第一篇：實驗二 植物核酸的提取-教案

授課教師 學生人數 55 課 題 實驗二 植物基因組DNA的提取 授課類型 新授課 授課方法 講授、演示 教學目的 掌握CTAB法提取植物基因組DNA的原理與方法 教學重點 理解每一步實驗操作的目的 教學難點 實驗操作過程中的一些注意事項 教學過程

一、背景知識

1.DNA在細胞中存在的位臵？植物細胞DNA存在的位臵和動物細胞有何不同？（圖）教學用具 多媒體

2.DNA的存在形式

雙螺旋結構圖

雙螺旋結構組成

染色體是怎樣形成的？

一級結構（核小體=雙螺旋+組蛋白）-二級結構（螺線管）-三級結構（超螺線管）-四級結構（染色體）

真核生物基因組DNA是經過四級包裝形成了染色體，先是DNA形成雙螺旋結構，再與組蛋白形成核小體（一級結構），壓縮7倍，再形成螺旋管（二級結構），壓縮6倍，之后再形成超螺旋管（三級結構），壓縮40倍，最后超螺旋管壓縮形成染色體（四級結構），再壓縮5倍，正常細胞中基因組DNA是以染色質（相當于一級結構）形式存在，在細胞分裂的中期以染色體形式存在，真核生物細胞質DNA主要是以裸露的環狀DNA形式存在，沒有核小體結構。

3.遺傳物質核酸除了DNA外還有另外一種，即RNA，它與DNA在結構上的區別？（圖）

RNA基本單位中間的五碳糖是核糖，含氮堿基尿嘧啶（U）替代 胸腺嘧啶（T）4.核酸的理化性質

（1）形狀：DNA為白色類似石棉樣的纖維狀物，RNA的純品呈白色粉末或結晶。

（2）溶解性：一般都溶于水，不溶于乙醇、異丙醇、氯仿等有機溶劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水。（3）保存：在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶液中較穩定。

二、實驗目的

1.掌握CTAB法提取植物基因組DNA的原理 2.CTAB法提取植物基因組DNA的實驗方法

三、實驗原理

1.核酸在細胞中的存在方式，是以核酸-蛋白質復合物的形式存在，如一級結構核小體（圖）：DNA螺旋+組蛋白

2.通過低溫研缽破壞植物細胞壁

3.加入CTAB溶解細胞膜，CTAB與核酸形成核酸-CTAB復合物，使核酸與蛋白質分離。

4.加入高鹽溶液溶解核酸-CTAB復合物，加入蛋白質變性劑使蛋白質變性沉淀出來，離心除去蛋白質。5.加入核酸沉淀劑，溶解CTAB，并使和核酸沉淀出來，離心得到核酸沉淀。

四、實驗儀器 1.水浴鍋

2.離心機（12管）：3臺 3.研缽：10個

4.移液槍（包括槍頭）：1ml、400ul

五、實驗材料與藥品

實驗材料：新鮮菠菜葉片 1.十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）

作用：溶解細胞膜并與核酸結合，便于分離核酸。商品信息：瓶裝/100g。

理化性質：白色或淺黃色結晶體至粉末狀，有刺激氣味，易溶于異丙醇，可溶于水,震蕩時產生大量泡沫，化學穩定性好，耐熱、耐光、耐壓、耐強酸強堿。有吸濕性，在酸性溶液中穩定；溶于10份水，溶于熱水、乙醇、三氯甲烷,易溶于異丙醇水溶液,微溶于丙酮,不溶于乙醚和苯。

儲存：在陰涼，干燥，通風良好的地方，遠離不相容的物質。危害：高毒，對皮膚及粘膜刺激性小，有輕微脫脂作用。2.1M Tris-HCl PH8.0緩沖液

作用：提供一個緩沖環境，防止核酸被破壞 商品信息：瓶/100ml，無色、澄清溶液

理化性質：Tris中文品名為三羥甲基氨基甲烷，瓶/500g。是一種白色結晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，對銅、鋁有腐蝕作用，有刺激性的化學物質。

儲存：室溫保存。

危害：毒性低，可致癌，不要直接接觸皮膚。3.乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）

作用：螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制脫氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。

商品信息：瓶/250g。

理化性質：無味無臭或微咸的白色或乳白色結晶或顆粒狀粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值約為5.3。可由EDTA與氫氧化鈉和碳酸鈣作用制得。

儲存：于陰涼、通風的庫房。遠離火種、熱源。應與氧化劑分開存放，切忌混儲。配備相應品種和數量的消防器材。儲區應備有合適的材料收容泄漏物。

危害：對粘膜和上呼吸道有刺激作用。對眼睛、皮膚有刺激作用。本品可燃，具刺激性。4.Tris飽和酚

作用：強蛋白質變性劑。商品信息：瓶/250ml。

理化性質：為淺黃色透明液體，上層為Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羥基喹啉和0.1%的β-巰基乙醇。

儲存：4℃避光保存。

危害：Tris飽和酚有較強的腐蝕性，應盡量避免皮膚直接接觸或吸入體內。如發現變為黃色或棕色，表明發生氧化，不能使用。5.β-巰基乙醇（2-巰基乙醇）

作用：提供一種還原劑，這樣酚類物質（植物材料特別是老的材料中含有大量的酚類物質）就不能被氧化成醌（醌易與DNA發生共價結合，使DNA發生褐變，從而影響你提DNA的實驗）。巰基乙醇兼有消除CTAB震蕩時產生的泡沫的作用。

商品信息：瓶/100g。

理化性質：無色透明液體，具有少許硫醇氣味。易溶于水，乙醇和乙醚等有機溶劑，與苯可以任意比例混溶。水中溶解度：1mg/mL。

儲存：對空氣敏感，易吸潮。使容器保持密閉，儲存在陰涼、干燥通風處。打開了的容器必須仔細重新封口并保持豎放位臵以防止泄漏。建議貯存溫度 2-8℃。

危害：高毒吸入、攝入或經皮膚吸收后會中毒。對環境有危害，對水體可造成污染。本品可燃。6.氯化鈉（NaCl）

作用：CTAB-核酸復合物在高鹽溶液中易溶。商品信息：瓶/500g，分析純AR。

理化性質：白色晶體狀。易溶于水、甘油，微溶于乙醇、液氨；不溶于濃鹽酸。在空氣中微有潮解性。穩定性比較好。

儲存：儲存于陰涼、通風的庫房。遠離火種、熱源。應與氧化劑分開存放，切忌混儲。危害： 7.無水乙醇

作用：DNA沉淀劑、洗滌劑。商品信息：瓶/500ml，分析純AR。

理化性質：無色澄清液體。極易從空氣中吸收水分，能與水和氯仿、乙醚等多種有機溶劑以任意比例互溶。儲存：儲存于陰涼、通風的庫房。遠離火種、熱源。庫溫不宜超過30℃。保持容器密封。應與氧化劑、酸類、堿金屬、胺類等分開存放，切忌混儲。采用防爆型照明、通風設施。禁止使用易產生火花的機械設備和工具。

危害：易燃，具刺激性。蒸氣與空氣能形成爆炸性混合物，爆炸極限3.5%～18.0%（體積）。8.氯仿（三氯甲烷）

作用：蛋白質變性劑，加速有機相與液相分層，去除核酸溶液中的少量酚（酚易溶于氯仿）。商品信息：瓶/500ml。

理化性質：無色透明液體，極易揮發，有特殊氣味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。儲存：保存在密封的棕色瓶中。

危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空氣逐漸被氧化生成劇毒的光氣。9.異戊醇

作用：減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩定。

商品信息：瓶/500ml。

理化性質：無色液體，有不愉快的氣味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有機溶劑。

儲存：儲存于陰涼、通風的庫房。遠離火種、熱源。庫溫不宜超過30℃。保持容器密封。應與氧化劑、酸類等分開存放，切忌混儲。采用防爆型照明、通風設施。禁止使用易產生火花的機械設備和工具。儲區應備有泄漏應急處理設備和合適的收容材料。

危害：吸入、口服或經皮膚吸收有麻醉作用。其蒸氣或霧對眼睛、皮膚、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神經系統功能紊亂，長時間接觸有麻醉作用。易燃，其蒸氣與空氣可形成爆炸性混合物，遇明火、高熱能引起燃燒爆炸。10.異丙醇

作用：DNA沉淀劑，DNA在異丙醇的溶解度更低，所以用異丙醇來沉淀更完全，而后由于異丙醇不易揮發，所以用乙醇洗去異丙醇，乙醇揮發快。用-20度預冷異丙醇沉淀效果較等體積乙醇沉淀好；異丙醇約和2.5倍體積的乙醇效果相當；但DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀會使部分DNA溶解損失；所以多選用-20度預冷異丙醇。一般6500倍到8000倍重力10分鐘就可以將異丙醇沉淀的核酸緊密的離到管底。

商品信息：棕色玻璃瓶/500ml。

理化性質：無色透明具有乙醇氣味的可燃性液體。有似乙醇和丙酮混合物的氣味，能與醇、醚、氯仿和水混溶，不溶于鹽溶液。

儲存：儲存于陰涼、通風的庫房。遠離火種、熱源。庫溫不宜超過30℃。保持容器密封。應與氧化劑、酸類、鹵素等分開存放，切忌混儲。采用防爆型照明、通風設施。禁止使用易產生火花的機械設備和工具。儲區應備有泄漏應急處理設備和合適的收容材料。

危害：微毒類，高濃度蒸氣具有明顯麻醉作用，對眼、呼吸道的黏膜有刺激作用，能損傷視網膜及視神經。常溫下可引火燃燒，其蒸汽與空氣混合易形成爆炸混合物。11.PVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）

作用：PVP是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶的絡合物質，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結合，有效去除多糖。

商品信息：白色塑料瓶/100g。

理化性質：白色或乳白色粉末或顆粒，有微臭。溶于水、堿、酸及極性有機溶劑。儲存：室溫干燥保存。危害： 12.液氮（LN2）

作用：低溫導致植物組織凍裂，方便研磨使細胞破碎，使DNA釋放完全；低溫情況下各酶處于低活性狀態，有利于抑制DNAase的作用，保護DNA。商品信息：分析純

理化性質：-196℃。液態的氮氣。是惰性的，無色，無臭，無腐蝕性，不可燃，溫度極低。儲存：儲存于陰涼、通風的庫房。庫溫不宜超過30℃。危害：汽化時大量吸熱接觸造成凍傷。

六、實驗試劑

1.氯仿-異戊醇（24:1）100ml-20ml=80ml {氯仿 96ml + 異戊醇 4ml} = 100ml，4℃保存 2.酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）40ml {氯仿-異戊醇（24:1）20ml + Tris飽和酚20ml} = 40ml，4℃保存 3.TE緩沖液 PH8.0 50ml {10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液 0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml} → → 定容到50ml → 高壓滅菌后冷卻4℃保存 ? 【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {蒸餾水 80ml + EDTA-2Na.2H2O 18.61g} → 用NaOH（約2g）調至PH8.0 → 定容至100ml → → 分裝后高壓滅菌備用。注：需加入NaOH調至PH8.0才能完全溶解。? 【10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液】的配制：10ml {1M Tris-HCl PH8.0緩沖液100μl + 水9.9ml} → 定容至10ml → 10mM Tris-HCl（PH8.0）緩沖液 4.2%CTAB抽提液 250ml

{CTAB 4g + 無水乙醇 5ml + 水100ml} → 加入200ml燒杯中 → 加熱溶解 → 再依次加入 → → {5M NaCl 56ml + 1M Tris-HCl（PH8.0）20ml + 0.5M EDTA 8ml} → 定容至250ml → 高壓滅菌冷卻后加入 → {1%β-巰基乙醇（400ul）2ml + PVP-40 5g} → 4℃保存 ? ? 【5M NaCl溶液】配制：100ml {NaCl 29.22g + 水90ml} → 加熱到80℃溶解冷卻后 → 定容至100ml → 高壓滅菌備用 【1%（v/v）β-巰基乙醇】配制：10ml {β-巰基乙醇 100μl +水9.9ml} → 1%β-巰基乙醇10ml 5.蒸餾水

所有藥劑用水都要純凈水經高壓滅菌冷卻

七、實驗步驟

（一）實驗前準備

1.研缽、異丙醇-20℃預冷；【研缽10個、異丙醇75ml】

2.將2%CTAB抽提液從4℃冰箱內取出在65℃水浴預熱；【CTAB抽提液30ml】 3.稱取30份新鮮菠菜葉片，每份1g，稱重時去葉脈；【菠菜葉片30g】 4.用蒸餾水沖洗葉片，濾紙吸干水分，將葉片用剪刀剪小。【洗瓶、濾紙、剪刀】

5.實驗器材：冰箱、65℃水浴鍋、液氮、10ml離心管90個、藥匙、移液槍（1ml、100μl、400μl）、離心機（10000r/min）

6.實驗藥劑：酚-氯仿-異戊醇30ml（每管1ml）、氯仿-異戊醇60ml（每管2ml）、無水乙醇12ml（每管400 μl）、TE緩沖液3ml（每管100μl）

（二）破碎細胞，釋放溶解核酸

1.將葉片臵于預冷的研缽（實驗前-20℃預冷）中，倒入液氮，盡快研磨成粉末；

? 目的：低溫導致植物組織凍裂，方便研磨使細胞破碎，使DNA釋放完全；低溫情況下各酶處于低活性狀態，有利于抑制DNase的作用，保護DNA。

2.將粉末加入10ml離心管中，加入 1ml預熱的CTAB 抽提緩沖液，輕輕攪動搖勻； ? 目的：CTAB可以溶解細胞膜并與DNA結合，便于分離DNA。加入β-巰基乙醇和PVP-40的目的是減少植物中酚類物質的影響。EDTA的作用是螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制脫氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。Tris-HCl提供一個緩沖環境，防止DNA被破壞。高鹽溶液可以更好的溶解核酸-CTAB復合物。

3.將離心管臵于 65℃的水浴中保溫40分鐘，期間每隔10分鐘輕輕搖晃幾次。? 目的：水浴使CTAB抽提液和葉片充分反應。

（三）抽提去掉蛋白質

1.將水浴的離心管取出，冷卻 2分鐘后，加入1ml酚-氯仿-異戊醇，振蕩 2分鐘，使兩者混合均勻，12000 r/min離心10分鐘； ? 目的：第一次離心溶液分3層，上-中-下層：CTAB-核酸-變性蛋白-有機溶劑

2.取上清液（含CTAB-核酸）至新的10 ml離心管中，加入2ml氯仿-異戊醇，輕輕顛倒離心管，混勻，12 000r/min離心10分鐘。? 目的：第二次離心進一步去掉變性蛋白，去掉多余的酚

（四）沉淀核酸

1.小心取上清液（含CTAB-核酸）臵于一個新的10ml離心管中（盡量避免吸取中間層）,加入2.5ml的異丙醇（-20℃預冷），將離心管慢慢上下搖動30秒，使異丙醇與水層充分混合，室溫放臵15分鐘至能見到DNA絮狀物； ? 目的：異丙醇為DNA沉淀劑，異丙醇與CTAB互溶，但不與核酸相溶。用-20℃預冷的異丙醇沉淀效果較等體積乙醇沉淀好，異丙醇約和2.5倍體積的乙醇效果相當，但核酸微溶于乙醇，使用乙醇沉淀會使部分核酸溶解損失；所以多選用-20度預冷異丙醇。核酸在異丙醇的溶解度更低，所以用異丙醇來沉淀更完全。異丙醇易溶于CTAB，但不與核酸相溶。2.10000r/min離心10分鐘,小心倒去上清液。? 目的：第三次離心使核酸沉淀到管底。

（五）核酸的洗滌

用400ul無水乙醇洗滌核酸沉淀直至無色，10000r/min離心10分鐘，傾去上清液晾干。? 目的：異丙醇不易揮發，所以用乙醇洗去異丙醇及多余的NaCl，乙醇揮發快。

（六）保存

向下層離心物中加入100μl TE緩沖液進行溶解，臵于-20℃冰箱保存，以便下次課用。? 目的：一般長期保存DNA，貯存在TE緩沖液中比較好。TE為含EDTA的Tris-HCl(PH 8.0)緩沖液：其中比較關鍵的成分是EDTA，日常環境中不可避免的存在DNase，而DNase的活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價錳離子激活。鎂離子存在條件下，DNase I可隨機剪切雙鏈DNA的任意位點；二價錳離子存在條件下，DNase I可在同一位點剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個核苷酸突出的粘末端。TE中含有的EDTA可以螯合金屬離子，從而使DNase失活。而Tris-HCl的作用主要是維持一定堿性PH值，有助于DNA的溶解和穩定。不加EDTA也是可以的，而且EDTA會影響下游酶切，連接反應以及質粒轉染進細胞的效率，如果接下來要做這些實驗是應該避免使用含EDTA的緩沖液的。短期儲存DNA也可以使用ddH2O，有助于DNA連接等效果。

八、實驗注意事項

1.在整個實驗過程中應嚴格執行無菌操作； 2.部分藥品有毒，操作中應注意安全防護；

3.磨樣時最好是加液氮，磨樣速度要快，使材料處于低溫狀態； 4.剛投入水浴時可以稍快速的晃動，之后的晃動一定要輕柔； 5.抽提時不要有太力振動，操作也要仔細，盡量避免DNA斷裂；

6.將異丙醇吸出時用的槍頭一定要剪過的，這點很重要，過尖的槍頭會把DNA鏈弄斷。

九、思考題

1.本實驗中用到的各種試劑的作用是什么？ 2.本實驗中進行了幾次離心操作，每次的目的？

十、實驗安排

全班55人，按照學號分組，每6人一組，共9組，最后一組7人。每組作3個離心管，共用一個研缽。

每3組（共18人9個離心管）共同進行離心操作。

第二篇：實驗四 植物DNA的提取[定稿]

實驗四

植物DNA的提取

一、實驗目的

掌握CTAB法從植物葉片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法從植物葉片中提取基因組DNA，并進行純度分析。

二、實驗原理

1、核酸提取的基本原理

核酸是生物有機體中的重要成分，在生物體中核酸常與蛋白質結合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)兩大類，在真核細胞中，前者主要存在于細胞核中，后者主要存在于細胞質及核仁里。在制備核酸時，通過研磨破壞細胞壁和細胞膜，使核蛋白被釋放出來。

在濃氯化鈉溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很?。欢谙÷然c溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液將DNA核蛋白和RNA核蛋白從樣品中分別抽提出來。分離得到核蛋白后，需進一步將蛋白等雜質除去，常采用的去除蛋白的方法有3種：①用含異戊醇的氯仿振蕩核蛋白溶液，使其乳化，然后離心除去變性蛋白質，此時蛋白質凝膠停留在水相和氯仿相中間，而DNA溶于上層水相。用兩倍體積的無水乙醇溶液將DNA鈉鹽沉淀出來。如果用酸性乙醇或冰乙酸來沉淀，得到的是游離的DNA。②用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑使蛋白質變性，與核酸分離，從而從材料中直接提取出DNA。③用苯酚處理，然后離心分層，DNA溶于上層水相，蛋白變性后則停留在酚層內。吸出上面水層，加兩倍體積的無水乙醇溶液，得到白色纖維狀DNA沉淀。反復使用上述方法多次處理DNA核蛋白溶液，就能將蛋白等雜質較徹底地除去，得到較純的DNA制品。為了徹底除去DNA制品中混雜的RNA，可用RNA酶處理。生物材料中含有的脂肪物質和大部分的多糖，在用鹽溶液分離核蛋白和用乙醇或異丙醇分級沉淀時即被除去。

在DNA提取、制備的過程中，核酸極不穩定，許多因素可破壞其完整結構：①化學因素，核酸的結構在pH值4.0～11.0間較穩定，pH值在此范圍外就會使核酸變性降解，故制備過程應避免過酸過堿。②物理因素，DNA分子鏈很長，是雙螺旋結構，既有一定的柔性，又有一定的剛性，故強機械作用如劇烈攪拌會令DNA分子斷裂，不利于收集，應加以避免。③酶的作用，細胞中普遍存在的核酸酶在細胞壁或膜遭到破壞時被釋放出來，它會降解DNA分子。故須用酶的變性劑、抑制劑使之失活。操作過程最好在低溫(0℃左右)下進行。常用的酶抑制劑有檸檬酸鹽、氟化物、砷酸鹽、乙二胺四乙酸鹽、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作為蛋白變性劑，同時可使核酸酶被破壞而失活。

2、CTAB法和SDS法的提取原理

（1）CTAB法是一種快速簡便的提取植物總DNA的方法.。CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種陽離子型去污劑，它不僅能使蛋白質變性，而且還能與核酸形成特異的核酸-CTAB復合物，這種復合物溶于高鹽緩沖液（≥0.7M NaCl），降低鹽濃度，通過超速離心能選擇性地沉淀核酸，并與多糖等可溶性雜質分開，CTAB-核酸復合物再用70-75%乙醇浸泡可脫掉CTAB。提取時先將新鮮的葉片在液氮中研磨，破碎其細胞，然后加入CTAB分離緩沖液，將DNA溶解出來，再經氯仿－異戊醇抽提除去蛋白質，最后通過異丙醇沉淀或低鹽離心得到DNA。

（2）SDS法也是提取植物DNA的常用方法。先將新鮮的葉片在液氮中研磨以機械力破本碎細胞壁，然后加入SDS使細胞膜破裂，并同時將蛋白質和多糖等雜質與核酸分開。加入KAc可使SDS—蛋白質復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式，使沉淀更加完全。

3、DNA的濃度測定和純度分析

（1）定磷法：是對樣品中核酸（DNA和RNA）含量的準確定量。將樣品中的核酸用強酸（硫酸或高氯酸）消化成無機磷，然后用定磷試劑對生成的無機磷酸進行滴定。定磷試劑是酸性鉬酸銨溶液，鉬酸銨能與無機磷酸定量結合成磷鉬酸絡合物，該絡合物能被抗壞血酸等還原劑還原成蘭色的鉬藍，在660nm處有最大光吸收。

（2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的RNA溶液或單鏈DNA的A260=0.022~0.024。1個A260相當于50ug/mL的DNA、40ug/mL的RNA。蛋白質的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。純的DNA的A260/A280在1.8左右，純的RNA的A260/A280在2.0左右。

三、試劑和器材：

(1)1M Tris-cl（pH8.0）：Tris l21.1g溶于蒸餾水，用濃HCl調至pH8.0以蒸餾水定容至1000ml(2)CTAB分離緩沖液： 2g CTAB，8.18g NaCL，0.74g EDTA.Na2.2H2O，10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0)，0.2mL巰基乙醇，加水定容到100mL。

(3)洗滌緩沖液（70%乙醇，10mmol/L乙酸銨）：70mL無水乙醇，0.077g乙酸銨，加水到100mL。(4)TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCL（pH7.4），1mmol/L EDTA(5)氯仿:異戊醇=24:1(6)液氮

(7)研缽，恒溫水?。?7～100℃），離心機，離心管。

四、操作方法：

(1)將10mlCTAB分離緩沖液加入50ml離心管中，置于65℃水浴中預熱。(2)稱取1.5g葉片，置于預冷的研缽中，倒入液氮，盡快將葉片研碎。(3)取1g粉末直接加入預熱的CTAB分離緩沖液中，輕輕轉動使之混勻。

(4)樣品于65℃保溫30分鐘，每5～10分鐘混勻一次。(5)加等體積（10ml）的氯仿－異戊醇，輕輕顛倒混勻。(6)室溫下4000r/min離心10分鐘。

(7)用膠頭滴管將上層水相吸入另一干凈的離心管中（注意不要吸動懸浮的細胞碎片和中間白色的蛋白質層），向離心管中加入2/3體積的異丙醇，輕輕混勻，使DNA析出。（有些情況下，這一步可以產生云霧狀的DNA析出，如果看不到云霧狀的DNA，樣品則可以在冰浴中放置數小時甚至過夜）。(8)用下述方法收集DNA：

如果呈云霧狀的DNA析出，則用玻璃棒在云霧狀的DNA中輕輕轉動，纏起DNA，然后將玻璃棒轉移至20mL洗滌緩沖液中浸泡洗滌10分鐘（不要將DNA沉淀從玻璃棒上弄掉）。

如果看不到云霧狀的DNA，可將離心管在4000r/min離心5分鐘，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加20mL洗滌緩沖液，輕輕轉動離心管，洗滌核酸沉淀10分鐘，然后離心，小心地倒掉上清液，讓DNA沉淀自然干燥20分鐘。(9)用玻璃棒纏出DNA，在室溫下使DNA自然干燥20分鐘。(10)

將自然干燥的DNA溶于1mLTE緩沖液中，—20℃保存備用。

(11)

取100uL稀釋20倍，測定A260，A280，A230，或作出吸收波譜200~400nm并計算濃度和得率。

(12)

取5~10uLDNA溶液做0.7%的瓊脂糖電泳，檢查DNA的大小和質量，以λ-DNA/HindⅢ做分子量標準，另取5uL做限制性酶切。

注意；所有操作均須溫和，避免劇烈震蕩。

五、思考題

1、CTAB、EDTA、巰基乙醇的作用是什么？

2、吸取樣品、抽提、及電泳時應注意什么？為什么？

第三篇：幾種核酸提取方法概述

幾種核酸提取方法概述

(1).濃鹽法

利用RNP和DNP在電解溶液中溶解度不同，將二者分離，常用的方法是用1M 氯 納提取化鈉抽提,得到的DNP粘液與含有少量辛醇的 氯仿一起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質,此時蛋白質凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上層水相中,用2倍體積95％乙醇可將DNA 鈉鹽沉淀出來.也可用0.15 MNaCL液反復洗滌細胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿---異醇法除去蛋白.兩種方法比較,后種方法使核酸降解可能少一些.以稀鹽酸溶液提取DNA 時,加入適量去污劑,如SDS可有助于蛋白質與DNA 的分離。在提取過程中為抑制組織中的DNase對DNA 的降解作用,在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑.通常用.15MNaCL,0.015M檸檬鈉,并稱SSC溶液,提取DNA.（2）.陰離子去污劑法:

用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質變性,可以直接從生物材料中提取DNA.由于細胞中DNA與蛋白質之間常借靜電引力或配位鍵結合,因為陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA.（3）.苯酚抽提法:

苯酚作為蛋白變性劑,同時抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與DNA 聯結鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性質，用乙醇沉淀DNA。此時DNA是十分粘稠的物質，可用玻璃漫漫繞成一團，取出。此法的特點是使提取的DNA保持天然狀態.

第四篇：植物芳香油的提取教案

植物芳香油的提取

教材內容解讀

要點1 植物芳香油的來源

（1）植物芳香油的來源

天然香料的主要來源是動物和植物。動物香料主要來源于麝、靈貓、海貍和抹香鯨等。植物香料的來源更為廣泛，植物芳香油可以從大約50多個科的植物中提取。例如，玫瑰花用于提取玫瑰油，樟樹樹干用于提取樟油。

（2）植物芳香油的主要化學成分

提取出的植物芳香油的組成主要包括萜類化合物及其衍生物，具有很強的揮發性。要點2 植物芳香油的提取方法

提取植物芳香油的三種基本方法：蒸餾、壓榨和萃取。（1）蒸餾法

①水蒸氣蒸餾法的原理

利用水蒸氣將揮發性較強的植物芳香油攜帶出來，形成油水混合物，冷卻后，混合物又會重新分出油層和水層。是植物芳香提取的常用方法。

②水蒸氣蒸餾法的類型

根據蒸餾過程中原料放置的位置，可以將水蒸氣蒸餾法劃分為水中蒸餾、水上蒸餾和水氣蒸餾。

③水中蒸餾的方法對于有些原料不適用的原因 如柑橘和檸檬不適用水中蒸餾的方法，這是因為水中蒸餾會導致原料焦糊和有效成分水解等問題。因此，柑橘、檸檬芳香油的制備通常使用壓榨法。

（2）萃取法

①萃取法是將粉碎、干燥的植物原料用有機溶劑浸泡，使芳香油溶解在有機溶劑中的方法。

②原理

植物芳香油易溶于有機溶劑，如石油醚、乙醚和戊烷等。芳香油溶解于有機溶劑后，只需蒸發出有機溶劑，就可以獲得純凈的植物芳香油。

③不適于用水蒸氣蒸餾的原料，可以考慮使用萃取法。要點3 實驗設計

（1）提取玫瑰精油的實驗流程

（2）提取橘皮精油的實驗流程

石灰水浸泡→漂洗→壓榨→過濾→靜置→再次過濾→橘皮油 要點4 實驗案例

案例一 玫瑰精油的提取

5月上、中旬是玫瑰的盛開期，最好是選用當天采摘的鮮玫瑰花。將花瓣用清水沖洗，去掉上面的灰塵等雜質，瀝干水分。由于玫瑰精油化學性質穩定，從玫瑰花中提取玫瑰精油可采取水中蒸餾法。本實驗的具體操作步驟如下。1.稱取50 g玫瑰花瓣，放入500 mL的圓底燒瓶中，加入200 mL蒸餾水。按教科書圖6-2所示安裝蒸餾裝置。蒸餾裝置包括：鐵架臺兩個、酒精燈、石棉網、蒸餾瓶、橡膠塞、蒸餾頭、溫度計、直型冷凝管、接液管、錐形瓶，以及連接進水口和出水口的橡皮管。所有儀器必須事先干燥，保證無水。整套蒸餾裝置可分為左、中、右三部分，其中左邊的部分通過加熱進行蒸餾，中部將蒸餾物冷凝，右邊的部分用來接收。安裝儀器一般都按照自下而上、從左到右的順序。拆卸儀器的順序與安裝時相反。具體安裝順序和方法如下。

（1）固定熱源──酒精燈。

（2）固定蒸餾瓶，使其離熱源的距離如教科書中圖6-2所示，并且保持蒸餾瓶軸心與鐵架臺的水平面垂直。

（3）安裝蒸餾頭，使蒸餾頭的橫截面與鐵架臺平行。

（4）連接冷凝管。保證上端出水口向上，通過橡皮管與水池相連；下端進水口向下，通過橡皮管與水龍頭相連。

（5）連接接液管（或稱尾接管）。

（6）將接收瓶瓶口對準尾接管的出口。常壓蒸餾一般用錐形瓶而不用燒杯作接受器，接收瓶應在實驗前稱重，并做好記錄。

（7）將溫度計固定在蒸餾頭上，使溫度計水銀球的上限與蒸餾頭側管的下限處在同一水平線上。

2.蒸餾裝置安裝完畢后，可以在蒸餾瓶中加幾粒沸石，防止液體過度沸騰。打開水龍頭，緩緩通入冷水，然后開始加熱。加熱時可以觀察到，蒸餾瓶中的液體逐漸沸騰，蒸氣逐漸上升，溫度計讀數也略有上升。當蒸氣的頂端達到溫度計水銀球部位時，溫度計讀數急劇上升。在整個蒸餾過程中，應保證溫度計的水銀球上常有因冷凝作用而形成的液滴?？刂普麴s的時間和速度，通常以每秒1～2滴為宜。蒸餾完畢，應先撤出熱源，然后停止通水，最后拆卸蒸餾裝置，拆卸的順序與安裝時相反。

3.收集錐形瓶中的乳白色的乳濁液，向錐形瓶中加入質量濃度為0.1 g/mL的氯化鈉溶液，使乳化液分層。然后將其倒入分液漏斗中，用分液漏斗將油層和水層完全分開。打開頂塞，再將活塞緩緩旋開，放出下層的玫瑰精油，用接收瓶收集。向接收瓶中加入無水硫酸鈉，吸去油層中含有的水分，放置過夜。

為了更好地將油、水兩層液體分離，操作時應注意正確使用分液漏斗。分液漏斗的使用方法如下。

（1）首先把活塞擦干，為活塞均勻涂上一層潤滑脂，注意切勿將潤滑脂涂得太厚或使潤滑脂進入活塞孔中，以免污染萃取液。

（2）塞好活塞后，把活塞旋轉幾圈，使潤滑脂分布均勻。并用水檢查分液漏斗的頂塞與活塞處是否滲漏，確認不漏水后再使用。

（3）將分液漏斗放置在大小合適的、并已固定在鐵架臺上的鐵圈中，關好活塞。將待分離的液體從上部開口處倒入漏斗中，塞緊頂塞，注意頂塞不能涂潤滑脂。

（4）取下分液漏斗，用右手手掌頂住漏斗頂塞并握住漏斗頸，左手握住漏斗活塞處，大拇指壓緊活塞，將分液漏斗略傾斜，前后振蕩（開始振蕩時要慢）。

（5）振蕩后，使漏斗口仍保持原傾斜狀態，左手仍握在漏斗活塞處，下部管口指向無人處，用拇指和食指旋開活塞，使其釋放出漏斗內的蒸氣或產生的氣體，以使內外壓力平衡，這一步操作也稱做“放氣”。

（6）重復上述操作，直至分液漏斗中只放出很少的氣體時為止。再將分液漏斗劇烈振蕩2～3 min，然后將漏斗放回鐵圈中，待液體靜置分層。

案例二 橘皮精油的提取 課前準備 在實驗前一天，教師需要準備新鮮的、沒有霉爛的橘皮，用量可根據實驗人數來決定。用清水沖洗橘皮，去掉灰塵等雜質，瀝干水分后，將橘皮攤放在干燥通風處。將晾干的橘皮浸泡在pH大于

12、質量分數為7%～8%的石灰水中，時間為16～24 h，中間翻動2～3次。浸泡好的橘皮呈黃色、無白芯、稍硬、脆而不斷、具有彈性。這樣的橘皮在壓榨時不易打滑，橘油的噴射力強；壓榨后的殘渣呈顆粒狀，殘渣中的含水量低，黏稠度不太高，過濾時比較順利，不易堵塞篩孔。

提取橘皮精油的具體步驟如下。

1.將浸泡后的橘皮，用流動的水漂洗，洗凈后撈起、瀝干。切記一定要將橘皮徹底沖洗干凈。然后將橘皮粉碎至3 mm大小，放入家用榨汁機或手動壓榨機中粉碎。粉碎時加入與橘皮同質量的質量分數為0.25%的小蘇打和質量分數為5%的硫酸鈉溶液，并調節pH為7～8。

2.在榨出的油水混合液中加入明礬，使之沉淀并變澄清，然后用布袋過濾，除去糊狀殘渣。再將得到的混合物，用6 000 r/min～8 000 r/min的轉速進行高速離心。在正常情況下，離心后獲得的香精油將是澄清透明的。

3.分離出的香精油往往帶有少量水分和蠟質等雜質，為了進一步除去雜質，可以將分離的產品放在5 ℃～10 ℃的冰箱中，靜置5～7 d，讓雜質與水下沉。然后用吸管吸出上層澄清的油層，再通過墊有濾紙或石棉紙的漏斗進行減壓抽濾，得到黃色油狀的橘皮精油。

第五篇：優質課教案---植物芳香油的提取教案

2010年河南省高中生物優質課

植物芳香油的提取

姓 名： 李 宴 會 單 位： 上 蔡 一 高 日 期： 2010 年 8月

專題6 植物有效成分的提取 課題1 植物芳香油的提取

一、課題目標

本課題通過設計簡易的實驗裝置來提取植物芳香油，使學生了解提取植物芳香油的基本原理，研究從生物材料中提取特定成分的方法，初步學會某些植物芳香油的提取技術。

二、課題重點與難點

課題重點：植物芳香油的提取技術；針對原料的不同特點，采用適宜的提取方法。課題難點：植物芳香油的提取技術；針對原料的不同特點，采用適宜的提取方法。

三、課題背景分析

課題背景從古代人類將芳香植物或花卉制成干品，當作藥物和香料使用談起，引入到歐洲中世紀香料貿易的發展，促成了植物芳香油提取技術的誕生，反映了社會生活的需要對科學技術的推動。隨著有機化學的發展，人造香料日益普及，但人們對天然植物芳香油仍情有獨鐘，它一方面說明了科學技術的發展賦予了人類更多的自由，同時也反映了人造物依舊很難取代自然產物的事實。在充分體現了植物芳香油與人類社會生產生活的緊密聯系后，教材說明了本課題的目標：了解提取植物芳香油的原理，設計簡單的實驗裝置，從橘皮或玫瑰花中提取芳香油。在教學中可充分利用上述素材，對學生進行生動的科學、技術、社會的教育，并激發學生動手實踐的興趣。

四、基礎知識分析與教學

（一）植物芳香油的來源

知識要點：1.植物芳香油的來源和發展歷史；2.植物芳香油的主要化學成分。教學：在介紹植物芳香油的來源時，宜結合教材提供的旁欄資料進行講解，讓學生對植物芳香油的廣泛來源有一個初步的了解。還可以采取學生查閱資料和介紹相關的小故事等方式，使學生大致了解植物芳香油的發展歷史。

（二）植物芳香油的提取方法

知識要點：提取植物芳香油的三種基本方法：蒸餾、壓榨和萃取。

教學：可以通過列舉日常生活中的一些具體事例，幫助學生熟悉提取植物芳香油的三種基本方法，并理解其原理。例如，實驗室制備蒸餾水就用到了蒸餾的方法；超市出售的手動榨汁器，其原理與教材介紹的壓榨法是類似的；等等。此外，還應引導學生分析這三種方法 的優點與不足，讓學生嘗試根據不同的原料，選用適宜的提取方法。

五、實驗案例 玫瑰精油的提取

5月上、中旬是玫瑰的盛開期，最好是選用當天采摘的鮮玫瑰花。將花瓣用清水沖洗，去掉上面的灰塵等雜質，瀝干水分。由于玫瑰精油化學性質穩定，從玫瑰花中提取玫瑰精油可采取水中蒸餾法。本實驗的具體操作步驟如下。

1.稱取50 g玫瑰花瓣，放入500 mL的圓底燒瓶中，加入200 mL蒸餾水。按教科書圖6-2所示安裝蒸餾裝置。蒸餾裝置包括：鐵架臺兩個、酒精燈、石棉網、蒸餾瓶、橡膠塞、蒸餾頭、溫度計、直型冷凝管、接液管、錐形瓶，以及連接進水口和出水口的橡皮管。所有儀器必須事先干燥，保證無水。整套蒸餾裝置可分為左、中、右三部分，其中左邊的部分通過加熱進行蒸餾，中部將蒸餾物冷凝，右邊的部分用來接收。安裝儀器一般都按照自下而上、從左到右的順序。拆卸儀器的順序與安裝時相反。具體安裝順序和方法如下。

（1）固定熱源──酒精燈。

（2）固定蒸餾瓶，使其離熱源的距離如教科書中圖6-2所示，并且保持蒸餾瓶軸心與鐵架臺的水平面垂直。

（3）安裝蒸餾頭，使蒸餾頭的橫截面與鐵架臺平行。

（4）連接冷凝管。保證上端出水口向上，通過橡皮管與水池相連；下端進水口向下，通過橡皮管與水龍頭相連。

（5）連接接液管（或稱尾接管）。

（6）將接收瓶瓶口對準尾接管的出口。常壓蒸餾一般用錐形瓶而不用燒杯作接受器，接收瓶應在實驗前稱重，并做好記錄。

（7）將溫度計固定在蒸餾頭上，使溫度計水銀球的上限與蒸餾頭側管的下限處在同一水平線上。

2.蒸餾裝置安裝完畢后，可以在蒸餾瓶中加幾粒沸石，防止液體過度沸騰。打開水龍頭，緩緩通入冷水，然后開始加熱。加熱時可以觀察到，蒸餾瓶中的液體逐漸沸騰，蒸氣逐漸上升，溫度計讀數也略有上升。當蒸氣的頂端達到溫度計水銀球部位時，溫度計讀數急劇上升。在整個蒸餾過程中，應保證溫度計的水銀球上常有因冷凝作用而形成的液滴?？刂普麴s的時間和速度，通常以每秒1～2滴為宜。蒸餾完畢，應先撤出熱源，然后停止通水，最后拆卸蒸餾裝置，拆卸的順序與安裝時相反。

3.收集錐形瓶中的乳白色的乳濁液，向錐形瓶中加入質量濃度為0.1 g/mL的氯化鈉溶

液，使乳化液分層。然后將其倒入分液漏斗中，用分液漏斗將油層和水層完全分開。打開頂塞，再將活塞緩緩旋開，放出下層的玫瑰精油，用接收瓶收集。向接收瓶中加入無水硫酸鈉，吸去油層中含有的水分，放置過夜。

為了更好地將油、水兩層液體分離，操作時應注意正確使用分液漏斗。分液漏斗的使用方法如下。

（1）首先把活塞擦干，為活塞均勻涂上一層潤滑脂，注意切勿將潤滑脂涂得太厚或使潤滑脂進入活塞孔中，以免污染萃取液。

（2）塞好活塞后，把活塞旋轉幾圈，使潤滑脂分布均勻。并用水檢查分液漏斗的頂塞與活塞處是否滲漏，確認不漏水后再使用。

（3）將分液漏斗放置在大小合適的、并已固定在鐵架臺上的鐵圈中，關好活塞。將待分離的液體從上部開口處倒入漏斗中，塞緊頂塞，注意頂塞不能涂潤滑脂。

（4）取下分液漏斗，用右手手掌頂住漏斗頂塞并握住漏斗頸，左手握住漏斗活塞處，大拇指壓緊活塞，將分液漏斗略傾斜，前后振蕩（開始振蕩時要慢）。

（5）振蕩后，使漏斗口仍保持原傾斜狀態，左手仍握在漏斗活塞處，下部管口指向無人處，用拇指和食指旋開活塞，使其釋放出漏斗內的蒸氣或產生的氣體，以使內外壓力平衡，這一步操作也稱做“放氣”。

（6）重復上述操作，直至分液漏斗中只放出很少的氣體時為止。再將分液漏斗劇烈振蕩2～3 min，然后將漏斗放回鐵圈中，待液體靜置分層。橘皮精油的提取

課前準備

在實驗前一天，需要準備新鮮的、沒有霉爛的橘皮，用量可根據實驗人數來決定。用清水沖洗橘皮，去掉灰塵等雜質，瀝干水分后，將橘皮攤放在干燥通風處。將晾干的橘皮浸泡在pH大于

12、質量分數為7%～8%的石灰水中，時間為16～24 h，中間翻動2～3次。浸泡好的橘皮呈黃色、無白芯、稍硬、脆而不斷、具有彈性。這樣的橘皮在壓榨時不易打滑，橘油的噴射力強；壓榨后的殘渣呈顆粒狀，殘渣中的含水量低，黏稠度不太高，過濾時比較順利，不易堵塞篩孔。

提取橘皮精油的具體步驟如下。

1.將浸泡后的橘皮，用流動的水漂洗，洗凈后撈起、瀝干。一定要將橘皮徹底沖洗干凈。然后將橘皮粉碎至3 mm大小，放入家用榨汁機或手動壓榨機中粉碎。粉碎時加入與橘皮同質量的質量分數為0.25%的小蘇打和質量分數為5%的硫酸鈉溶液，并調節pH為7～8。

2.在榨出的油水混合液中加入明礬，使之沉淀并變澄清，然后用布袋過濾，除去糊狀殘渣。再將得到的混合物，用6 000 r/min～8 000 r/min的轉速進行高速離心。在正常情況下，離心后獲得的香精油將是澄清透明的。

3.分離出的香精油往往帶有少量水分和蠟質等雜質，為了進一步除去雜質，可以將分離的產品放在5 ℃～10 ℃的冰箱中，靜置5～7 d，讓雜質與水下沉。然后用吸管吸出上層澄清的油層，再通過墊有濾紙或石棉紙的漏斗進行減壓抽濾，得到黃色油狀的橘皮精油。

六、課題成果評價

（一）是否提取出了植物精油

觀察學生提取出的玫瑰精油或橘皮精油，從顏色、氣味等方面來評價所提取的精油的純度和質量。從玫瑰花提取的芳香油是淺黃色至黃色的液體，并帶有甜韻的玫瑰香；從橘皮提取的橘皮精油無色透明，具有誘人的橘香味。本課題只是對兩種精油進行了初步的提取，其中仍然含有大量的雜質。

（二）出油率的計算

根據教科書提供的公式計算出油率。如果出油率高，說明實驗方案設計合理；如果出油率低，可以幫助學生從實驗方法的選擇、實驗過程的操作等各方面分析原因，改進后再作嘗試。