第一篇：免疫組化對照設計

原則上講，所有實驗都應該設置陽性對照（用以檢驗染色過程成功），陰性對照（用以檢驗陽性結果為真陽性），空白對照（用以排除非特異背景染色）。不過，由于樣本選取的復雜性，國內多數實驗室以及國外多數小實驗室，都無法做到規范的陰性對照，所以普遍以空白對照代替陰性對照，而這種方法也在國內外得到承認。1）空白對照：

第一抗體由PBS取代。2）嚴格的陰性對照： 用已知的確定不表達你所要檢測的抗原的其他組織的切片做陰性對照 3）回收實驗陰性對照： 已知抗原與相應的第一抗體混合，發生結合沉淀，再用此沉淀抗體復合物進行免疫組化實驗，結果為陰性。

4）同型抗體替代對照： 用于第一抗體同種動物的血清或非免疫IGg代替第一抗體結果為陰性。

5）自身對照 在同一切片上，應將不同組織成分中的陰性結果與檢測的目的物對照比較 不過目前絕大多數人都是用PBS來代替一抗作為陰性對照，其實質是空白對照，因為這樣做如果結果是陰性，也只是排除了二抗引起的非特異而已，但至于一抗是否會產生非特異，那只通過空白對照是不得而知的。因此你就必須做嚴格意義上的陰性對照。

第二篇：免疫組化經驗總結

免疫組化

關鍵詞： 免疫 組織化學 細胞2012-03-30 14:41 來源：互聯網 點擊次數：14044 一，免疫組織化學簡介

免疫組織化學又稱免疫細胞化學，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應炕原進行定性、定位、定量測定的一項新技術。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(如蛋白質、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。

二，免疫組化技術的基本原理

免疫組化技術是一種綜合定性、定位和定量；形態、機能和代謝密切結合為一體的研究和檢測技術。在原位檢測出病原的同時，還能觀察到組織病變與該病原的關系，確認受染細胞類型，從而有助于了解疾病的發病機理和病理過程。

免疫酶組化技術是通過共價鍵將酶連接在抗體上，制成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，于普通顯微鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內各種抗原成分的定位，根據酶標記的部位可將其分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯法（多步法）等，用于標記的抗體可以是用免疫動物制備的多克隆抗體或特異性單克隆抗體，最好是特異性強的高效價的單克隆抗體。直接法是將酶直接標記在第一抗體上，間接法是將酶標記在第二抗體上，檢測組織細胞內的特定抗原物質。目前通常選用免疫酶組化間接染色法。

三，免疫組化步驟

1，切片，烤片60℃，1h；

2，脫蠟及復水

二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自來水1min，雙氧水1min；

3，1份30％H2O2加10份蒸餾水，室溫10min，蒸餾水洗3次，每次3min；

4，微波修復

將切片浸入0.01M枸櫞酸緩沖液，微波中最大火力（98℃-100℃）加熱至沸騰，冷卻（約5-10min），反復兩次；

5，將切片自然冷卻至室溫，PBS洗滌3次，每次5min；

6，封閉，5％BSA，室溫20min，甩去多余液體；

7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃過夜；

8，PBS洗滌3次，每次3min；

9，滴加二抗，37℃，15-30min；

10，PBS洗滌3次，每次3min；

11，滴加SABC，37℃，30min；

12，PBS洗滌3次，每次5min；

13，1ml蒸餾水中分別滴加顯色劑，混勻；

14，DAB顯色劑配置好后，滴加于切片，室溫，鏡下檢測反應時間（約5min）；

15，自來水沖洗干凈，過蒸餾水；

16，蘇木素復染2min，自來水沖洗；

17，脫水

30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；

18，樹膠封片，鏡檢。

四，免疫組化常見問題分析

1，石蠟切片在染色過程中出現脫片現象

1）烤片時間不夠，或溫度不夠，可以延長烤片時間和提高烤片溫度；

2）用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購買到或這自己做；

3）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織；

4）用高溫修復時，溫度驟冷也可能引起。

2，邊緣效應

1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致.解決辦法：制備優質的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應規范，盡量避免選用壞死較多的組織；

2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應超出組織邊緣2mm。用組化筆畫圈時，為了避免油劑的影響，畫圈應距組織邊緣3-4mm。

3，產生組織切片非特異性染色

1）抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條；

2）一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；

3）內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細胞多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；

4）非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果；

5）DAB孵育時間過長或濃度過高；

6）PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；

7）標本染色過程中經常出現干片，這容易增強非特異性著色。

4，免疫組化染色呈陰性結果

1）抗體濃度和質量問題以及抗體來源選擇錯誤；

2）抗原修復不全，對于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復來打開抗原表位，以利于與抗體結合；建議微波修復用高火4次*6min試試。有人做過實驗，這是最佳的時間和次數。若不行，還可高壓修復；

3）組織切片本身這種抗原含量低；

4）血清封閉時間過長；

5）DAB孵育時間過短；

6）細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內參與反應；

7）開始做免疫組化，我建議你一定要首先做個陽性對照片，排除抗體等外的方法問題。

5，背景

1，考慮一抗濃度高；

2，然后調整DAB孵育時間；

3，也要考慮血清封閉時間是否過短；

4，適當增加抗體孵育后的浸洗次數和延長浸洗時間等。

第三篇：病理科免疫組化技術員培訓

病理科免疫組織化學技術員培訓及技術操作規范

一、病理科免疫組織化學技術員培訓規范：

凡新入我科的病理技術員均需進行免疫組化理論知識的學習、培訓，經考核合格、具備病理技術員技士資質后方能從事免疫組織化學染色。

二、病理科免疫組織化學染色操作規范 1.免疫組織化學染色前的準備事項(一)組織切片的制備

常規切片脫蠟至水（組織固定需用10%中性甲醛）(二)抗體的選擇、稀釋和保存

（1）選擇抗體應先了解其反應譜和適用條件〔包括適用切片(石蠟切片抑或冷凍切片)、稀釋度和溫育時間等〕。

（2）對于未曾使用過的新抗體，應按照有關說明書的提示，以幾個不同的稀釋度對適宜檢材(已知陽性切片/涂片)進行預試驗;根據染色陽性表達的程度和檢材背景著色程度，確定用于染色的最適稀釋度

（3）抗體的原液應于分裝后置于一20℃冷室中保存，切勿反復凍存(以免效價 降低)。（4）抗體的工作液可置于4℃冰箱中保存。（5）抗體的稀釋。

(1)一般用0.01M PBS(生理鹽水磷酸鹽緩沖液)，pH值7.2。(2)或用0.05M TBS(生理鹽水三經基氨基甲烷緩沖液)，pH值7.6。(3)必要時可按需要加適量小牛血清清蛋白。(三)被檢測組織內抗原的修復

（1）經4%中性甲醛之類含醛基固定劑固定的組織，其切片中的抗原決定簇因醛的交聯作用而被封閉，從而影響抗原一抗體反應。進行免疫組織化學染色前，對于組織切片進行抗原修復處理，會使組織中的固有抗原盡量多地暴露出來，提升了大部分檢測抗體的陽性率和反應強度。有的抗體不需要進行抗原修復。應按抗體試劑說明書的提示決定是否進行被檢測組織內的抗原修復。（2）抗原修復緩沖液。

(l)一般為0.01M檸檬酸緩沖液(2.1g檸檬酸溶于100ml蒸餾水中，用2M NaOH調節pH值至6.0)。(2)有些抗體需要特殊修復緩沖液，如高PH值的EDTA(50mM Tris.，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的該高，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的該高pH修復液等。（3）抗原修復的常用方法。(l)胰蛋白酶消化法: ①組織切片脫蠟、水化。

②滴加一滴0.1%胰蛋白酶液于組織切片上。

③37℃下溫育20-40min(溫育時間取決于組織經4%中性甲醛固定時間的長短和被檢測抗原)。

④蒸餾水沖洗，終止反應。

⑤阻斷內源性過氧化物酶。

⑥進行免疫組織化學染色。（配制0.1%胰蛋白酶液時，應將0.1g胰蛋白酶溶于0.1%無水氯化鈣水溶液(pH值7.8)中。）

（2)胃蛋白酶消化法: ①組織切片脫蠟、水化.②滴加胃蛋白酶工作液于組織切片上。

③37℃下溫育10-30min(一般為10min，可延至30min，取決于組織經4%中性甲醛固定時間的長短).④浸人蒸餾水，終止反應。

⑤進行免疫組織化學染色。用1%胰蛋白酶液37℃下處理20min。(應以 0.1M HCI配制胃蛋白酶工作液。過度的胃蛋白酶消化會使組織結構破壞、切片 脫落。)（3)微波修復抗原法: ①組織切片脫蠟、水化(硅化玻片或經防脫片膠處理的玻片)。

②將組織切片置于容器(塑料盒或玻璃缸)中，并向其中加人抗原修復液 200ml，蓋上具有小孔的蓋子。

③將該容器置于微波爐(705-800W)中央加熱(95℃)5min，2次(于兩次之間，應向容器中添加蒸餾水50ml，嚴防組織切片干燥)。

④將該容器移出微波爐，置于室溫下冷卻15-20min。

⑤蒸餾水沖洗。

⑥阻斷內源性過氧化物酶，而后將切片置于蒸餾水中。

⑦用TBS或 PBS液沖洗。⑧進行免疫組織化學染色。(4)熱水浴法: ①組織切片脫蠟、水化(硅化玻片或經防脫片膠處理的玻片)。

②向裝組織切片的容器加人足量(例如200ml)抗原緩沖液，置于水浴鍋中，加熱至95-99℃(不沸騰)預熱。

③將組織切片插人已預熱的容器內，溫育20-40min。

④將該容器由微波爐移出，置于室溫下冷卻20min。⑤室溫下，用TBS、PBS或水洗。

⑥蒸餾水沖洗。

⑦阻斷內源性過氧化物酶，而后將切片置于蒸餾水中。

⑧用TBS或PBS液沖洗。

⑨進行免疫組織化學染色。

（5)壓力鍋法: ①組織切片脫蠟、水化(硅化玻片或經防脫片膠處理的玻片)。

②向4-5.5L的不銹鋼壓力鍋中加人抗原修復緩沖液(約為鍋容積的2/3)，不加閥情況 下加熱至沸騰。

③將組織切片插放于金屬切片架上，并置于壓力鍋內沸騰的緩沖液中。

④加閥情況下，將組織切片加壓2min。

⑤壓力鍋自行冷卻或以流水冷卻減壓后，持續20min。

⑥將冷卻后的切片取出，蒸餾水沖洗后，置于TBS或PBS液中(以免組織切片干燥)。

⑦蒸餾水沖洗。

⑧阻斷內源性過氧化物酶，而后將切片置于蒸餾水中。

⑨用TBS或PBS液沖洗。

⑩進行免疫組織化學染色。

（四）組織切片中內源性酶的阻斷

1.內源性過氧化物酶 主要存在于紅細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞了嗜酸性粒細胞和組織內。阻斷方法:最常用0.3%-0.5%H2O2-甲醇液，作用15-30min，阻斷液必須使用時新鮮配制。由于阻斷內源性過氧化物酶常同時導致被測抗原變性(使特異性著色減弱)，而大部分組織不含有內源性過氧化物酶，所以阻斷內源性過氧化物酶一般不必作為常規步驟。必須阻斷內源性過氧化物酶時，可安排在第一抗體反應后進行，以減少抗原的破壞。2.內源性堿性磷酸酶 主要存在于嗜中性粒細胞和內皮細胞。阻斷方法:應用1M左旋咪唑，作用15-30min。

3.內源性生物素 肝、胰、腎等的細胞內含有多量生物素或類生物素物質。阻斷方法:先將切片浸于卵白素(0.5μg/ml)中15min，以緩沖液洗凈后，移浸于生物素飽和溶液中15min，再用緩沖液洗去多余的生物素飽和液;也可應用商供的阻斷試劑盒(按說明書操作)。(五)正常血清保護

作為檢測試劑的抗體蛋白帶有一定的負電荷，免疫組織化學染色時，易與帶有正電荷的組織〔特別是纖維組織、變性和(或)壞死的細胞、嗜酸性粒細胞等〕發生靜電吸引而導致非特異性染色。去除這種非特異性染色最有效的方法是，在滴加第一抗體前，先滴加用于制備第二抗體動物的非免疫血清或是滴加除制備第一抗體動物以外的其他動物非免疫血清，濃度為1：5-1：20;必要時可滴加2%-5%牛 血清清蛋白。正常血清保護作用時間10-20min。用于阻斷非特異性結合的血清不能有明顯的溶血。(六)緩沖液

用于稀釋抗體，洗滌切片的緩沖液主要有兩種。1.TBS(0.05M，pH7.6)，Tris一HCl緩沖液(0.SM，pH 7.6)100ml 8.5%NaCl 100ml 蒸餾水加至 1000ml Tris一HCI緩沖液(0.5M，pH7.6)三經甲基氨基甲烷(Tris)61g HCl 37ml 蒸餾水加至 1000ml 2．PBS(0.IM，pH 7.6)Na2 HPO4 · 12H2O2 29g NaH2PO4 · 2H2O 3g NaCl 85g 蒸餾水加至 1000ml 使用時用蒸餾水稀釋10倍即成0.0lM。

二、免疫組織化學染色常用方法(一)直接法 1.脫蠟和水化。

2.3%過氧化氫或0.5%過氧化氫甲醇液，5min。

3.TBS或PBS緩沖液洗滌。4.抗原修復。

5.無關動物正常血清(適當稀釋)20-30min。

6.甩去正常動物血清，滴加適當稀釋的辣根過氧化物酶標記抗體，或增強的酶標多聚物一步法(Enhanced Polymer One-step Staining，EPOS)抗體于切片上，20-60min。7.TBS或PBS緩沖液洗滌。

8.0.04%-0.05%DAB(二氨基聯苯胺四鹽酸)H2O2液顯色5-10min，鏡下觀察控制顯色時間。底物配法:DAB 40-50mg；0.05M TBS(pH 7.6)l00ml；3% H2O2 100-200ml。9.緩沖液洗，流水洗滌。10.蘇木精淡染細胞核。11.脫水，透明，封片。(二)間接法

l-5步同“直接法”。

6.滴加第一抗體于切片上，濕盒內溫育30-60min。7.TBS或PBS緩沖液洗滌。

8.HRP標記抗體或用增強的酶標記多聚物(Enhanced Labeled一 Polymer Sys-tem，ELPS)抗體滴加切片上，濕盒內溫育30min。9-14步同“直接法”的7-11步。(三)過氧化物酶一抗過氧化物酶(PAP)法 1-5步同直接法。

6.適當稀釋的第一抗體，濕盒內溫育30-60min。7.緩沖液洗滌。

8.第二抗體，濕盒內溫育30min。9.緩沖液洗滌。

10.滴加PAP，濕盒內溫育30min。11-15步同“直接法”的7-11步。

雙PAP法:上述操作進行到第10步后，再重復7-10步1次，然后繼續11-15步。(四)葡萄球菌A蛋白(SPA)免疫酶法 1-5步同“直接法”。

6.第一抗體，濕盒溫育30-60min。7.緩沖液洗滌。

8.酶聯SPA，濕盒溫育30min。9.緩沖液洗滌。

10-13步同“直接法”的8-11步。(五)ABC法和SABC法

ABC法是卵白素-生物素-酶復合物(Avidin--Biotin--Peroxidase Complex)法的簡稱。SABC法是鏈霉卵白素-生物素-酶復合物(Streptavidin一Biotin一peroxidase Complex)法的簡稱。

l-5步同“直接法”。

6.第一抗體，濕盒溫育30-60min.7.緩沖液洗滌。

8.生物素化的第二抗體，30min。9.緩沖液洗滌。

10.ABC復合物或SABC復合物(皆于使用前新鮮配制)，30-60min。11-15步同“直接法”7-11步。(六)LSAB(SP)法

LSAB(SP)法，是標記的鏈酶卵白素-生物素(Labeled Streptavidin--Biotin)法的簡稱，操作步驟同“ABC法”，只是以LSAB復合物替代ABC復合物。(七)CSA法

CSA法是催化信號放大(Catalyzed Signal Amplifieation)法的簡稱。1-5步同“直接法”。6.第一抗體，15-30min。7.緩沖液洗滌。

8.生物素標記的第二抗體，15-30min。9.緩沖液洗滌。

10.鏈霉卵白素-生物素-HRP復合物(用前新鮮配制)，15min。11.緩沖液洗滌。12.放大液，15min。13.緩沖液洗滌。

14.HRP-StrePtavidin，15min。15-19步同“直接法”的7-11步。(八)二步法Envision System Envision是通過一個多聚葡聚糖骨架聯接成一個多聚體。1-5步同“直接法”。6.第一抗體，30-60min。7.緩沖液洗滌。

8.Envision TM，10-30min。9-13步同“直接法”的7-11步。(九)雙重免疫組織化學法.Sequential(1)鼠或兔抗體1，30-60min。

(2)Envision TM，羊抗鼠/羊抗兔/HRP，30 min。(3)DAB(棕色)，2-10 min。(4)鼠或兔抗體2，30-60 min。

(5)Envision TM，羊抗鼠/羊抗兔/AP，30 min。(6)AP(紅色)。2.Simnl一Aaneous(1)混合鼠抗體1和兔抗體2，4℃，過夜或60 min。(2)Envision TM羊抗鼠/HRP和羊抗兔/AP。(3)AP染色。(4)HRP染色。

上述方法除注明溫度者外，均可在室溫(20-25℃)環境中進行;第一抗體溫育后，如有必要可置于4℃ 下過夜。

三、免疫組織化學染色的常用抗體標記物(一)上皮源性標記物 1.一般性標記物

（1）CK(角蛋白)CK亞型:①CK5/6;②CK7;③CK8;④CK10/13;⑤CK18;⑥CK19;⑦CK20。(2)EMA(上皮細胞膜抗原)。

2.特異性和(或)相對特異性上皮標記物

（1）CEA(癌胚抗原，標記胃癌、大腸癌).（2）CA242(腫瘤相關粘液抗原，標記胰腺癌、大腸癌)。

（3）TG(甲狀腺球蛋白，標記甲狀腺癌).（4）PSA(前列腺特異性抗原，標記前列腺癌)。

（5）PSAP(前列腺特異性酸性磷酸酶，標記前列腺癌).（6）34βE12(標記前列腺底細胞).（7）AFP(甲胎蛋白，標記肝癌、內胚竇癌).（8）Hepatoeyte(標記肝細胞癌)。

(9)β-HCG(β-絨毛膜促性腺激素，標記胎盤滋養層細胞腫瘤、生殖細胞腫瘤).（10）CA125(卵巢癌).（二)間葉源性標記物

主要是Vimentin(vim，波形蛋白)等.（三）肌源性標記物 1.Desmin(Des，結蛋白)2.Actin(肌動蛋白）.3.SMA(平滑肌肌動蛋白).4.MSA(肌特異性肌動蛋白).5.Myosin(肌球蛋白).6.Myoglobin(MG，肌紅蛋白)7.Myogen(肌漿蛋白).8.MyoDI(肌調節蛋白).(四)血管源性標記物 FⅧRAg(第8因子相關抗原).CD31 CD34 UEA-l BNH9.(五)組織細胞源性標記物 1.CD68/KP-l.2.Lysozyme(溶菌酶)。3.a1-AT(a1-抗胰蛋白酶).4.a1-ACT(al-抗胰糜蛋白酶)5.Mac387.淋巴造血組織源性標記物 1.全淋巴細胞

(1)CD45/LCA(白細胞共同抗原）。(2)TdT(末端脫氧核昔酸轉移酶)。(3)CD30/Ki-1。2.全B細胞(1)Igκ。(2)Igλ。(3)CD20/L26。(4)CD79a。

(5)BLA36(B淋巴細胞抗原)。3.B細胞亞型(1)CDl0。

(2)CD21(標記濾泡性樹突狀細胞)。(3)CD23。

(4)CD35(標記濾泡性樹突狀細胞)。(5)CD38.4.全T細胞(1)CD3。(2)CD5。(3)CD43。(4)CD45RO/UCHL-1.5.T細胞亞型(1)CDla。(2)CD4。(3)CD8。6.NK細胞(1)CD56。(2)CD57/Leu-7。(3)CD16/Leu-11。7.粒細胞和單核巨噬細胞(1)CD11c/LeuM5。(2)CD15/LeuM5。(3)Lysozyme(溶菌酶)。(4)al-AT(al-抗胰蛋白酶)。(5)al-ACT(al-抗胰糜蛋白酶)。(6)CD68.(7)S-100蛋白.(8)Mac387。8.其他

(1)EMA(上皮細胞膜抗原).(2)CD99(尤因肉瘤標記物).(3)ALK-l(間變性淋巴瘤激酶)。(4)HLA-DR。(5)Bel-2。(6)Bel-6。(7)Bel-10。(8)Ki-67。

(9)CyclinD1(周期素D1)。(10)CD25。

(11)CD34。

（七）神經源性標記物 1.S-100蛋白.2.NSE（神經原特異性烯醇化酶）.3.Leu7。

4.Neurofilament(NF，神經微絲蛋白)。5.GFAP(膠質纖維酸性蛋白）

（八）神經內分泌源性標記物 1.激素標記物(1)CA(兒茶酚胺)。(2)5-HT(5-經色胺).(3)垂體激素。

①GH(促生長素)。

②PRL(催乳素)。

③ACTH(促腎上腺皮質激素).④TSH(促甲狀腺素).⑤FSH(促濾泡素).⑥LH(促黃體素)。(4)甲狀腺。

①TG(甲狀腺球蛋白)。

②CT(降鈣素)。

(5)甲狀旁腺:PTH(甲狀旁腺素)。(6)胰島。

①Insulin(胰島素)。

②Glueagon(胰高糖素)。

③VIP(舒血管腸肽).④PP(胰多肽).⑤Someitostatin(生長抑素)。

⑥Gastrin(胃泌素)。2.非激素標記物

(1)NSE(神經原特異性烯醇化酶).(2)CgA(嗜鉻素A).(3)SY(突觸素).3.激素受體（1）ER(雌激素受體）.（2）AR(雄激素受體）.（3）PR(孕激素受體).(九)細胞增殖標記物 1.PCNA(增殖細胞核抗原).2.Ki-67.（十）黑色素標記物 1.S-100蛋白.2.HMB45.3.Melanoma。

(十一）癌基因和（或）抑癌基因 1.bel-2.2.c-erbB-2.3.p53 4.p16(多腫瘤抑制基因)。5.nm23。(十二)病原體標記物

1.Myoeobaeterium Bovis(分枝桿菌，抗卡介苗)。2.HBsAg(乙型肝炎病毒表面抗原).3.HBcAg(乙型肝炎病毒核心抗原).4.HPV(人乳頭狀瘤病毒)5.HTLV-1(人類T細胞白血病病毒)。

第四篇：免疫組化常用方法介紹及個人經驗總結

免疫組化常用方法介紹及個人經驗總結、定義

用標記的特異性抗體對組織切片或細胞標本中某些化學成分的分布和含量進行組織和細胞原位定性、定位或定量研究，這種技術稱為免疫組織化學（immunohistochemistry）技術或免疫細胞化學（immunocytochemistry）技術。

2、原理

根據抗原抗體反應和化學顯色原理，組織切片或細胞標本中的抗原先和一抗結合，再利用一抗與標記生物素、熒光素等的二抗進行反應，前者再用標記辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如鏈霉親和素等）結合，最后通過呈色反應或熒光來顯示細胞或組織中化學成分，在光學顯微鏡或熒光顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應產物，從而能夠在細胞爬片或組織切片上原位確定某些化學成分的分布和含量。、分類

1）按標記物質的種類，如熒光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、免疫酶標法和免疫金銀法等。2）按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。

3）按結合方式可分為抗原-抗體結合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（PAP）法；親和連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）法等，其中 SP 法是比較常用的方法；聚合物鏈接，如即用型二步法，此方法尤其適合于內源性生物素含量高的組織抗原檢測。、目前幾種常用免疫組化方法簡單介紹 1）免疫熒光方法

是最早建立的免疫組織化學技術。它利用抗原抗體特異性結合的原理，先將已知抗體標上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發光的照射后即會發出一定波長的熒光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應用較廣。

2）免疫酶標方法

免疫酶標方法是繼免疫熒光后，于 60 年代發展起來的技術。基本原理是先以酶標記的抗體與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內的各種抗原成分進行定位研究。免疫酶標技術是目前最常用的技術。

本方法與免疫熒光技術相比的主要優點是：定位準確，對比度好，染色標本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。

免疫酶標方法的發展非常迅速，已經衍生出了多種標記方法，且隨著方法的不斷改進和創新，其特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來越方便。目前在病理診斷中廣為使用的有 ABC 法、SP 三步法、即用型二步法檢測系統等。

3）免疫膠體金技術

免疫膠體金技術是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩定地吸附蛋白，對蛋白的生物學活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標記一抗、二抗或其他能特異性結合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作為探針，就能對組織或細胞內的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術特別適合于免疫電鏡的單標記或多標記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進行光鏡觀察。如應用銀加強的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。、被檢測的物質

組織或細胞中凡是能作為抗原或半抗原，如蛋白質、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應的特異性抗體進行檢測。、特點

1）特異性強。免疫學的基本原理決定抗原與抗體之間的結合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，LCA 顯示淋巴細胞成分。只有當組織細胞中存在交叉抗原時，才會出現交叉反應。

2）敏感性高。在應用免疫組化的起始階段，由于技術上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術，那時的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現在由于 ABC 法或 SP 三步法的出現，使抗體稀釋上千倍、上萬倍甚至上億倍仍可在組織細胞中與抗原結合，這樣高敏感性的抗體抗原反應，使免疫組化方法越來越方便地應用于常規病理診斷工作。

3）定位準確、形態與功能相結合。該技術通過抗原抗體反應及呈色反應，可在組織和細胞中進行抗原的準確定位，因而可同時對不同抗原在同一組織或細胞中進行定位觀察，這樣就可以進行形態與功能相結合的研究，對病理學領域開展深入研究是十分有意義的。、從蛋白水平檢測角度，免疫組化技術與 Western blotting、ELISA 的異同

1）Western blotting：蛋白質免疫印跡，也是利用抗體抗原反應原理，結合化學發光等技術來檢查組織或細胞樣品內蛋白含量的檢測方法。與免疫組化技術相比，定量可能更加準確；當然 Western blotting 也可定性和定位（通過提取膜蛋白或核蛋白、胞漿蛋白分別檢測其中抗原含量，進而間接反映它們的定位），但敏感性遠遠低于免疫組化技術。

2）ELISA：酶聯免疫吸附試驗，也是利用抗體-抗原-抗原結合反應原理來檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的檢測。與免疫組化技術相比，定量最準確，是分泌性蛋白檢測首選方法之一。

8、免疫組化個人經驗總結

1、方法操作不難，最大的難處是出現異常結果時如何解決？這就需要掌握免疫組化實驗原理，每一步知道為什么這樣做，這樣你才敢大膽地改革先前的不對的方法步驟。如抗體孵育條件主要是抗體濃度、溫度、時間，這三者一般是相互成反比的（相對），其中濃度是最重要的先決條件，溫度決定反應的速度、時間決定反應的量。就拿溫度來說，可以有 4 度、室溫、37 度，我推薦4 度最佳，反應最溫和，背景較淺；而 37 度反應速度較快，時間較短；室溫我不太提倡，除非你每次都把環境溫度控制在一定的范圍，否則，盡量選擇前兩者。

2、免疫組化最大的優勢是定位和定性。相比于其他蛋白檢測方法，免疫組化具有定性靈敏度高、定位較直接準確，是定位檢測分析首選方法。尤其對于有些因子的轉位研究十分有用。

3、免疫組化結果定量分析的前提是高質量的染色切片。免疫組化結果也能定量分析，但必須是背景染色淺而特異性染色較深的情況下，分析最為準確，這種原則可能也是我們日常審稿時判定研究結果的必備條件。

4、免疫組化實驗一定要設置陽性對照和陰性對照。陽性對照一般是用肯定表達這種抗原的切片來做；陰性對照一般是用 PBS 或非一抗替代一抗來進行反應，其余步驟均一致。前者是排除方法和實驗系統有無問題；后者是排除有無一抗外的非特異性染色。

5、免疫組化的應用廣泛，是當前實驗研究的最重要方法之一。如今發 SCI 論文時，明顯感覺僅靠量化的數據來發文章很難，加一些形態學數據或圖片，老外十分歡迎，可能是怕你學術造假吧。當然也不能做假陽性或假陰性結果。

6、免疫組化技術掌握與否的鑒定標準是同一切片或不同切片中不同抗原均從摸索濃度或條件而做出優良的染色切片。

免疫組化技術掌握與否的鑒定標準是同一切片或不同切片中不同抗原均從摸索濃度或條件而做出優良的染色切片。我在平時帶教中就發現許多研究生把我已經摸索很成熟的反應條件、濃度、方法步驟，重復運用于同一性質的切片和同一種抗體，做出來后就覺得自己已經掌握了免疫組化方法，更換一種抗體后，居然連二抗的種屬來源都拿錯了。失敗往往促進你去思考試驗原理和過程，成功有時也加快你自傲。

7、實驗方法需要動手+ 動腦。如今我還不敢說我在免疫組化什么都知道。我只所以今天敢在這里說這說那，這是因為我經過了反復的動手+動腦，把理論原理運用于實踐，在把實踐中發現的問題帶到理論知識中去解決，最終把理論與實踐融會貫通。

第五篇：病理切片與免疫組化個人經驗總結

免疫組織化學中對載波片和蓋波片的處理

（一）載波片的清潔

進行免疫組化染色必須保證載波片的潔凈否則常導致非特異性染色和組織脫片現象的出現而新的載波片常有油污等可能影響免疫組化染色的異物。因此必須對載波片進行清潔工作。常用的載波片清潔液是用重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水以不同比例混合配成不同強度的清潔液。

1． 常用清潔液的配制方法：

1．1重鉻酸鉀：濃硫酸：蒸餾水=1：1：10 重鉻酸鉀10g., 濃硫酸10ml, 蒸餾水100ml 1.2重鉻酸鉀：濃硫酸：蒸餾水=2：3：25 1.3重鉻酸鉀：濃硫酸：蒸餾水=2：5：25 2載波片的清潔方法

1。1先將載波片用清潔液浸泡12-24h 1．2流水沖洗后再用蒸餾水清洗3-5遍 1。3 95%的酒精中浸泡2h，用紗布擦干

1．4放入60℃烤箱中烤干或者自然晾干儲存在玻片盒內備用

（二）載玻片的表面處理

在免疫組化試驗中由于實驗操作步驟的繁多常引起組織切片或者細胞涂片的脫落，影響檢測效果，因此常需要用粘附濟對切片進行處理。

1APES黏附劑APES是一種新型玻片黏附劑它的黏附劑機制是通過對玻璃表面的化學修飾改變玻璃表面的化學物理特性使組織切片活細胞成分牢固的貼附于玻璃表面不易脫落并可長期保存。是目前應用最多的組織黏附劑。

1．1APES工作液配制APES1ml丙酮50ml，混勻即可。

1．2切片處理方法1。1。1干警的切片放入盛有丙酮的染色缸中浸泡5min 1．1．2浸入APES工作液停留20-30s 1．1．3純丙酮洗2次1。1。4放入烤箱37℃過夜1。1。5用干凈玻片盒裝好室溫保存備用一般可存放半年以上

2多聚賴氨酸（poly-l-lycine.pll）多聚賴氨酸水溶液是一種良好的組織黏附劑使用濃度在0。005-0。01％但是由于價格較高在免疫組化中很少用。1．1多聚賴氨酸儲備液的配制，將0.5g多聚賴氨酸充分溶于100 ml蒸餾水中，4℃或者-20℃保存備用（pll可反復水融）工作液可將pll原液稀釋10-50倍使用 1。2切片的處理方法

1。1。1干凈干燥切片浸入pll工作液，停留20-30s 1.1.3用干凈玻片盒裝好，室溫保存備用一般可存放半年以上

（三）蓋波片的處理

蓋波片的處理方法如上,處理時間可適當縮短,清潔液浸泡2h即可（摘自常雙鎖主編醫學常用實驗技術精編）

石蠟切片微波修復抗原染色程序

1載玻片防脫片劑處理：可選擇APES或poly-l-lycine。撈片后置烤箱58-60℃30-60分鐘以上使切片緊密黏附 2． 切片常規脫蠟至水

3．30％H2O2+蒸餾水10份混合，室溫5-10分鐘以滅活內源性酶，蒸餾水洗3次 4．熱修復抗原：將切片浸入0.01M購船酸鹽緩沖液中（PH6。0），電路或微波爐加熱之沸騰后斷電間隔5-10分鐘后，反復1-2次。冷卻后PBS（PH7。2-7。6）洗1-2次。5滴加5％BSA封閉液室溫20分鐘，甩去多余液體不洗。6滴加適當稀釋的抗（小鼠或兔IgG）.37℃1h左右或20℃時左右，也可4℃過夜，PBS（PH7。2-7。6）洗2分鐘×3次。（一抗的稀釋度孵育時間和溫度與染色強度、背景有直接關系。一般來說陽性染色強度不夠時可提高一抗濃度和延長孵育時間背景過高時可降低一抗濃度和縮短孵育時間）

7．滴加生物素化山羊抗小鼠IgG（或兔、人IgG），20-37℃20分鐘PBS（PH7。2-7。6）洗2分鐘×3次。

8滴加試劑SABC,20-37℃20分鐘.PBS（PH7。2-7。6）洗5分鐘×4次.9.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒（AR1022）。取蒸餾水1ml加試劑盒中A,B,C試劑各1滴,混勻后加至切片,室溫顯色,鏡下控制反應時間,一般在5-30分鐘之間.也可自配顯色劑顯色。蒸餾水洗滌。

0．02M PBS（PH7。2-7。6）配法：

1000ml蒸餾水中加氯化鈉8.5g,Na2HPO42.8g, Na2H2PO40.4g.如果用的是含水磷酸鹽，應加上分子式中水的含量。

0．02M枸椽酸鹽緩沖液：1000ml蒸餾水中加枸椽酸三鈉（C6H5Na3O7·2H2O）3g, 枸椽酸（C6H8O7·H2O）0.4g 注意事項：

如果染色背景較高，在SABC反應之后，DAB顯色之前，用加水0。01-0。02％TWEEN20的PBS（PH7。2-7。6）洗滌切片4次，單純PBS洗2次，然后顯色。

以上摘自武漢博士德生物工程有限工程公司所產的即用型SABC免疫組化染色試劑和使用說明書。

HE染色方法

1二甲苯I脫蠟10-15min 2二甲苯II脫蠟10-15min 3無水乙醇脫二甲苯1min×2次 4.95％乙醇 5.90％乙醇 6.85％乙醇 7自來水洗2min 8蘇木蘇染色1-5 min 9自來水洗1 min 10.0.5％-1％鹽酸乙醇分化20S 11自來水洗1min 12稀氨水（1％）返藍數秒，自來水或蒸餾水洗1 min 13尹紅染色1-5 min 14自來水洗

15.85％乙醇脫水20S 16.90％乙醇30S 17.95％乙醇I 1 min 18.95％乙醇II 1 min 19.無水乙醇I 2min 20.無水乙醇II2min 21二甲苯I 2min 22二甲苯II2min 23二甲苯III2min 24中性樹膠或加拿大樹膠封固。結果：

細胞核呈藍色，鈣鹽和各種微生物呈藍染色或紫藍色，細胞質，肌纖維，纖維結締組織，紅細胞和嗜尹紅顆粒呈不同程度的紅色。摘自梁曉俐主編病理學基礎與實驗技術