第一篇：DNA提取問(wèn)題集

DNA提取問(wèn)題集

默認(rèn)分類 2009-12-31 18:59:50 閱讀155 評(píng)論0字號(hào)：大中小

提取植物DNA時(shí)遇到多糖成分的干擾，DNA質(zhì)量一直不高，如何消除多糖的影響？ 參考見(jiàn)解：一般來(lái)說(shuō)，SDS法提取的DNA會(huì)還有較多的多糖，使DNA成膠凍狀。而CTAB法提取可基本上除去多糖。如果是植物材料本身含糖量比較高，可用以下方法試一試：

1、在 DNA 未溶出之前，先用一些緩沖液洗去多糖。如可用緩沖液：100 mmol/LTris-HCl(pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol洗幾次。

2、使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍體積的無(wú)水乙醇，迅速混勻，多糖會(huì)先沉淀。

3、沉淀 DNA 時(shí)，使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入 1/2 體積的 5 mol/L NaCl，或加 NH4Ac 使終濃度為 10 mmol/L。或 0.5 mL DNA 液中加 0.12 5 mL 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13% PEG 8000（冰浴 1 h）。

4、多糖和 DNA 的共沉淀物進(jìn)行再分離。如用 TE緩沖液反復(fù)清洗共沉淀 物，將清洗液合并再用醇沉淀 DNA，或?qū)⒊恋砦锶芙夂螅?jīng)瓊脂糖電泳，切下 DNA 部分再將膠回收，或者用多糖水解酶將多糖降解。還 有在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用而去除多糖。

上述方法還可組合使用，以達(dá)到最佳效果。然而這些方法均會(huì)在一定程度上減低 DNA 的提取量；如果材料較少或要求較高，則可考慮用柱層析方法，使用對(duì) DNA 具有 特異性吸附的樹(shù)脂來(lái)純化 DNA。曾有文獻(xiàn)提到選用 Wizard Purification Kit，PRC-5 柱，Sephacryl S-1000 或 S-500，Qiagen Genomic tip 500/G，或者 CsCl 梯度離心純化 DNA。血樣4度保存了2月，現(xiàn)在按照酚常規(guī)提取方法不能提取出DNA，有什么解決辦法？ 參考見(jiàn)解：按照常規(guī)的酚/氯仿法不可能提不出來(lái)，下面是參考方法：

1、首先洗出白細(xì)胞，最好有1毫升以上血液。

2、加入5ml DNA提取緩沖液，(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混勻。

3、加入25ul 蛋白酶K ,使終濃度達(dá)到100ug/ml, 混勻，50℃水浴過(guò)夜。

4、用等體積的（酚，氯仿，異戊醇，25：24：1）混合物抽提一次，5000r/min，10min離心收集水相。

5、取水層，加入3倍體積-20℃預(yù)冷無(wú)水乙醇5000r/min，10min，75%乙醇5000r/min洗DNA，充分干燥將DNA溶于適量水中。

CTAB法提取水稻基因組DNA，TE 溶解后瓊脂糖膠電泳檢測(cè)，點(diǎn)樣孔附近有一條明顯的主帶。用MBI 公司產(chǎn)的限制性內(nèi)切酶酶切過(guò)夜，鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)DNA已經(jīng)被完全切爛，只在溴酚藍(lán)前存在微弱smear狀產(chǎn)物。換用NEB 公司產(chǎn)的酶，更換EP管，滅菌水之后重復(fù)幾次，結(jié)果還是如此。拿其他人的DNA 做對(duì)照，酶切結(jié)果正常。用異丙醇將DNA 重新沉淀，換了TE溶解，檢測(cè)主帶仍舊清晰，可是用酶切之后DNA還是被切爛。為什么？

參考見(jiàn)解：

1、公司的酶不行。

2、如做酶切，DNA最好不用異丙醇（因其不易揮發(fā)）而用無(wú)水乙醇沉淀。

3、酶量大或作用時(shí)間太長(zhǎng)了。

建議重提DNA，取少許用超純水溶解（非TE），按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶切。要用新鮮樣品或液氮冷凍-70度保存的樣品。這樣通過(guò)降低內(nèi)切酶的活性減少DNA的降解；

要得到全血基因組DNA，可以先用分層液密度梯度離心將淋巴細(xì)胞分離嗎？這樣做，與沉淀全血細(xì)胞然后破壞紅細(xì)胞得到的結(jié)果有何差異？ 參考見(jiàn)解：

1、覺(jué)得還是先分離細(xì)胞好，因?yàn)镈NA和RNA大都是在細(xì)胞核內(nèi)，有紅細(xì)胞反而不太好。從血里面提RNA，用淋巴細(xì)胞分離液先分離有核細(xì)胞的，效果還是不錯(cuò)的。

2、現(xiàn)在提取全血的DNA,也就是提取淋巴細(xì)胞中的DNA，用密度梯度離心，只是富積淋巴細(xì)胞，能得到更多的DNA而已。一般如果DNA的量的要求不太多的話，沒(méi)必要。

3、如果對(duì)基因組的要求不高，可以試試這個(gè)方法。取EDTA-Na2抗凝血100μl加至1.5ml Eppendorf管中，加無(wú)菌重蒸水500μl；10 000r/分鐘離心3分鐘，棄凈上清；加20μl 5mol/L KI，旋渦振蕩30秒;0.9%NaCl 100μl,150μl氯仿/異戊醇(24∶1)，振蕩30秒；10 000r/分鐘離心5分鐘，吸上清100μl于另一Eppendorf管中，加異丙醇60μl，輕輕混勻，10 000r/分鐘離心5分鐘，棄上清；加冷無(wú)水乙醇1000μl，10 000r/分鐘離心5分鐘；棄去無(wú)水乙醇，37℃烤干；50μl無(wú)菌重蒸水或TE，混勻溶解備用。

從經(jīng)福爾馬林處理后的組織標(biāo)本中提取DNA可以嗎？

參考見(jiàn)解：可以的，國(guó)外有好多相關(guān)試劑盒，qiagen, roche等公司都有的。

100ml的大量提取，蛋白酶Ｋ是必需的嗎？它的作用是什么？用溶菌酶代替可以嗎？每次在用酚氯仿異戊醇抽提后，上層里面都是絮狀的蛋白質(zhì)，離心幾次都沉淀不下來(lái)，請(qǐng)問(wèn)是哪里出了問(wèn)題？

參考見(jiàn)解：一般來(lái)說(shuō)，蛋白酶的作用是將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的分開(kāi)，同時(shí)，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。而溶菌酶的作用是破壞微生物細(xì)胞壁，二者作用各異，不可替代。對(duì)于實(shí)驗(yàn)中的蛋白問(wèn)題，建議離心后先用竹簽挑出蛋白，小心吸取上層清液，再重復(fù)抽提幾次試試。

一般植物DNA提取的時(shí)候都不加蛋白酶K，這樣提出來(lái)的DNA鏈上的組蛋白等未被蛋白酶消化，不是很難除去嗎？那DNA是不是不純？可以用來(lái)酶切嗎？

參考見(jiàn)解：蛋白酶k的主要作用并不是消化組蛋白，而是消化細(xì)胞，在動(dòng)物細(xì)胞DNA的提取也不加蛋白酶k也是可以的，植物細(xì)胞的較易破碎，不需要蛋白酶k的作用。protenase K作用：

1、消化組蛋白，釋放出DNA。

2、消化DNAse，提高DNA分子量。

建議還是加蛋白酶k為好，這樣提出來(lái)的 DNA分子量會(huì)高一點(diǎn)，且更純。提白粉孢子的總DNA，白粉孢子比較小，直接在研磨中加液氮研磨可以嗎？

參考見(jiàn)解：液氮研磨的方法應(yīng)該可行的，做動(dòng)物組織，植物組織多采用這種方法，植物纖維一樣可以用液氮研磨，要有耐心，邊加液氮邊研磨，研磨好后再抽提，應(yīng)該是可以的。在CTAB法提取DNA時(shí)，有一些品種沒(méi)有DNA析出，是什么原因？ 參考見(jiàn)解：

1、用預(yù)冷的異丙醇來(lái)沉淀試試，同時(shí)研磨的時(shí)候要研的非常非常的細(xì)。

2、沒(méi)有看到析出物并不代表沒(méi)有沉淀，可以繼續(xù)下一步試驗(yàn)，溶解的時(shí)候少加一點(diǎn)兒。

3、高離子強(qiáng)度下DNA與CTAB能形成共沉淀。可能DNA就這樣留在沉淀里了。提取DNA配方

CTAB為十六烷基三甲基溴化銨，CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方

Tris-HCl(pH8.0)提供一個(gè)緩沖環(huán)境,防止核酸被破壞；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNase活性；

NaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境,使DNP充分溶解,存在于液相中；

Cβ-巰基乙醇是抗氧化劑,有效地防止酚氧化成醌,避免褐變,使酚容易去除基因組DNA。

CTAB 4g

NaCl 16.364 g

1M Tris-HCl 20ml(PH8.0)

0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml滅菌

冷卻后0.2-1% 2-巰基乙醇（400ul）氯仿-異戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml異戊醇，搖勻即可。

提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，怎樣更好的抑制內(nèi)源核酸酶的活性？ 參考見(jiàn)解：在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí),可增加裂解液中螯合劑的含量,細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔。

用試劑盒對(duì)農(nóng)田土壤的的微生物群落DNA進(jìn)行提取，雖然總DNA提出來(lái)了，可是用細(xì)菌的通用引物進(jìn)行PCR的時(shí)候卻怎么也擴(kuò)不出來(lái)，請(qǐng)有沒(méi)有什么好的辦法可以解決這個(gè)問(wèn)題？

參考見(jiàn)解：環(huán)境特別是土壤的樣品成分復(fù)雜，尤其是有腐殖酸具有和DNA類似的性質(zhì)，因此用一般的國(guó)內(nèi)試劑盒無(wú)法提純。應(yīng)當(dāng)選用自制的提取方法，在裂解液中加入要加入PVP。洗滌后硅膠膜上仍有雜色殘留？

參考見(jiàn)解：細(xì)胞裂解不充分，裂解液和樣品要快速充分混勻。洗滌產(chǎn)物中DNA量很少或沒(méi)有？ 參考見(jiàn)解：

1、樣品中細(xì)胞或者病毒濃度低。

2、裂解液和樣品混合不均勻造成細(xì)胞的裂解不充分。

3、蛋白酶K活性下降造成細(xì)胞裂解的不充分。

4、溫浴時(shí)間不夠造成的細(xì)胞裂解不充分或蛋白降解不完全，盡量把組織切成小塊，延長(zhǎng)溫浴時(shí)間，使裂解物中沒(méi)有顆粒狀物殘留。

5、在上柱前，裂解物中沒(méi)有加乙醇，或用低濃度乙醇代替無(wú)水乙醇。

6、DNA沒(méi)有有效洗脫，提高洗脫效率，可將離心柱在加入洗脫液后在室溫靜止至少1min，再離心。

7、洗脫液pH不合適，低pH值會(huì)減少DNA產(chǎn)率，確保洗脫液pH在7.0－8.5之間。8洗脫體積太大，超過(guò)200ul洗脫體積所得的DNA濃度會(huì)降低，但DNA總量不會(huì)減少。

第二篇：dna粗提取和鑒定

dna粗提取和鑒定

實(shí)驗(yàn)用具

洋蔥或其他植物、洗潔精、食鹽、攪拌機(jī)或研缽(我們采用的是家用豆?jié){機(jī))、紗布、漏斗、燒杯、玻璃棒、量筒(10mL一支)、滴管、試管(20mL兩支)、天平，dna粗提取和鑒定。95%酒精、蒸餾水、0.015mol/L的NaCl溶液、二苯胺試劑。

實(shí)驗(yàn)材料的選取

凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但是使用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功的可能性更大。

原理

①加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂

蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。

②加入洗滌劑和食鹽的作用

洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放;食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。

③研磨不充分，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響

研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。

④此步驟獲得的濾液中可能含有的細(xì)胞成分?

可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液

動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易，以雞血細(xì)胞為例，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液即可。如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，需要先用洗滌劑溶解細(xì)胞膜。例如，提取洋

.蔥的DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過(guò)濾后收集研磨液。

2.去除濾液中的雜質(zhì)

方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同;方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分解DNA;方案三的原理是蛋白質(zhì)和DNA的變性溫度不同。

注意事項(xiàng)

①用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì);用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。

②方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi);方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。

DNA的析出與鑒定

將處理后的溶液過(guò)濾，加入與濾液體積相等、冷卻的酒精溶液，靜置2～3min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取的DNA，鑒定材料《dna粗提取和鑒定》。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。

取兩支20ml的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液5ml，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4ml的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變藍(lán)。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.稱取30克已切碎的洋蔥，放入研缽中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L的氯化鈉溶液，充分研磨。

洋蔥含有揮發(fā)性刺激物，有效減少刺激，才能使實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。上課前，教師可先將洋蔥放入冰箱冷凍一會(huì)兒，使其涼透但又不能結(jié)冰;或?qū)⒀笫[切成幾大塊，放入清水泡一會(huì)兒，讓其揮發(fā)性刺激物溶于水，可以減輕刺激。然后將洋蔥切碎備用。研磨的目的主要是使洋蔥細(xì)胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化鈉溶液，沒(méi)必要將洋蔥研成粥糊狀，后者既浪費(fèi)時(shí)間又影響實(shí)驗(yàn)效果。研磨時(shí)，切忌使用攪拌器(榨汁機(jī))。使用攪拌器雖可以提高研磨效率，但攪拌器將洋蔥切成極細(xì)小的顆粒，無(wú)法通過(guò)過(guò)濾將洋蔥顆粒剔除。只能將酒精直接倒入濾液中，許多洋蔥小顆粒因?yàn)檩p會(huì)漂浮起來(lái)，DNA藏在其中，無(wú)法分辨。學(xué)生看不到白色纖維狀粘稠物的DNA。

2.研磨后，用漏斗和紗布將汁液過(guò)濾到小燒杯中，得到濾液。

3.向?yàn)V液中加入95%的酒精溶液20mL，沿?zé)诰従彽谷耄灰饎?dòng)或攪拌。

此時(shí)，燒杯中的液體分為上、下兩層，下層較渾濁，上層澄清，很快上層溶液中就會(huì)有白色纖維狀粘稠物析出，用玻璃棒可將其輕輕卷起。這就是記錄生命遺傳信息的重要物質(zhì)——DNA。DNA析出的過(guò)程中，切忌震動(dòng)和攪拌(不震動(dòng)易于分層，我們就能很容易觀察到上清液中的絲狀物;攪拌會(huì)使非常柔軟的DNA斷裂成小段，不易取出)。如果用玻璃棒DNA不易卷起，可改用表面打毛的牙簽，DNA提取物就纏繞在牙簽上了。

4.鑒定：取兩支試管，編為1、2號(hào)，各加入2mol/L的氯化鈉溶液2mL，向1號(hào)試管中加入一些白色纖維狀物，振蕩使其溶解，然后向兩支試管中各加入2mL二苯胺試劑，沸水浴加熱5分鐘。

注意事項(xiàng)

1.以血液為實(shí)驗(yàn)材料時(shí)，每100ml血液中需要加入3g檸檬酸鈉防止血液凝固。

2.加入洗滌劑后，動(dòng)作要輕緩、柔和，否則容易產(chǎn)生大量的泡沫，不利于后續(xù)步驟地操作。加入酒精和用玻璃棒攪拌時(shí)，動(dòng)作要輕緩，以免DNA分子的斷裂，導(dǎo)致DNA分子不能形成絮狀沉淀。

3.二苯胺試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則會(huì)影響鑒定的效果。

4.DNA的溶解度與NaCl溶液濃度的關(guān)系：

當(dāng)NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，隨濃度的升高，DNA的溶解度降低;當(dāng)NaCl溶液濃度高于0.14mol/L時(shí)，隨濃度升高，DNA的溶解度升高。

5.盛放雞血細(xì)胞液的容器，最好是塑料容器。

雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于細(xì)胞內(nèi)DNA的含量本來(lái)就比較少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就會(huì)更少。因此，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中最好使用塑料的燒杯和試管，這樣可以減少提取過(guò)程的DNA的損失。

第三篇：dna的粗提取和鑒定

dna的粗提取和鑒定

在溶液中,DNA鏈略帶負(fù)電荷,而鹽離子可被吸引到DNA的負(fù)電荷上,中和這些負(fù)電荷,只要控制鹽的濃度,就能夠使DNA片段或者散開(kāi),或者聚合在一起,因此,食鹽能保持溶液中的濃度與細(xì)胞液相當(dāng)，dna的粗提取和鑒定。DNA不溶于酒精,但細(xì)胞中的某些物質(zhì)則可以溶于酒精。利用這一原理,就可以用酒精萃取DNA。DNA與二苯胺作用生成藍(lán)色沉淀,即可觀察到。

提取生物大分子的基本思路是選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。對(duì)于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。

DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，利用這一特點(diǎn)，選擇適當(dāng)?shù)柠}濃度就能使DNA充分溶解，而使雜質(zhì)沉淀，或者相反，以達(dá)到分離目的。

此外，DNA不溶

.于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。利用這一原理，可以將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步的分離。

DNA對(duì)酶 高溫和洗滌劑的耐受性

蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但是對(duì)DNA沒(méi)有影響。大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60—80oC的高溫，而DNA在80oC以上才會(huì)變性。洗滌劑能夠瓦解細(xì)胞膜，但對(duì)DNA沒(méi)有影響。

DNA的鑒定

在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色，因此二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。

實(shí)驗(yàn)用具

洋蔥或其他植物、洗潔精、食鹽、攪拌機(jī)或研缽(我們采用的是家用豆?jié){機(jī))、紗布、漏斗、燒杯、玻璃棒、量筒(10mL一支)、滴管、試管(20mL兩支)、天平。95%酒精、蒸餾水、0.015mol/L的NaCl溶液、二苯胺試劑。

實(shí)驗(yàn)材料的選取

凡是含有DNA的生物材料都可以考慮，但是使用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功的可能性更大，鑒定材料《dna的粗提取和鑒定》。

原理

①加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂

蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。

②加入洗滌劑和食鹽的作用

洗滌劑是一些離子去污劑，能溶解細(xì)胞膜，有利于DNA的釋放;食鹽的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。

③研磨不充分，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響

研磨不充分會(huì)使細(xì)胞核內(nèi)的DNA釋放不完全，提取的DNA量變少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。

④此步驟獲得的濾液中可能含有的細(xì)胞成分?

可能含有核蛋白、多糖和RNA等雜質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液

動(dòng)物細(xì)胞的破碎比較容易，以雞血細(xì)胞為例，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液即可。如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，需要先用洗滌劑溶解細(xì)胞膜。例如，提取洋

.蔥的DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過(guò)濾后收集研磨液。

2.去除濾液中的雜質(zhì)

方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同;方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分解DNA;方案三的原理是蛋白質(zhì)和DNA的變性溫度不同。

注意事項(xiàng)

①用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì);用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。

②方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi);方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。

DNA的析出與鑒定

將處理后的溶液過(guò)濾，加入與濾液體積相等、冷卻的酒精溶液，靜置2～3min，溶液中會(huì)出現(xiàn)白色絲狀物，這就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌，卷起絲狀物，并用濾紙吸取上面的水分。

取兩支20ml的試管，各加入物質(zhì)的量濃度為2mol/L的NaCl溶液5ml，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4ml的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min，待試管冷卻后，比較兩支試管溶液顏色的變化，看看溶解有DNA的溶液是否變藍(lán)。

第四篇：DNA粗提取及鑒定教案

《DNA粗提取及鑒定》

一、學(xué)習(xí)目標(biāo)：

學(xué)生通過(guò)對(duì)本節(jié)內(nèi)容的探究學(xué)習(xí)：能

⑴了解DNA的物理化學(xué)性質(zhì)。⑵理解DNA粗提取與鑒定的原理。⑶掌握DNA粗提取及鑒定方法，⑷利用DNA的性質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

二、本節(jié)內(nèi)容學(xué)習(xí)的重點(diǎn)：DNA的粗提取和鑒定原理、方法。

難點(diǎn)：DNA的粗提取和鑒定原理、方法。

三、自主探究

（一）（閱讀教材、學(xué)案；探究下列問(wèn)題）

1、提取生物大分子的基本思路？

2、提取DNA的基本思路？

3、用文字和坐標(biāo)曲線描述DNA的溶解性；并思考該問(wèn)題在DNA粗提取中將有何應(yīng)用？

4、DNA在酒精溶液中的溶解性

5、DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性

6、如何來(lái)進(jìn)行DNA鑒定

自主探究

（二）（閱讀教材、學(xué)案；探究下列問(wèn)題）

1、進(jìn)行DNA粗提取應(yīng)選擇什么樣的材料；你的選擇的理由？

2、為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂？

3、如何破碎植物細(xì)胞，并獲取含DNA的濾液；請(qǐng)舉例說(shuō)明，并告訴自己應(yīng)注意什么？

自主探究

（三）（閱讀教材、學(xué)案；探究下列問(wèn)題）

去除濾液中的雜質(zhì)

1、此步驟獲得的濾液中可能含有哪些細(xì)胞成分？

2、方案一中為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？

3、方案二與方案三的原理有什么不同？

自主探究

（四）（閱讀教材、學(xué)案；探究下列問(wèn)題）

1、DNA析出的原理，DNA析出物是什么顏色？

2、DNA鑒定需要設(shè)置對(duì)照嗎？要注意什么問(wèn)題？ 四：

討論

（一）你幫助、我改正；我質(zhì)疑，共提升

小組內(nèi)討論自主探究?jī)?nèi)容并自行改正

討論

（二）你我同思考，細(xì)總結(jié)，共同突破難點(diǎn)

小組內(nèi)討論：總結(jié)

1、本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)原理

2、DNA粗提取與鑒定過(guò)程

3、此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有幾次使用蒸餾水？幾次過(guò)濾，幾次析出？分別在哪一步？

五：

小組間質(zhì)疑，完善 六：課堂小結(jié)

七：達(dá)標(biāo)檢測(cè)；當(dāng)堂掌握 知識(shí)拓展：課下思考總結(jié)：

1、在我們的高中生物學(xué)習(xí)中有顏色反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)有那些？

2、DNA在不同濃度氯化鈉溶液中溶解度的變化曲線還能表示那些量的關(guān)系？

3、還有那些實(shí)驗(yàn)中用到了酒精，他們的作用是？

第五篇：DNA提取方法和試劑作用匯總

1試劑的作用

氯仿的作用？

氯仿：克服酚的缺點(diǎn)；加速有機(jī)相與液相分層。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）

用酚-氯仿抽提細(xì)胞基因組DNA時(shí)，通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇，為什么？

異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。

用乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么加入單價(jià)的陽(yáng)離子？

用乙醇沉淀DNA時(shí)，通常要在溶液中加入單價(jià)的陽(yáng)離子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。DNA提取分為三個(gè)基本步驟

每個(gè)步驟的具體方法可根據(jù)樣品種類、影響提取的物質(zhì)以及后續(xù)步驟的不同而有區(qū)別。

.細(xì)胞的破碎

細(xì)菌有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，首先要破碎經(jīng)胞。方法有三種;①機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法;②化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞;③酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，都可使細(xì)胞壁破碎。

利用研磨或者超聲破碎細(xì)胞，并通過(guò)加入去污劑以除掉膜脂。

加入蛋白酶，醋酸鹽沉淀，或者酚/氯仿抽提，以除掉細(xì)胞內(nèi)的蛋白，如與DNA結(jié)合的組蛋白。將DNA在冷乙醇或異丙醇中沉淀，因?yàn)镈NA在醇中不可溶而黏在一起，這一步也能除掉鹽分。另外，目前也有利用吸附過(guò)柱的方法提取DNA的商業(yè)化試劑盒。

DNA提取的幾種方法(1).濃鹽法

A.利用RNA和DNA在電解溶液中溶解度不同，將二者分離，常用的方法是用1M 氯納抽提,得到的DNA粘液與含有少量蛋白質(zhì) 氯仿一起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質(zhì),此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上層水相中,用2倍體積95%乙醇可將DNA 鈉鹽沉淀出來(lái).B.也可用0.15 MNaCL液反復(fù)洗滌細(xì)胞破碎液除去RNA,再以1MNaCL提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿---異醇法除去蛋白.兩種方法比較,后種方法使核酸降解可能少一些.C.以稀鹽酸溶液提取DNA 時(shí),加入適量去污劑,如SDS可有助于蛋白質(zhì)與DNA 的分離。在提取過(guò)程中為抑制組織中的DNase對(duì)DNA 的降解作用,在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離子的烙合劑.通常用.15MNaCL,0.015M檸檬鈉,并稱SSC溶液,提取DNA.（2）.陰離子去污劑法;用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性,可以直接從生物材料中提取DNA.由于細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,因?yàn)殛庪x子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA

（3）.苯酚抽提法：苯酚作為蛋白變性劑,同時(shí)抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時(shí),由于蛋白與DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA。此時(shí)DNA是十分粘稠的物質(zhì)，可用玻璃漫漫繞成一團(tuán)，取出。此法的特點(diǎn)是使提取的DNA保持天然狀態(tài)

（4）.水抽提法:利用核酸溶解于水的性質(zhì),將組織細(xì)胞破碎后,用低鹽溶液除去RNA，然后將沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,離心后收集上清液.在上清中加入固體氯化鈉調(diào)節(jié)至2.6M.加入2倍體積95%乙醇,立即用攪拌法攪出.然后分別用66%，80%和95%乙醇以及丙銅洗滌,最后在空氣中干燥,既得DNA樣品.此法提取的DNA中蛋白質(zhì)含量較高,故一般不用.為除蛋白可將此法加以改良,在提取過(guò)程中加入SDS.1.動(dòng)物來(lái)源的DNA的提取 1.1經(jīng)典提取方法

酚抽提法、異丙醇沉淀法以及甲酞胺裂解法是提取DNA最為經(jīng)典的方法，目前很多方法的改進(jìn)都是在這些方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，這三種方法均利用蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉(SDS)消化破碎細(xì)胞。在前兩種方法中裂解液先用酚/氯仿去除蛋白質(zhì)，再分別用乙醇或異丙醇沉淀DNA。甲酞胺法是利用高濃度的甲酞胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，然后利用透析來(lái)處理DNA樣品。這些經(jīng)典方法獲得的DNA純度很高，能夠滿足各種試驗(yàn)的要求，但操作繁瑣，用時(shí)長(zhǎng)，且所用試劑具有一定的毒性。

1.2 玻璃棒纏繞法

該 法 用 鹽酸肌裂解細(xì)胞，然后將細(xì)胞裂解物小心鋪在離心管中的乙醇上，用一個(gè)帶鉤的或前端為U形的玻璃棒在這兩層液體的交界面慢慢攪動(dòng)，沉淀出的膠狀DNA纏繞在玻璃棒上。玻璃棒上的DNA經(jīng)多次乙醇浸泡并于室溫下蒸干乙醇，由膠狀逐漸回縮，然后浸人TE中過(guò)夜，使其重新吸水膨脹進(jìn)而和玻璃棒分離。這種方法對(duì)操作技術(shù)要求較高，但簡(jiǎn)單快速。

1.3 血細(xì)胞DNA的快速提取法

采用 非離子變性劑NP40(乙基苯基聚乙二醇)代替SDS裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞核，然后用酚/氯仿抽提DNA。這樣從血液中分離獲得的DNA純度高，能夠滿足各種臨床檢驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)的需要。也可采用NP40和Tween-20同時(shí)作用破碎細(xì)胞膜，以避免SDS對(duì)以后步驟的負(fù)面作用。Ba sun i等 [‘〕采用了4種常用的從血液中提取DNA的方法:High Pure Viral Nucleic 試劑盒法、QlAamp試劑盒法、Tri-PureTM試劑分離提取法以及經(jīng)典酚抽提法，對(duì)通常作拋棄處理的血凝塊進(jìn)行人DNA 及病毒DNA的抽提，發(fā)現(xiàn)前兩種方法可以迅速高效獲得目的DNA，從而建立了由血凝塊中提取DNA的方法，擴(kuò)大了臨床檢驗(yàn)樣本的來(lái)源。

1.4 玻璃顆粒吸附法

在該 法 中首先利用含異硫氰酸肌的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，然后加人含有能夠與DNA 結(jié)合的玻璃顆粒的緩沖液，經(jīng)沉淀收集結(jié)合染色體DNA的玻璃顆粒，利用洗脫液進(jìn)行洗脫獲得DNA。不僅玻璃顆粒可以與DNA 進(jìn)行結(jié)合，一定大小的硅膠顆粒也可以與 DNA進(jìn)行結(jié)合，據(jù)此，不少實(shí)驗(yàn)工作者實(shí)踐了很多利用顆粒結(jié)合DNA 的提取方法。Pichler等[2〕在從抹香鯨(Physeter macrocephalus)牙齒及骨骼中抽提DNA時(shí)采用了一種以二氧化硅為吸附介質(zhì)的方法，從抹香鯨標(biāo)本骨骼組織中鉆取的少量粉末中獲得了足夠用于分析的DNA產(chǎn)物，此方法擴(kuò)大了對(duì)稀有哺乳動(dòng)物DNA研究的取材范圍。Caldarelli-stefano等[3〕在從福爾馬林固定、石蠟包埋的人體組織標(biāo)本中提取DNA時(shí)利用小磁珠作為結(jié)合核，也獲得了理想的純化 DNA。很多試劑公司也依此設(shè)計(jì)生產(chǎn)了許多顆粒提取試劑盒，Pint。等[4]就探討了采用 Gibc。公司的GlassMAX系統(tǒng)，對(duì)福爾馬林固定的組織進(jìn)行DNA提取的具體操作方法，目前這些試劑盒在臨床上廣為應(yīng)用，省時(shí)省力。

1.5 三乙醇胺月桂基硫酸鹽(TLS)法

由于 常 規(guī) 方法中使用的蛋白酶K的水解條件不好掌握，采用TLS來(lái)提取組織、細(xì)胞以及外周血DNA可以克服這一弊端。TLS是一種較強(qiáng)的表面活性劑，將其直接作用于細(xì)胞或組織勻漿，可迅速溶解細(xì)胞膜、核膜，而且蛋白質(zhì)與其結(jié)合后即失去對(duì)DNA 的結(jié)合，進(jìn)一步的純化可采用常規(guī)方法。

1.6 臨床病理標(biāo)本的DNA提取方法

由于 PC R技術(shù)不僅可用于基因分離、核酸序列分析，還可用于突變體和重組體的構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)控研究、基因病的診斷及腫瘤發(fā)生機(jī)理的探討等。近年來(lái)，PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病理學(xué)研究，尤其對(duì)福爾馬林固定石蠟包埋病理標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)的研究更成為關(guān)注的焦點(diǎn)。對(duì)于從這些病理標(biāo)本中提取 DNA的方法研究也很多。一般采用酚/氯仿抽提法，該法雖然效率較高，但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且其操作中要求多次離心，增加了樣品污染的可能性。近年來(lái)很多高效靈敏的方法在實(shí)踐中得以采用，這些方法通常采用加熱或微波法〔s〕去除包埋的石蠟，使用Sephadex G-5。柱色譜或鹽析法[s7等去除蛋白質(zhì)。高文濤[71等在研究福爾馬林固定石蠟包埋組織 DNA提取方法對(duì)PCR的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)在組織切片中加人鰲合樹(shù)脂(Chelating Resin，亞氨基二乙酸)提取獲得的DNA可取得較好的PCR擴(kuò)增結(jié)果。Coombs等〔s〕則采用熱循環(huán)方法，將標(biāo)本上的蠟融人樣品溶液，在酶的作用下進(jìn)行裂解，然后用Chelex-100進(jìn)行吸附，離心去蠟，這種方法安全、簡(jiǎn)便、有效、經(jīng)濟(jì)。1.7 鹽析法

該 法用 飽 和氯化鈉代替有機(jī)溶劑去除蛋白質(zhì)，所獲得的DNA質(zhì)量可以滿足PCR模板的要求，但產(chǎn)率相對(duì)較低，純度較差。譚建明等[9]對(duì)上述鹽析法進(jìn)行了改進(jìn)，即將處理過(guò)的樣本加人SDS和蛋白酶K后，在56'C 消化1h，然后用飽和氯化鈉沉淀蛋白質(zhì)，并經(jīng)離心除去，上清直接用乙醇沉淀DNA。該法簡(jiǎn)化了DNA的抽提步驟，可用于人體各種樣本DNA的提取，所獲DNA的純度可以滿足各種檢測(cè)的需要。植物來(lái)源的DNA提取

利用 基 因工程手段對(duì)植物進(jìn)行定向改造，已成為當(dāng)今植物育種學(xué)發(fā)展的一個(gè)新領(lǐng)域，植物基因工程操作離不開(kāi)植物基因組總 DNA的制備，不同植物的核酸結(jié)合蛋白的情況各不相同，因而要采取不同的提取方法[10]。由于植物中次生代謝產(chǎn)物— 多酚類化合物可介導(dǎo)DNA降解，而多糖的污染也是影響植物DNA純度最常見(jiàn)的問(wèn)題，這些多糖能抑制限制酶、連接酶及DNA聚合酶等酶類的生物活性。因此要從富含多酚和多糖的植物組織中分離獲得高質(zhì)量的基因組 DNA也并非易事[11l。目前采用的方法有以下幾種。

2.1 十六烷基三乙基澳化按(CTAB)法

CTAB 是 一種陽(yáng)離子去污劑，它能與核酸形成復(fù)合物，這些復(fù)合物在低鹽溶液中會(huì)因溶解度的降低而沉淀，而在高鹽溶液中可解離，從而使DNA和多糖分開(kāi)，再用乙醇沉淀DNA 而除去CTAB。在該法中使用的聚維酮(PVP)與多酚結(jié)合形成復(fù)合物，從而可有效避免多酚類化合物介導(dǎo)的DNA降解[121。王卓偉等[13〕在對(duì)桑葉DNA提取方法研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)PVI〕還能有效地去除多糖。羅志勇等[14〕在研究中對(duì)這種方法進(jìn)行了幾點(diǎn)改進(jìn): ①提高CTAB的濃度;②對(duì)于含多酚類較多的植物，增加CTAB提取緩沖液中琉基乙醇的含量，同時(shí)加人PVP使其與多酚類物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物;③增加低鹽沉淀緩沖液的量;④增加高鹽溶液中鹽的濃度。用改進(jìn)的方法從人參、西洋參、三七等藥用植物中分離獲得了高純度的DNA, Porebski等[1s]在沉淀粗提 DNA時(shí)，將提取緩沖液中氯化鈉的濃度提高至2.5m o卜L-’以使DNA在高鹽緩沖條件下優(yōu)先沉淀，可更有效地除去多糖。Stein等[16] 對(duì)傳統(tǒng)的CTAB法進(jìn)行了優(yōu)化，創(chuàng)建了一種從新鮮草本植物樣本中提取DNA的方法。首先在特制的有96個(gè)孔的托盤(pán)上種植植物樣本，并依照不同樣本在托盤(pán)中的位置進(jìn)行編號(hào)，然后取適量植物葉子分裝在充滿提取液的塑料袋中，除去袋中的空氣并封口，再用特制的手工勻化器將各袋中的樣本混勻，56`C孵育 1h后將袋中的液體取出進(jìn)行離心以及DNA 的沉淀。Xin等〔17〕則采用簡(jiǎn)易的96孔托盤(pán)作為提取時(shí)的容器，將多種植物樣本經(jīng)研磨處理后分別放在不同的孔中進(jìn)行提取，在一天內(nèi)由一人就可完成上千個(gè)樣本的DNA提取，為高通量植物基因分析及篩選提供了極大的便利。

2.2 SDS法

為 了避 免 CTAB法試驗(yàn)步驟多、操作繁瑣的不足之處，近年來(lái)又提出了利用SDSTris-Cl--EDTA等直接裂解細(xì)胞使其釋放出DNA的方法]。在該法后續(xù)的DNA純化過(guò)程中通常采用酚/氯仿處理，但對(duì)于植物 DNA純化不是一個(gè)很好的選擇，因?yàn)榉拥氖褂每山档虳NA的提取效率和純度。在用該法提取DNA的過(guò)程中采用較大的離心力和較長(zhǎng)的離心時(shí)間，然后用氯仿一異戊醇代替酚來(lái)去除變性蛋白質(zhì)，從而克服了由于酚的摻人及殘留對(duì)以后酶切帶來(lái)的困難。用琉基乙醇代替SDS，對(duì)大豆DNA分離提取能夠更有效地去除蛋白質(zhì)，而且可以有效防止褐變，獲得天然雙鏈高分子量的DNA產(chǎn)物，并且減少了SDS對(duì) PCR、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)等操作的影響。在對(duì)辣椒DNA進(jìn)行提取時(shí)為了提高DNA的產(chǎn)率將待提取的植物材料首先在液氮中研磨成粉末，并且針對(duì)辣椒葉子中多酚類物質(zhì)極少的特點(diǎn)將其中的加人PVP的步驟省去，消除了PVP對(duì)以后操作的影響.2.3 氯化千法在對(duì)稱猴桃的基因組DNA 提取過(guò)程中選用了氯化節(jié)法，與其他方法相比該法的得率較高，其原因可能是氯化節(jié)不僅可與植物細(xì)胞壁上的多糖經(jīng)基反應(yīng)生成醚，而且與細(xì)胞液中多糖物質(zhì)的All基反應(yīng)，起到破壞糖鏈的作用，利于DNA的釋放和提純。

2.4 高鹽低pH法

該 法 中 所用的提純?cè)噭﹥H為無(wú)機(jī)鹽和異丙醇。通常采用的無(wú)機(jī)鹽為醋酸鉀，低pH的醋酸鉀是有效的蛋白質(zhì)沉淀劑。與一般氯仿一異丙醇反復(fù)抽提去除蛋白質(zhì)的操作相比該法操作更方便省時(shí)，所需樣品量少，適用于 瀕危植物DNA的提取。

2.5 果膠酶法

Ste ve n等 [2s采用果膠酶對(duì)植物細(xì)胞破碎后的抽提混合物進(jìn)行消化處理使與DNA共沉淀的膠狀物質(zhì)分解成小的片段，從而無(wú)法與DNA一起沉淀下來(lái)，降低了DNA的純化難度，提高純化效率。微生物來(lái)源DNA的提取

常規(guī) 的微 生物DNA提取多是根據(jù)某種微生物的具體特點(diǎn)選擇合適的方法。在實(shí)際的科學(xué)研究過(guò)程中，很多科學(xué)工作者通過(guò)實(shí)踐總結(jié)出許多快速實(shí)用的提取方法，現(xiàn)擇其中比較典型的加以總結(jié)。

3.1 細(xì)菌質(zhì)粒的提取方法

質(zhì)粒是獨(dú)立于細(xì)菌染色體DNA之外的環(huán)狀DNA，它能攜帶外源基因進(jìn)人細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增，或表達(dá)外源基因，是基因工程中常用的載體，在DNA重組技術(shù)、DNA測(cè)序、轉(zhuǎn)基因等方面具有廣泛的應(yīng)用。對(duì)于細(xì)菌質(zhì)粒的提

取比較經(jīng)典的方法有:堿裂解法、煮沸法、SDS裂解法以及Triton-溶菌酶裂解法等。這些方法的選擇取決于質(zhì)粒的大小、細(xì)菌菌株的性質(zhì)等。Keunosky等GE_發(fā)展了一種以 Zn'+誘導(dǎo)DNA沉淀的方法，在該法中利用一定濃度的ZnCl:溶液使一定體積的細(xì)菌菌液質(zhì)粒DNA大量沉淀，無(wú)需多次離心，大大簡(jiǎn)化了抽提的步驟。

近年 來(lái)，一些生物技術(shù)公司，比如Promega公司及Qiagen公司等紛紛推出質(zhì)粒抽提試劑盒，這些試劑盒多運(yùn)用樹(shù)脂材料或硅膠來(lái)特異性的吸附質(zhì)粒DNA，提取過(guò)程用時(shí)少，效率高。

3.2 真菌DNA提取方法

對(duì) 真菌 DNA的提取關(guān)鍵是破碎細(xì)胞，通常采取酶解破壁法或以液氮冷凍處理增加細(xì)胞壁脆性的物理破壁法。在這兩種方法中酶解破壁法較為簡(jiǎn)單，易于操作和控制，而物理破壁法在處理過(guò)程中容易造成細(xì)胞核的大量破損。在提取獲得核酸一蛋白質(zhì)復(fù)合物后，對(duì)其中蛋白質(zhì)的沉淀也多采用傳統(tǒng)的氯仿一異戊醇沉淀法或高鹽沉淀法。韓利剛等C25用CTA13法直接從絲狀真菌的新鮮菌絲中提取DNA，并將所提取的DNA進(jìn)行 RAPD，得到了較清晰的擴(kuò)增圖譜。Loeffler 等[Z6為滿足快速靈敏準(zhǔn)確的臨床檢驗(yàn)的需要，利用MagNA Pure LC系統(tǒng)建立了一種實(shí)用的快速提取方法，該法自動(dòng)化程度高，避免了可能的交叉污染。Manian等[z7〕在對(duì)真菌進(jìn)行DNA抽提時(shí)采用幾個(gè)循環(huán)的快速制冷、煮沸以破碎真菌細(xì)胞壁，并通過(guò)Qiagen 公司的QIAquick DNA純化柱，迅速?gòu)臉O微量的真菌中獲得高純度的DNA大分子。3.3 結(jié)核桿菌DNA的提取方法

利用 PC R微孔板雜交技術(shù)檢測(cè)臨床標(biāo)本中結(jié)核桿菌DNA是診斷結(jié)核桿菌感染的一種快速靈敏和特異的方法。從不同的臨床標(biāo)本中獲得DNA是檢測(cè)準(zhǔn)確和成功的關(guān)鍵。而不同來(lái)源的結(jié)核桿菌又分別受到不同來(lái)源材料的影響，所以提取方法各不相同。同時(shí)由于結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁比較厚不易破碎，一般的微波法、異硫氰酸肌法、凍融法等難以破壞結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁。通常采取的方法有:經(jīng)典酶一酚一氯仿法，堿一SDS裂解法，堿裂解煮沸法，超聲裂解法，Chelex-100 法，玻璃粉一硅吸附法等。楊正林等[28〕通過(guò)對(duì)以上幾種方法的比較發(fā)現(xiàn)玻璃粉一硅吸附法操作簡(jiǎn)單，假陽(yáng)性低，適合臨床檢測(cè)使用。3.4 土壤微生物總DNA的提取方法

土壤 中 細(xì) 菌的含量豐富，種類齊全，從中提取細(xì)菌DNA可用于檢測(cè)不可培養(yǎng)的細(xì)菌，跟蹤某些目標(biāo)菌或重組基因在自然環(huán)境中的行為，也可用來(lái)解釋土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)中的基因的多樣性及其隨環(huán)境的變化。從土壤中提取和純化DNA是最關(guān)鍵的技術(shù)之一。Courtoi:等[29]對(duì)比了在土壤中直接裂解微生物體、然后提取DNA和先將微生物菌體通過(guò)梯度離心與土壤顆粒分開(kāi)再進(jìn)行提取的方法，利用PCR技術(shù)以及雜交技術(shù)檢測(cè)不同方法獲得DNA的種類和純度，發(fā)現(xiàn)前一種方法具有更高的效率，能夠提取獲得較多微生物物種的 DNA。張瑞福等[30]采用SDS高鹽提取法和透析袋回收法對(duì)9種不同來(lái)源的土壤進(jìn)行微生物DNA的提取，與通常采用的對(duì)菌體細(xì)胞的超聲破碎法以及對(duì)粗提DNA的微型柱純化法相比，既保證了一定提取與回收效率，又兼顧了DNA的質(zhì)量，使DNA在提取和純化過(guò)程中不會(huì)受到損傷。4 海洋生物DNA的提取方法

海洋 是 地 球上最大的生物資源庫(kù)，同時(shí)由于海水的保護(hù)使海洋生物變化很少，物種得到較好的保存，這樣就為研究生命現(xiàn)象的基本問(wèn)題提供了豐富的資料。在利用這些資源探討諸如生命的起源、生物進(jìn)化、生物與環(huán)境的關(guān)系、改造海洋生物以為人類服務(wù)(如生產(chǎn)某種藥物)時(shí)離不開(kāi)對(duì)生物核酸的研究。對(duì)于海洋來(lái)源的動(dòng)物、植物、微生物由于其不同于陸生生物的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)特點(diǎn)往往采用不同的DNA提取方法。

張海 琪 等 [31_在對(duì)不同方法保存的大黃魚(yú)(Pseudosciaena crocea)肌肉樣品基因組 DNA進(jìn)行提取時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)福爾馬林、乙醇及含有EDTA的乙醇保存的樣品可以同鮮活樣品和冷凍樣品一樣獲得基因組DNA，但相比之下采用乙醇作為固定劑更方便快速，所提取的DNA用于RAPD分析，獲得了滿意的效果。楊文新等[32〕利用75%的乙醇固定鮑魚(yú)(Haliotis discus)樣本并進(jìn)行DNA的提取，證明用乙醇固定海洋動(dòng)物組織是一種切實(shí)可行的方法，材料處理后可同步提取，增加了實(shí)驗(yàn)的同步性、可比性，適用于大量樣本的提取。由于組織中含有許多DNA酶，絕大多數(shù)DNA酶需要一個(gè)二價(jià)陽(yáng)離子作為輔助因子，因此采用含適量EDTA的乙醇固定劑是野外標(biāo)本采集和運(yùn)輸?shù)囊环N更簡(jiǎn)便有效的方法。

韓兵 社 等 33:針對(duì)傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取工藝進(jìn)行改進(jìn)，應(yīng)用多種萃取液體系從廢棄物魷魚(yú)肝臟中提取核酸，與原工藝相比，核酸提取產(chǎn)量提高30%-60%，整體工藝得到簡(jiǎn)化，而且避免了有機(jī)物的殘留。

赤 潮 是 在特定的環(huán)境前提條件下，海水中的某些浮游生物、原生動(dòng)物或細(xì)菌爆發(fā)性增殖或高度聚集而引起水體變色的一種有害生態(tài)現(xiàn)象，對(duì)海洋漁業(yè)、水產(chǎn)資源以及人類的健康造成很大的威脅。發(fā)生赤潮的生物類型主要為藻類，銅綠微囊藻(Microcytis aeruginosa)是造成赤潮的藻類之一。陸源等[34〕用乙醇乙醚混合液對(duì)純化的銅綠微囊藻作預(yù)處理，破壞了其膠質(zhì)鞘，從而使蛋白酶K和 SDS能更好地直接作用于其細(xì)胞壁，細(xì)胞內(nèi)的DNA釋放完全，提高了總DNA的得率。通過(guò)提取獲得的DNA有助于開(kāi)展對(duì)有害藻類的研究，為防范赤潮提供依據(jù)。在對(duì) 紫 菜(Porphyras p.)進(jìn)行DNA提取時(shí)，郭寶太等[35〕先用海螺酶處理樣品制備紫菜體細(xì)胞，然后用SDS和蛋白酶K裂解細(xì)胞提取總DNA，再用Wizard DNA clean-up;樹(shù)脂進(jìn)行純化。經(jīng)海螺酶處理的紫菜細(xì)胞解決了通常采用的液氮破碎細(xì)胞后裂解物勃稠、DNA得率低且有嚴(yán)重的多糖污染等難題。但這種方法對(duì)植物組織需求量較多，不適于個(gè)體體積小的紫菜。劉必謙等[36〕采用美國(guó)Roche公司的DNA Isolation Kit for Cell and Tissue和上海生工公司的UNIQ-10小量柱式基因組DNA提取試劑盒對(duì)個(gè)體體積較小的圓紫菜(Porphyra suborbiculato)、鐵釘菜(Ishige okamurae)等進(jìn)行DNA 的提取，獲得高純度的基因組DNA，完全能滿足酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)技術(shù)的需要。

陳子 桂 等[371以海洋尾絲蟲(chóng)(Uronema marinum)為材料，針對(duì)纖毛蟲(chóng)難以建立培養(yǎng)以及個(gè)體豐度不高等特點(diǎn)，就微量條件下提取DNA的方法進(jìn)行了探討，成功地獲得了活體直接提取、活體酚/氯仿抽提、固定標(biāo)本直接提取以及固定標(biāo)本酚/氯仿抽提等四種簡(jiǎn)便有效的微量DNA提取方法，解決了纖毛蟲(chóng)微量DNA提取的困難。

綜合 DN A的提取方法，雖然不同生物 DNA的提取方法不盡相同，但各種提取方法也有很多相通之處，可以相互借鑒。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，對(duì)這一技術(shù)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)將會(huì)越來(lái)越多，一些生物領(lǐng)域新的DNA提取方法也將逐漸固定下來(lái)，更為簡(jiǎn)捷、高效的方法也必將出現(xiàn)，為基因工程提供更高純度的DNA.1）學(xué)習(xí)并掌握動(dòng)物組織總DNA的提取方法及其原理。（2）從肝臟組織中提取到一定量的純凈的DNA樣品。【實(shí)驗(yàn)原理】

DNA是一切生物細(xì)胞的重要組成成分，主要存在于細(xì)胞核中。通過(guò)研磨和SDS作用破碎細(xì)胞；苯酚和氯仿可使蛋白質(zhì)變性，用其混合液（酚：氯仿：異戊醇）重復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性，然后離心除去變性蛋白質(zhì)；RNase降解RNA，從而得到純凈的DNA分子。【儀器、材料、試劑】

（一）儀器 1．高速離心機(jī) 2．烘箱 3．冰箱 4．水浴鍋 5．微量移液器 6．高壓滅菌鍋

（二）材料 1．生理鹽水

2．十二烷基硫酸鈉（SDS）3．三羥甲基氨基甲烷（Tris）4．乙二胺四乙酸（EDTA）5．飽和酚 6．氯仿 7．異戊醇 8．無(wú)水乙醇 9．75%乙醇 10．蛋白酶K 11．RNase酶

12．手術(shù)剪刀、鑷子、吸水紙 13．微量取液器

14．研缽、1.5mL 離心管、一次性手套、1.5mL離心管架、記號(hào)筆

（三）試劑配制 1．Tris–HCL 1mol/L PH8.0 50ml 配制方法：

40ml雙蒸水，6.057g固體Tris放入燒杯中溶解，用濃鹽酸調(diào)PH值到8.0，轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶中，加入雙蒸水定容，搖勻后，轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的輸液瓶中，貼上標(biāo)簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2．生理鹽水: 0.85%NaCL 100ml 配制方法：

在20ml雙蒸水中溶解0.85g固體NaCL，加水定容至100ml，搖勻后，轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的輸液瓶中，貼上標(biāo)簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?．EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml 配制方法：

將9.08g的EDTA·Na2·2H2O溶解于40ml雙蒸水，用1g的NaOH顆粒（慢慢逐步加入）調(diào)PH值到8.0，用50ml容量瓶定容，如果EDTA難溶，先加NaOH溶解，然后逐步加EDTA·Na2·2H2O。

4．TES緩沖液（釋放DNA）100ml 配制方法：

將0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml雙蒸水，在分別加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml的Tris-HCl(pH=8.0)，加定容至100ml, 搖勻后，轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的輸液瓶中，貼上標(biāo)簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

5．10% SDS（變性劑 破細(xì)胞壁）100ml 配制方法：

將10g的十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解于80ml雙蒸水于68℃加熱溶解，用濃HCl調(diào)至PH=7.2，定容至100ml，搖勻后，轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的輸液瓶中，貼上標(biāo)簽，4℃保存?zhèn)溆谩?．蛋白酶K（降解蛋白質(zhì)）：20mg/mL 無(wú)菌三蒸水溶解。7．RNA酶（降解RNA）配制方法：

將胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/L的Tris·CL（PH7.5）、15mmol/LNaCL中，配成10mg/ml的濃度，于100℃加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝成小份存于–20℃。8．氯仿：異戊醇=24：1 100ml 按24:1的比例加入氯仿、異戊醇，搖勻，轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的瓶中，貼上標(biāo)簽，4℃保存?zhèn)溆谩?．TE緩沖液（溶解DNA）PH8.0 50ml 配制方法：

將0.5ml 的10mmol Tris-HCl(PH8.0)、0.1ml的0.5mol/l EDTA(PH8.0)加入到50ml的容量瓶中，調(diào)PH8.0定容至50ml搖勻后，轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的瓶中，貼上標(biāo)簽，高壓滅菌后，降至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩！緦?shí)驗(yàn)步驟】

1．組織塊解凍，用生理鹽水洗去血污，剪取約0.5g組織，放入1.5ml離心管中，剪碎。2．加入0.45ml TES混勻，再加入50ul SDS（10%），5.0ul蛋白酶K（20mg/ml），充分混勻后，于56°C保溫4-6h，每2h搖1次。3．放置到室溫，加入等體積飽和酚（500ul），顛倒混勻，10000r/m，離心10m，分離水相和有機(jī)相，小心吸取上層含核酸的水相，到一個(gè)新的1.5ml離心管。4．加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），顛倒混勻，10000r/m，離心10分鐘，取上層轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中。5．加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），顛倒混勻，10000r/m，離心10分鐘，取上層清液到一個(gè)新的1.5ml離心管。6．加入2.5倍體積的-20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀DNA，觀察現(xiàn)象。7．12000 r/m，離心10分鐘，棄乙醇。8．-20°C保存的75%乙醇洗滌，10000 r/m，離心5分鐘，去乙醇，55°C干燥DNA。9．加入適量TE溶解DNA（具體依DNA的多少而定），-20°C保存?zhèn)溆谩！咀⒁馐马?xiàng)】

1．抽提每一步用力要柔和，防止機(jī)械剪切力對(duì)DNA的損傷。2．取上層清液時(shí)，注意不要吸起中間的蛋白質(zhì)層。3．乙醇漂洗去乙醇時(shí)，不要蕩起DNA。

4．離心后，不要晃動(dòng)離心管，拿管要穩(wěn)，斜面朝外。