第一篇：乙型肝炎病毒耐藥基因及分型檢測

乙型肝炎現狀如何？

乙型病毒性肝炎是由乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的、以肝臟炎性病變為主，并可引起多器官損害的一種疾病，主要存在于肝細胞內，可引起肝細胞炎癥、壞死和纖維化。

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，全球約有3.6億感染者，每年約有100萬人死于與HBV相關的肝臟疾病。我國屬于感染的高發區，現有的慢性HBV感染者約9300萬例。

乙型肝炎病毒（HBV）基因分型的臨床意義

HBV根據DNA差異可分為A、B、C、D、E、F、G、H八種類型，不同型別在流行特征，致病性，對藥物治療反應等方面存在差異，其中，我國以B型和C型為主，感染HBV基因型B的患者發生肝纖維化及肝細胞癌的平均年齡要比感染HBV基因型C的患者的年齡大。

通過分型檢測，可判斷病毒復制活躍程度及突變發生率情況。研究表明，與HBV-B型相比，C型復制較活躍，不易發生HBeAg血清轉換；HBV-B型易產生前C區突變，C型核心啟動子區變異發生率更高，與重型肝炎發病機制密切相關，可作為肝癌高危指標之一。同時，HBV-B、C型患者易產生拉米夫定耐藥突變，通過分型檢測，可指導臨床治療方案制定，有針對性進行臨床治療，更大程度上提高患者的生活質量。

乙肝的治療方式有哪些？

HBV感染主要的治療方法是抗病毒治療，國內外普遍使用的藥物有干擾素和核苷（酸）類。由于干擾素需要反復注射，且副作用較多，近年來，核苷(酸)類似物(NA)已成為抗HBV感染的主要方法之一，NA因其抑制病毒復制能力強、使用方便、耐受性好且療效確切，適用于不同階段的肝病患者，是長期治療的合理選擇。但隨著治療時間的延長，往往會出現病毒耐藥株，從而需要監測乙型肝炎病毒耐藥基因型，指導臨床用藥。

乙肝病毒產生耐藥的機理是什么？

HBV對某種藥物的耐藥性一般是指由HBV基因組上某些位點的變異導致這種藥物對HBV的抑制作用減弱或無作用。通常分為以下幾種：

（1）原發性耐藥變異：指藥物作用靶位的基因及其編碼的氨基酸發生變異，導致變異病毒株對治療藥物的敏感度下降；

（2）繼發性耐藥變異(又稱補償性耐藥變異)：指由于原發性耐藥變異病毒株復制能力下降，在原發性耐藥變異的基礎上，病毒株也可在其他位點發生變異，這些變異可部分恢復變異病毒的復制能力或可導致變異病毒對藥物敏感度的進一步下降；

（3）基因型耐藥：指檢測到已在體外的表型分析研究中被證實與抗病毒藥物耐藥相關的HBV變異；（4）表型耐藥：通過體外復制系統證實檢測到的HBV變異會降低其對抗病毒藥物的敏感度。

HBV屬于嗜肝DNA病毒科，基因組長約3.2kb，是部分雙鏈環狀DNA結構。HBV基因組含有4個部分重疊的開放讀框(open reading frame，ORF)，分別為S基因區、C基因區、P基因區和x基因區。產物為含末端蛋白、間隔區、逆轉錄酶區和RNA酶H區4部分的HBV聚合酶。

HBV雖然屬于DNA病毒，但其復制過程并非DNA—DNA的直接復制過程，而是經過前基因組RNA的中間過程，即DNA—RNA—DNA的復制過程。在前基因組RNA逆轉錄為負鏈DNA的過程中，HBV逆轉錄酶由于缺乏嚴格的校正機制，導致HBV復制過程中核苷酸錯配率較高，發生變異的頻率為每年(1.4～3.2)X105核苷酸替換／位點。HBV復制的這種過程和特點，決定了同一患者體內不同的HBV株基因序列之間也存在差別。

核苷（酸）類藥物主要通過抑制HBV聚合酶的逆轉錄酶區活性，阻止HBV復制過程中以HBV的前基因組RNA為模板逆轉錄生成新的病毒DNA，從而發揮抑制病毒復制的作用，HBV前基因組RNA是以HBV的cccDNA為模板合成的，即NA的藥效靶點在cccDNA的下游，所以NA不能直接清除已經存在的cccDNA。為了持續抑制HBV的復制，NA抗HBV治療的療程往往需要數年。但在長期應用某一抗病毒藥物的情況下，產生選擇壓力，野生株被抑制。生存下來的突變株占主導，此種藥物便失去了療效，從而導致耐藥的發生。

HBV對NA的耐藥分析

1.拉米夫定(LAM)

LAM屬于L-構型核苷，是目前用于臨床最廣、時間最長的藥物，其產生的耐藥也是最多的。在LAM初次治療時，1、2、3、4和5年YMDD突變的發生率約為23％、46％、55％、65％和7l％。LAM主要的耐藥突變位點是rtM204V／I(YMDD變異)，rtM204V變異通常與其補償突變rtL180M聯合出現，rtM204V／I株較野生株復制能力低，而rtL180M的出現使突變株HBV的復制接近野生株的水平圈。目前報道發現的與LAM相關的主要耐藥突變有rtM204V、rtM204I和rtL180M，其他的突變位點有rtL80V／I、rtI169T、rtV173L、rtTI84S和rtQ215S這些突變通常以下面不同的組合方式出：(1)trM204I／V+rtIJ80M；(2)rtM204I：(3)rtM204V+rtL1810M+rtV173L；(4)rtM204I+rtI80I：(5)rtM204I／V4+rtQ215S±rtL180M：(6)rtM204V+rtL180M+rtV173L+rtl169T；(7)rtA181T：(8)rtM204I／V+rtT184S±rtL180M：(9)rtM204S+rtLl80M。這些HBV耐藥突變株常以準種的形式存在，當使用LAM治療后，突變株便可成為主要病毒侏。

LAM耐藥的分子機制目前推斷可能是rtM204位點參與形成了LAM與聚合酶的結合部位，rtM204位點發生突變后主要產生了兩方面影響：(1)使dNTP結合位點甲基化，從而產生空間位阻降低了LAM與dNTP底物的親和力；(2)降低使LAM三磷酸根結合到正在復制的病毒DNA的催化活性，這些原導因致rtM204位點突變株的復制力減低，且與LAM的結合力低于野生侏，從而降低了LAM的抗病毒作用。

2.恩曲他濱（FTC）

FTC屬低耐藥基因屏障藥物，在臨床應用中應密切關注其耐藥情況。體內與體外研究均表明FTC耐藥位點與LAM相同，即rtM204V/I ± rtL180 M變異，FTC治療1年的基因型耐藥發生率為13%～16%，但缺乏長期的耐藥數據。

在開始FTC治療前應充分評估患者的治療指征，詳細了解患者既往治療史。免疫耐受期的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者除非需接受免疫抑制劑治療等特殊情況，一般不建議進行抗病毒治療。首次出現ALT升高的CHB患者，應分析其可能的誘因，慎重開始抗病毒治療。FTC治療期間應督促患者規范服藥、定期隨訪，盡可能提高患者依從性。如隨訪發現患者病毒學應答不佳或出現病毒學突破，應及時明確患者是否存在依從性問題。排除依從性問題后，應及時進行HBV基因型耐藥檢測以明確FTC耐藥情況，相應調整治療方案。

目前對于FTC耐藥挽救治療證據尚不充分。參照LAM耐藥挽救治療情況，可考慮加用ADV或TDF抗病毒治療，亦可考慮換用TDF抗病毒治療。

3.阿德福韋酯(ADV)

ADV屬于無環嘌呤類核苷酸類似物。與LAM相比，在使用ADV初次治療時，1～5年基因耐藥變異的概率分別為0％、3％、6％、18％、29％，耐藥發生的時間和機率都遠低于LAM。然而，在已產生了LAM耐藥的患者中，單獨改用ADV治療1年和2年，基因耐藥變異率分別升高為6.4％和25.4％，ADV聯合LAM治療可降低耐藥突變發生率，對于產生LAM耐藥的患者，加用ADV為首選。

與LAM單點突變不同，ADV相關的耐藥突變多為多點突變，目前得到學界公認的主要耐藥位點有rtA181T、rtA181V和rtN236T，組合方式主要有四種：(1)rtA181V；(2)rtN236T；(3)rtAl81V+rtN236T；(4)rtA181T+rtN236T。另外rtA181T突變也在長期使用LAM患者的HBV基因中檢測到，但是，該突變并未合并rtM204I／V的突變。有認為這是因為rtAl81V／T突變能改變rtM204密碼子的位置，導致一個間接的催化位點空間位阻，從而使LAM的敏感性下降。有進一步研究表明A181V／T突變株對LAM、LdT和ETV的敏感性都下降，但對TDF仍然敏感。4.恩替卡韋(ETV)

ETV是一種脫氧嘌呤核苷酸類似物，ETV對初治患者很少發生耐藥，1-5年的累積耐藥發生率分別為0.2％、0.5％、1.2％、1.2％與1.2％。但對原有LAM耐藥的患者，改用ETV，治療1-5年后的臨床耐藥率分別為6％～7％、15％～16％、36％、46％和51％。因此，ETV在LAM失效患者中的耐藥發生率明顯增加，產生LAM耐藥的患者不推薦首選ETV。這是因為ETV的耐藥變異需要在rtM204+rtL180位突變的基礎上，再聯合rtT184、rtS202、rtM250和rtI169位點上一個或多個的氨基酸突變。

其耐藥變異主要有兩種模式：(1)rtM250v+rtIl69T+M204v+L18OM；(2)rtT184G+rtS202I+rtM204V+rtL180M。有體外試驗證實，rtM250位點突變可引起ETV的敏感性下降，單獨rtI169位點的突變對ETV只低度耐藥，但rtI169聯合rtM250位點突變則可阻止DNA鏈延伸，從而降低ETV敏感性；rtT184和rtS202位點的突變可以改變YMDD附近的核苷酸聚合酶結合袋的幾何構像，影響C區的兩個催化性天門冬氨酸殘基的編碼，從而導致對藥物的敏感性下降。ETV需多個位點的突變才能出現耐藥，表明它的高基因屏障。由于ETV抗病毒治療的有效性及低耐藥性，被推薦為乙肝肝硬化失代償期的一線用藥。

5.替比夫定(LdT)

LdT與LAM同屬于L-構型核苷，與LAM耐藥基序相似，都發生在YMDD區，但其耐藥發生率低于LAM，對初治患者的第l與第2年累積耐藥發生率分別為4％與22％。而且LdT出現的耐藥突變位點僅有rtM204I，尚未發現rtM204V變異。原因尚不清楚，有研究認為可能與其抗病毒復制的高效能有關。也有文獻報道LdT相關的耐藥突變還可發生在rtL80、rtL180、rtL181、rtL229等位點，其意義還有待進一步明確。

6.替諾福韋(TDF)

TDF是一種新型核苷酸類逆轉錄酶抑制劑，國外已批準該藥用于治療人類免疫缺陷病毒(HIV)和成人的慢性乙型肝炎。在Ⅲ期臨床實驗中，替諾福韋治療2年以上還未被證實有基因型耐藥發生，但是此臨床實驗在治療72周時對血清仍能檢測到病毒者都增加使用了恩曲他濱，所以不能確定72周后單一使用替諾福韋治療的耐藥發生率。有報道稱rtA194T變異與TDF耐藥相關，能夠改變DNA模板與dNTP底物的結合位點，從而影響DNA合成。體外實驗發現，rtA181／T或rtN236T突變的ADV耐藥株對TDF的敏感性下降34倍；若此位點與rtL180M+rtM204V聯合出現，則能增加TDF半數抑制濃度10倍以上。

乙型肝炎病毒耐藥基因檢測的臨床意義

（1）在初始治療前檢測，有助于判斷是否感染耐藥突變株，可以幫助選擇初治藥物；

（2）在治療過程中檢測，有助于及時發現基因型耐藥，從而采取預防措施，避免發生病毒反彈；

（3）耐藥發生后檢測，可根據耐藥情況及時換藥加藥或更改治療方案，使患者獲得更好的治療效果。

我們可以提供的乙型肝炎病毒耐藥基因和分型檢測項目有哪些？

1.2.檢測血液中乙肝病毒的DNA濃度（被稱為乙肝病毒載量）。這項檢測用于監測乙肝病毒在體內復制水平，從而衡量病人的受感染情況以及監測治療情況。

檢測乙型肝炎病毒耐藥基因，與六種用于乙肝抗病毒治療的核苷（酸）類藥物相關的11個耐藥位點的基因變異情況。

3.檢測乙型肝炎病毒A、B、C、D、E、F、G、H八種基因型。

HBV耐藥檢測建議

? ? ? ? 在使用核苷（類）藥物治療前，先做一次耐藥檢測，以確定用藥種類 在治療的最初兩年，對于輕微肝病患者，推薦每6個月檢測一次 兩年后建議每3個月檢測一次，因為這個時候耐藥出現的可能性更高

對病情較重的患者來說，耐藥的后果會迅速表現出來，并可能威脅生命，因此建議每3個月檢測一次

檢測的技術

1.即時定量PCR檢測： 用于檢測血液中乙肝病毒的DNA水平。

可以使用的試劑盒：GeneProof Hepatitis B Virus(HBV)PCR Kit

2.HBV基因分型檢測

采用測序法，對HBV基因S區進行擴增及測序，獲得病毒的型別信息。

3.HBV耐藥基因檢測

采用測序法，對HBV基因P區進行擴增及測序，獲得核苷（酸）類藥物相關耐藥位點的變異信息，從而分析病毒變異情況。

第二篇：PCR-RFLP方法檢測特定基因SNP及基因分型

PCR-RFLP方法檢測特定基因SNP及基因分型

陸韻玲

（廣東 廣州 510303）

摘要：本實驗隨機抽取菜市場上的8頭豬的豬肉，通過PCR-RFLP技術進行氟烷基因檢測。結果表明，被檢測到豬的基因型均為NN，未出現Nn和nn基因型，即市場上的豬肉是不含氟烷基因的。PCR-RFLP技術可準確診斷豬氟烷基因，在種豬選育過程中及時淘汰攜帶氟烷基因的個體，提高豬種質量。

關鍵詞：PCR-RFLP；基因分型；SNP；氟烷基因

隨著人民生活水平的不斷提高，豬肉品質問題日益受到關注。SNP（Single Nucleotide Polymorpgism），單核苷酸多態性，指DNA發生了單個堿基的變異。這種變異可能會引起性狀的改變或者導致疾病的發生。如豬的蘭尼定受體（Rynodine receptor, RYR1）基因CDS序列第1843位堿基“C”突變為“T”，使蛋白第615位精氨酸（Arg,CGC）變成了半胱氨酸（Cys, TGC），引起蛋白結構和功能改變，這種改變能夠引起豬的應激敏感綜合征。豬在應激情況下，如長途運輸、屠宰等，會對應激原刺激過度敏感，豬呼吸急促，心跳亢進，肌肉僵直，機體內水、電解質代謝紊亂，甚至突然死亡。對于商品豬而言，會導致豬肉質量嚴重下降，如肌肉蒼白、質地疏松和有液體滲出等，大大降低了豬肉的經濟價值。而氟烷基因是導致豬的應激敏感綜合征的主效基因之一[1]。其雜合子（HalNn）雖然在生產性能上有一定優勢，但其隱性純合子（Halnn）是導致發生豬應激綜合征。

本試驗采用PCR-RFLP技術對隨機取自市場的8頭豬進行氟烷基因檢測，旨在研究氟烷基因對豬的影響，以及檢測市場上豬肉的品質。實驗材料與方法

1.1實驗材料

8頭豬的豬肉樣本（來自廣東第二師范學院附近的市場）。

1.2實驗試劑

（1）PCR反應相關試劑：含有鎂離子的PCR緩沖液，特定的上下游引物，dNTP，Taq DNA聚合酶，滅菌雙蒸餾水。（2）凝膠電泳相關試劑：瓊脂糖，100×TAE或者100×TBE

緩沖液等，DNA分子量標準，上樣緩沖液（6×Loading buffer），溴化乙錠（EB）或者替代物。（3）酶切相關試劑：HhalI限制性內切酶，酶切緩沖液，等。

1.3實驗方法

1.3.1豬基因組DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測

取200mg豬肉組織樣本，剪碎，置于1.5mL離心管中，加入裂解液650μL,蛋白酶K25μL，混合均勻，50℃恒溫孵育14~20h，直到看不到組織塊，加入Tris飽和酚400μL，氯仿384μL，異戊醇16μL，室溫震蕩10~15min，12000r離心10min。取上清液于1.5mL離心管，加入700μL異丙醇（與上清液體積相當），輕輕晃動，直至白色絮狀DNA出現，12000r離心10min。棄上清，留沉淀，75%乙醇漂洗，再離心，棄上清，加100μLddH2O（滅菌雙蒸水）。

配制1%瓊脂糖凝膠，待膠凝固后，取1μL DNA溶液與5μL上樣緩沖液混勻后加入點樣孔，將膠放在電泳槽內，200V電泳15~20min后將凝膠取出放在紫外燈下觀察并拍照，亮橘色條帶表明DNA提取成功。

1.3.2豬HAL基因的PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測

豬HAL基因的結構分析： 登錄GenBank查閱獲得豬HAL基因序列，分析并設計引物，目的片段包括含有CDS序列第1843位堿基。目前，兩條特異引物已經廣泛用于檢測豬HAL基因，該對引物位于第16和18內含子上，PCR擴增范圍包括了HAL基因的第17外顯子，具體如下：

上游引物：5’ TCCAGTTTCC CACAGGTCGT ACCA 3’ 下游引物：5’ ATTCACCGGA GTGGAGTCTC TGAG 3’

已有文獻報道擴增產物為659bp，根據登錄的參考序列，擴增產物實際為660bp。引物由生物公司合成。

PCR反應體系的配制：按照如下比例配制，反應體積為20 μL。各成分的初始濃度和用量如下表1：

表1 PCR反應體系（20μL）

成分

10×Buffer含Mg2+）dNTPs Taq DNA聚合酶 上游引物

最初溶度或者含量 10× nM/mL

體積(μL)2 1.6 0.2 0.4

下游引物 DNA模板 ddH2O 總體積 nM/mL 50 ng/μL

0.4 0.4 15 20 在配制上述溶液時，一般將除了DNA模板外的所有成分混合，均勻分裝到滅菌的用于PCR擴增的Ep管中（0.2 mL規格）。在分裝好的Ep管中加入DNA模板，蓋緊蓋子，瞬時離心，使各成分混合均勻。

PCR反應程序: 設置如下PCR程序：首先95 ℃預變性5min，然后94 ℃變性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸40s進行35個循環，最后72 ℃延伸5min后冷卻到4 ℃。

PCR擴增片段的檢測:配制2%瓊脂糖凝膠，取3μL PCR反應產物與3μL上樣緩沖液混勻將其點入梳孔中，同時在其中一梳孔中加入DNA分子量標準，80V電泳15min后，最后在紫外燈下或者凝膠成像系統下進行觀察或拍照。1.3.3PCR產物的RFLP: 按HhaI內切酶說明書要求，取10uL PCR產物，10× Buffer 2uL，0.5uL HhaI內切酶(10U/uL)，加水至20uL，37℃溫3h，3％瓊脂糖凝膠電泳檢測，并拍照。

2結果與分析

2.1豬基因組DNA提取瓊脂糖凝膠電泳結果

提取的DNA檢測結果如圖1，條帶為亮黃色，說明提取的基因組DNA含量較高且蛋白雜質含量較少。

2.2 PCR擴增氟烷基因瓊脂糖凝膠電泳結果

氟烷基因PCR產物HhaI酶切結果見圖2A。PCR擴增產物經測序其全長大部分為659bp。與GenBank[2]已發表的序列比對后，確認為目的片段。且目的條帶清晰明亮且無雜帶,表明目的基因擴增效果良好。

2.3氟烷基因Hhal酶切瓊脂糖凝膠電泳結果

由圖2 B可見，在各樣品中均沒有發現氟烷基因陽性純合子（HaLnn）；而陰性純合子（HaLNN）在樣品中有4頭。這是由于目的基因是含氟烷基因第1843位點、長度為659 bp的片段，HhaI內切酶可識別5-' GCG|C-3'序列，即正常氟烷基因（HalN）序列的第1843位點。酶切后進行電泳、染色,根據電泳圖譜中的帶型判斷個體氟烷基因型。

基因型為HalNN時,由于第1843位堿基為胞嘧啶（C）而有酶切位點，因而PCR產物被酶切為493 bp和166 bp兩部分，瓊脂糖檢測為2條帶。如圖2 B1，2，3，5條帶。

基因型為Halnn時,由于發生了CyT的突變，酶切位點消失，PCR產物為659 bp不變，瓊脂糖檢測為1條帶。

基因型為Halnn雜合子時，瓊脂糖檢測為659 bp、493 bp和166 bp 3條帶。而圖2 B4，只有一條亮帶，在2000bp處，說明該DNA氟烷基因Hhal酶切不成功，該條帶實驗失敗。

圖1 豬基因組DNA提取瓊脂糖凝膠電泳結果

圖2 實驗結果

A：PCR擴增氟烷基因瓊脂糖凝膠電泳結果

B：氟烷基因Hhal酶切瓊脂糖凝膠電泳結果(M-DNA marker B1,2,3,5-陰性 B4-實驗結果失敗)3討論

豬應激綜合征檢測的傳統方法是用氟烷麻醉法，但該方法不能識別雜合子和陰性豬，且操作誤差較大。而通過提取DNA利用PCR-RLFP進行檢測，可以準確地檢測出純合子和雜合子，這樣就克服了用氟烷檢測費時、費力而且不能測出雜合子的弊端。本實驗進一步驗證了該技術在試驗過程快速，簡便。結果更科學準確，且對豬的創傷性小，節省人力，物力和時間。

此外，國外一些專家認為氟烷基因的存在弊大于利，因此近年來國外一些育種公司紛紛推出無氟烷基因的種豬。但我國學者對此持不同觀點。上海農科院的屠宰試驗已經初步證明,Nn基因型比NN基因型在瘦肉率、眼肌面積等方面更具優勢,這與蔣思文報道的結果一致[3]

。但是，現代的育種手段還不能準確定位和分離及其遺傳規律，對瘦肉率的選擇更多的依靠常規育種。所以在種豬的選擇過程中，攜帶氟烷陽性基因的豬種容易被選種，使得Haln基因在群中的擴增，給養殖業帶來巨大的經濟損失。

本實驗雖然所檢測的豬基本不含氟烷基因，但是，由于樣本量少，不能全面地說明問題。另外，實驗存在實驗誤差及有實驗的結果是失敗的。所以，實驗存在很多可以改進的地方，例如：在取樣時，能夠給不同的豬編號，以防后面實驗樣本是取自同一頭豬的；在提取DNA時，要盡量提高提取出的DNA的純度，使后面的實驗效果更明顯。

參考文獻：

[1]劉銳.嘉興市鳳橋鎮豬氟烷基因檢測對PSE肉的影響[J].江蘇農業科學, 2011, 39(2): 298-300.[2] Brenig B, Brem G.Molecular cloning and analysis of theporcine/halothane0gene.Arch.Tierz., Dummerstorf 3215,1992.129~135 [3]蔣思文,熊遠著,鄧昌彥等.豬RYR1基因的PCR-RFLP分析和氟烷基因利用的研究.中國畜牧雜志,1997,33(2):9-10

第三篇：乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR熒光探針法)

乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒

樣本要求

1.適用標本類型：血清或血漿 2.標本采集

1）血清：用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入無菌的干燥玻璃管，室溫放置30—60min，血標本可自發完全凝集析出血清，或直接使用水平離心機，1500 rpm離心5分鐘，吸取上層血清，轉移至1.5ml滅菌離心管

2）血漿：用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入含EDTA-2K或枸櫞酸鈉的玻璃管，立即顛倒玻璃管混合5—10次，使抗凝劑和靜脈血充分混勻，5—10分鐘后即可分離血漿，轉移至1.5 ml滅菌離心管

3.標本保存與運送：所采集的標本可立即用于測試，也可以保存在—20℃待測，保存期為6個月，標本運送采用0℃冰壺。檢驗方法

1.DNA提取（樣品制備區）

將待測樣本、陽性定量參考品、陰性質控品、HBV 強陽性質控品、HBV臨界陽性質控品進行同步處理。1）取200μl樣品，加入450μlDNA提取液I和4μl的內標溶液，用振蕩器劇烈混勻15秒，瞬時離心數秒。100℃恒溫處理10±1分鐘 2）12000rpm離心5分鐘，備用 2.PCR試劑準備（試劑準備區）直接使用HBV-PCR反應管 3.加樣（樣品制備區）

往上述HBV反應管中用帶濾芯吸嘴分別加入待測樣本、陰性質控品、HBV 強陽性質控品、HBV臨界陽性質控品和陽性定量參考品的上清液各20μl。蓋緊管蓋，8000rpm離心數秒后轉移至擴增檢測區。

4.PCR擴增（擴增和產物分析區）5.結果分析

反應結束后自動保存結果，根據分析后的圖像調節baseline值得Start值、End值以及Threshold值，點擊Analysis自動獲取分析結果，在Repoet界面查看結果，記錄未知樣本數值（C）6.質量控制

(1)陰性質控品：FAM通道無對數增長期或Ct值等于30，VIC檢測通道擴增曲線為明顯對數增長期

(2)HBV陽性質控品：FAM通道有明顯的對數增長期且Ct值小于30(3)HBV陽性定量參考品：FAM通道有明顯的對數增長期，呈典型S形曲線。CT<29且R2>0.98 7.結果判斷（1）如果在FAM通道無明顯的對數增長期或Ct值等于30，在VIC檢測通道擴增曲線有對數增長期，則判定樣本的HBV DNA濃度小于檢測靈敏度。（2）如果在FAM通道有對數增長期或Ct值小于30 則1）若樣本的C<100，則樣本的HBV DNA濃度<100IU/ml 2）若樣本的100《C《5.00E+008，則樣本的HBV DNA濃度= C IU/ml 3）若樣本的C>5.00E+008，則樣本的HBV DNA濃度>5×10 ? IU/ml

第四篇：第十節 血清乙型肝炎病毒前S1抗原(HBVPreS1)檢測SOP(MYSOP-009HBVPRS1

第十節 血清乙型肝炎病毒前S1抗原（HBVPreS1）檢測（MY/SOP-009）

1.目的

規范乙型肝炎病毒核心抗體檢測試驗，確保檢測結果準確性和重復性。可用于臨床輔助診斷是否感染乙型肝炎病毒。2.原理

應用ELISA法原理檢測人血清或血漿中的乙型肝炎病毒前S1抗原，用乙型肝炎病毒表面抗體（抗-HBs）包被微孔，配以辣根過氧化物酶標記的乙型肝炎病毒前S1（PreS1）多克隆抗體，加入TMB顯色液后顯色，用來檢測血清中的乙型肝炎病毒前S1抗原。3.標本：采集見采樣手冊。

3.1標本要求：用無抗凝劑管抽取靜脈血2～3ml，1小時內送檢，2小時內離心(2500～3000r/m)10分鐘分離出血清。

3.2標本儲存：一般標本應在2小時內完成檢驗，室溫放置下不超過8小時，不能立即檢測的標本應離心后4～8℃保存不超過48小時。超過48小時的標本應分離出血清于2～8℃的待檢樣本冰箱保存，一周內檢測完畢。已完成檢測的標本儲存在廢棄樣本冰箱保存1周，以備復查。3.3 拒收的標本包括

標本量過少；放置時間過久；申請單與標本上信息不一致；檢驗項目與標本類型不符；輸液時在同側血管抽血；標本溶血或嚴重脂血；標本污染；空的試管等。4.試劑

4.1試劑名稱：乙型肝炎病毒前S1抗原檢測試劑盒（酶聯免疫法）。4.2 生產廠家：上海復星長征醫學科學有限公司。4.3 試劑組成：

包被板(96T)；酶結合物1瓶；TMB顯色劑A、B各1瓶；濃縮洗滌液1瓶(1：20稀釋)；終止液1瓶；陰性對照；陽性對照；子母袋；板貼。

4.4 試劑儲存條件及有效期：儲存溫度為2～8℃，有效期為12個月，穩定期開封后的使用期限為7天（剩余包被條裝入密封袋中保存）。4.5性能參數

4.5.1靈敏度：用靈敏度企業參照品（L1、L2、L3）進行檢測，結果應為陽性。4.5.2 精密性：用精密性企業參考品進行檢測，CV（%）<15%（n=0）。4.5.3其它因素的影響：

4.5.3.1 常見的干擾因素如溶血（血紅素含量不高于500mg/L）、高血脂（甘油三酯含量不高于5.6mmol/L）、黃疸（膽紅素含量不高于340ug/L）、類風濕因子和ALT升高均不會造成假陽性。

4.5.3.2 檢測血清與三種常見的抗凝劑抗凝血漿標本，結果無差異。4.5.3.3 本試劑與HAV-IgM、HEV、HCV和HIV抗體陽性樣品均無交叉反應。5.儀器設備: Anthos 2010酶標分析儀。6.操作步驟

6.1 取出試劑盒及待測樣品，將所有試劑及樣品恢復至室溫（18-25℃）。將恒溫箱調至反應溫度。

6.2 編號與加樣：第1孔加陽性對照50μl，第2孔加陰性對照50μl，第3孔加低值質控50μl和第4孔加高值質控50μl，第5孔開始分別按序將樣本50μl加入對應微孔。（注：用雙波長檢測，可不設空白對照孔；）

6.3 每孔加酶標結合物各50μl,振蕩30s，使孔內液體混勻，用板貼封蓋反應板,置 37℃溫育 60 分鐘。

6.4洗滌:小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌6次,扣干。

6.5 顯色:每孔加入TMB顯色劑A、B各50μl,輕輕振蕩混勻,置 37℃避光顯色 10～15分鐘。

6.6 加終止液:每孔加終止液 50μl，輕輕振蕩混勻。

6.7 測定：用酶標儀雙波長450nm/（620nm～630nm）測定各孔OD值。7.結果的分析與判斷

7.1 CUT OFF值=陰性對照孔OD值×2.5。（陰性對照孔OD值低于0.05者按0.05計算；高于0.05，按實際值計算。）

7.2 待測樣品OD值＜CUT OFF值時，判為陰性。7.3 待測樣品OD值≥CUT OFF值時，判為陽性。8.質量控制：

8.1 質控物來源: 上海復星長征醫學科學有限公司。8.2 貯存條件和穩定期：2～8℃貯存，效期12個月。8.3 室內質量控制和外部質量評價程序：見程序性文件。9.生物參考區間：陰性。10.可報告區間：陰性～陽性。11.報告時間：

11.1平診：門診報告發放時限是當日下午6：00統一發放報告。病區報告發放時限是當日下午6：00由護士發放到各科室。11.2急診：一般不報告急診。12.注意事項

12.1 勿使用過期試劑，不同品名、不同批號的試劑不可混用，從冰箱中取出使用前必須回復至室溫。

12.2取出當天所需微孔條后，其余微孔條用封口膜封存，以避免受潮。12.2加樣至孔底，勿加在孔壁上，勿產生氣泡；加試劑前應使液體混勻。如果滴加，滴加前應棄去1—2滴。垂直滴加。勿滴在孔壁上。12.3溫育時間一定要夠。

12.4洗板要充分；防溢出，防污染。

12.5拍板時應注意微孔掉落及多余液體灑濺。13．操作中可能的風險與安全措施（見第一節）14.臨床意義

14.1反映HBV感染與復制狀況的標準。PreS1-Ag出現較早并與HBeAg，HBV-DNA顯著相關，可作為急性乙型肝炎早期感染的標志，也是反應HBV復制的指標 14.2 預后及藥物療效的判斷。急性乙型肝炎患者PreS1一Ag陰轉越早，預后越好，是病毒清除的最早跡象；如果PreS1一Ag持續陽性，提示將發展至慢性肝炎，且在機體免疫反應參與下，可出現肝細胞損害，其中一部分可演變為肝硬化和肝癌。

14.3早期診斷病毒感染。PreS1-Ag出現在急性乙型肝炎最早期，在轉氨酶升高之前即可查出，提示可作為早期診斷乙型肝炎病毒感染。在體檢和獻血員中加查PreS1一Ag，對早診斷和盡早切斷傳染源有十分重要作用。因此前S1抗原聯合乙肝五項檢測，可提高乙肝病毒檢出率、減少漏診率。15.當檢測系統（儀器）不能工作時，所采取的補救措施：

15.1一般使用anthos2010酶標儀，如出現故障可以用MK3酶標儀進行代替檢測。15.2如儀器都出現故障，可以比對陰陽對照，肉眼判讀；無法準確判讀者，應留樣待系統正常后復查。16.參考文獻

16.1郭葆玉，等。乙型肝炎前S1蛋白的融合表達。第二軍醫大學學報2000年第3期第21卷 研究簡報。16.2試劑使用說明書。

第五篇：病毒YMDD檢測

山東煙臺解放軍107醫院肝病中心供稿|/

什么是病毒YMDD檢測

病毒YMDD檢測技術能夠判斷病毒類型，了解病毒是否變異耐藥、是否傳染、是否需要治療，并評估患者用哪種藥有效，用哪種藥無效等，對實現乙肝的科學轉陰提供了堅實、精準的數據支持，專家根據這些檢測數據配合乙肝治療最新方法進行治療，提升乙肝的治愈率。

病毒YMDD檢測的原理

病毒YMDD檢測是國外的一種新技術，就是抽取患者的血液，在該設備上面進行化驗。可以準確的查明您體內的乙肝病毒是否變異耐藥、病毒存在數量、是否復制、是否傳染、傳染性有多大、以及決斷病人適合用哪一類抗病毒藥物才是適應癥。

原來乙型肝炎病毒和其它病毒一樣，在復制過程中可產生多種變異，它的變異是在慢性感染過程中為適應生存環境而自然發生的，也可于發生在應用藥物或接種疫苗后。國內外研究表明，拉米夫定治療期間，病毒DNA編碼的DNA聚合酶基因序列發生了變異，這種變異在YMDD序列及其附近，因而稱為YMDD變異。YMDD變異既有在拉米夫定應用后出現的，也有病人未用過拉米夫定卻出現了YMDD變異。當長期應用拉米夫定時，發生YMDD變異的比率逐年增加，據來自臺灣的文獻報道，應用拉米夫定1年時的平均YMDD變異率約為14%，2年、3年和4年分別為38%、49%和66%。

因為病毒變異的緣故，臨床通常把病毒株分為野毒株和變異株，YMDD變異株對臨床預后和病毒學反應具有重要意義。當病毒發生了YMDD變異后，拉米夫定失去了對病毒的抑制作用，病毒重新出現復制，會伴有HBVDNA水平反跳和肝功能變化，甚至導致病情惡化。故開展YMDD變異的檢測很有必要，對及時調整治療方案、合理用藥及提高療效具有重要意義。

YMDD檢測的臨床意義

1、能夠檢測出體內乙肝病毒的數量。

2、能夠檢測乙肝病毒是否存在耐藥性。

3、能夠檢測是否具有傳染性以及傳染性的強弱。

4、能夠檢測體內乙肝病毒復制的程度。

5、能夠針對不同病情的患者，提供合適的治療藥物。

山東煙臺解放軍107醫院肝病中心供稿|/ 資料來源：山東煙臺解放軍107醫院肝病中心