第一篇：細(xì)胞骨架組分的熒光染色觀察

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

細(xì)胞骨架組分的熒光染色觀察

姓名：

學(xué)號(hào)：

班級(jí)：

專業(yè)：

同組成員：

一、實(shí)驗(yàn)原理

鬼筆環(huán)肽(phalloidin)是從一種毒性菇類中分離的劇毒生物堿，它同細(xì)胞松弛素的作用相反, 只與聚合的微絲結(jié)合, 而不與肌動(dòng)蛋白單體分子結(jié)合。它同聚合的微絲結(jié)合后, 抑制了微絲的解體, 因而破壞了微絲的聚合和解聚的動(dòng)態(tài)平衡。

由于鬼筆環(huán)肽非常特異地結(jié)合并穩(wěn)定聚合態(tài)肌動(dòng)蛋白,因而對(duì)肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)平衡造成嚴(yán)重影響.此外, 較高濃度的鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞有毒害作用。因此,用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記微絲并不是用于研究活體細(xì)胞的理想方法。

二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1．掌握細(xì)胞骨架的顯示方法 2.掌握熒光顯微鏡的使用方法

3.了解熒光顯微鏡下細(xì)胞骨架的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)

三、實(shí)驗(yàn)器材 1.材料：

CHO（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）、雞胚成纖維細(xì)胞 2.試劑：

PEM：50mM pipes(pH6.9), 5mM EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇 0.5% Triton X-100溶于PEM緩沖液。4%多聚甲醛溶于PEM緩沖液。3.儀 器

超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡 4.其它用品：

蓋玻片（無菌）、35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿、試管、移液管，滴管，酒精燈、75％酒精棉球、廢液缸。

四、方法與步驟

由于上節(jié)課雞胚成纖維細(xì)胞被污染，本次實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為CHO細(xì)胞（1）準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)器材。（本次實(shí)驗(yàn)無需在超凈臺(tái)中進(jìn)行）

（2）將上節(jié)課進(jìn)行細(xì)胞爬片的培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出，取出蓋片，于小平皿中。（3）37℃預(yù)溫 PEM洗3次(每次 1mL)（4）Triton X-100處理約10min(1mL)（5）37℃預(yù)溫 PEM洗3次(每次 1mL)（6）37℃預(yù)溫 4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min(1mL)（7）37℃預(yù)溫 PEM洗3次

（8）55nM Alex-phalloidin 10μL濕盒中室溫染色30min。（避光）（9）在parafilm 膜上加PEM，待蓋玻片被沖起后，再輕輕揭下蓋玻片。（10）37℃預(yù)溫 PEM洗數(shù)3次，滴加10μL Ho.33342復(fù)染色。（11）熒光顯微鏡下觀察并拍照。

五、注意事項(xiàng)

1.蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時(shí)動(dòng)作要輕。2.注意不要弄碎蓋片，分清細(xì)胞所在面； 3.各步洗細(xì)胞要輕，勿使細(xì)胞脫落； 4.熒光觀察注意避光操作，防止熒光淬滅。5.節(jié)約試劑。

六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)我們對(duì)CHO細(xì)胞爬片結(jié)果進(jìn)行了熒光染色，在熒光顯鏡下用不同波長的激發(fā)光對(duì)細(xì)胞骨架微絲結(jié)構(gòu)及細(xì)胞核進(jìn)行了觀察、拍攝照片并將結(jié)果疊加。得到以下的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：

圖1.CHO細(xì)胞微絲熒光染色圖

圖2.CHO細(xì)胞核熒光染色圖

圖3.CHO細(xì)胞微絲及細(xì)胞核熒光染色合成圖

從拍攝的照片可以較為清晰的看到CHO細(xì)胞骨架的微絲被染成了綠色，細(xì)胞核被染成藍(lán)色；微絲的形狀為長條的紡錘狀細(xì)絲，遍布整個(gè)細(xì)胞，在細(xì)胞中起到了類似骨架般的支撐作用；細(xì)胞核為橢圓形，之后再將兩圖合成，可觀察到細(xì)胞核被遍布的微絲結(jié)構(gòu)包圍。實(shí)驗(yàn)較為成功。在實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意熒光染料均存在淬滅問題，所以要盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。每步洗滌要充分，并吸去水分(但也不要干透)，以免稀釋下一步的抗體或試劑，這樣才能得到清晰的熒光圖像。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 桑建利, 譚信.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo).北京:科學(xué)出版社, 2010.[2] 北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn).北京:北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,2015.9.

第二篇：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)細(xì)胞骨架組分的熒光染色觀察

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞骨架組分的熒光染色觀察

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、掌握細(xì)胞骨架的顯示方法

2、掌握熒光顯微鏡的使用方法

3、了解熒光顯微鏡下細(xì)胞骨架的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)

4、了解熒光探針Hoechst 33342（Ho.33324）與細(xì)胞成分的結(jié)合特性和光譜特性

二、實(shí)驗(yàn)原理

1、微絲股價(jià)是一種高度動(dòng)態(tài)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞的多種生理活動(dòng)如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、胞質(zhì)分離、細(xì)胞器的定位、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸、吞噬作用、細(xì)胞極性生長等密切相關(guān)。

2、鬼筆環(huán)肽(phalloidin)是從一種毒性菇類中分離的劇毒生物堿，它同細(xì)胞松弛素的作用相反, 只與聚合的微絲結(jié)合, 而不與肌動(dòng)蛋白單體分子結(jié)合。它同聚合的微絲結(jié)合后, 抑制了微絲的解體, 因而破壞了微絲的聚合和解聚的動(dòng)態(tài)平衡。

3、由于鬼筆環(huán)肽非常特異地結(jié)合并穩(wěn)定聚合態(tài)肌動(dòng)蛋白, 因而對(duì)肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)平衡造成嚴(yán)重影響.此外, 較高濃度的鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞有毒害作用.因此, 用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記微絲并不是用于研究活體細(xì)胞的理想方法。

三、實(shí)驗(yàn)材料

1、材料：CHO（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）

2、試劑：

（1）PEM：50mM pipes(pH6.9), 5mM

EGTA, 5mM MgSO4, 0.225M 山梨醇

（2）0.5% Triton X-100溶于PEM緩沖液中。

（3）4%多聚甲醛溶于PEM緩沖液中。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1、取出上次實(shí)驗(yàn)爬片于小蓋玻片上的CHO細(xì)胞；

2、取出培養(yǎng)有CHO細(xì)胞的蓋片，于小平皿中37℃預(yù)溫 PEM洗3次(每次 1mL)； 3、37℃預(yù)溫 4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min(1mL)4、37℃預(yù)溫 PEM洗3次

5、加入0.5%Triton X-100處理約10min(1mL)；

6、取一潔凈的載玻片，按照其的大小在其上放置一條封口膜，在封口膜上滴加20μL 60nM Alex-phalloidin 10L濕盒中室溫染色30min；

7、在parafilm 膜上加PEM，待蓋玻片被沖起后，再輕輕揭下蓋玻片； 8、37℃預(yù)溫 PEM洗數(shù)3次；

9、滴加10L Ho.33342復(fù)染色；

10、熒光鏡下觀察。【注意事項(xiàng)】

1、注意不要弄碎蓋片，分清細(xì)胞所在面；

2、各步洗細(xì)胞要輕，勿使細(xì)胞脫落；

3、熒光觀察注意避光操作

4、節(jié)約試劑。

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖一：CHO細(xì)胞微絲熒光染色圖

圖二：CHO細(xì)胞細(xì)胞核熒光染色圖

圖三：CHO細(xì)胞微絲與細(xì)胞核熒光染色疊加圖

六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

染色后微絲呈綠色，細(xì)胞核為藍(lán)色，染色較為清晰。但細(xì)胞數(shù)量較多，導(dǎo)致有些染色結(jié)果重疊。

七、思考題

1、PEM緩沖液的作用是什么？

細(xì)胞內(nèi)的微絲在含有ATP和Ca2+及低濃度的Na+，K+等陽離子溶液中，趨于解聚成G-actin；而在Mg2+和高濃度的Na+，K+等陽離子溶液中，G-actin則裝配為F-actin。PEM緩沖液提供高M(jìn)g環(huán)境，讓單體肌動(dòng)蛋白（G-actin）聚合成絲狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）。同時(shí)，EGTA能螯合Ca2+，使G-actin裝配成F-actin，微絲骨架保持聚合狀態(tài)且較為舒張。用PEM緩沖液處理細(xì)胞，能夠模擬體內(nèi)環(huán)境并提高細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性。2、0.5%Triton X-100處理細(xì)胞的作用是什么？

0.5%Triton X-100處理細(xì)胞的作用是溶解細(xì)胞膜上的脂類和蛋白質(zhì)，增加細(xì)胞膜的通透性，使熒光染料能夠更容易地透過細(xì)胞膜與F-actin特異性結(jié)合。

3、鬼筆環(huán)肽用于細(xì)胞骨架研究的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？

（1）鬼筆環(huán)肽用于細(xì)胞骨架研究的優(yōu)點(diǎn)：鬼筆環(huán)肽的分子量小，很容易通過細(xì)胞，不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷丙酮和TRITON X-100處理。鬼筆環(huán)肽可以與聚合的微絲結(jié)合，通過讓這種毒素吸附于熒光染料上面，可以研究細(xì)胞的內(nèi)部工作機(jī)制，窺視細(xì)胞如何分裂。（2）鬼筆環(huán)肽用于細(xì)胞骨架研究的缺點(diǎn)：對(duì)細(xì)胞有毒性，價(jià)格昂貴。

參考文獻(xiàn)：細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(桑建利, 譚信)

第三篇：細(xì)胞骨架的觀察

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞骨架的觀察

姓名：鄧燕玲 學(xué)號(hào)：201011202912 專業(yè)：生命科學(xué)生物科學(xué) 實(shí)驗(yàn)時(shí)間：20121030 指導(dǎo)老師：張偉 同組同學(xué)：張麗華

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.了解細(xì)胞骨架的組成、結(jié)構(gòu)和功能。2.學(xué)習(xí)細(xì)胞骨架標(biāo)記的原理和方法。3.學(xué)習(xí)用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記微絲的方法步驟。

4.觀察小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和中國倉鼠卵巢細(xì)胞的細(xì)胞微絲骨架。5.討論細(xì)胞骨架在中學(xué)中教學(xué)的重點(diǎn)與難點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)原理

1.細(xì)胞骨架一般是指真核細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)纖維網(wǎng)架系統(tǒng)。廣義大的細(xì)胞骨架包括細(xì)胞膜骨架、細(xì)胞核骨架和細(xì)胞質(zhì)骨架。直至1963年，科學(xué)家用戊二醛在室溫下固定成功后，人們才廣泛地觀察到各類細(xì)胞骨架纖維的存在。細(xì)胞骨架包括微管、微絲和中間纖維。不同成分有不同的結(jié)構(gòu)和功能。細(xì)胞骨架處于不斷地動(dòng)態(tài)平衡中，并且有極性。2.微絲的標(biāo)記方法可分為在固定細(xì)胞中標(biāo)記和在活體中標(biāo)記。本實(shí)驗(yàn)采用的是固定細(xì)胞標(biāo)記，主要運(yùn)用帶熒光探針的抗體或鬼筆環(huán)肽標(biāo)記，這需要對(duì)樣品進(jìn)行化學(xué)固定和膜的通透。

3.熒光探針是一種標(biāo)記物，其中包含的熒光物質(zhì)在從外界吸收能量后變成激發(fā)態(tài)，在回到基態(tài)時(shí)以電磁波的形式釋放能量，從而產(chǎn)生熒光。熒光物質(zhì)在受到長時(shí)間的照射后會(huì)淬滅。

4.鬼筆環(huán)肽（phalloidin）是一種劇毒生物堿，能結(jié)合F-actin，而不與G-actin結(jié)合，并且在結(jié)合后可以抑制微絲的解聚，破壞微絲聚合和解聚的動(dòng)態(tài)平衡。鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞有毒害作用，因此不利于活體細(xì)胞的研究。

5.熒光顯微鏡是用于觀察和分析樣品中產(chǎn)生的熒光物質(zhì)的成分和定位的一種光學(xué)顯微鏡，熒光物質(zhì)在受到激發(fā)光的激發(fā)下，會(huì)發(fā)出比激發(fā)光波長更長的光，從而在顯微鏡下觀察。

實(shí)驗(yàn)器材

1.材料：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、CHO中國倉鼠卵巢細(xì)胞

2.試劑：PEM緩沖液（50 mM pipes,5 mM EGTA, 5 mM MgSO4, 0.225M 山梨醇），0.5 % Triton X-100（溶于PEM緩沖液），4%多聚甲醛（溶于PEM緩沖液），55nM Alex-phalloidin 3.器械：熒光顯微鏡 實(shí)驗(yàn)步驟

1.將小培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液用移液槍吸掉，加入預(yù)熱的1mlPEM清洗，注意不要打在蓋玻片

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

上，洗三次。

2.加入1ml37°C預(yù)熱的0.5 % Triton X-100，放置10min。3.加入預(yù)熱的1mlPEM清洗，洗三次。4.加入預(yù)熱的4%多聚甲醛1ml，放置15min。5.加入預(yù)熱的1mlPEM清洗，洗三次。

6.剪下一段與載玻片寬度一樣的封口膜，將封口膜包在在玻片上，在玻片上的封口膜上加10?L的 55nM Alex –phalloidin，將載玻片有細(xì)胞的一面朝下蓋片，在暗盒中靜置25min。7.用37°預(yù)熱的PEM洗三次，將載玻片有細(xì)胞的一面朝上轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的載玻片中，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果 思考題

1.PEM緩沖液的作用是什么？

答：促進(jìn)微管中肌動(dòng)蛋白的聚合，抑制其解聚，使微管形態(tài)固定，便于觀察。2.1％Triton X-100處理細(xì)胞的作用是什么？

答：能溶解膜上的脂類和蛋白質(zhì)，使細(xì)胞膜穿孔，便于標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞。3.如何在中學(xué)教學(xué)中推進(jìn)細(xì)胞骨架的教學(xué)？

第四篇：2014 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容(細(xì)胞形態(tài)觀察、細(xì)胞器活體染色、細(xì)胞骨架觀察)

實(shí)驗(yàn)三 細(xì)胞形態(tài)的觀察

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1.認(rèn)識(shí)光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)； 2.掌握臨時(shí)制片和顯微繪圖的方法。

【材料、器材和試劑】

材料：人體口腔黏膜上皮細(xì)胞、洋蔥鱗莖；

器材：顯微鏡、剪刀、鑷子、載玻片、蓋玻片、牙簽、濾紙； 試劑：1%碘液。

【方法和步驟】

1.口腔黏膜上皮細(xì)胞的制片與觀察

口腔黏膜細(xì)胞涂片標(biāo)本的制備：吸取一滴碘液滴在一張潔凈的載玻片中央，用一根事先滅菌的牙簽伸入自己的口腔內(nèi)壁輕輕刮取黏膜上皮細(xì)胞，然后，將其放入載玻片上的染液中并來回?cái)噭?dòng)使細(xì)胞散開，染色1 min左右后小心加蓋玻片（盡量避免產(chǎn)生氣泡），用濾紙吸去蓋玻片周圍的液體。

觀察：將自制的口腔黏膜上皮細(xì)胞標(biāo)本裝片置于顯微鏡下觀察，先用低倍鏡觀察較分散的、輪廓清晰的黏膜上皮細(xì)胞。由于該細(xì)胞體積較小、著色較淡，觀察時(shí)應(yīng)稍降低視野亮度以便于較快找到目標(biāo)（在低倍鏡下，用碘液染色的細(xì)胞呈黃色，成群或分散分布，形態(tài)大小多呈扁平橢圓形）。選擇輪廓清晰的細(xì)胞移至視野中央，轉(zhuǎn)換至高倍鏡下觀察。在高倍鏡下，可見口腔黏膜上皮細(xì)胞外圍有一層薄薄的細(xì)胞膜，扁圓形的細(xì)胞核呈深黃色，細(xì)胞質(zhì)呈淺黃色或淺藍(lán)色，核中央致密的結(jié)構(gòu)為核仁。

2.洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞的制片與觀察

表皮細(xì)胞裝片標(biāo)本的制備：取一干凈載玻片，在其中央滴一滴碘液，將洋蔥鱗莖用小刀分為幾塊，取一塊肉質(zhì)鱗葉，用剪刀在內(nèi)表皮劃“田”字形小方格，每一小方格邊長3-4mm，然后用鑷子輕輕撕下一小方格的膜質(zhì)表皮，置于載玻片的碘液滴中鋪平，取一干凈的蓋玻片，將其一側(cè)先接觸標(biāo)本旁的碘液，再緩緩地蓋上蓋玻片，盡量避免產(chǎn)生氣泡，用濾紙吸去蓋玻片周圍的液體。

觀察：將制備好的裝片標(biāo)本放到顯微鏡下，先用低倍鏡觀察，可見許多長柱狀、排列整齊、彼此相連的細(xì)胞，選擇其中一個(gè)典型的細(xì)胞移至視野中央，再轉(zhuǎn)換至高倍鏡下仔細(xì)觀察細(xì)胞壁、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和液泡等結(jié)構(gòu)。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】

繪圖并進(jìn)行適當(dāng)標(biāo)注：人口腔黏膜上皮細(xì)胞和洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞。【討論】

簡述觀察細(xì)胞形態(tài)時(shí)，制作臨時(shí)裝片和顯微鏡鏡檢時(shí)的注意事項(xiàng)。

實(shí)驗(yàn)四 線粒體和液泡系的活體染色

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1.掌握一些細(xì)胞器的超活性染色技術(shù)和原理。

2.觀察動(dòng)物、植物細(xì)胞內(nèi)線粒體和液泡系的形態(tài)、數(shù)量和分布。

【材料、器材和試劑】

材料：人體口腔黏膜上皮細(xì)胞、洋蔥；

器材：顯微鏡、牙簽、鑷子、剪刀、載玻片、蓋玻片；

試劑：Ringer溶液；1/5000詹納斯綠B溶液；1/3000中性紅溶液。

【方法和步驟】

1.線粒體的超活染色與觀察

（1）人體口腔黏膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色和觀察

① 取清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上，滴2滴1/5000詹納斯綠B染液； ② 用一根預(yù)先滅菌的牙簽伸入自己的口腔內(nèi)壁輕輕刮取黏膜上皮細(xì)胞，將刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中，染色10-15min（注意不可使染液干燥，必要時(shí)可再加一滴染液），蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去四周溢出的染液，置于顯微鏡下觀察；

③ 在低倍鏡下，選擇平展的口腔黏膜上皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)換高倍鏡進(jìn)行觀察。可見扁平狀上皮細(xì)胞的核周圍胞質(zhì)中，分布著一些被染成藍(lán)綠色的顆粒狀或棍棒狀的線粒體。（2）洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞線粒體的超活染色和觀察

① 用吸管吸取1/5000詹納斯綠B染液，滴一滴在干凈的載玻片上，然后用鑷子撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮一小塊，置于染液中，染色10-15min；

② 吸去染液，加一滴Ringer液，注意使內(nèi)表皮展平，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察。在高倍鏡下，可見表皮細(xì)胞中央被一大液泡所占據(jù)，細(xì)胞核被擠至旁邊，線粒體染成藍(lán)綠色，呈顆粒狀或線條狀。

2.液泡系的超活染色和觀察

① 洋蔥鱗莖內(nèi)表皮一小塊，置于1/3000中性紅溶液中，染色5-10min；

② 吸去染液，加一滴Ringer液，注意使內(nèi)表皮展平，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察，可見被染成磚紅色的中央大液泡。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】

1.根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察，繪制洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞和人體口腔黏膜上皮細(xì)胞線粒體分布圖。2.根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察，繪制洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞指示液泡系的形態(tài)和分布。

【討論】

1.簡述線粒體詹納斯綠B活體染色和液泡系中性紅活體染色的原理； 2.分析線粒體和液泡系活體染色時(shí)需要注意的事項(xiàng)。3.細(xì)胞內(nèi)線粒體的形態(tài)和分布有何特點(diǎn)？

實(shí)驗(yàn)五 植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

了解細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)特征及其樣品制備技術(shù)。

【材料、器材和試劑】

材料：洋蔥鱗莖；

器材：普通光學(xué)顯微鏡、5Oml燒杯、玻璃滴管、容量瓶、試劑瓶、載玻片、蓋玻片、鑷子、小剪刀、吸水紙、擦鏡紙；

試劑：M 緩沖液；6mmol/L（pH 6.8）磷酸緩沖液；1% Triton X-100；0.2%考馬斯亮藍(lán)R250；3%戊二醛。

【方法和步驟】

1.撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮（約lcm大小若干片）置于裝有pH 6.8磷酸緩沖液的50ml燒杯中，使其下沉；

2.吸去磷酸緩沖液，用l% Triton X-100處理20-30min； 3.吸去Triton X-100，用M緩沖液洗3次，每次10min； 4.3%戊二醛固定O.5-lh；

5.pH 6.8磷酸緩沖液洗3次，每次10min； 6.0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色20-30min；

7.用蒸餾水洗1或2次，細(xì)胞置于載玻片上，加蓋玻片，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

2【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】

繪制洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞微絲束的分布圖。

【討論】

1.闡述采用考馬斯亮藍(lán)R250染色法顯示微絲的原理； 2.分析和論述在光學(xué)顯微鏡下觀察到的細(xì)胞骨架的形態(tài)特征。

第五篇：細(xì)胞骨架觀察實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

細(xì)胞骨架觀察實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

I、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

一、正常細(xì)胞

二、秋水仙素處理 三、VP16處理 四、低溫處理 II、實(shí)驗(yàn)流程

一、細(xì)胞傳代

二、細(xì)胞爬片

1~2d

三、細(xì)胞處理

6h

四、細(xì)胞固定、免染、觀察

1d III、實(shí)驗(yàn)過程

一、細(xì)胞傳代

1、實(shí)驗(yàn)材料

VEC

2、實(shí)驗(yàn)器材

超凈臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、普通冰箱、倒置顯微鏡、離心機(jī)、離心管、微量加液器、吸管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（皿）、鑷子、酒精燈、消毒酒精、廢液缸

3、試劑

胰酶、PBS、培養(yǎng)液（牛血清、雙抗）

二、細(xì)胞爬片

已處理蓋片

三、細(xì)胞處理

細(xì)胞爬片、秋水仙素、VP16、普通冰箱

四、細(xì)胞固定、免染、觀察

1、實(shí)驗(yàn)材料

已處理的爬片

2、實(shí)驗(yàn)器材

離心機(jī)、離心管、玻璃培養(yǎng)皿、載玻片、濾紙、封口膜、溫箱、熒光顯微鏡、微量加液器、鑷子

3、試劑

PBS、BSA封閉液、一抗、二抗、蒸餾水、DAPI

4、步驟

固定

爬片置于玻璃培養(yǎng)皿中，PBS（500uL）洗3次，每次2min 吸棄PBS，加-20℃預(yù)冷甲醇，固定5min 吸棄甲醇，PBS洗3次，每次2min 免染

吸棄PBS，加100uL 2﹪BSA封閉液，蓋上培養(yǎng)皿蓋，室溫固定15min 濾紙吸去片子上封閉液，加30uL（1:500）稀釋一抗，蓋上封口膜（勿大于蓋片），37℃孵育30min ,邊上滴一滴PBS PBS洗3次，每次5min 在邊緣吸棄PBS（濾紙），滴加30uL（1:200）稀釋二抗，避光，蓋封口膜，37℃,30min 揭去封口膜，PBS洗3次，每次5min 吸棄PBS，蒸餾水清涮，迅速，片子正面朝上，晾干

干凈載玻片上，滴加3uLDAPI，將爬片鑷子夾上，反蓋于防淬滅劑上 熒光鏡觀察

IV、注意事項(xiàng)

1、區(qū)分蓋片正反面

2、保持樣品濕潤

3、一抗二抗孵育后，封口膜輕輕沖起

4、二抗孵育后，避光操作，以免熒光淬滅

5、標(biāo)本染色后立即觀察，不看時(shí)4℃保存