標志選擇純化所需細胞的方法是陽性選擇法；而選擇性去除不要的細胞，僅留下所需的細胞是為陰性選擇。常用以下幾種方法：

（1）E花環沉降法

本法是將淋巴細胞與一定比例的綿羊紅細胞混合，待淋巴細胞形成E花環后，繼用淋巴細胞分層液分離細胞。浮懸在分層界面而不形成E花環的群則富含B細胞，而沉降在管底的形成E花環的細胞用低滲法處理，使圍繞細胞周圍的綿羊紅細胞快速裂解，則獲得純的T細胞。

（2）尼龍毛分離法

本法利用B細胞和單核細胞具有易粘附于尼龍纖維表面的特性，可將T和B細胞分開。操作原則是取松散而經過處理的尼龍毛（聚酰胺纖維），均勻充填在內徑5～6nm的聚乙烯塑料管（飲料管即可）內，經Hanks液浸透保溫，將單個核細胞懸液加入柱內，放37溫箱靜置1～2h。用預溫的含10％～20％小牛血清培養液灌洗，洗脫液內含有非粘附的T細胞，重復灌洗幾次以除去管內殘留的T細胞。再用冷或溫培養液邊沖邊洗邊擠壓塑料管，此時洗脫液內富含B細胞。如此得到的T細胞純度在90％以上，B細胞純度可達80％。

（3）親和板結合分離法

利用親和層析法分離淋巴細胞亞群，其原理是各種淋巴細胞亞群具有不同的抗原性，將相應抗體結合于塑料平板上，繼加細胞懸液，凡抗原陽性的細胞則與相應抗體結合，抗原陰性的細胞可從未吸附的細胞懸液中獲取（圖-3）。同樣若用特異性抗原交聯在塑料板上，則可分離得具有特異抗原受體的淋巴細胞。淋巴細胞受體與特異抗原或抗體接觸，可引起細胞激活，因此，凡欲去除細胞懸液內某一細胞亞群時，本法更適用。如要分離CD4+或CD8+細胞，則可用抗CD4或CD8單克隆抗體吸附。用抗Ig抗體則可分離B細胞。同樣，用活化的C3包被，可分離出有C3受體的細胞。

圖-3 親和分離法圖解

（4）熒光激活細胞分離儀分離法

熒光激活細胞分離儀（fluorescenceactivatedcellsorter，FACS）主要由4部分組成：①細胞流動系統及氣壓流速控制系統，②激光系統，③檢測與訊號處理系統，④細胞分選系統。其主要原理是細胞經熒光染色后，通過高速流動系統，細胞排成單行，逐個流經檢測區進行測定。當細胞從流動室噴嘴處流出時，超聲振蕩攪動液流，使液流斷裂成一連串的均勻小滴（40000個/s），每小滴內最多含一個細胞（其中只有百分之幾的液滴中含細胞），細胞經激光束照射產生熒光和散射光，由光電倍增管接收，轉換成脈沖信號，數據經電腦處理，分辨細胞的類型。如識別的是預計所需的細胞時（如T細胞、B細胞要其亞群），在細胞樣品流斷裂成小滴時，使液滴瞬即感應陽電荷、陰電荷或不帶電荷，使所需的細胞在電場偏轉下進入不同的收集管（圖-4）。用FACS分離細胞準確快速，能保持細胞活力，并可在無菌條件下進行，但儀器昂貴，極少用于常規，而多數僅作為研究的手段。

圖-4 熒光激活細胞分離儀簡圖

四、吞噬細胞的分離和收集

人外周血中單核－巨噬細胞可通過Pecoll密度梯度分離法獲取，但數量較少，用血量多。用斑蝥敷貼法可從人體組織液中獲取較純的巨噬細胞，不需作進一步體外分離，細胞量損失較少。該法是用濾紙蘸取10％中藥斑蝥酒精浸出液，貼敷在臂內側皮膚表面，4～5h后皮膚局部充血，48h后局部形成水皰，吸取皰中的組織液，內含巨噬細胞。但此法對病人皮膚有一定損傷，有時可引起局部感染，應慎用。

欲獲取小鼠、大鼠、豚鼠等小動物的巨噬細胞，可經腹腔內注入少許石蠟油，3～4天后沖洗出腹腔滲出液，所得細胞懸液中70％～80％為巨噬細胞。

五、淋巴細胞的保存和活力測定

（一）、分離細胞的保存

在某些情況下，分離所得細胞需要加以保存，否則活力迅速下降，甚至死亡。

（1）短期保存技術

將分離到的細胞用適量含10％～20％滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培養液稀釋重懸。所用培養液要求等滲，具緩沖作用，并對細胞無毒性。通常置4℃保存較好，可減低細胞代謝活動。要注意不要迅速改變細胞所處的溫度，以免造成細胞“溫度”休克。

（2）長期冷凍保存技術

利用液氮深低溫（－196℃）環境保存細胞，是當前世界上通用的細胞長期保存技術。其原理在于深低溫環境可中斷細胞的代謝，但在降溫過程由于冰晶的形成和滲透壓的改變均可導致細胞的損傷和部分死亡，所以在冷凍過程中一定要加用冷凍保護劑，常用的保護劑為二甲亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）。冷凍時的降溫速度和細胞解凍時的升溫速度對細胞活力的保存有很大影響。條件合適時，凍存細胞一旦復蘇，恢復37℃培養，其形態和代謝活動均可恢復正常。操作的原則是先對需凍存的細胞作活細胞計數，低速離心后，取沉積細胞用含10％二甲亞砜的小牛血清配制成適當濃度的細胞懸液，分裝于凍存管內，速即放入降溫過渡站中，避免二甲亞砜對細胞的損傷。繼而進行降溫冷凍，目前常用兩步降溫法，即迅速降溫至一選擇好的臨界溫作為過渡站，如－80℃低溫冰箱過夜，或在液氮罐液面以上的一層空間放置片刻，然后再放入液氮中。如需復蘇細胞，則需迅速解凍以恢復細胞的活力，要求在20s以內完全融化。將凍存管自液氮中取出，立即放入40℃溫水中，融化后即從水中取出，吸出細胞懸液，加入10倍的培養液中混勻，繼而低速離心，盡快洗去保護劑，再懸于新培養液中，計數并檢查細胞活力，然后置37℃培養箱內培養。

（二）、細胞活力測定

細胞活力常用百分比表示，活力的大小對試驗結果有很大影響。細胞活力的測定有許多方法，最簡便常用的方法是臺盼藍（trypanblue）染色法。臺盼藍又稱錐藍，是一種陰離子型染料，這種染料不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色，但死亡細胞的細胞膜通透性增加，可使染料通過細胞膜進入細胞內，使死細胞著色呈藍色。免疫檢測試劑中常用的防腐劑有硫柳汞、疊氮鈉、抗生素等。

1.疊氮鈉是HRP的抑制劑，凡是和HRP接觸的試劑，一定不能用；

2.硫柳汞在ELISA試劑中可普遍使用，但因其有毒，較少使用；

3.市面許多試劑盒產品，用抗生素做防腐劑較多，如慶大。

4.如果試劑僅在實驗室短期使用，其實并不需加防腐劑，常規試劑放4度冰箱，抗體、酶等加甘油分裝凍存即可。

5.梅里埃生產的HIV診斷試劑中提到：對照血清的防腐用0.1g/L硫酸慶大霉素和0.2ml/L肉桂醛。

6.防污染可添加0.02%的疊氮鈉，或0.01%的硫柳汞。疊氮鈉在多數情況下有用且有效，但在有些實驗中卻不合適，因為它能阻斷細胞的電子傳遞鏈，對許多生物體都有毒醫學 教育網 搜 集整理性，因此不能用于活體實驗；因為含有氨基而能干擾許多標記方法；不能用于辣根過氧化物酶標記的抗體。而硫柳汞不含氨基，不影響基質的穩定性。如果將抗體應用于生物活性檢測、體內實驗，一般不使用任何防腐劑，這些實驗用的抗體應少量分裝冷存，切忌反復凍融。

7.吐溫-20是作為穩定劑，可減少非特異性黏合。甘油是防止凍融過程中的固-液相變而引起蛋白變性，能有效地增強蛋白質的穩定性，-20度凍存時甘油的濃度可以在20~30%。