第九章　酶免疫技術

第一節　酶免疫技術的特點

它是將酶與抗體或抗原結合成酶標記抗體或抗原，在酶標抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應完成后，加入酶的相應底物，通過酶對底物的顯色反應，對抗原或抗體進行定位、定性或定量的測定分析。

一、酶和酶作用底物

（一）酶的要求：一個酶蛋白分子每分鐘可催化103～104個底物分子轉變成有色產物。

1.酶的活性要強，催化反應的轉化率高，純度高。

2.易與抗體或抗原偶聯，標記后酶活性保持穩定，且不影響標記抗原與抗體的免疫反應性。

3.作用專一性強，酶活性不受樣品中其他成分的影響，受檢組織或體液中不存在與標記酶相同的內源性酶或抑制物。用于均相酶免疫測定的酶還要求當抗體與酶標抗原結合后，酶活性可出現抑制或激活。

4.酶催化底物后產生的產物易于判斷或測量，方法簡單易行、敏感和重復性好。

5.酶、輔助因子及其底物對人體無害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物應價廉易得。

（二）常用的酶

1.辣根過氧化物酶（HRP）：目前酶聯免疫吸附試驗中應用最廣泛的標記用酶。由無色的糖蛋白（主酶）和亞鐵血紅蛋白（輔基）結合而成的復合物。輔基是酶活性基團，而主酶則與酶活性無關，HRP的純度用RZ（HRP分別在403nm和275nm處的吸光度比值）表示，RZ值應大于3.0。

RZ值僅說明血紅素基團在HRP中的含量，并非表示HRP制劑的真正純度，而且RZ值高的HRP并不意味著酶活性也高，RZ值與酶活性無關。

酶活性以單位U表示：即1分鐘將1μmol底物轉化為產物所需的酶量。酶變性后，RZ值不變但活性降低，因此使用酶制劑時，酶活性單位比RZ值更為重要。

2.堿性磷酸酶（AP）：大腸桿菌來源的AP分子量80kD，酶作用最適pH為8.0；小牛腸黏膜AP分子量為100kD，最適pH為9.6；后一種AP的活性高于前者。

3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）：β-Gal來源于大腸桿菌。因人血中缺乏此酶，以其制備的酶標志物在測定時不易受到內源性酶的干擾，從而提高特異性，被用于均相酶免疫測定。

（三）常用的底物

1.HRP的底物

（1）鄰苯二胺（OPD）：是HRP最為敏感的色原底物之一。OPD在HRP的作用下顯橙黃色，加強酸如硫酸或鹽酸終止反應后呈棕黃色，最大吸收峰在492nm波長。OPD應用液穩定性差，易變色，需新配制后在1小時內使用，顯色反應過程需避光，而且具有致癌性。

（2）四甲基聯苯胺（TMB）：TMB經HRP作用后變為藍色，加入硫酸終止反應后變為黃色，最大吸收峰波長450nm。TMB穩定性好，成色無需避光，無致突變作用，是目前ELISA中應用最廣泛的底物。缺點是水溶性差。

（3）其他：5-氨基水楊酸（5-ASA）和2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）。

2.AP的底物

常用對-硝基苯磷酸酯（p-NPP），p-NPP經AP作用后的產物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。

3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）的底物

常用4-甲基傘酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU），酶作用后，生成高強度熒光物4-甲基傘形酮（4-MU），其敏度性較HRP高30～50倍，但測量時需用熒光計。

二、酶標記抗體或抗原

（一）酶標記抗體或抗原的制備

標記方法應符合：技術方法簡單、產率高，且重復性好；標記反應不影響酶和抗原或抗體的活性；酶標志物穩定，應避免酶、抗體（抗原）以及酶標志物各自形成聚合物等。

1.戊二醛交聯法：同源雙功能交聯劑。

（1）一步法：連接AP。

①優點：操作簡便、有效，重復性好。

②缺點：交聯時分子間比例不嚴格，大小不一，影響效果。

（2）二步法：連接HRP。

先將HRP與戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而形成酶標抗體。

優點：酶標志物質量較均一，標記效率也較一步法高。

2.改良過碘酸鈉法

HRP標記抗體或抗原的最常用方法。

（二）酶標記物的純化及鑒定

常用的純化方法有葡聚糖凝膠G-200/G-150過柱層析純化和50%飽和硫酸銨沉淀提純等。

常用免疫電泳或雙相擴散法進行鑒定。

1.出現沉淀線表示酶標記物中的抗體（抗原）具有免疫活性。

2.沉淀線經生理鹽水漂洗后，滴加酶的底物溶液，若沉淀線上顯色，則酶標記物中的酶活性仍保留。

三、固相載體

除均相酶免疫測定外，各種非均相酶免疫測定反應最后都需要分離游離和結合的酶標記物。

固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結合到固相載體的表面上，是酶免疫技術中將游離和結合的酶標志物迅速分離的最常用方法。

（一）固相載體的要求　結合抗體或抗原的容量大；可將抗體或抗原牢固地固定在其表面，經長期保存和多次洗滌也不易脫落；不影響所固定的抗體或抗原的免疫反應性，而且為使反應充分進行，最好其活性基團朝向反應溶液，固相方法簡便易行，快速經濟。

（二）固相載體的種類和選擇

1.塑料制品：聚苯乙烯塑料最常采用?？乖蚩贵w以非共價或物理吸附方式結合到此載體上。

主要缺點是抗體（抗原）結合容量不高、固相抗體（抗原）脫吸附率較高且不均一，孔間變異大，重復性差，從而影響測定的靈敏度、精確度及檢測范圍。

目前采用非共價和化學偶聯共價吸附方法進行抗原或抗體的固相化可改善上述缺點

2.微粒：易與抗體（抗原）形成化學偶聯，且結合容量大。均勻地分散到整個反應溶液中，因此反應速度快?？芍瞥纱呕㈩w粒。自動化檢測中常用。

3.膜載體：常有硝酸纖維素膜（Nc）、玻璃纖維素膜及尼龍膜等通過非共價鍵吸附抗體（抗原），廣泛用于定性或半定量斑點ELISA的固相載體。

（三）包被與封閉

1.包被：將抗原或抗體結合在固相載體上的過程。普遍使用的聚苯乙烯載體，將抗原或抗體溶于緩沖液（常用為pH9.6的碳酸鹽緩沖液）中，加于ELISA板孔中4℃過夜。包被好的固相載體在低溫可放置一段時間而不失去免疫活性。

2.封閉：包被的蛋白質濃度過低，固相載體表面不能被此蛋白質完全覆蓋，其后加入的血清標本和酶結合物中的蛋白質也會部分地吸附于固相載體表面，最后產生非特異性顯色致本底偏高，在這種情況下，需用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清再包被一次，消除此干擾，此過程稱為封閉。

第二節　酶免疫技術的分類

包括兩種：

酶免疫組織化學技術：用于組織切片或其他標本中抗原的定位。

酶免疫測定技術（EIA）：用于液體標本中抗原或抗體的定性和定量。根據抗原抗體反應后是否需將結合和游離的酶標志物分離，EIA一般可分為均相和異相兩種類型。

一、均相酶免疫測定

利用酶標志物與相應的抗原或抗體結合后，標記酶的活性會發生改變的原理，可以在不將結合和游離酶標志物分離的情況下，通過測定標記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。該法主要用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定，均相法的優點是適合于自動化測定，但反應中被抑制的酶活力較小，需用靈敏的光度計測定，反應的溫度也需嚴格控制。

（一）酶放大免疫測定技術（EMIT）EMIT的基本原理是半抗原與酶結合成酶標半抗原。當與抗體結合后，所標的酶與抗體密切接觸，使酶的活性中心受到影響而活性被抑制。反應后酶活力大小與標本中的半抗原量呈一定的比例，從酶活力的測定結果就可推算出標本中半抗原的量。

（二）克隆酶供體免疫分析（CDEIA）DNA重組技術可分別合成某種功能酶（如β-D半乳糖苷酶）分子的兩個片段，大片段稱為酶受體（EA），小分子稱作酶供體（ED），兩者單獨均無酶活性，一定條件下結合形成四聚體方具酶活性?？寺∶腹w免疫測定（CDEIA）的反應模式為競爭法。

標本中的抗原和酶供體（ED）標記的抗原與特異性抗體競爭結合，形成兩種抗原抗體復合物。ED標記的抗原與抗體結合后由于空間位阻，不再能與酶受體（EA）結合，而游離的ED標記的抗原上的ED可和EA結合，形成具有活性的酶，加入底物測定酶活性，酶活力的大小與標本中抗原含量成正比。

二、異相酶免疫測定

是目前應用最廣泛的一類標記免疫測定技術。

（一）異相液相酶免疫測定　主要用于檢測樣品中極微量的短肽激素和某些藥物等小分子半抗原。酶標志物具有更好的穩定性，且無放射性污染。

1.平衡法：將待測樣品抗原、酶標抗原及特異性抗體進行一次性溫育，待反應達平衡后，測定離心沉淀物（酶標抗原抗體復合物）中加入酶底物液后的呈色吸光度值。

2.非平衡法：先將樣品（或標準品）與抗體混合反應達平衡，然后加入酶標記抗原繼續溫育一段時間，測定離心沉淀物（酶標抗原抗體復合物）中加入酶底物液后的呈色吸光度值。

（二）固相酶免疫測定　酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。

第三節　酶聯免疫吸附試驗

一、基本原理

把抗原或抗體結合到固相載體表面，測定時將受檢樣品和酶標記抗原或抗體與結合在固相載體上的抗原或抗體反應形成抗原抗體復合物；洗去未結合成分；加入底物后，底物被固相載體上的酶催化變成有色產物。故：

①固相的抗原或抗體；

②酶標記的抗原或抗體；

③酶反應的底物三種試劑為反應必備。

二、方法類型及反應原理

（一）檢測抗原的方法

1.雙抗體夾心法：屬于非競爭結合，檢測抗原最常用的方法，檢測含有至少兩個抗原決定簇的多價抗原。原理是先將特異性抗體與固相載體連接；加入待測標本，形成固相抗原抗體復合物；再加入酶標抗體形成雙抗體夾心，洗滌；加底物顯色，根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量檢測。

如血清標本中有類風濕因子（RF）存在，則可出現假陽性反應，因為RF是一種抗變性IgG的自身抗體，它能與多種動物的變性IgG的Fc部分結合，因此RF就可作為固相抗體和酶標抗體之間的橋接抗原。

雙抗體夾心法只適用于二價或以上的較大分子抗原的測定，不能用于小分子半抗原的檢測。

2.雙位點一步法：針對抗原分子上兩個不同且空間距離較遠的決定簇，包被使用一種單抗，酶標記使用另一種單抗。測定時將待測抗原和酶標抗體同時加入，溫育、洗滌，加入底物顯色。若待測抗原濃度過高時，過量的抗原可分別同固相抗體和酶標抗體結合而抑制夾心復合物的形成，出現鉤狀效應，顯色降低，甚至假陰性。必要時可將標本經過適當稀釋后重復測定。

3.競爭法

用于測定小分子抗原，如藥物、激素等。原理為先用抗小分子的特異性抗體包被固相，然后同時加入待測樣本和酶標記的小分子，兩種小分子競爭與固相上的抗小分子的特異性抗體結合，溫育一定時間后洗滌，加入酶底物顯色。

特點是：

①酶標記抗原與樣品或標準品中的非標記抗原具有相同的與固相抗體結合的能力；

②反應體系中，固相抗體和酶標抗原是固定限量，且前者的結合位點少于酶標記和非標記抗原的分子數量和；

③免疫反應后，結合于固相載體上復合物中被測定的酶標抗原的量（酶活性）與樣品或標準品中非標記抗原的濃度成反比。

（二）檢測抗體的方法

1.間接法：最常用的方法，屬非競爭性結合試驗。原理：將抗原包被在固相載體上，加入待測樣本形成固相抗原-受檢抗體復合物；經溫育洗滌后，加入酶標二抗，常用羊抗人IgG，在固相上即形成固相抗原-待測抗體-酶標抗抗體復合物，加入底物后根據顯色的深淺確定待測抗體含量。多用于檢測IgG類型抗體。

2.雙抗原夾心法

此法可檢測各類抗體，因此雙抗原夾心法的靈敏度和特異性要高于間接法。其原理及操作步驟類似雙抗體夾心法，也可采用一步法。由于機體產生抗體IgG的效價有限，一般不會出現鉤狀效應。

臨床上乙型肝炎表面抗體的測定常用此法。

3.競爭法

一般抗體檢測是較少采用，當相應抗原材料中含有與抗人IgG反應的物質，而且不易得到足夠的純化抗原或抗原的結合特異性不穩定時，可采用這種方法測定抗體，目前臨床運用較多的是乙型肝炎病毒核心抗體（HBcAb）和乙型肝炎病毒e抗體（HBeAb）的檢測。

競爭抗體與待測抗體的特異性及親和力越接近，則測定的可靠性越強。

4.捕獲法又稱反向間接法

主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測定，最常用的是病原體急性感染診斷中的IgM型抗體。原理：先將針對IgM的二抗包被于固相載體，加入待測標本，其中IgM類抗體可被固相抗體捕獲，再加入特異性抗原，其與固相上捕獲的IgM抗體結合后，加入酶標記特異性抗原的抗體，形成固相二抗-IgM-抗原-酶標記抗體復合物，加底物顯色后，即可對待測標本中IgM是否存在及含量進行測定。

第四節　酶免疫測定的應用

幾乎所有的可溶性抗原抗體系統均可用酶免疫測定檢測。

均相酶免疫測定主要用于藥物和小分子物質的檢測。

非均相免疫測定中的ELISA在多種物質的檢測中被廣泛的使用。

實戰演練

目前酶免疫技術中應用較廣、提純較簡便的酶是

A.脲酶

B.堿性磷酸酶

C.葡萄糖氧化酶

D.辣根過氧化物酶

E.半乳糖苷酶

『正確答案』D

『答案解析』HRP是目前在酶聯免疫吸附試驗中應用最為廣泛的標記用酶。

酶放大免疫測定技術（EMIT）主要用來檢測

A.抗原

B.抗體

C.半抗原

D.不完全抗體

E.抗原抗體復合物

『正確答案』C

『答案解析』酶放大免疫測定技術（EMIT）主要用來檢測半抗原。

以下關于酶標記抗體或抗原不正確的是

A.過碘酸鹽氧化法只用于HRP的標記

B.未標記上的游離的抗體與酶標記抗體競爭固相上的抗原

C.制備的標記物無須純化，因為游離的酶或未標記上的抗原或抗體成分在測定過程中被洗掉

D.制備的結合物需要純化

E.標價物需要鑒定

『正確答案』C

『答案解析』每批制備的酶標志物都要進行質量和標記率的鑒定，質量鑒定包括酶活性和抗體（抗原）的免疫活性鑒定。常用免疫電泳或雙相擴散法，出現沉淀線表示酶標記物中的抗體（抗原）具有免疫活性。沉淀線經生理鹽水反復漂洗后，滴加酶的底物溶液，若在沉淀線上能顯色，則表示酶標記物中的酶活性仍保留。也可直接用ELISA方法測定。

關于酶聯免疫吸附試驗（ELISA）錯誤的是

A.屬于液相和固相酶免疫測定

B.固相常用聚苯乙烯反應板

C.通過洗滌除去未結合成分

D.底物顯色

E.既能定性又能定量分析

『正確答案』A

『答案解析』酶聯免疫吸附試驗（ELISA）屬于固相酶免疫測定。

酶免疫技術中最常用的固相載體是

A.聚氯乙烯

B.聚苯乙烯

C.硝酸纖維素膜

D.瓊脂糖

E.尼龍膜

『正確答案』B

『答案解析』酶免疫技術中最常用的固相載體是聚苯乙烯。

酶免疫技術中懸浮在溶液中具有液相反應速率的固相載體是

A.聚氯乙烯

B.聚苯乙烯

C.硝酸纖維素膜

D.磁性微粒

E.尼龍膜

『正確答案』D

『答案解析』酶免疫技術中懸浮在溶液中具有液相反應速率的固相載體是磁性微粒。

將抗原或抗體固相化的過程稱為

A.吸附

B.包被

C.封閉

D.標記

E.交聯

『正確答案』B

『答案解析』將抗原或抗體固相化的過程稱為包被。

ELISA技術中，最常用來檢測抗體的方法是

A.雙抗體夾心法

B.間接法

C.競爭法

D.捕獲法

E.應用生物素和親和素的ELISA

『正確答案』B

『答案解析』ELISA技術中，最常用來檢測抗體的方法是間接法。

下列有關雙位點一步法ELISA的敘述中，錯誤的是

A.使用針對同一抗原不同決定簇的兩種單克隆抗體作為酶標抗體

B.一種單克隆抗體作為固相抗體，另一種作為酶標抗體

C.采用高親和力的單克隆抗體將提高測定的敏感性和特異性

D.可使標本和酶標抗體同時加入

E.標本中抗原過高時，會出現鉤狀效應

『正確答案』A

『答案解析』雙位點一步法：在雙抗體夾心法基礎上，進一步發展了雙位點一步法。該法是針對抗原分子上兩個不同且空間距離較遠的決定簇的兩種單克隆抗體，即包被使用一種單抗，酶標記使用另一種單抗。測定時將含待測抗原標本和酶標抗體同時加入進行反應，兩種抗體互不干擾，經過一次溫育和洗滌后，即可加入底物進行顯色測定。但當待測抗原濃度過高時，過量的抗原可分別同固相抗體和酶標抗體結合而抑制夾心復合物的形成，出現鉤狀效應（hook

effect），顯色降低，嚴重時可出現假陰性結果。必要時可將標本經過適當稀釋后重復測定。這是應用此法必須要注意的問題。

ELISA技術中待測孔（管）顯色顏色的深淺與待測抗原或抗體呈負相關的是

A.雙抗體夾心法

B.雙位點一步法

C.間接法測抗體

D.競爭法

E.捕獲法

『正確答案』D

『答案解析』ELISA技術中待測孔（管）顯色顏色的深淺與待測抗原或抗體呈負相關的是競爭法。

雙位點一步法鉤狀效應產生是因為

A.標本中的抗原不純

B.洗滌不充分

C.孵育時間過長

D.酶標抗體過量

E.標本中的抗原濃度過高

『正確答案』E

『答案解析』雙位點一步法鉤狀效應產生是因為標本中的抗原濃度過高。

用一種標記物可檢測多種與抗原相應的抗體的ELISA方法是

A.雙抗體夾心法

B.間接法

C.競爭法

D.雙抗原夾心法

E.雙位點一步法

『正確答案』B

『答案解析』用一種標記物可檢測多種與抗原相應的抗體的ELISA方法是間接法。

關于ELISA競爭法的敘述中，正確的是

A.只用于檢測抗原

B.待測成分優先于酶標記物與固相結合C.被測物含量多則標記物被結合的機會少

D.待測管顯色顏色越淡表示被測物含量越少

E.只用于檢測抗體

『正確答案』C

『答案解析』關于ELISA競爭法的敘述中，正確的是被測物含量多則標記物被結合的機會少。

ELISA間接法中固相上包被的是

A.抗體

B.不完全抗體

C.抗原

D.抗抗體

E.酶標抗體

『正確答案』C

『答案解析』ELISA間接法中固相上包被的是抗原。

臨床上檢測IgM抗體常用的ELISA方法是

A.雙抗體夾心法

B.間接法

C.競爭法

D.雙抗原夾心法

E.捕獲法

『正確答案』E

『答案解析』捕獲法，又稱反向間接法。主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測定，目前最常用的是病原體急性感染診斷中的IgM型抗體。

酶免疫技術分為兩類酶免疫測定，它們是

A.均相和異相

B.固相和液相

C.酶免疫組化和酶免疫測定

D.均相和固相

E.異相和液相

『正確答案』C

『答案解析』酶免疫技術分為兩類酶免疫測定，它們是酶免疫組化和酶免疫測定。

ELISA一般不用于檢測

A.病原體及其抗體

B.Ig、補體、腫瘤標志物等蛋白質

C.非肽類激素

D.藥物

E.半抗原

『正確答案』E

『答案解析』ELISA一般不用于檢測半抗原。半抗原一般用均相酶免疫測定法。