第一篇：實(shí)驗(yàn)四 植物RNA的提取及其電泳鑒定2

實(shí)驗(yàn)四 植物RNA的提取及其電泳鑒定

一、原理植物細(xì)胞內(nèi)含有細(xì)胞質(zhì)RNA、細(xì)胞核RNA和細(xì)胞器RNA。細(xì)胞質(zhì)RNA包括mRNA、rRNA、tRNA。細(xì)胞核RNA主要有細(xì)胞質(zhì)RNA的前體及小分子細(xì)胞核RNA(snRNA)、染色質(zhì)RNA(chRNA)等。細(xì)胞器RNA主要指線粒體RNA及葉綠體RNA。這些RNA統(tǒng)稱細(xì)胞總RNA，其中大量的是rRNA，占80％左右。基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA在總RNA中只占1％～5％。不同的mRNA在分子大小、核苷酸序列，以及在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平等方面各不相同，但真核細(xì)胞mRNA 3ˊ末端都具有20～200個(gè)不等的多聚腺苷酸的尾，稱為poly(A)結(jié)構(gòu)。利用poly(A)結(jié)構(gòu)可以把mRNA從總RNA中分離出來。對于Northern雜交可以使用植物細(xì)胞總RNA，也可以使用由總RNA中分離出的mRNA。

植物細(xì)胞RNA提取中的主要問題是防止RNA酶的降解作用。RNA酶是一類水解核糖核酸的內(nèi)切酶，它與一般作用于核酸的酶類有著顯著的不同，不僅生物活性十分穩(wěn)定，耐熱、耐酸、耐堿，作用時(shí)不需要任何輔助因子，而且它的存在非常廣泛，除細(xì)胞內(nèi)含有豐富的RNA酶外，在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，如各種器皿、試劑、人的皮膚、汗液、甚至灰塵中都有RNA酶的存在。因而，生物體內(nèi)源、外源RNA酶的降解作用是導(dǎo)致RNA提取失敗的致命因素。

內(nèi)源RNA酶來源于材料的組織細(xì)胞，提取自始至終都應(yīng)對RNase活性進(jìn)行有效抑制。RNA提取過程中將蛋白質(zhì)變性劑與RNase抑制劑聯(lián)合使用效果較理想。蛋白質(zhì)變性劑包括酚、氯仿、SDS、Sarkosyl(十二烷酰肌氨酸鈉)、DOC(脫氧膽酸鈉)、鹽酸胍、異硫氰酸胍、4—氨基水楊酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉等；RNA酶抑制劑有RNasin(RNase阻抑蛋白)、氧釩核糖核苷復(fù)合物等。

外源RNA酶的抑制主要是使用DEPC(焦碳酸二乙酯C2Hs-O-CO-O-CO-O-CxH5)，它能與RNase分子中的必需基團(tuán)組氨酸殘基上的咪唑環(huán)結(jié)合而抑制酶活性，用于水、試劑及器皿的RNase滅活。DEPC與肝素合用效果增強(qiáng)，值得注意的是DEPC在Tris溶液中很不穩(wěn)定，很快分解成CO2 及C2H5OH，因而不能用于Tirs溶液的RNase滅活。水及其它溶液的滅活一般使用0.05％～0.1％DEPC，37℃處理過夜，也有人采用磁攪0.5小時(shí)以上的做法。DEPC處理后的溶液還需高壓滅菌，以去除殘存的DEPC。若DEPC去除不凈，會破壞mRNA活性。不能高壓滅菌的試劑要使用經(jīng)過DEPC處理的滅菌蒸餾水配制，然后用0.22μm 濾膜過濾。含有Tris的試劑用經(jīng)DEPC處理過的水配制，再經(jīng)高壓消毒。玻璃器皿可以在180℃烘烤8小時(shí)以上，不能烘烤的器皿用0.1％的DEPC水處理過夜后再高壓滅菌。

提取全過程必須在清潔無塵的環(huán)境中進(jìn)行。操作人員要使用一次性的手套拿取物品，盡可能避免一切污染機(jī)會。提取時(shí)使用的器皿應(yīng)經(jīng)過硅烷化處理，以防止RNA被吸附在器皿壁上，造成損失。RNA電泳使用的電泳槽需用去污劑洗滌，水沖洗，乙醇干燥。再浸入3％ H202溶液中，室溫下放置10分鐘以上，再用DEPC溶液處理過的水沖洗干凈。總之，實(shí)驗(yàn)中所用的試劑、器皿都要經(jīng)過RNase滅活處理。盡管如此，有時(shí)還會出現(xiàn)在提取的后期RNA被降解的問題。這是因?yàn)镽Nase活性的抑制只是一個(gè)暫時(shí)的現(xiàn)象，一旦抑制劑濃度下降RNase就有可能恢復(fù)活性。對于RNA提取來說，這是一個(gè)潛伏的危險(xiǎn)。在提取的前階段，提取液中無疑是有足夠的抑制劑，但到了提取后期，抑制成分逐漸減少，殘存的RNase就會復(fù)活而引起RNA降解。另外，提取后期發(fā)生的RNase污染，那怕是極輕微的，也會使到手的產(chǎn)品降解，因而提取后期要更加小心。

影響植物RNA提取的另一個(gè)問題是水溶性的細(xì)胞代謝物如酚、多糖等易與RNA結(jié)合成膠凍狀的不溶物或有色的復(fù)合物，它們能影響RNA的質(zhì)量及產(chǎn)量。人們采用了多種處理方法來解決這個(gè)問題，如對組織提取液進(jìn)行高速離心去除多糖；采用低pH值的提取緩沖液抑制酚的解離及氧化；或用β—巰基乙醇、PVP來抑制酚類的干擾等。

（一）總RNA的提取

用于研究基因表達(dá)的總RNA提取時(shí)首先要考慮的問題是材料的選取及預(yù)處理。由于基因表達(dá)與生理狀態(tài)密切相關(guān)，因而取材時(shí)必須考慮材料的生理狀態(tài)，必要時(shí)還要對材料進(jìn)行預(yù)處理，即施加某種因素，誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，如進(jìn)行光照、暗處理、或加入誘導(dǎo)物等。

材料的破碎與植物細(xì)胞總DNA的提取相同，采用液氮冷凍及在液氮中研磨。預(yù)處理過的材料要盡早地投入到液氮中，投入前要盡可能保持材料完整及新鮮，不要讓材料壓碎及破損。因?yàn)橹参锊牧显谄茡p時(shí)會引起多酚類物質(zhì)的積累及氧化，使組織變褐而影響RNA分離。細(xì)胞膜裂解也與DNA提取相同，主要使用SDS或Sakosyl、酚等。

由于細(xì)胞內(nèi)RNA主要以核蛋白體形式存在，所以總RNA提取的路線是細(xì)胞破碎，使核蛋白體從細(xì)胞內(nèi)釋放；采用使蛋白質(zhì)變性的做法，令核蛋白體解析，RNA迅速與蛋白質(zhì)分離，大量地釋放到溶液中；然后用酚、氯仿有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)，使核酸進(jìn)入水相；再選擇性沉淀RNA，使之與DNA分離；所得RNA再進(jìn)行必要的純化，最后用乙醇或異丙醇沉淀RNA。

至于植物細(xì)胞總RNA的提取方法，同植物總DNA提取一樣，沒有一種固定的通用方法。文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)的植物細(xì)胞總RNA的提取方法很多，但綜合起來看，分離的主要依據(jù)不外乎如下幾點(diǎn)：① 用酚及去污劑SDS或Sakosyl破碎細(xì)胞膜并去除蛋白質(zhì)；② 酚、氯仿反復(fù)抽提純化核酸；③ LiCl選擇性沉淀去除DNA及其它不純物；④ 3mol／L乙酸鈉(pH6)沉淀RNA，DNA在上清液中；⑤ CsCl密度梯度離心，去除多糖等雜質(zhì)，純化RNA。

目前用于Northern 雜交植物總RNA提取方法根據(jù)主要試劑可分為苯酚法、異硫氰酸胍（或CTAB）法及氯化鋰沉淀法：

1、苯酚法：該法利用苯酚協(xié)助破碎細(xì)胞；酚／氯仿變性蛋白質(zhì)并反復(fù)抽提核酸；3mol／L乙酸鈉選擇沉淀RNA；提取液中使用4—氨基水楊酸及三異丙基萘磺酸鹽抑制RNase活性。該方法操作簡單、經(jīng)濟(jì)，可用于從植物葉、莖、根及萌發(fā)幼苗中提取總RNA或核RNA。

2、異硫氰酸胍法：異硫氰酸根及胍離子都是很強(qiáng)的蛋白質(zhì)變性劑。異硫氰酸胍與十二烷基肌氨酸鈉合用可使核蛋白體迅速解體；與還原劑β—巰基乙醇合用能強(qiáng)烈抑制RNase 活力，因而是制備RNA的一種常用試劑。

傳統(tǒng)的異硫氰酸胍法需利用CsCl離心分離RNA(沉到管底)。這種做法操作時(shí)間長、設(shè)備要求高。經(jīng)改進(jìn)，目前使用的方法使操作大大地簡化，并可同時(shí)提取多個(gè)樣品。做法是將異硫氰酸胍、β—巰基乙醇、十二烷基肌氨酸鈉三者合用，強(qiáng)有力抑制了RNA降解，增加了核蛋白體的解離，將大量的RNA釋放到溶液中，然后用酸性酚進(jìn)行抽提，既可保證RNA穩(wěn)定，又可抑制DNA解離，使DNA與蛋白質(zhì)一起沉淀，RNA被抽提進(jìn)入水相，用異丙醇沉淀RNA后，經(jīng)酚／氯仿再次抽提進(jìn)行純化。該方法提取的RNA 用于Northern 雜交可以得到滿意結(jié)果。

3、氯化鋰沉淀法：該方法的主要原理是在一定的pH條件下，Li+使RNA發(fā)生特異性沉淀，通過多級沉淀可提高RNA的純凈度。利用氯化鋰選擇性沉淀時(shí)，因提取緩沖體系不同有多種不盡相同的氯化鋰法，有的使用硼酸緩沖液，加入還原劑二硫蘇糖醇抑制RNase活性，用SDS變性核蛋白；有的使用Tris—HCl緩沖體系，用苯酚及蛋白酶K處理蛋白；還有的使用高濃度尿素變性蛋白質(zhì)同時(shí)抑制RNase。氯化鋰沉淀法雖也有效，但沉淀過程較為繁瑣，并存在著Li+的污染問題。

（二）mRNA的分離

從總RNA中分離mRNA主要是利用親和層析的原理。植物mRNA的3ˊ—端具有poly(A)結(jié)構(gòu)，可用oligo(dT)—纖維素(寡聚(dT)—纖維素)或Poly(U)—Sepharse(多聚(U)—瓊脂糖)親和層析技術(shù)來純化mRNA。總RNA在流經(jīng)寡聚(dT)—纖維素層析柱時(shí)，在高鹽緩沖液作用下，mRNA 3／—端多聚(A)殘基與連接在纖維素柱上的寡聚(dT)殘基間配對，形成氫鍵，使mRNA被吸附在柱上。不具poly(A)結(jié)構(gòu)的RNA，不能發(fā)生特異性結(jié)合而從柱中流出。結(jié)合在柱上的mRNA可以用低鹽緩沖液或蒸餾水洗脫。因?yàn)樵诟啕}溶液中堿基間的氫鍵穩(wěn)定，在低鹽狀態(tài)下易解離，水打破poly(A)與(dT)間的氫鍵，使mRNA洗脫。

層析中涉及到的緩沖液有兩種，一是上樣緩沖液，也有人稱結(jié)合緩沖液。各文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)合緩沖液都由Tris·C1、EDTA、氯化物鹽類及去污劑組成。不同之處是有的使用0.5mol/L的NaCl、有的使用0.5mol／L的LiCl。不管使用哪種鹽，都為高濃度，以促進(jìn)poly(A)與寡聚(dT)結(jié)合。第二種是洗脫緩沖液，除Tris、去污劑的濃度減半外(也有Tris 量不減半的)，最大的變化是不含氯化物或含低濃度的LiCl。其作用是解除Poly(A)與寡聚(dT)的結(jié)合，使mRNA洗脫下來。

在沒有特制的層析柱時(shí)，可以用無菌硅化的巴斯德吸管或lml的注射器做層析柱，出口端用無菌硅烷化過的玻璃纖維填充。寡聚(dT)纖維素用上樣緩沖液懸浮后裝柱。柱體積在0.25ml左右。裝柱后用0.1mol/L 的NaOH 洗柱，上樣緩沖液平衡。RNA的樣品量一般在2~5mg，體積為lml左右。上樣前樣品要經(jīng)過變性處理，置沸水浴中加熱數(shù)分鐘后立即置冰浴中。上樣后就要立即收集流出液，這時(shí)流出液中可能含有一些未能與纖維素結(jié)合的mRNA。將流出液加熱至65℃維持6~7分鐘，然后快速冷卻再重新上樣，如此反復(fù)多次，以使mRNA充分被吸附在纖維素柱上，用5~10倍體積的結(jié)合緩沖液洗柱，這時(shí)rRNA、tRNA 等逐漸被冼脫，而mRNA掛在柱上。洗脫至流出液的OD260值幾乎為零，換用低鹽的洗脫緩沖液洗脫mRNA，部分收集器收集，測定每管中的mRNA濃度，合并含mRNA的洗脫液，用乙醇沉淀mRNA，于-70℃保存。

（三）RNA樣品質(zhì)量檢測

用于Northern雜交的RNA樣品應(yīng)是純凈的，無明顯的DNA、蛋白質(zhì)污染，無小分子有機(jī)物復(fù)合，無提取試劑的污染。分子完整，無嚴(yán)重降解。同DNA樣品質(zhì)量檢測相同，主要有紫外吸收法及瓊脂糖凝膠電泳法兩種。

1、紫外吸收法

① 純度檢測：在分光光度計(jì)上分別測定樣品在230nm、260nm、280nm的吸收值，計(jì)算A260/A280及A260／A230的比值。純凈的RNA樣品A260/A280的比值應(yīng)在1.7~2.0之間，若小于1.7則表明樣品中有蛋白質(zhì)或酚試劑污染。此時(shí)，可用等體積的酚／氯仿重新抽提去除蛋白質(zhì)；用氯仿、乙醚抽提去除殘酚。在抽提過程中RNA損失較大(約60％)。A260/A230的比值應(yīng)大于2.0，如小于2.0則表明RNA被異硫氰酸胍污染。這時(shí)可以通過乙醇或異丙醇重新沉淀(可反復(fù)幾次)來去除。關(guān)于DNA雜質(zhì)的存在與否紫外分光光度法不能予以明確說明。

② 濃度測定：純凈的RNA樣品(無DNA及核苷酸雜質(zhì))260nm的光吸收值等于1.0時(shí)，RNA的含量為37 μg/m1。根據(jù)此吸收值與濃度的關(guān)系可求出任一RNA樣品的濃度。

RNA含量(μg／m1)＝A × 稀釋倍數(shù)× 37 μg／m1 當(dāng)對含量要求不十分精確時(shí)，可近似認(rèn)為A260=1.0 時(shí)的RNA濃度為40μg/m1。測定時(shí)如果按如下做法可使計(jì)算簡化：取4μl RNA樣品，加蒸餾水至lml，以蒸餾水或TE為空白測定A260值，該數(shù)值× 10 即為樣品RNA濃度(μg/μl)。

2、瓊脂糖凝膠電泳法

由于RNA分子結(jié)構(gòu)與DNA不同，因而RNA電泳時(shí)有著與DNA電泳的不同之處。因RNA為單鏈分子，鏈內(nèi)配對堿基很易通過氫鍵結(jié)合而形成二級以至三級結(jié)構(gòu)。不同的RNA分子空間結(jié)構(gòu)不同，因而RNA分子在未變性的條件下分子量與泳動率無嚴(yán)格的相關(guān)性。在變性條件下電泳，破壞RNA的空間結(jié)構(gòu)，才能使RNA的泳動距離與其分子量對數(shù)值成正比。變性后的RNA泳動速度比天然RNA小1/2左右。在不需要測定RNA分子量時(shí)，使用濃度1.0％~1.4％的非變性瓊脂糖凝膠也可將不同的RNA分子分離。當(dāng)需要對所提取的RNA樣品進(jìn)行快速檢測時(shí)可使用非變性膠。

總RNA樣品中的主要成分是28S的rRNA、18S的rRNA及5SrRNA。電泳后在膠板上呈現(xiàn)三條明顯的條帶。在上樣量小時(shí)，5SrRNA的條帶有時(shí)顯示不清。若在變性膠上，這三條帶的遷移率分別與5.1kb、2.0kb 及0.12kb 的標(biāo)準(zhǔn)RNA的遷移率相近。從量上看，溴化乙錠染色后28SrRNA條帶的亮度應(yīng)為18SrRNA的兩倍。如果28SrRNA的亮度不如18SrRNA條帶，表明樣品中RNA有降解。發(fā)生降解的原因主要是RNase滅活不好，或操作中溫度過高。防止的方法是操作全過程在4℃低溫條件下或冰上進(jìn)行。操作中一次性手套要經(jīng)常更換，盡量避免RNase污染。

二、植物總RNA的提取方法

（三）TRIZOL法小量提取RNA（Invitrogen Co.）

1、于1.5ml離心管中加入1ml TRIZOL提取液；

2、稱取0.1g液氮研磨后的材料，轉(zhuǎn)移到提取液中，漩渦振蕩混勻，15-30℃靜置5min； 3、4℃，12000g，離心10min；取上清；

4、加0.2ml氯仿，劇烈搖動15sec，15-30℃放置2-3min，4℃，12,000g，離心15 min；

5、取水相，加0.25ml異丙醇，0.25ml高鹽溶液，顛倒混勻，15-30℃放置10min，4℃，12,000g離心10 min，去上清；

6、用1ml冰預(yù)冷的75％乙醇洗滌沉淀，漩渦振蕩，4℃，7500g離心5min；

7、真空泵吸除乙醇，用DEPC-ddH2O溶解RNA，55-60℃溶解10min，迅速冰浴，稍離心

8、-20℃短時(shí)間保存，-80℃保存長期保存。

高鹽溶液（100mL）：0.8M檸檬酸鈉 23.528g；1.2M NaCl 7.013g

三、RNA電泳檢測

在含有甲醛的凝膠上進(jìn)行的RNA電泳應(yīng)小心，甲醛蒸氣有毒，含有甲醛的溶液應(yīng)在化學(xué)通風(fēng)櫥內(nèi)配制，含甲醛溶液的電泳槽應(yīng)盡可能蓋嚴(yán)。操作步驟如下：

1、配制5×甲醛凝膠電泳緩沖液：0.1M MOPS（pH7.0）；40mM 乙酸鈉；5mM EDTA（pH8.0）

將20.6g 3-（N-瑪琳代）丙磺酸（MOPS）溶于800ml經(jīng)用DEPC處理的50mM乙酸鈉溶液。用2M氫氧化鈉將溶液的pH值調(diào)至7.0，加10ml經(jīng)用DEPC處理的0.5M EDTA(pH8.0)，在加經(jīng)用DEPC處理的水至溶液總體積為1L。上述溶液經(jīng)用0.2μm微孔濾膜過濾除菌，避光保存于室溫。光照或高壓后溶液逐漸變黃，淡黃色的緩沖液可正常使用，而深黃色緩沖液則不然。

2.、制備凝膠

將適量瓊脂糖溶于水（1%），冷卻至60℃，加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液和甲醛至終濃度分別為1×和2.2M（將12.3M甲醛貯存液、瓊脂糖水溶液和5×甲醛凝膠電泳緩沖液按1:3.5:1.1比例混合即可）。再化學(xué)通風(fēng)櫥內(nèi)灌制凝膠，于室溫放置30分鐘或更長時(shí)間，使凝膠凝固。

3、在一滅菌的1.5ml離心管內(nèi)混合下列液體，以制備樣品：RNA（30μg）

4.5μl；5×甲醛凝膠電泳緩沖液

2.0μl；甲醛

3.5μl；甲酰胺

10.0μl 于65℃溫育15分鐘，冷浴冷卻，離心5秒鐘使管內(nèi)所有液體集中于管底。每一泳道至多可分析30μg RNA，通常用10-20μg細(xì)胞總RNA進(jìn)行Northern雜交，可以檢測高豐度mRNA（占mRNA總量的0.1%以上）。許多批號的試劑級甲醛溶液已足夠純，不需經(jīng)過任何預(yù)處理即可直接使用。但如果甲醛溶液呈黃色，需在溶液中加入Dowex XG8混合床樹脂置磁力攪拌器上攪拌1小時(shí)，再用Whatman1號濾紙過濾2次，進(jìn)行去離子甲醛應(yīng)分裝成小份，充氮保存于-70℃。

4、加2μl滅菌的并經(jīng)用DEPC處理的甲醛凝膠加樣緩沖液。

甲醛凝膠加樣緩沖液：50% 甘油；1mM EDTA（pH8.0）；0.25% 溴酚藍(lán)；0.25% 二甲苯青FF；

5、加樣前，將凝膠預(yù)電泳5分鐘，電壓降為5V/cm，隨后將樣品加至凝膠加樣孔。可用已知大小的RNA作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，如用18S和28SrRNA或者9S兔β-珠蛋白mRNA，這些RNA的長度分別為6333、2366和710個(gè)核苷酸。也可以從BRL購置已知大小的RNA的混合物作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。通常分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的泳道位于凝膠邊緣，便于電泳后將其切去進(jìn)行溴化乙錠染色，可能的話在分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物以及欲轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜或尼龍膜的樣品之間留一個(gè)空白泳道。

6、將凝膠浸入1×甲醛凝膠加樣緩沖液中，3-4V/cm電壓降進(jìn)行電泳。電泳緩沖液不需進(jìn)行持續(xù)循環(huán)，電泳1-2小時(shí)后，收集并混合兩個(gè)液槽的緩沖液，再加入電泳槽中，即可繼續(xù)電泳。

7、電泳結(jié)束后（溴酚藍(lán)遷移出約8cm），切下分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物的凝膠，浸入溴化乙錠溶液（0.5μg/ml,用0.1M乙酸銨配制）中染色30-45分鐘。在凝膠旁放置一透明尺，在紫外燈下照像。測量照片上每個(gè)RNA條帶至加樣孔的距離，以RNA片段大小的1g對數(shù)值對RNA條帶的遷移距離作圖，用所得曲線計(jì)算從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物后通過雜交所檢出的RNA分子的大小。

小心：溴化乙錠是一種強(qiáng)烈的誘變劑并有中度毒性，使用含有這種染料的溶劑時(shí)應(yīng)戴手套，用后應(yīng)進(jìn)行凈化處理。紫外線照射有危害，對眼睛尤甚。為盡量避免受到照射② RNA沉淀未完全溶解

2、A260/A280<1.65。可能的原因是：

① 檢測吸光度時(shí)，RNA樣品沒有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高② 樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少③ 勻漿樣品時(shí)未在室溫放置5分鐘④ 吸取水相時(shí)混入了有機(jī)相⑤ RNA沉淀未完全溶解

3、RNA降解。可能的原因是：① 組織取出后沒有馬上處理或冷凍② 待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃③ 細(xì)胞在用胰酶處理時(shí)過度④ 溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理⑤ 電泳時(shí)使用的甲醛pH值低于了3.5

4、DNA污染。可能的原因是：① 樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少 ② 樣品中含有有機(jī)溶劑（如乙醇，DMSO等），強(qiáng)緩沖液或堿性溶液

五、植物RNA提取過程中難點(diǎn)的相應(yīng)對策

（一）酚類化合物的干擾及對策：

許多植物組織特別是植物的果實(shí)（如蘋果、櫻桃、李子、葡萄等）和樹木類植物中富含酚類化合物。酚類物質(zhì)的含量會隨著植物的生長而增加。因而從幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，針葉類植物的針葉中多酚的含量比在落葉植物的葉子中要高得多。在植物材料勻漿時(shí)，酚類物質(zhì)會釋放出來，氧化后使勻漿液變?yōu)楹稚㈦S氧化程度的增加而加深，這一現(xiàn)象被稱為褐化效應(yīng)（browning effect）。被氧化的酚類化合物（如醌類）能與RNA穩(wěn)定地結(jié)合，從而影響RNA的分離純化。但Newbury等發(fā)現(xiàn)RNA提取的難易程度與材料中酚類物質(zhì)的總量之間并無相關(guān)性，因此認(rèn)為不是所有的酚類化合物都影響RNA的提取。但一般認(rèn)為所謂的“縮合鞣質(zhì)”即聚合多羥基黃酮醇類物質(zhì)（如原花色素類物質(zhì)）是影響RNA提取的一類化合物。目前去除酚類化合物的一般途徑是在提取的初始階段防止其被氧化，然后再將其與RNA分開。

1、防止酚類化合物被氧化的方法：

① 還原劑法：一般在提取緩沖液中加入(-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）或半胱氨酸來防止酚類物質(zhì)被氧化，有時(shí)提取液中(-巰基乙醇的濃度可高達(dá)2％。(-巰基乙醇等還可以打斷多酚氧化酶的二硫鍵而使之失活。Su等認(rèn)為在過夜沉淀RNA時(shí)加入(-巰基乙醇（終濃度1％）可以防止在此過程中酚類化合物的氧化。硼氫化鈉（NaBH4）是一種可還原醌的還原劑，用它處理后提取緩沖液的褐色可被消減，醌類化合物可被還原成多酚化合物。

② 螯合劑法：螯合劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很強(qiáng)的結(jié)合多酚化合物的能力，其結(jié)合能力隨著多酚化合物中芳環(huán)羥基數(shù)量的增加而加強(qiáng)。原花色素類物質(zhì)中含有許多芳環(huán)上的羥基，因而可以與PVP或不溶性的PVPP形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使原花色素類物質(zhì)不能成為多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步驟中被除去。用PVP去除多酚時(shí)pH值是一個(gè)重要的影響因素，在pH8.0以上時(shí)PVP結(jié)合多酚的能力會迅速降低〔11〕。當(dāng)原花色素類物質(zhì)量較大時(shí)，單獨(dú)使用PVPP無法去除所有的這類化合物，因而需要與其它方法結(jié)合使用。

③ Tris-硼酸法：如果提取緩沖液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以與酚類化合物依*氫鍵形成復(fù)合物，從而抑制了酚類物質(zhì)的氧化及其與RNA的結(jié)合。這一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取緩沖液中不再加入其它還原劑。但如果Tris-硼酸濃度過高（＞0.2M）則會影響RNA的回收率。

④ 牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素類物質(zhì)與BSA間可產(chǎn)生類似于抗原－抗體間的相互作用，形成可溶性的或不溶性的復(fù)合物，減小了原花色素類物質(zhì)與RNA結(jié)合的機(jī)會，因此提高了RNA的產(chǎn)量。BSA與PVPP結(jié)合使用提取效果會更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用時(shí)要加入肝素以抑制RNase的活性。

⑤ 丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷凍研磨后的植物材料，可以有效地從云杉、松樹、山毛櫸等富含酚類化合物的植物材料中分離到高質(zhì)量的RNA。

2、酚類化合物的去除：

通過Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以將未被氧化的酚類化合物去除。與PVP、不溶性PVPP或BSA結(jié)合的多酚，可以直接通過離心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提時(shí)除去。Manning利用高濃度的2-丁氧乙醇（50％）來沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50％ 2-丁氧乙醇的緩沖液洗滌RNA沉淀以去除殘留的多酚。他認(rèn)為即使多酚被氧化，其氧化產(chǎn)物仍可以溶解在高濃度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，無需再用NaBH4來處理。

（二）多糖的干擾及對策：

多糖的污染是提取植物RNA時(shí)常遇到的另一個(gè)棘手的問題。植物組織中往往富含多糖，而多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似，因此很難將它們分開。在去除多糖的同時(shí)RNA也被裹攜走了，造成RNA產(chǎn)量的減少；而在沉淀RNA時(shí)，也產(chǎn)生多糖的凝膠狀沉淀，這種含有多糖的RNA沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液。由于多糖可以抑制許多酶的活性，因此污染了多糖的RNA樣品無法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。在常規(guī)的方法中，通過SDS-鹽酸胍處理可以部分去除一些多糖；在高濃度Na+或K+離子存在條件下，通過苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通過LiCl沉淀RNA也可以將部分多糖留在上清液中。但即使通過這些步驟仍會發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)多的多糖與RNA混雜在一起，所以還需要用更有效的方法來解決植物RNA分離純化時(shí)多糖污染的問題。

用低濃度乙醇沉淀多糖是一個(gè)去除多糖效果較好的方法。在RNA提取液或溶液中緩慢加入無水乙醇至終濃度10％～30％，可以使多糖沉淀下來，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的勻漿液中加入乙醇，如Lewinsohn等在從裸子植物的木質(zhì)莖中提取RNA時(shí)，在勻漿上清液中加入乙醇至終濃度10％以沉淀多糖。但Tesniere等在從葡萄漿果組織中提取RNA時(shí)，是在用CsCl超離心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入終濃度30％乙醇來沉淀多糖的，進(jìn)一步純化了RNA樣品。

另一個(gè)常用的方法是醋酸鉀沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉組織的RNA時(shí)在勻漿上清液中加入1/3體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液以沉淀多糖；Ainsworth在提取酸模植物花組織的RNA時(shí)加入的是1/5體積的5M醋酸鉀（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花葉和花粉的RNA時(shí)是加1/3體積的8.5M醋酸鉀（pH6.5）溶液到勻漿液中以除去多糖等雜質(zhì)。在提取某些植物材料的RNA時(shí)，是將上述兩種方法結(jié)合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA時(shí)，是在勻漿液中加入0.25體積的無水乙醇和0.11體積的5M醋酸鉀溶液以去除多糖雜質(zhì)。Su等在去除褐藻的多糖時(shí)，單獨(dú)使用乙醇或醋酸鉀都無效，只有兩者結(jié)合使用效果最佳。Fang等認(rèn)為緩沖液中含有高濃度的NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松樹RNA時(shí)，緩沖液中NaCl的濃度為2.0M和1.0M，通過氯仿抽提和乙醇沉淀RNA將RNA與多糖分離。Manning是將胡蘿卜種子等材料苯酚提取后的上清液稀釋，調(diào)節(jié)Na+離子濃度至80mM，然后加入0.4體積的2-丁氧乙醇來沉淀去除多糖。

（三）蛋白雜質(zhì)的影響及對策：

蛋白質(zhì)是污染RNA樣品的又一個(gè)重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦屬于蛋白質(zhì)，因而要獲得完整的、高質(zhì)量的RNA就必須有效地去除蛋白雜質(zhì)。常規(guī)的方法是在冷凍的條件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取緩沖液中含有蛋白質(zhì)變性劑，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等，這樣在勻漿時(shí)可以使蛋白質(zhì)變性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K來降解蛋白雜質(zhì)。進(jìn)一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)。

Wilcockson利用蛋白質(zhì)與RNA在高氯酸鈉溶液中的溶解度不同將它們分離。在70％高氯酸鈉溶液中，RNA的溶解度大于蛋白質(zhì)的溶解度，因而將大部分蛋白質(zhì)沉淀下來。接著在離心上清液中加入兩倍體積的無水乙醇，這時(shí)RNA能沉淀下來而能溶于70％高氯酸鈉溶液中的殘留蛋白質(zhì)仍然留在上清液中。這樣可以除去絕大部分的蛋白質(zhì)。

（四）次級代謝產(chǎn)物的影響及對策：

從植物組織中提取高質(zhì)量RNA的另一個(gè)難點(diǎn)是許多高等植物組織尤其是成熟組織能產(chǎn)生某些水溶性的次級代謝產(chǎn)物，這些次級代謝產(chǎn)物很容易與RNA結(jié)合并與RNA共同被抽提出來而阻礙具有生物活性的RNA的分離。因不能確定這些次級產(chǎn)物具體是什么物質(zhì)，所以，目前還沒有什么特殊的方法來解決這個(gè)問題。Baker等綜合Hughes等的選擇性沉淀法、Chirgwin的氯化銫梯度離心法和Iversen等的RNA回收方法純化了松樹種子、成熟松樹針葉等植物組織的RNA。

由于植物組織特別是高等植物組織細(xì)胞內(nèi)外組成成分的復(fù)雜多樣性，使得植物組織RNA的提取相對于其它生物材料來說要困難的多。實(shí)踐中經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)，即使同一種植物的不同組織其RNA提取方法會有很大的不同；含有某種干擾因素的不同植物材料，其適用的RNA提取方法可能不同；即使是同一種植物同一種組織材料，但來源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一樣。所以，對于某一植物或其組織來說，其相應(yīng)的RNA提取方法必需經(jīng)過摸索和實(shí)踐才能確立。

隨著植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的拓寬，可以肯定地說，在作為其研究基礎(chǔ)的植物材料RNA提取過程中還會出現(xiàn)新的難點(diǎn)，但隨著不斷地探索和經(jīng)驗(yàn)的積累，科學(xué)工作者們一定會迅速地解決這些難點(diǎn)，為植物分子生物學(xué)的發(fā)展鋪平道路。

思考題

1、RNA純化過程中如何避免RNA酶的污染？

2、如何檢測已純化RNA的質(zhì)量？

第二篇：實(shí)驗(yàn)四 植物DNA的提取[定稿]

實(shí)驗(yàn)四

植物DNA的提取

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

掌握CTAB法從植物葉片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法從植物葉片中提取基因組DNA，并進(jìn)行純度分析。

二、實(shí)驗(yàn)原理

1、核酸提取的基本原理

核酸是生物有機(jī)體中的重要成分，在生物體中核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)兩大類，在真核細(xì)胞中，前者主要存在于細(xì)胞核中，后者主要存在于細(xì)胞質(zhì)及核仁里。在制備核酸時(shí)，通過研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來。

在濃氯化鈉溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化鈉溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來。分離得到核蛋白后，需進(jìn)一步將蛋白等雜質(zhì)除去，常采用的去除蛋白的方法有3種：①用含異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液，使其乳化，然后離心除去變性蛋白質(zhì)，此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相和氯仿相中間，而DNA溶于上層水相。用兩倍體積的無水乙醇溶液將DNA鈉鹽沉淀出來。如果用酸性乙醇或冰乙酸來沉淀，得到的是游離的DNA。②用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質(zhì)變性，與核酸分離，從而從材料中直接提取出DNA。③用苯酚處理，然后離心分層，DNA溶于上層水相，蛋白變性后則停留在酚層內(nèi)。吸出上面水層，加兩倍體積的無水乙醇溶液，得到白色纖維狀DNA沉淀。反復(fù)使用上述方法多次處理DNA核蛋白溶液，就能將蛋白等雜質(zhì)較徹底地除去，得到較純的DNA制品。為了徹底除去DNA制品中混雜的RNA，可用RNA酶處理。生物材料中含有的脂肪物質(zhì)和大部分的多糖，在用鹽溶液分離核蛋白和用乙醇或異丙醇分級沉淀時(shí)即被除去。

在DNA提取、制備的過程中，核酸極不穩(wěn)定，許多因素可破壞其完整結(jié)構(gòu)：①化學(xué)因素，核酸的結(jié)構(gòu)在pH值4.0～11.0間較穩(wěn)定，pH值在此范圍外就會使核酸變性降解，故制備過程應(yīng)避免過酸過堿。②物理因素，DNA分子鏈很長，是雙螺旋結(jié)構(gòu)，既有一定的柔性，又有一定的剛性，故強(qiáng)機(jī)械作用如劇烈攪拌會令DNA分子斷裂，不利于收集，應(yīng)加以避免。③酶的作用，細(xì)胞中普遍存在的核酸酶在細(xì)胞壁或膜遭到破壞時(shí)被釋放出來，它會降解DNA分子。故須用酶的變性劑、抑制劑使之失活。操作過程最好在低溫(0℃左右)下進(jìn)行。常用的酶抑制劑有檸檬酸鹽、氟化物、砷酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作為蛋白變性劑，同時(shí)可使核酸酶被破壞而失活。

2、CTAB法和SDS法的提取原理

（1）CTAB法是一種快速簡便的提取植物總DNA的方法.。CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種陽離子型去污劑，它不僅能使蛋白質(zhì)變性，而且還能與核酸形成特異的核酸-CTAB復(fù)合物，這種復(fù)合物溶于高鹽緩沖液（≥0.7M NaCl），降低鹽濃度，通過超速離心能選擇性地沉淀核酸，并與多糖等可溶性雜質(zhì)分開，CTAB-核酸復(fù)合物再用70-75%乙醇浸泡可脫掉CTAB。提取時(shí)先將新鮮的葉片在液氮中研磨，破碎其細(xì)胞，然后加入CTAB分離緩沖液，將DNA溶解出來，再經(jīng)氯仿－異戊醇抽提除去蛋白質(zhì)，最后通過異丙醇沉淀或低鹽離心得到DNA。

（2）SDS法也是提取植物DNA的常用方法。先將新鮮的葉片在液氮中研磨以機(jī)械力破本碎細(xì)胞壁，然后加入SDS使細(xì)胞膜破裂，并同時(shí)將蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)與核酸分開。加入KAc可使SDS—蛋白質(zhì)復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式，使沉淀更加完全。

3、DNA的濃度測定和純度分析

（1）定磷法：是對樣品中核酸（DNA和RNA）含量的準(zhǔn)確定量。將樣品中的核酸用強(qiáng)酸（硫酸或高氯酸）消化成無機(jī)磷，然后用定磷試劑對生成的無機(jī)磷酸進(jìn)行滴定。定磷試劑是酸性鉬酸銨溶液，鉬酸銨能與無機(jī)磷酸定量結(jié)合成磷鉬酸絡(luò)合物，該絡(luò)合物能被抗壞血酸等還原劑還原成蘭色的鉬藍(lán)，在660nm處有最大光吸收。

（2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的RNA溶液或單鏈DNA的A260=0.022~0.024。1個(gè)A260相當(dāng)于50ug/mL的DNA、40ug/mL的RNA。蛋白質(zhì)的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。純的DNA的A260/A280在1.8左右，純的RNA的A260/A280在2.0左右。

三、試劑和器材：

(1)1M Tris-cl（pH8.0）：Tris l21.1g溶于蒸餾水，用濃HCl調(diào)至pH8.0以蒸餾水定容至1000ml(2)CTAB分離緩沖液： 2g CTAB，8.18g NaCL，0.74g EDTA.Na2.2H2O，10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0)，0.2mL巰基乙醇，加水定容到100mL。

(3)洗滌緩沖液（70%乙醇，10mmol/L乙酸銨）：70mL無水乙醇，0.077g乙酸銨，加水到100mL。(4)TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCL（pH7.4），1mmol/L EDTA(5)氯仿:異戊醇=24:1(6)液氮

(7)研缽，恒溫水浴（37～100℃），離心機(jī)，離心管。

四、操作方法：

(1)將10mlCTAB分離緩沖液加入50ml離心管中，置于65℃水浴中預(yù)熱。(2)稱取1.5g葉片，置于預(yù)冷的研缽中，倒入液氮，盡快將葉片研碎。(3)取1g粉末直接加入預(yù)熱的CTAB分離緩沖液中，輕輕轉(zhuǎn)動使之混勻。

(4)樣品于65℃保溫30分鐘，每5～10分鐘混勻一次。(5)加等體積（10ml）的氯仿－異戊醇，輕輕顛倒混勻。(6)室溫下4000r/min離心10分鐘。

(7)用膠頭滴管將上層水相吸入另一干凈的離心管中（注意不要吸動懸浮的細(xì)胞碎片和中間白色的蛋白質(zhì)層），向離心管中加入2/3體積的異丙醇，輕輕混勻，使DNA析出。（有些情況下，這一步可以產(chǎn)生云霧狀的DNA析出，如果看不到云霧狀的DNA，樣品則可以在冰浴中放置數(shù)小時(shí)甚至過夜）。(8)用下述方法收集DNA：

如果呈云霧狀的DNA析出，則用玻璃棒在云霧狀的DNA中輕輕轉(zhuǎn)動，纏起DNA，然后將玻璃棒轉(zhuǎn)移至20mL洗滌緩沖液中浸泡洗滌10分鐘（不要將DNA沉淀從玻璃棒上弄掉）。

如果看不到云霧狀的DNA，可將離心管在4000r/min離心5分鐘，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加20mL洗滌緩沖液，輕輕轉(zhuǎn)動離心管，洗滌核酸沉淀10分鐘，然后離心，小心地倒掉上清液，讓DNA沉淀自然干燥20分鐘。(9)用玻璃棒纏出DNA，在室溫下使DNA自然干燥20分鐘。(10)

將自然干燥的DNA溶于1mLTE緩沖液中，—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(11)

取100uL稀釋20倍，測定A260，A280，A230，或作出吸收波譜200~400nm并計(jì)算濃度和得率。

(12)

取5~10uLDNA溶液做0.7%的瓊脂糖電泳，檢查DNA的大小和質(zhì)量，以λ-DNA/HindⅢ做分子量標(biāo)準(zhǔn)，另取5uL做限制性酶切。

注意；所有操作均須溫和，避免劇烈震蕩。

五、思考題

1、CTAB、EDTA、巰基乙醇的作用是什么？

2、吸取樣品、抽提、及電泳時(shí)應(yīng)注意什么？為什么？

第三篇：提取RNA注意事項(xiàng)

RNA提取的細(xì)節(jié)

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發(fā)布日期：2009-05-26 03:06 文章來源：丁香園

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對大部分實(shí)驗(yàn)人員來說，RNA 抽提比基因組 DNA 抽提要困難得多。事實(shí)上，現(xiàn)有的 RNA 抽提方法/試劑，如果用于從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提 RNA，比抽提基因組 DNA 更方便，成功率也更高。那為什么同樣的方法用于組織 RNA 的抽提，總會碰到問題呢？ 組織 RNA 抽提失敗的兩大現(xiàn)象是： RNA 降解和組織內(nèi)雜質(zhì)的殘留。關(guān)于降解問題，首先看一下為什么從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提 RNA 不容易降解。現(xiàn)有的 RNA 抽提試劑，都含有快速抑制 Rnase 的成分。在培養(yǎng)細(xì)胞中加入裂解液，簡單的混勻，即可使所有的細(xì)胞與裂解液充分混勻，細(xì)胞被徹底裂解。細(xì)胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住細(xì)胞內(nèi)的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。也就是說，培養(yǎng)細(xì)胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸，所以其 RNA 不容易被降解；反過來講，組織中的 RNA 之所以容易被降解，是因?yàn)榻M織中的細(xì)胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。因此，假定有一種辦法，在抑制 RNA 活性的同時(shí)能使組織變成單個(gè)細(xì)胞，降解問題也就可以徹底解決了。液氮碾磨就是最有效的這樣一種辦法。但是，液氮碾磨方法非常麻煩，如果碰到樣品數(shù)比較多的時(shí)候更加會有此感覺。這樣就產(chǎn)生了退而求其次的方法：勻漿器。勻漿器方法沒有考慮細(xì)胞與裂解液接觸前如何抑制 Rnase 活性這個(gè)問題，而是祈禱破碎組織的速度比細(xì)胞內(nèi)的 Rnase 降解 RNA 的速度快。電動勻漿器效果較好，玻璃勻漿器效果較差，但總的來說，勻漿器方法是不能杜絕降解現(xiàn)象的。因此，如果抽提出現(xiàn)降解，原來用電動勻漿器的，改用液氮碾磨；原來用玻璃勻漿器的，改用電動勻漿器或者直接用液氮碾磨，問題幾乎 100% 能獲得解決。影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的雜質(zhì)殘留問題，其原因比降解更多樣，解決方法相應(yīng)也不同。總之，如果出現(xiàn)降解現(xiàn)象或者組織內(nèi)雜質(zhì)殘留現(xiàn)象，則必須對具體實(shí)驗(yàn)材料的抽提方法/試劑進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化大可不必使用您的寶貴樣品：可以從市場上購買一些魚/雞之類的小動物，取相應(yīng)部分的材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白質(zhì) – 用嘴碾磨，腸胃抽提。

究竟怎樣才能確保 RNA 抽提的成功率呢？實(shí)驗(yàn)前選擇合適的方法/試劑，這是最重要的一步；好的方法/試劑在確保成功的同時(shí)，操作方便，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。當(dāng)然，您的選擇可能仍然有問題，這就需要能正確分析實(shí)驗(yàn)失敗的原因，以便改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)前方法/試劑的選擇 0：抽提 RNA 的目的

RNA 用于不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其質(zhì)量要求不盡相同。cDNA 文庫構(gòu)建要求 RNA 完整而無酶反應(yīng)抑制物殘留；Northern 對 RNA 完整性要求較高，對酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RT-PCR 對 RNA 完整性要求不太高，但對酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。投入決定產(chǎn)出；每次都以獲得最高純度的 RNA 為目的，勞民傷財(cái)。1：樣品的收集/保存 – 影響降解的因素

樣品離開活體/或者原來的生長環(huán)境后，樣品中的內(nèi)源酶即會開始降解 RNA，降解速度與內(nèi)源酶含量及溫度有關(guān)。傳統(tǒng)上，只有兩個(gè)辦法可以徹底抑制內(nèi)源酶活性：立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿；切成小塊后立即投入液氮冷凍。這兩個(gè)辦法都要求操作快速。后者適合所有的樣品，而前者只適合細(xì)胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。具體地講，植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等最好都先用液氮冷凍起來，再往下做。

2：樣品的破碎及勻漿 – 影響降解和得率的因素

樣品的破碎是為了徹底勻漿，勻漿是為了使 RNA 徹底完整地釋放出來。細(xì)胞無須破碎即可直接勻漿，組織需要破碎后才能勻漿，酵母菌和細(xì)菌需要先用相應(yīng)的酶破壁后才能勻漿。內(nèi)源酶含量較低并且較容易勻漿的組織可以在裂解液中通過勻漿器一次完成破碎和勻漿過程；植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等樣品，它們不是內(nèi)源酶含量高，就是不容易勻漿，所以必須將組織的破碎和勻漿分開操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的勻漿方法是使用電動勻漿器。使用液氮碾磨要特別注意一點(diǎn)：在整個(gè)碾磨過程中，樣品不得融化，因?yàn)槔鋬龊髢?nèi)源酶更容易起作用。

3：裂解液的選擇 – 影響操作方便程度，內(nèi)源雜質(zhì)殘留的因素

常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性，因此，選擇裂解液的重點(diǎn)是要結(jié)合純化方法一起考慮。只有一個(gè)例外：高內(nèi)源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂解液，以增加滅活內(nèi)源酶的能力。

4：純化方法的選擇 – 影響內(nèi)源雜質(zhì)殘留，抽提速度的因素

對于干凈的樣品，如細(xì)胞，手邊的幾乎任何純化方法都可以獲得滿意的結(jié)果。但對于許多其它樣品，尤其是植物，肝臟，細(xì)菌等雜質(zhì)含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關(guān)重要的。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，但價(jià)格較貴；使用經(jīng)濟(jì)而經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以獲得滿意的結(jié)果，但操作時(shí)間長。

第四篇：RNA提取注意事項(xiàng)

RNA提取心得/經(jīng)驗(yàn)/體會/紀(jì)律（RNA提取注意事項(xiàng)）！

紀(jì)律一：杜絕外源酶的污染。

注意一：操作環(huán)境干凈無灰塵，嚴(yán)格戴好口罩，手套。

注意二：實(shí)驗(yàn)所涉及的離心管，Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實(shí)驗(yàn)臺面等要徹底處理。

注意三：實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNase-Free。紀(jì)律二：阻止內(nèi)源酶的活性

注意四：選擇合適的勻漿方法。

注意五：選擇合適的裂解液。

注意六：控制好樣品的起始量。紀(jì)律三：明確自己的抽提目的

注意七：任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時(shí)，抽提成功率急劇下降。

注意八：RNA 抽提成功的唯一經(jīng)濟(jì)的標(biāo)準(zhǔn)是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的一次成功，而不是得率。Rnase 污染的10大來源

1：手指頭 – 手指頭是外源酶的第一來源，所以必需戴手套并且頻繁更換。另外，口罩也必需戴，因?yàn)楹粑彩且粋€(gè)重要的酶來源。戴手套口罩的另外的好處是保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員。

2：槍頭，離心管，移液器 – 單純的滅菌是不能滅活 Rnase 的，所以槍頭和離心管要用 DEPC 處理，即使是標(biāo)明為 DEPC 處理過的。移液器最好是專用的，用前用 75% 的酒精棉球搽拭干凈，尤其是桿子；另外，一定不要使用褪頭器。3：水/緩沖液 – 一定要確保無 Rnase 污染。

4：實(shí)驗(yàn)臺面 – 最起碼要用 75% 的酒精棉球搽拭干凈。

5：內(nèi)源 Rnase – 所有組織均含內(nèi)源酶，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。液氮保存/碾磨方法的確不方便，但對有一些內(nèi)源酶含量很高的組織，卻是唯一的辦法。

6：RNA 樣品 – RNA 抽提產(chǎn)物可能都會含痕量的 Rnase 污染。

7：質(zhì)粒抽提 – 質(zhì)粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，殘留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。

8：RNA 保存 – 即使低溫保存，痕量的 Rnase 亦會導(dǎo)致 RNA 降解。長期保存 RNA 的最好辦法是鹽/醇懸液，因?yàn)榇荚诘蜏貢r(shí)抑制所有的酶活性。9：陽離子(Ca, Mg)– 在含這些離子時(shí)，80C 加熱 5 分鐘會導(dǎo)致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加熱，保存液需要含螯合劑(1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。10：后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用的酶 – 酶均有可能被 Rnase 污染。RNase 和 DEPC 處理

1：高壓滅菌是可以滅活部分 Rnase A 的。實(shí)驗(yàn)證明：37 C 與 RNA 反應(yīng)，沒有滅菌的 PBS，活性點(diǎn)為 100 pg/ml；滅菌后，活性點(diǎn)為 100 ng/ml。當(dāng)然，滅菌后 Rnase 仍然不能認(rèn)為沒有殘留。

2：DEPC 在水中半衰期為 30 分鐘。0.1% 的 DEPC 滅菌 15 分鐘可以認(rèn)為徹底 破壞了 DEPC。破壞后可以聞到一點(diǎn)氣味。

3：在1M Tris, 1M HEPES, 1M MOPS 中分別加入 1ug/ml Rnase A 和 0.1% 及 1% DEPC 實(shí)驗(yàn)。結(jié)果提示，0.1% DEPC 只對 MOPS 有效，而 1% DEPC 對三種試劑都有效。

4：0.01% DEPC，0.1% DEPC，1% DEPC 有效去除 Rnase A 的濃度分別為：100 ng/ml，500ng/ml，1 ug/ml。但要注意，DEPC 滅活后的副產(chǎn)品，對有些后續(xù)實(shí)驗(yàn)是有影響的。我也來談?wù)凴NA的提取，我覺得14樓說的方法很嚴(yán)格，但是有時(shí)候我們其實(shí)不必在過多的細(xì)節(jié)上太緊張。而在有些步驟一定要小心了。以下的內(nèi)容，是講給那些既想偷懶，有希望實(shí)驗(yàn)結(jié)果有保證的人聽的，如果你是習(xí)慣于每一步都很嚴(yán)格的人的話，建議還是按照14樓的方法做，因?yàn)槟菢硬攀钦景　?/p>

好了，下面是給想偷懶，但又不想搞砸實(shí)驗(yàn)的戰(zhàn)友看的。用最少的時(shí)間，Money，力氣，來做出最好的結(jié)果，是我們的終極目標(biāo)（PS：我相信一句話，懶人推動科技進(jìn)步！個(gè)人愚見，大家不要拍我啊）。我是做植物的，所以以植物RNA提取為例子：

一、關(guān)于器皿的處理：

槍頭ep管最好是用DEPC處理一下，當(dāng)然如果老板錢多的話，盡管用進(jìn)口的RNase-Free的吧。這里，如果你想要偷點(diǎn)懶，也是有辦法的，就是少處理一些ep管，因?yàn)楹竺嫖覀儠v到，不是所有的ep管都一定要處理的。

研缽，這個(gè)東西按要求是要高溫干燥處理的，但是在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，如果你不處理的話，也不會有太大的影響。因?yàn)樵谝话阄覀円幚淼牟牧仙隙紩в泻芏嗟腞NA酶，設(shè)想一下，一個(gè)研磨碎了的細(xì)胞會釋放多少RNA酶出來。所以，在研缽上殘留的那些RNase，不是導(dǎo)致你RAN降解的原因。我的做法是，洗干凈的研缽，和槍頭等一起濕熱滅菌即可。如果你真的很急的話，連濕熱滅菌也免了。

關(guān)于手套、口罩和實(shí)驗(yàn)臺。手套是一個(gè)很重要的東西，這個(gè)千萬不能省，而且實(shí)驗(yàn)過程當(dāng)中要勤換手套。因?yàn)椋话阄覀冊谧鰧?shí)驗(yàn)是時(shí)候，還要取用很多其他試劑、儀器。所以手套往往是最有可能污染你樣品的東西。所以千萬記得要換得勤快點(diǎn)。還有，順便說一下，最好是戴兩層PE手套，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)過程中，往往手上會出汗，戴一層手套的話，往往脫下來，就很難戴上去了。戴上兩層，外層的手套可以方便更換，免得戴不上，還把PE手套夾到ep管里面，這樣可是很危險(xiǎn)的！至于口罩，我認(rèn)為，不戴也沒關(guān)系，但不戴口罩的話，建議你少說些話了，尤其是不要對這樣品。講話是時(shí)候，帶出去的口水，足夠降解你的樣品了。工作臺的話，我想，能在一個(gè)超凈臺上是最好，普通的bench也可以，但是要保證周圍沒人干擾，否則，有人沖你打個(gè)招呼，那噴過來的口水就夠讓你的RNA嗝屁了（像口水兵？）。

二、關(guān)于實(shí)驗(yàn)過程和試劑

通常，提取植物RNA的方法如下

試劑：Trizol，氯仿，75％乙醇，異丙醇，DEPC水；

操作：

1）、每100mg組織加1ml TRIZOL試劑，用液氮?jiǎng)驖{后，室溫放置到變成液態(tài)；

2）、將液體吸到1.5 ml EP管中（可以用沒有經(jīng)DEPC處理的ep管），加新開的氯仿0.2ml，振蕩15秒。

3）、室溫靜置2-3分鐘后，12000 rpm，15 min，4℃，離心。

4）、取0.5ml上清到ep管（DEPC處理）加等體積的氯仿重新抽提；4℃，12000g，15min；

5）、取上清無色水相（約0.6 ml）到 EP管（DEPC處理過），加0.5 ml新開的異丙醇，室溫下靜置10分鐘；

6）、12000 rpm，15分鐘，4℃，離心。觀察總RNA在管底的白色沉淀，棄去上清（小心別倒了沉淀），75%乙醇1.0 ml洗滌（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4℃離心。

7）、重復(fù)洗滌（可選）；

8）、去上清，用10 ul Tip吸干液體。氣干沉淀5-10分鐘； 9）、加DEPC水20-30 ul，槍打勻，溶解總RNA，測OD值。10）、電泳，檢測RNA質(zhì)量。

講一下注意事項(xiàng)和可以偷懶的地方。Trizol現(xiàn)在我發(fā)現(xiàn)好多實(shí)驗(yàn)室都是自己做的，所以也不要吝嗇，多加一點(diǎn)吧，這個(gè)東西可以有效的抑制RNase的活力，情愿偏多，不要偏少。

第1）步，在磨樣的時(shí)候，注意，千萬要保持低溫，尤其是開始還沒加Trizol的時(shí)候，千萬不要讓樣品的溫度升高了，否則就可以和你的RNA說拜拜了。在加了Trizol后，情況會好些，如果研磨充分，那就暫時(shí)安全了。

第2）步的時(shí)候，這里直接加了氯仿，不少protocol上都還要多一步，先離心去渣，取上清后再加氯仿，這兩步完全可以合并，而且感覺合并的話，似乎RNA得率還高些！而且省下一批ep管，還省下一步的時(shí)間。

3）、4）和5）就按照protocol做，可以放松點(diǎn)，注意用處理過的ep管就好了，一般不會有降解的危險(xiǎn)。

第6）和7）兩步的洗滌會明顯的減少RNA的鹽含量，對提高RNA質(zhì)量有很大的幫助，當(dāng)然也會同時(shí)損失掉一部分的RNA，所以洗幾次，就看你的要求了。

后面幾步，大家就要小心了，現(xiàn)在剩下的可都是精貴的RNA了，做了幾個(gè)小時(shí)，可別前功盡棄啊。最后一步，推薦使用進(jìn)口ep管，進(jìn)口管不容易把液體掛在管壁上，這樣，將來取用的時(shí)候，損失會小不少。

三、其他

在批量提取的時(shí)候，建議用個(gè)大點(diǎn)的ep管架子，否則ep管擠在一起，手戴著手套，一不小心，就容易打翻樣品（哭吧，如果就一份樣）！

槍頭的話都是高溫成型的，如果你使用是槍頭是沒開封過的，一般不用DEPC處理也沒問題。主要是怕二次污染，有些工廠是用人工包裝了，不是機(jī)器打包的，那建議處理一下。

友情提示，DEPC是疑似致癌物質(zhì)，使用是時(shí)候千萬小心！我始終認(rèn)為，安全是第一位的，如果條件允許的話，盡量使用進(jìn)口ep管和槍頭，這樣就不用接觸DEPC了。

(TRIZOL提取注意事項(xiàng)

TRIZOL試劑是直接從細(xì)胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細(xì)胞時(shí)能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機(jī)層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水 3 樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機(jī)層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA對于樣品間標(biāo)準(zhǔn)化RNA的產(chǎn)量十分有用。

論是人、動物、植物還是細(xì)菌組織，該方法對少量的組織(50-100 mg)和細(xì)胞(5×106)以及大量的組織(≥1 g)和細(xì)胞(>107)均有較好的分離效果。TRIZOL試劑操作上的簡單性允許同時(shí)處理多個(gè)的樣品。所有的操作可以在一小時(shí)內(nèi)完成。TRIZOL抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白的污染。故而能夠作RNA 印跡分析、斑點(diǎn)雜交、poly(A)+ 選擇、體外翻譯、RNA酶保護(hù)分析和分子克隆。如果是用于PCR，當(dāng)兩條引物位于單一外顯子內(nèi)時(shí)，建議用級聯(lián)擴(kuò)大的DNase I(Cat.No.18068)來處理抽提的總RNA。

RIZOL試劑能促進(jìn)不同種屬不同分子量大小的多種RNA的析出。例如，從大鼠肝臟抽提的RNA瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色，可見許多介于7 kb和15 kb之間不連續(xù)的高分子量條帶，（mRNA和hnRNA成分）兩條優(yōu)勢核糖體RNA條帶位于~5 kb(28S)和~2 kb(18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之間(tRNA, 5S)。當(dāng)抽提的RNA用TE稀釋時(shí)其A260/A280比值≥1.8 預(yù)防RNA酶污染: 提RNA過程中任一環(huán)節(jié)的不正確操作都可能導(dǎo)致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很難完全抑制，預(yù)防其污染是十分必要的。在實(shí)際的操作中應(yīng)遵循以下指南：

* 全程佩戴一次性手套。皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成為RNA酶的來源。培養(yǎng)良好的微生物實(shí)驗(yàn)操作習(xí)慣預(yù)防微生物污染。

* 使用滅菌的，一次性的塑料器皿和自動吸管抽提RNA，避免使用公共儀器所導(dǎo)致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探針的實(shí)驗(yàn)室可能用RNA酶A 或 T1來降低濾紙上的背景，因而某些非一次性的物品（如自動吸管）可能富含RNA酶。* 在TRIZOL中，RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對樣品的后續(xù)操作會要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小時(shí)。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。其他注意事項(xiàng)

* 當(dāng)TRIZOL用量少于2-ml時(shí)建議使用清潔的一次性的聚丙材質(zhì)試管。

* 當(dāng)TRIZOL用量較大時(shí)，可以使用玻璃試管(Corex)或聚丙材質(zhì)試管，事先檢驗(yàn)以確保該試管可以耐受加入TRIZOL和氯仿后12,000×g的離心力。不可使用有裂縫或者破損的試管。* 離心前小心平衡試管。

* 離心前玻璃管口必須蓋上鋁箔并用石蠟?zāi)し饪冢郾┕鼙仨毶w緊。RNA抽提指南

注意：用TRIZOL抽提RNA時(shí)要戴手套和護(hù)眼罩。避免接觸皮膚和衣服。在化學(xué)通風(fēng)櫥完成操作。避免呼吸道吸入。

如無例外，所有的操作應(yīng)該在15-25°C的條件下完成，試劑亦在15-25°C的條件下。

RNA提取注意事項(xiàng)

一些RNA提取方法，在進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)根據(jù)研究對象的性質(zhì)，提取核酸的用途而對上述方法在操作步驟和試劑使用量上作一定的修改。

1、在核酸提取時(shí)，為了增加細(xì)胞的裂解度，增加核蛋白復(fù)合體破碎度，以釋放更多的游離核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在確保沒有核酸水解酶存在的前提下，酶反應(yīng)時(shí)間越長越好。

2、有時(shí)在使用蛋白酶時(shí)，為了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶緩沖液中用終濃度5mM的EDTA代替NaCL，并且可將反應(yīng)溫度提高到50－60℃，并將反應(yīng)時(shí)間縮短到15－25min，但酶用量必須提高10－20倍。溶菌酶使用時(shí)緩沖液中需加EDTA，因游離金屬離子對酶有抑制。

3、許多植物材料中富含酚，在細(xì)胞破碎時(shí)，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的錕類物資，影響核酸的提取及降低提取質(zhì)量，在提取液中加入PVP和巰基乙醇對降低酚類的干撓可能有所幫助。PVP將與酚形成復(fù)雜的聚合體，在提取時(shí)將酚從核酸成分中游離。且PVP與巰基乙醇作為強(qiáng)還原劑可防止多酚的褐變。另外作為還原劑的這些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。

4、許多生物材料在提取核酸時(shí)，都會遇到多糖的污染問題，具體表現(xiàn)為有機(jī)溶劑沉淀時(shí)，沉淀很多，但復(fù)溶時(shí)，大量沉淀不溶，電泳觀察時(shí)核酸含量很低。

克服多糖污染可采用以下一些辦法 1)CTAB多次抽提。

2)在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)先稀釋樣品濃度（可到10倍左右），對低濃度樣品再進(jìn)行沉淀。

3)在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)選用異丙醇和5MNaCL作為沉淀溶劑，此時(shí)氯化鈉的用量可用到1/5-1/2的體積，異丙醇可用到0.6-1的體積。異丙醇沉淀核酸時(shí)，高濃度鹽存在將使大量多糖存在在溶液中，從而可達(dá)到去多糖的作用。但高濃度的鹽存 在會影響核酸的進(jìn)一步操作，因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。

5、在核酸提取時(shí)，酚與氯仿均起到變性的作用。酚的變性能力強(qiáng)于氯仿，但酚與水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能損失部分核酸外，水相中還會殘留酚，而酚的存在將對核酸的酶反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)的抑制，因此在操作中可單用氯仿作變性劑、也可用酚/氯仿混合變性，也可用單一酚作變性己，但用單一酚后在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)一定要用氯仿從抽提。

6、在操作中當(dāng)加入變性劑氯仿后，為了保證核酸樣品的完整性，操作要輕，尤其在提DNA時(shí)，更要避免劇烈操作。

7、在沉淀核酸時(shí)可用乙醇與異丙醇，乙醇的極性要強(qiáng)于異丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高時(shí)，用異丙醇沉淀可部分克服這種污染，尤其用異丙醇在室溫下沉淀對擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。

8、在提取核酸時(shí)，如樣品濃度低，則應(yīng)增加有機(jī)溶劑沉淀時(shí)間，－70℃下>30min;－20℃過夜將有助于增加核酸的沉淀量。

9、在核酸提取過程中有機(jī)溶劑沉淀后復(fù)溶時(shí)可加水因此時(shí)離子濃度可能較高，而到高度純化后低溫保存時(shí)最好復(fù)溶于TE緩沖液中，因溶于TE的核酸儲藏穩(wěn)定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸樣品保存時(shí)要求以高濃度保存，低濃度的核酸樣品要比高濃度的更易降解。

10、核酸提取后可通過PCR、RT－PCR直接擴(kuò)增出目的基因片斷，也可首先構(gòu)建文庫、然后由RACE、dd-PCR等差異顯示技術(shù)、AFLP等標(biāo)記技術(shù)、差異雜交或文庫扣除技術(shù)等方法篩選出特異探針，再用此探針從文庫中篩選出完整基因。

11、在抽提過程中，若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多，可以增加抽提次數(shù).提取RNA請盡量在低溫下操作，如果條件不容許，在室溫下操作的時(shí)間要盡可能的短。

第五篇：組織RNA提取

哺乳動物組織樣品RNA的抽提

哺乳動物組織樣品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提過程中降解，以及盡可能得到最高的RNA抽提效率。以下介紹我們實(shí)驗(yàn)室認(rèn)為最符合以上兩個(gè)要素的抽提方法。

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一、實(shí)驗(yàn)材料：

Trizol試劑（Invitrogen公司）

研缽，勻漿器，鑷子，鋁箔都高溫滅菌即可；

二、具體過程：

1、樣品在離體后應(yīng)迅速冷凍在液氮中，若是比較大塊的組織，要盡量把組織剪切成黃豆大小的塊，使液氮迅速滲透到組織內(nèi)部而防止組織內(nèi)部的RNA降解。組織用鋁箔包好或放入凍存管中，并做好記號，注意不要把記號寫在紙上，以防紙被組織的血水滲透而導(dǎo)致記號模糊。可以把鋁箔放入紗布袋并儲存在液氮中。

2、在抽提RNA前，先把研缽預(yù)冷，往研缽內(nèi)反復(fù)加入液氮，至少4-5次，使研缽充分預(yù)冷。從液氮罐中取出樣本后，把組織塊放入已預(yù)冷的研缽中進(jìn)行研磨，邊研磨邊加液氮，整個(gè)過程都不要使液氮揮干。一次研磨的組織塊重量不要超過300mg。

3、研磨到組織樣品成粉末狀后（一般需要8-10min的研磨過程），在液氮基本揮發(fā)完時(shí)，在每個(gè)研缽中加2-3ml Trizol試劑。由于此時(shí)研缽很冷，Trizol加入后會凍結(jié)成固體狀。可以繼續(xù)研磨此固體成粉末，隨著研缽溫度回升到室溫，固體狀的 Trizol逐步回復(fù)到液體狀態(tài)，此時(shí)，若發(fā)現(xiàn)液體很粘，研杵能牽起絲狀物，說明Trizol的量太少，需在此步繼續(xù)補(bǔ)加Trizol。若 Trizol的量過少，會導(dǎo)致抽提的RNA中有較多的基因組DNA污染。由于Trizol試劑中含有強(qiáng)烈的RNA酶抑制劑，因此組織樣品和Trizol充分研磨混勻后就不用擔(dān)心RNA的降解了。

4、把此Trizol試劑轉(zhuǎn)移到玻璃勻漿器中，再進(jìn)一步勻漿3-5min。

5、再把Trizol試劑轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，后續(xù)可以按照Trizol試劑的標(biāo)準(zhǔn)操作抽提總RNA。也可以把此Trizol試劑保存在生物冰（低于15℃即可）郵寄給我們，由我們來完成后續(xù)的抽提過程。說明：

1、研磨，勻漿過程中使用過的器具放入八四消毒液中浸泡消毒一天后，再用洗滌靈洗刷干凈晾干后泡酸過夜，洗刷晾干后包上鋁箔高壓滅菌后，180℃烘烤4小時(shí)以備下次使用。

2、此方法看上去過程雖然比較繁瑣，但得到的RNA質(zhì)量好，抽提的RNA量比其他方法要高，比如米粒大的胃鏡標(biāo)本平均能提出約10 g總RNA，足夠做一張人22K全基因組芯片了。得到的RNA的電泳檢測圖片如圖7。

3、另外在我們的工作中，接觸到一些用戶在取了組織后，馬上凍到-70℃冰箱來保存，然后提取RNA做反轉(zhuǎn)錄，這樣的樣品中RNA往往有較大的降解，用來 做一些基因的RT-PCR還可以，但若做芯片工作就不行了。要盡量先液氮速凍。