第一篇：張紹陽 20130524 《分子生物學》實驗講稿20130223

銅仁學院

Tong ren xue yuan

講 稿

課 程 分子生物學 實驗 專 業 生物科學科 年 級 2010級 教 師 張 紹 陽 職 稱、學 位 講 師 博 士 部系、教研室 生物科學與化學系植物教研室

2012至2013學年度第二學期

實驗1 CTAB法提取植物基因組DNA

一、實驗目的和原理 基因組DNA提取實驗意義

基因組DNA提取是植物生物技術的基本環節，所得DNA可用于基因克隆、分子標記分析、基因文庫構建以及Southern雜交等試驗操作。2 基因組DNA提取方法

關于植物基因組DNA提取的方法有諸多文獻報道，但基本步驟和原理是相近的，其提取液主要成份不外乎兩種試劑，即十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethyl-ammonium bromide，CTAB）和十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），并以CTAB為多。本次實驗介紹CTAB法提取植物基因組DNA原理和相應方法?；蚪MDNA提取CTAB法基本原理

植物組織是由多種組分構成的，如糖、脂類、蛋白質、DNA和RNA構成。提取基因組DNA就是要先將組織細胞進行破碎，然后通過試劑作用和離心作用將其余雜質去除。植物組織經液氮粉碎后用含表面活性劑的CTAB提取液提取，經氯仿抽提，DNA和RNA得到回收而蛋白質及細胞碎片和脂溶性雜質得到去除。經有機溶劑沉淀，DNA和RNA得以沉淀而水溶性雜質被去除。RNA經RNase處理可被降解，最終獲得基因組DNA。

以下是提取方法和基本步驟。

4.本實驗要掌握事項：移液器使用注意事項、離心機操作注意事項

二、實驗材料、試劑、儀器及用具

1.實驗材料及選取標準：健康無病蟲害的植物鮮嫩組織，通常是芽和未完全展開的幼葉。思考題：為什么要選用鮮嫩組織？說明不同植物材料DNA提取難易程度有顯著差別。本實驗實驗材料為：青甌柑幼葉。

2.試劑種類及其作用

2.1 試劑種類： 液氮、2×CTAB提取緩沖液、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）（水不溶性）、β-巰基乙醇、氯仿:異戊醇（24:1）、酚: 氯仿:異戊醇（25:24:1）、異丙醇、70%乙醇、RNase（10mg/ml）、TE緩沖液等。

2.2 試劑作用：（1）液氮和PVP。液氮就是保持研磨時低溫降低組織內生理生化反應，同時使得組織變脆易于研磨。PVP是防止組織發生醌類反應而褐化。（2）2×CTAB提取緩沖液（由2% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl , 20 mmol/L EDTA, 1.4 mol/L NaCl, pH 8.0)，其作用就是細胞破碎，基因組DNA從核內游離出來；其中，EDTA成分為DNase抑制劑，防止DNA被該酶降解。β-巰基乙醇，在提取前CTAB溶液中，具有抑制氧化作用，其具有臭雞蛋難聞氣味。加入該試劑要在通風廚內進行。

（3）氯仿:異戊醇（24:1），該溶液密度比水大，其作用去除葉綠素等脂溶性物質，包括糖和大部分蛋白質。

（4）RNase A ,其作用就是去除RNA（5）酚: 氯仿:異戊醇（25:24:1）,去除蛋白質，尤其是染色體上的組蛋白（6）異丙醇，使DNA沉淀。用前要-20度低溫遇冷半小時或更長時間。（7）乙醇，漂洗DNA，使得到的DNA更為純凈

（8）TE緩沖液（10 mM Tris和 1 mM EDTA，pH8.0）。溶解DNA。溶解完畢的DNA溶液，即為最終提取產物。也可以用超純水（或雙蒸水）進行溶解。在TE緩沖液中，DNA更為穩定。

3.儀器及用具：冷凍離心機、研缽、移液器、通風廚、水浴鍋等。分子生物學實驗中，氯仿、甲醛、醋酸、?-巰基乙醇，都具有刺激性氣味，進行相關操作時要在通風廚內進行。

三、實驗步驟（實驗操作順序，以一A1小小組為例）

1.一A1-1 加提取緩沖液。將600 ?l 2×CTAB提取緩沖液和20 ?l ?-巰基乙醇加入1.5 ml 離心管中（在通風廚內進行）, 將該離心管放入65℃水浴中進行預熱。

2.液氮研磨組織。取適量植物組織（約0.5-1.0g），加入適量PVP，于液氮中研磨成粉末。（已有研磨好樣品，在本實驗中，此步驟已省略）

3.一A1-2 65℃水浴45-60 min。取0.10-0.12g研磨好的組織粉末，轉入提取液已預熱過的離心管中，蓋好蓋子后，旋窩震蕩10-15s左右，然后隨浮板放入在65℃水浴中保溫45-60 min, 并每隔10-15min顛倒混勻10次左右。（待水浴完成后，將溫度設置為37℃，加入適量水，使其水溫降到37℃，以備后續RNA消解用）

4.一A1-3 等體積氯仿:異戊醇（24:1）抽提。加600 ?l 氯仿:異戊醇（24:1）到管中（在通風廚內進行），蓋緊離心管蓋，顛倒混勻50-100次，12000 rpm 離心10 min。（在本實驗中，4℃12000 rpm離心10min，只有異丙醇沉淀所必需，其他相應操作可以不采用此條件。但為方便起見，均采用此條件）

5.一A1-1 RNase消解RNA。吸取500 ?l上清液（注意不要洗到下層溶液）轉入新的離心管中。（注A4和A5在此可直接跳到步驟6）。加入0.5 ?l RNase溶液，顛倒混勻后，隨浮板放入37℃水浴鍋內，放置30min。

6.一A1-2 酚: 氯仿:異戊醇（25:24:1）抽提。加入500 ?l（在通風廚內進行），蓋緊離心管蓋，顛倒混勻50-100次，12000 rpm 離心10 min。

7.一A1-3 異丙醇沉淀。用1 ml 移液器吸取400 ?l上清液（注意不要洗到下層溶液）轉入新的離心管中，加入等體積的已遇冷的異丙醇，蓋緊離心管蓋，輕輕顛倒1-2次，-20℃冰柜內放置30 min左右，然后于4℃下12000 rpm離心10 min。

8.一A1-1 70%乙醇漂洗兩次。小心倒棄上清液，在含DNA沉淀的離心管中加入1 ml 70%乙醇，輕輕顛倒1次，小心倒棄上清液，此為一次漂洗。重復一次漂洗。然后，短暫離心，充分吸棄殘液，敞開離心管口，散除乙醇10-15min；

9.一A1-2 TE緩沖液溶解DNA。加入30-50 ?l TE緩沖液（10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA，pH8.0），用移液器吸頭輕柔吸打溶解沉淀，沉淀溶解后，即為DNA提取產物，DNA提取到此結束；取5?l 產物用于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余放置在-20℃冰柜保存備用。DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光度計檢測，見后續實驗。

四、思考題與作業

1.把你認為在實驗過程中最應該注意的事項寫下來。

實驗2 核酸瓊脂糖凝膠電泳

一、實驗目的和原理

核酸電泳是分子生物學實驗室最頻繁的基本操作之一，它可用于分析核酸片段的長度從而檢查特定長度的目的核酸片段是否存在，也可用于判斷核酸的質量（如有無嚴重多糖污染）和降解程度，它也常用于粗略估計核酸的濃度以及用于核酸片段的純化。

核酸為多元酸，具有較強的酸性，因此在呈堿性的電泳緩沖液中帶有正電荷，在電場作用下由負極向正極移動，核酸在瓊脂糖凝膠中的泳動距離與凝膠濃度、核酸長度和構象等因素相關。線性核酸在凝膠中的泳動距離與核酸長度的對數呈線性負相關，根據這一特性，可以依據已知長度的核酸標準物計算目的條帶的長度。本實驗的目的是掌握核酸瓊脂糖凝膠電泳的原理、影響因素及其應用。

二、實驗材料、試劑、儀器及用具

1.材料：先前實驗獲得的DNA或RNA樣品。本實驗為青甌柑基因組DNA。2.試劑：瓊脂糖、1倍TAE 緩沖液、溴化乙錠（EB）、6 倍 loading buffer、DNA Marker(本實驗用DL 2000 和 λ-Hind III，如下圖所示)等。

3.儀器及用具：電泳儀、水平電泳槽、紫外分析儀（或手提紫外燈）、凝膠成像系統、微波爐等。

三、實驗步驟（有待調整，見5月25日早上正式版本；先看先了解）1.根據膠模面積計算制備瓊脂糖凝膠所需體積，控制凝膠的厚度在5-7mm左右。取所需體積的1×TAE電泳緩沖液（50×TAE電泳緩沖液的配法：24.2克Tris，3.72克EDTANa2?2H2O，加適量水，攪拌并稍加熱溶解后加5.71ml冰乙酸，加水至100 ml）于合適大小的三角瓶中。

[提示：（1）凝膠過薄影響點樣體積以及凝膠強度，低于1%的瓊脂糖凝膠宜厚些。過厚導致凝膠成像時背景較深且易導致條帶變得模糊（由于上下泳動速度不完全一致所致）；（2）瓊脂糖凝膠電泳可采用的電泳緩沖液包括1×TAE和0.5×TBE，但后者不適于從瓊脂糖凝膠中回收DNA的操作，故實驗室統一作用1×TAE為佳；（3）三角瓶的容量以達到電泳緩沖液的3-5倍以上為佳。] 2.根據所分離核酸片段大小確定瓊脂糖凝膠濃度，具體如下。

基因組DNA（約50 kb）

0.7%

質粒（＞3kb）、RNA

0.8%

1000-3000 bp

1.0%

500-1000 bp

1.5%

<500 bp

2.0%

[提示：（1）凝膠濃度過低會導致凝固不良或凝膠強度低，而過高則會導致凝膠成像時背景較深；（2）濃度使用不當會導致條帶間分離不良；（3）低于300 bp的片段進行電泳時條帶間往往難以獲得良好分離，使用高分辨率瓊脂糖可改善短片段間的分離效果，從而可應用于AFLP或SSR產物的電泳，但所使用的濃度相應提高。] 3.根據上兩步驟確定瓊脂糖用量，稱取瓊脂糖倒入已裝有電泳緩沖液的三角瓶中，混勻，置微波爐中加熱至微沸或接近微沸，取出，再次混勻，再用微波爐加熱至沸騰，取出，若溶液中尚有瓊脂糖顆粒的跡象，需重復加熱步驟。

[提示：（1）瓊脂糖的充分熔化對于最終電泳圖片的質量十分重要。多次反復加熱比一次持續加熱更有利于瓊脂糖的熔化且可避免瓊脂糖溶液在沸騰時溢出；（2）選擇具透明爐門的微波爐有利于避免因過度沸騰導致的溶液溢出；（3）需戴防熱手套以防燙傷。] 4.取出三角瓶，在室溫放置0.5-1 min，然后加入溴化乙錠（EB）至終濃度為0.5 ?g/ml，迅速混勻，然后將瓊脂糖溶液倒入膠模并插入電泳梳子。

[提示：（1）EB為致癌物質，操作時需戴乳膠手套。EB在沸騰的瓊脂糖溶液中易揮發，因此，在室溫放置瓊脂糖溶液0.5-1 min使溫度稍降之后加入EB為佳。已添加EB的凝膠不宜再次熔化以避免EB揮發；（2）EB通常配制成10 mg/ml的貯存液，因此，每100 ml凝膠溶液中加入5 ?l貯存液即可。] 5.待瓊脂糖凝膠充分凝固后方可用于電泳。拔出電泳梳子，將凝膠連膠模放入電泳槽，點樣孔一端靠負極，倒入1×TAE電泳緩沖液至高出凝膠表面0.5 cm。

[提示：（1）瓊脂糖的充分凝固對于最終電泳圖片的質量十分重要。夏天低濃度瓊脂糖凝膠的凝固需要較長時間，可在凝膠基本凝固后將凝膠連膠模放入4℃冰箱加速凝固；（2）凝膠長時間（如過夜）不用時需用保鮮膜包裹以防止水分蒸發，且不應拔下電泳梳子。] 6.將5-10 ?l樣品與1-2 ?l 6×上樣緩沖液（0.25%溴酚蘭, 40%蔗糖）按大約5：1的比例混勻，然后點到凝膠點樣孔中；

[提示：（1）上樣體積宜根據核酸濃度確定，通常電泳條帶的量以20-200 ng為宜，過小導致條帶信號弱難以觀察，過大導致條帶間不易分離；（2）當上樣體積較大時，可在制膠時使用梳孔較厚的梳子，但電泳分辨率不及梳孔較窄時；（3）隨凝膠濃度不同，溴酚蘭指標對應的DNA條帶長度約為300-1000 bp，當溴酚蘭與目的條帶同一位置時會影響目的條帶的熒光觀察和攝像，此時可將上樣緩沖液用40%蔗糖稀釋3倍后使用；（4）出于DNA長度或濃度計算需要，需要同時點商業化的DNA Marker。] 7.點樣完畢后開始電泳，電泳電壓以5V/cm [即兩電極間的長度（以cm為單位）×5為宜]。用紫外分析儀或手提紫外燈監測電泳進程，待條帶間達到理想分離程度時停止電泳，進行凝膠攝像。

[提示：（1）電泳時間過短不利于條帶分離，過長則易導致短片段條帶變寬模糊且熒光信號變弱；（2）閱讀凝膠攝像儀說明書，進行合理的參數設置對于獲得理想圖片十分重要。]

四、思考題與作業（可以思考，但不做要求）1.影響核酸泳動距離的因素有哪些？

2.如何根據電泳結果計算目標核酸片段的長度？ 3.如何獲得一張理想的電泳圖片？

第二篇：分子生物學實驗講義

實驗 質粒DNA的堿裂解法提取與純化

一、實驗原理

細菌質粒是一類雙鏈、閉環的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質粒都是存在于細胞質中、獨立于細胞染色體之外的自主復制的遺傳成份，通常情況下可持續穩定地處于染色體外的游離狀態，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。

質粒已成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質粒DNA的提取，本實驗采用堿裂解法提取質粒DNA。堿裂解法是一種應用最為廣泛的制備質粒DNA的方法，其基本原理為：當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質與DNA發生變性，當加入中和液后，質粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態，離心時留在上清中；蛋白質與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。

純化質粒DNA的方法通常是利用了質粒DNA相對較小及共價閉環兩個性質。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費時。對于小量制備的質粒DNA，經過苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質和RNA，所得純化的質粒DNA已可滿足細菌轉化、DNA片段的分離和酶切、常規亞克隆及探針標記等要求，故在分子生物學實驗室中常用。

二、實驗試劑

1、溶液Ⅰ： 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高壓滅菌15min，貯存于4℃。

2、溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時配置。

3、溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存備用。

4、TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存備用。

5、苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）

6、乙醇（無水乙醇、70%乙醇）7、5×TBE：Tris 堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存備用。

8、溴化乙錠（EB）：10mg/ml

9、RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free)RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20℃。

10、6×loading buffer（上樣緩沖液）：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11、1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5μg/ml（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液0.5×TBE），即可上樣。

三、實驗操作

1、挑取LB固體培養基上生長的單菌落，接種于2.0ml LB（含相應抗生素）液體培養基中，37℃、250g振蕩培養過夜（約12-14hr）。

2、取1.0ml培養物入微量離心管中，室溫離心8000g×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。

3、將細菌沉淀重懸于100μl預冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。

4、加200μl新鮮配制的溶液Ⅱ，顛倒數次混勻（不要劇烈振蕩），并將離心管放置于冰上2-3min，使細胞膜裂解（溶液Ⅱ為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

5、加入150μl預冷的溶液Ⅲ，將管溫和顛倒數次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時質粒DNA復性，染色體和蛋白質不可逆變性，形成不可溶復合物，同時K+使SDS-蛋白復合物沉淀,4℃離心8000g × 10min, 小心移出上清于一新微量離心管中。

6、加入450μl的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4℃離心8000g × 10min。

7、小心移出上清于一新微量離心管中，加入2.0倍體積（1ml）預冷的無水乙醇，混勻，室溫放置５min，4℃離心12000g×10min，棄上清。

8、加入1ml預冷的70%乙醇洗滌沉淀1次，4℃離心8000g×7min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干或吹干（不能過于干燥，造成溶解困難）。

9、沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），-20℃保存備用。

四、質粒DNA的電泳檢測

觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色。該物質含有一個可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個平面基團，這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近，導致染料與DNA結合并呈現熒光，其熒光產率比游離染料溶液有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結合的染料本身則在302nm和366nm有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區的590nm處重新發射出來。因此，當凝膠中含有游離溴化乙錠時即可以檢測到少量的DNA。

取制備的質粒DNA 1-2μl，加適當loading buffer混勻上樣,采用 1-5V/cm的電壓，使DNA分子從負極向正極移動至合適位置，取出凝膠置紫外燈下檢測，攝片。

五、注意事項

本裂解法小量制備質粒 DNA重復性好，一般無麻煩。若所提取質粒 DNA不能被限制性內切酶切割，可通過酚/氯仿再次抽提，以清除雜質來解決問題。

六、習題：

1、什么是質粒？質粒有什么主要用途？

2、分子生物學實驗中用的質粒是由野生型改建而來的，它必須具備哪三個基本要素？

3、制備的質粒DNA在瓊脂糖凝膠上通常以三種形式條帶存在，它們分別是什么？

實驗 瓊脂糖凝膠電泳實驗

一、實驗目的

（1）學習瓊脂糖凝膠電泳的基本原理；

（2）掌握使用水平式電泳儀的方法；

二、實驗原理

瓊脂糖凝膠電泳是基因工程實驗室中分離鑒定核酸的常規方法。核酸是兩性電解質，其等電點為pH2-2.5，在常規的電泳緩沖液中（pH約8.5），核酸分子帶負電荷，在電場中向正極移動。核酸分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，具有電荷效應和分子篩效應，但主要為分子篩效應。因此，核酸分子的遷移率由下列幾種因素決定：

（1）DNA的分子大小。線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中移動，因而遷移得越慢。

（2）DNA分子的構象。當DNA分子處于不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋質粒DNA在瓊脂糖凝膠中移動的速度是不一樣的，超螺旋DNA移動得最快，而開環狀DNA移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時，可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收，用同一種限制性內切酶分別水解，然后電泳，如在凝膠上出現相同的DNA圖譜，則為同一種DNA。

（3）電源電壓。在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率達到最大，所加電壓不得超過5v/cm。

（4）離子強度影響。電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時（如誤用蒸餾水配制凝膠），電導率最小，DNA幾乎不移動；在高離子強度的緩沖液中（如誤加10×電泳緩沖液），則電導很高并明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。

溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1）能插入DNA分子中形成復合物，在波長為254nm紫外光照射下EB能發射熒光，而且熒光的強度正比于核酸的含量，如將已知濃度的標準樣品作電泳對照，就可估算出待測樣品的濃度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑，所以現在也開發出了安全的染料，如Sybergreen。

常規的水平式瓊脂糖凝膠電泳適合于DNA和RNA的分離鑒定；但經甲醛進行變性處理的瓊脂糖電泳更適用于RNA的分離鑒定和Northern 雜交，因為變性后的RNA是單鏈，其泳動速度與相同大小的DNA分子量一樣，因而可以進行RNA分子大小的測定，而且染色后條帶更為銳利，也更牢固結合于硝酸纖維素膜上，與放射性或非放射性標記的探針發生高效雜交。

三、試劑與器材

（一）材料

電泳儀、水平電泳槽、樣品梳子、瓊脂糖等

（二）試劑 1、50*TAE(1000mL)：242g Tris, 57.1mL 冰醋酸，18.6g EDTA。

2、EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力攪拌數小時以確保其完全溶解，分裝，室溫避光保存。

3、DNA加樣緩沖液：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。

4、DNA分子量標準

四、操作方法

常規的水平式瓊脂糖電泳：

制備瓊脂糖凝膠：按照被分離DNA分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量；一般情況下，可參考下表：

瓊脂糖的含量（%）分離線狀DNA分子的有效范圍（Kb）

0.3 60-5

0.6 20-1

0.7 10-0.8

0.9 7-0.5

1.2 6-0.4

1.5 4-0.2

2.0 3-0.1

1、制備瓊脂糖凝膠：稱取瓊脂糖，加入1x電泳緩沖液，待水合數分鐘后，置微波爐中將瓊脂糖融化均勻。在加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液；加熱時應蓋上封口膜,以減少水份蒸發。

2、膠板的制備：將膠槽置于制膠板上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙，待膠溶液冷卻至50℃左右時，加入最終濃度為0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分鐘)，搖勻，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡；待凝膠冷卻凝固后，垂直輕拔梳子；將凝膠放入電泳槽內，加入1x電泳緩沖液，使電泳緩沖液液面剛高出瓊脂糖凝膠面；

3、加樣：點樣板或薄膜上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數應不小于1X。用10 μL微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內，每加完一個樣品，應更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。（注意：加樣前要先記下加樣的順序和點樣量）。

4、電泳：加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。當瓊脂糖濃度低于0.5%，電泳溫度不能太高。樣品由負極（黑色）向正極（紅色）方向移動。電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當溴酚藍移動到距離膠板中央時，停止電泳。

5、觀察和拍照：電泳完畢，取出凝膠。在波長為254nm的紫外燈下觀察染色后（2）的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。于凝膠成像系統中拍照并保存之。

五、注意事項

1、EB是強誘變劑并有中等毒性，易揮發，配制和使用時都應戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經專門處理后才能清洗或丟棄。簡單處理方法為：加入大量的水進行稀釋（達到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍體積新鮮配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍體積新鮮配制的0.5mol/L 的亞硝酸鈉，混勻，放置1天后，加入過量的1mol/L碳酸氫鈉。如此處理后的EB的誘變活性可降至原來的1/200左右。

2、由于EB會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA，使DNA遷移率降低。因此，如果要準確地測定DNA的分子量，應該采用跑完電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。

六、實驗報告要求與思考題

1、附上電泳結果的圖片并進行正確的標注（如下圖）

M：1Kb DNA ladder；1：質粒DNA

2、瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素的影響？

3、如果樣品電泳后很久都沒有跑出點樣孔，你認為有哪幾方面的原因？

4、為什么分子生物學實施時要擔心EB？

5、瓊脂糖凝膠電泳時膠中DNA是靠什么發出熒光的？為什么？

電泳流程圖：

實驗 PCR擴增eGFP基因

一、PCR技術的基本原理

PCR類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。(Plateau)。到達平臺期所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。

PCR 技術應用廣泛，不可能有這樣一套條件滿足所有的實驗，但本實驗所介紹的方法可適應于大多數DNA 擴增反應，即使有的不適應，至少也確定了一個共同的起點，在此基礎上可以作多種變化。不過下列因素在實驗應用時應予以特別注意，以求取得滿意結果。

1、模板：單、雙鏈DNA 和RNA都可以作為PCR樣品，若起始材料是RNA，須先通過逆轉錄得取第一條cDNA。雖然PCR 可以僅用極微量的樣品，但為了保證反應的特異性，一般宜用ng 量級的克隆DNA，ug 級的染色體DNA，待擴增樣品質量要求較低，但不能混合有任何蛋白酶、核酸酶，Taq DNA聚合酶的抑制劑以及能結合DNA 的蛋白質。

2、引物：引物是決定PCR 結果的關鍵，下列原則有助于引物的合理設計。（1）盡可能選擇堿基隨機分布，GC 含量類似于被擴增片段的引物，盡量避免具有多聚嘌呤、多聚嘧啶或其它異常序列的引物。（2）避免具有明顯二級結構（尤其是在引物3'—末端）的序列。

3、防止引物間的互補，特別要注意避免具有3'末端重疊的序列。

4、引物的長度約為20個堿基，較長引物較好，但成本增加，短引物則特異性降低。

5、引物濃度不宜偏高，過高易形成二聚體解鏈；然后冷卻至37—55℃，使引物與模板退

二、實驗試劑

（一）儀器與器皿

PRC 擴增儀，瓊脂糖凝膠電泳設備，微量取樣器，一次性eppendorf管，凝膠成像儀

（二）試劑與材料

1、瓊脂糖凝膠電泳試劑

1）電泳緩沖液：Tris—乙酸0.04mol/L PH8.0 0.002mol/L EDTA

2）加樣緩沖液：0.25%溴酚蘭40% w/v蔗糖

3）溴化乙錠溶液：0.05mg/ml溴化乙錠/水

4）瓊脂糖

2、TaqDNA 多聚酶3、5′反應緩沖液：

125mmol/L Tris-HCl pH8.2；10mmol/L MgCl2；0.5mg/ml gelatin；125mmol/L(NH4)2SO4； Formamide 25%

4、混合dNTP 液(dATP dGTP dTTP dCTP各2.5 mmol/L)

5、DNA 模板

6、引物 1（10μmol/L）

7、引物 2（10μmol/L）

8、無菌水

三、實驗步驟

1、按順序在200μl 指形管中加入以下試劑與樣品：（因購入的試劑批次不同，加樣時有所差別，以預實驗結果為準。

1）ddH2O 37μl

2）10*Buffer 5μl(含有MgCL2)

3）dNTP ２μl

4）引物1(上游)２μl

5）引物2（下游）２μl

6）模板 1μl（pEGFP質粒）

7）TaqDNA聚合酶１μl（2.5U）總體積共50μl

2、在PCR 擴增儀上按以下反應條件編入程序：（以下為參考值，因擴增的DNA片段不同，各類PCR 擴增儀程序設定各不相同，編程過程視擴增的DNA 片段的要求及儀器而定參數。）

1)預變性 94℃ 3 分種

2)循環條件（30 次）

變性 94℃ 30 秒

復性 55℃ 30 秒

延伸 72℃ 1分

3)延長延伸 72℃ 7 分鐘

編完反應程序，置反應管于PCR擴增儀的反應孔中，開動機器，擴增循環反應開始。

3、PCR 擴增完畢，配1.5%瓊脂糖凝膠，電泳觀察結果。

4、凝膠成像儀或紫外燈下觀察實驗結果，是否已擴增到實驗設計的DNA片段

四、習題

1、PCR反應液中主要成分是哪些？在PCR反應過程中各起什么作用？

2、為什么在PCR反應過程中，使用三個不同的溫度變化？

3、用PCR擴增目的基因，要想得到特異性產物需注意哪些事項？

實驗 從動物組織（豬肝）中提取DNA

一、實驗內容

采用SDS裂解和蛋白酶K消化法從豬肝中提取DNA，并進行瓊脂糖凝膠電泳分析。目的

(1)掌握SDS裂解法從豬肝中的原理和方法；(2)鞏固DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析實驗。

二、實驗原理

DNA是一切生物細胞的重要組成成分，主要存在于細胞核中。通過研磨和SDS作用破碎細胞；苯酚和氯仿可使蛋白質變性，用其混合液（酚：氯仿：異戊醇）重復抽提，使蛋白質變性，然后離心除去變性蛋白質；RNase降解RNA，從而得到純凈的DNA分子。

三、實驗材料

新鮮豬肝

TES 緩沖液 ： pH8.0 Tris-HCl 10 mmoL/L , EDTA 1mmoL/ L , SDS 0.1 mmoL/ L

四、實驗步驟

1、剪取約0.5g肝臟組織，放入到研缽中磨碎；

2、向研缽中再加入1 ml TES輕輕研磨，將TES與破碎的組織混勻；

3、吸取535 μl組織勻漿液于2 ml EP管中，再加入60 μl SDS（10%），5.0 μl蛋白酶K，充分混勻后，于56°C保溫1 h，每30分鐘輕搖1次；

4、放置到室溫，加入等體積飽和酚（600μl），顛倒混勻，11000 rpm，離心10 min，吸取400 μl水相，并轉移至一個新的1.5 ml離心管中；

5、加入2倍體積（1000 μl）的無水乙醇和1/10倍體積（40 μl）3 M 醋酸鈉沉淀DNA，12000 rpm離心10 min，棄乙醇；

6、加入適量TE溶解DNA和RNAse A（具體依DNA的多少而定），并利用0.7%的瓊 脂溏進行電泳分析。

五、注意事項

1、在將豬肝剪碎前要將豬肝清洗干凈，除去脂肪及系膜成分。

2、抽提每一步用力要柔和，防止機械剪切力對DNA的損傷。

3、取上層清液時，注意不要吸起中間的蛋白質層。

4、乙醇漂洗去乙醇時，不要蕩起DNA。

5、離心后，不要晃動離心管，拿管要穩。

6、在乙醇沉淀后，經離心要觀察留在EP管中的小白點，其主要成分就是DNA，在以后的實驗中都要細心觀察，防止因將小白點丟失。

六、習題

1、為了獲得高質量的肝臟DNA，在實驗過程中應注意什么。

2、結合本人操作體會，總結在提取過程中如何避免大分子DNA的降解。

3、核酸提取中，去除蛋白質的方法有哪些？ 實驗 限制性內切酶切割DNA

一、實驗目的

1． 通過對DNA的酶切，學會設計構建體外重組DNA分子； 2． 根據目的基因合理選擇載體與限制性內切酶； 3． 掌握DNA的酶切技術。

二、實驗原理

限制性內切酶是從細菌中分離出來的一種能在特異位點切割DNA分子的核酸內切酶，目前已從多種細菌中分離出超過400種，識別各自不同的核苷酸順序，這一順序大多為具有一對稱中心的回文序列，如從大腸桿菌中分離的 EcoR I識別?GAATTC? 切割后產生?CTTAAG?、?G 和

AATTC?的末端，?CTTAAG?該末端由于有一段小的能互補配對的單鏈突出，故稱為粘性末端。切割后的末端為3’-OH和5’-磷酸基團，即?G-OH和?CTTAA-P。

有的限制性酶識別四堿基對的順序，如 San3A識別?GATC ?；有的識別六

堿基對，如上述的ECOR I。識別四堿基對的內切酶由于識別順序在DNA出現的頻率更高（四堿基酶為44=256，六堿基酶為46＝4096），因而可將DNA切割成更小的片段，而識別八堿基對的Not I?GCGGCCGC?、?CGCCGGCG? 則識別和切割位點更少（48＝65536），但堿基并不以均等的概率出現，因而切割后產生的片段變化范圍很大。

＋

限制性內切酶作用的溫度一般為37℃，反應體系中以Mg2為唯一的輔助因子，且要求pH緩沖在7.5左右。

商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃貯存，活性通常較高，5u/μl（每單位即最適條件下1小時內完全酶解1μg DNA的酶量）。

三、實驗材料

待酶切的DNA樣品

四、實驗儀器、器皿及試劑

1、儀器：可調微量加樣器、恒溫水浴箱、電泳儀、電泳槽、紫外檢測燈

2、器皿：Eppendorf管、Tip、試管架

3、試劑：標準DNA(Marker)

EcoRI限制性內切酶

10×buffer：50mmol/l NaCl

10mmol/l Tris-HCl(pH7.5)

10mmol/l MgCl2

lmmol/l

DTT（二硫蘇糖醇）

五、實驗步驟

1、將DNA樣品8.5μl(質粒pEGFP, 1μg)

2、加入1μl 10×buffer，酶解buffer由廠家提供。

3、加入1u（0.5μl）的限制性內切酶EcoRI（限制性酶很昂貴，從-20℃取出要置于冰上，吸取要新的Tip頭，以免污染雜質，吸完后盡快放回冰箱）。

4、混勻反應液后，稍離心使液體聚集，置37℃溫育１小時。

5、進行電泳檢查酶切結果，100V 25分鐘。

6、紫外燈下觀察消化效果。

六、注意事項

1、分子生物學實驗大多為微量操作，DNA樣品與限制性內切酶的用量都極少，必須嚴格注意吸樣量的準確性以保證酶切效果最佳?，F介紹三種微量取樣方法：

(1)吸樣時，將Tip尖剛剛接觸到液面時，輕輕吸取。此法可吸取0.2~0.5μl的樣品，注意不要將Tip尖全部插入溶液，這樣Tip壁上會沾上很多的樣品，導致吸樣不準。

(2)用1cm長的塑料毛細管代替Tip吸樣，此法也可吸取0.2~0.5μl的樣量。

(3)目前也有細長Tip出售，專門用于吸取微量樣品。

2、限制性內切酶價格比較貴，因此要注意不使其污染而導致浪費。這就要求每次吸酶時要用新的無菌Tip。另一個造成限制性內切酶浪費的因素就是限制性內切酶的失活。因此，要注意加樣次序，即各項試劑加好后，最后才加酶，并要在冰上操作，且操作要盡可能快，以使限制性內切酶拿出冰箱的時間盡可能短。

若用同一酶消化很多樣品時，可先計算出所需酶量（可稍多計一點），取出此量的酶與1×緩沖液混合，然后再分裝至各個反應管內。這樣可節約用酶且縮短操作過程、減少污染機會。

3、開啟Eppendorf管時，手不要接觸到管蓋內面，以防雜酶污染。

4、樣品在37℃與65℃保溫時，要注意將Eppendorf管蓋嚴，以防水進入管內造成實驗失敗。

5、無實驗必要應盡量避免長時間酶消化樣品。因長時間消化，限制酶溶液中可能存在的雜酶會影響試驗結果。

七、習題

1、限制性核酸內切酶天然存在于什么生物體內？

2、什么是細菌的限制-修飾系統？限制-修飾系統對細菌有什么用途？

3、限制性內切酶有幾類？這幾類限制性內切酶各有什么特點？可作為工具酶的限制性內切酶是哪一類？為什么？

4、限制性內切酶的識別序列有什么特點？稱為什么序列？

5、酶通常在什么溫度中保存？為什么酶在該溫度下保存不會結凍？酶最后工作的時候其甘油濃度必須低于多少？ 6、1個單位（1 U）的限制性內切酶代表什么意思？

實驗 質粒的轉化

一、實驗目的

掌握熱激法或電轉化法轉化大腸桿菌感受態細胞及轉化子的鑒定方法。實驗材料：質粒DNA；大腸桿菌感受態細胞。

二、實驗原理

質粒的轉化是指將質?；蛞运鼮檩d體構建的重組子導入細菌的過程。將連接產物轉化到感受態細胞中，實現重組克隆的增殖，便于后續分子操作?？梢圆捎枚喾N方法篩選和鑒定目的克隆。

（1）熱激法：大腸桿菌在0℃ CaCl2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基－鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經42℃短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收DNA復合物，在豐富培養基上生長數小時后，球狀細胞復原并分裂增殖。在被轉化的細胞中，重組子基因得到表達，在選擇性培養基平板上可挑選所需的轉化子。

（2）電轉化法：外加于細胞膜上的電場造成細胞膜的不穩定，形成電穿孔，不僅有利于離子和水進入細菌細胞，也有利于孔DNA等大分子進入。同時DNA在電場中形成的極性對于它運輸進細胞也是非常重要的。

三、實驗步驟

1、制備選擇性培養基平板：在融化的250ml LB固體培養基中（冷卻止55攝氏度以下）加入Amp至終濃度50μg/ml，混勻后倒入滅菌培養皿中；

2、取出1管制備好的感受態細胞，放在冰上融化；

3、每100μl感受態細胞加入約20ng質粒DNA，輕輕混勻，在冰上放置30分鐘；

4、熱擊：將離心管放置42℃水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動離心管；

5、冰鎮：快速將離心管轉移至冰浴，放置1－2分鐘；

6、復蘇：每管加400 μl LB培養基，在37℃搖床溫和搖動溫育45分鐘，使細菌復蘇；

7、布皿：取適當體積均勻涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板；

8、培養：倒置培養皿，于37℃培養12－16小時即可觀察到白色的菌落，即為轉化子。

四、結果與分析

計算轉化效率

菌落數/DNA質量（μg）*稀釋倍數

五、習題

1、制備感受態細胞的關鍵是什么？

2、如果DNA轉化后，沒有得到轉化子或者轉化子很少，分析原因。

3、如何提高轉化效率？

第三篇：分子生物學實驗方案

實驗一 分子生物學實驗安全注意事項及分子生物學實驗室所需要的儀器設備的使用（2學時）實驗二 分子材料的采集、保存和植物/動物基因組DNA 的分離（8學時）實驗三 DNA/RNA 的瓊脂糖凝膠檢測（4學時）實驗三 聚合酶鏈式反應（PCR）（3學時）

實驗四 PCR產物的瓊脂糖凝膠檢測與聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測（6學時）實驗五 分子生物學軟件的使用（4學時）

實驗六 生物信息學（3學時）生物信息獲取與利用 實驗考試

實驗三：瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA

【目的要求】

學習并掌握DNA瓊脂糖凝膠電泳基本原理和操作，了解如何通過電泳判斷DNA純度、含量和分子量。

【實驗原理】

凝膠電泳是分離、純化和鑒定DNA的常用方法。因為DNA分子是兩性解離分子，在pH高于其等電點（約3.5）的中性或堿性溶液中帶負電荷，在電場中向正極方向泳動。DNA凝膠電泳的介質主要有兩種：瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。聚丙烯凝膠的孔徑較小，適合于分離5-500bp的小片段DNA；而瓊脂糖凝膠的孔徑較大，可以分離100bp-60kb的較大片段DNA。不同濃度的瓊脂糖凝膠適合于分離不同大小的DNA片段（表7-1）。

瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，當熔化后再凝固時就會形成固體基質，具有多孔的網狀結構，孔徑大小取決于瓊脂糖濃度。DNA在瓊脂糖凝膠中泳動時，受到電荷效應和分子篩效應的雙重影響。電荷效應由分子所帶的電荷量多少來決定，而分子篩效應則與分子大小和構象有關。在一定的電場強度下，DNA分子的泳動速度主要取決于分子量大小和構象。線狀雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠介質中的遷移率與其分子量的對數值成反比。分子越大，遷移速度越慢，從而可以將不同大小的DNA分子分開。因此，通過與DNA標準分子量參照物（MW marker）的遷移率對照，可以鑒定DNA分子的大小。DNA分子的構象也可以明顯影響其遷移率。在細胞內質粒DNA有3種構象：超螺旋的共價閉環DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），松弛型的開環DNA（open circular DNA，ocDNA）和線性DNA，在瓊脂糖凝膠電泳中，其泳動速度依次為：cccDNA >線性DNA >ocDNA，因而未酶切的質粒DNA在電泳中多顯示為3條帶，泳動速度最快的超螺旋帶越亮，說明質粒DNA提取質量越好。

表7-1：不同濃度瓊脂糖凝膠對DNA的有效分離范圍

瓊脂糖濃度（%）線性DNA有效分離范圍(kb)0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3 DNA的遷移率還與電場強度（即單位長度的電壓降）有關，電場強度越大，泳動速度越快。當需要快速觀察電泳結果時，可以適當加大電場強度。但是電泳分辨率會隨著電場強度的增大而縮小，因為高分子高速流動時摩擦力增加，相對分子質量與移動速度就不一定成正比，因此一般電場強度應不超過5V/cm。特別是當需要較精確測定DNA片段大小、獲得理想的分辨率和漂亮的帶型時，應該適當降低電場強度，相應的適當延長電泳時間，并選用相對較低的凝膠濃度。

為了顯示凝膠中DNA的泳動位置，需要加入染色劑染色。最常用的染色劑是溴化乙錠（ethidium bromide EB）。溴化乙錠可以嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間，在紫外線的激發下發出橘紅色熒光。一般是在凝膠中直接加入終濃度為0.5μg/ml的溴化乙錠，這樣可以在電泳過程中隨時利用紫外燈觀察核酸的遷移情況。但是EB與DNA的結合會影響DNA的遷移率，因此對于需要較精確測定DNA片段大小、或需根據熒光強度測定DNA含量時，EB染色應在電泳結束后再進行（將凝膠浸入0.5μg/ml的溴乙錠水溶液中10min即可）。注意：EB是強誘變劑，使用EB必須戴一次性手套，不要灑在桌面地面上，被污染的物品必須專門處理后（加少量漂白粉可使EB分解），再徹底清洗或丟棄。

指示劑溴酚藍和二甲苯青的作用是指示樣品在凝膠中的遷移過程，以確定終止電泳時間。在0.6 %、1%、2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚藍分別約與1kb、600bp、150bp雙鏈線狀DNA片段的遷移率大致相同。在1%瓊脂糖凝膠中，二甲苯青大致相當于2kb雙鏈線狀DNA的位置。【試劑器材】

1．5×TAE：

2．10mg/ml溴化乙錠（EB），避光4℃保存。/ GoldView 常溫保存。3．6×上樣緩沖液（配方見附錄）4．（電泳）瓊脂糖

5． DNA、PCR擴增產物

6．DNA標準分子量marker（λDNA/HindIII）7．水平式電泳槽、電泳儀 8．透射式紫外燈 9．膠帶

10．微波爐或恒溫水浴 11．微量移液器 【操作步驟】

1．稱取瓊脂糖1g，置三角燒瓶中，加入1×TAE 100 ml，置沸水浴或微波爐中加熱，使充分溶解。注意：微波爐煮沸1次可能不能充分溶解，需取出混合后反復加熱1-2次，注意此時可能出現爆沸現象，避免蒸汽燙傷。

2．待瓊脂糖溶液冷卻至60-65℃左右時加入溴化乙錠/5ulGold View，使終濃度為0.5μg/ml，混勻。

3．用膠帶把制膠模具的兩端邊緣封好，置水平位置，選擇孔徑適宜的加樣孔模板（梳子），并垂直安插好。注意梳齒必須與模具底面保持一定距離（約0.5-1mm），防止樣品槽破裂，導致樣品泄漏。

圖3-1：凝膠灌膠過程示意圖

4．將冷卻至50-60℃左右的瓊脂糖溶液緩慢倒入制膠模具中，使凝膠液緩慢展開，直至形成厚度適當（一般為0.3-0.5cm）的膠層。小心去除加樣孔周圍的氣泡。室溫靜置30-60分鐘。（如圖3-1）

5．瓊脂糖完全凝固后，小心取出梳子，去掉模具兩端的膠帶，將凝膠放入電泳槽中。6．電泳槽中注入適量0.5×TBE緩沖液，使液面高于凝膠約1mm左右。7．分別取5μl DNA或者2μl PCR產物和約0.5μg DNA分子量marker，加入1/5體積（2ul）的上樣緩沖液，混勻。

8．小心緩慢將樣品上樣于凝膠加樣孔中。記錄樣品加樣孔順序。

9．上樣完成后，盡快開始電泳，以防止樣品漂流。接通電源，注意正負極是否正確。調節電壓在1-5V/cm左右，樣品進膠前電壓不要太高。電泳開始后不久就可以觀察到溴酚藍從加樣孔遷移到凝膠中。

10．根據指示劑遷移的位置，或根據反射紫外燈顯示的DNA遷移位置，判斷是否需要終止電泳。切斷電源后，取出凝膠。

11．將凝膠置于透射紫外燈上，打開紫外燈（注意盡量避免使用254nm短波紫外燈，并戴好防護眼鏡或防護罩），觀察染色后發出橘紅色熒光的DNA條帶，拍照記錄。

注意觀察樣品DNA條帶是否清晰，有無拖尾現象，條帶數量、大小是否正確，判斷樣品DNA分子大小，與預期大小是否相符，并目測粗略估算樣品DNA含量?！咀⒁馐马棥?/p>

（1）凝膠不能有氣泡。（2）電泳是從負極到正極。

（3）EB是致癌劑，操作要帶手套。【實驗安排】

本實驗一天內可做完?！咀鳂I】

寫出實驗步驟及注意事項。

相關溶液配制

1,50倍TAE緩沖液的配制(pH8.5)配方：2MTris-HAc、100mM EDTA 配制量：1L 配制方法：

1）稱取Tris堿242.3g，置于燒杯中

2）稱取EDTA固體29.3g或Na2EDTA-2H2O固體37.2g 3）加入700mLddH2O，溶解完全 4）加入57mLHAc，充分攪拌 5）用HAc調pH至8.5 6）定容至1L，室溫保存

2，溴化乙錠(EB)【強致癌物】 配制量：100mL 配制方法：

1）1gEB于專用容器中

2）加入100mLddH2O,攪拌數小時至溶解完全 3）轉移至棕色瓶中，避光保存 3，6×上樣緩沖液Loading Buffer 配方：30mMEDTA；36%（V/V）丙三醇；0.05%溴酚藍；pH7.0 配制量：100mL 配置方法：

1）6mL EDTA（500mM，pH8.0）加入50ml ddH2O中 2）5mL 1%溴酚藍 3）取36mL丙三醇

4)用2N的NaOH調pH=7.0 5）定容至100mL 4，6×甘油上樣緩沖液Loading Buffer 配方、配制量：

成分及終濃度 0.15%溴酚藍

0.15%二甲苯靑EF 5mmol/L EDTA 50%甘油 水

配制10ml溶液各成分用量 1.5ml 1%溴酚藍

1.5ml 1%二甲苯靑EF

100ul 0.5mol/L EDTA(pH8.0)3ml 3.9ml

5.GoldView(GV)GoldView(GV)是一種可代替溴化乙錠（EB）的新型核酸染料，其靈敏度與EB相當，使用方法與之完全相同，在100ml瓊脂糖膠溶液中加入5μl GoldView?即可。在紫外透射光下雙鏈DNA呈現綠色熒光，也可用于染RNA。

由于未發現GoldView?有致癌作用，且靈敏度與EB相當，將有可能逐漸取代EB而得以廣泛應用。

概 述

GoldView?是一種可代替溴化乙錠（EB）的新型核酸染料，采用瓊脂糖電泳檢測DNA時，GoldView?與核酸結合后能產生很強的熒光信號，其靈敏度與EB相當，使用方法與之完全相同。在紫外透射光下雙鏈DNA呈現綠色熒光，而且也可用于染RNA。

通過Ames試驗、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗、小鼠睪丸精母細胞染色體畸變試驗，致突變性結果均為陰性；而溴化乙錠（EB）是一種強致癌劑。因此用Goldview?代替EB不失為一種明智的選擇。

使用方法

1.將100ml瓊脂糖凝膠溶液（濃度一般為0.8%~2%）在微波爐中融化。

2.加入5ul GoldView，輕輕搖勻，避免產生氣泡。

3.冷卻至不燙手時倒膠，待瓊脂糖凝膠完全凝固后上樣電泳。

4.電泳完畢在紫外燈下觀察。若使用數碼相機照相記錄，則關閉相機的閃光燈，放在自動檔即可；若使用凝膠成像系統照相，通過調節光圈、曝光時間，選擇合適的濾光片，可得到成像清晰、背景較低的照片。

注意事項

1.膠厚度不宜超過0.5cm，膠太厚會影響檢測的靈敏度。

2.加入GoldView的瓊脂糖凝膠反復融化可能會對核酸檢測的靈敏度產生一定影響，但不明顯。

3.通過凝膠電泳回收DNA片段時，建議使用GoldView染色，在自然光下切割DNA條帶，避免紫外線與EB對目的DNA產生的損傷，可明顯提高克隆、轉化、轉錄等分子生物學下游操作的效率。

4.雖然未發現GoldView有致癌作用，但對皮膚、眼睛會有一定的刺激，操作時應戴上手套。

第四篇：分子生物學講稿

碩士研究生公共選修課

分子生物學講稿

浙江大學生物技術研究所

胡東維

二零零三年八月修改

概

論

一、分子生物學的基本含義

分子生物學是從分子水平研究生命本質為目的的一門新興邊緣學科，它以核酸和蛋白質等生物大分子的結構及其在遺傳信息和細胞信息傳遞中的作用為研究對象，是當前生命科學中發展最快并正在與其它學科廣泛交叉與滲透的重要前沿領域。分子生物學的發展為人類認識生命現象帶來了前所未有的機會，也為人類利用和改造生物創造了極為廣闊的前景。

所謂在分子水平上研究生命的本質主要是指對遺傳、生殖、生長和發育等生命基本特征的分子機理的闡明，從而為利用和改造生物奠定理論基礎和提供新的手段。這里的分子水平指的是那些攜帶遺傳信息的核酸和在遺傳信息傳遞及細胞內、細胞間通訊過程中發揮著重要作用的蛋白質等生物大分子。這些生物大分子均具有較大的分子量，由簡單的小分子核苷酸或氨基酸排列組合以蘊藏各種信息，并且具有復雜的空間結構以形成精確的相互作用系統，由此構成生物的多樣化和生物個體精確的生長發育和代謝調節控制系統。闡明這些復雜的結構及結構與功能的關系是分子生物學的主要任務。

二、分子生物學的主要研究內容

1.核酸的分子生物學

核酸的分子生物學研究核酸的結構及其功能。由于核酸的主要作用是攜帶和傳遞遺傳信息，因此分子遺傳學（molecular genetics）是其主要組成部分。由于50年代以來的迅速發展，該領域已形成了比較完整的理論體系和研究技術，是目前分子生物學內容最豐富的一個領域。研究內容包括核酸/基因組的結構、遺傳信息的復制、轉錄與翻譯，核酸存儲的信息修復與突變，基因表達調控和基因工程技術的發展和應用等。遺傳信息傳遞的中心法則（central dogma）是其理論體系的核心。

2.蛋白質的分子生物學

蛋白質的分子生物學研究執行各種生命功能的主要大分子──蛋白質的結構與功能。盡管人類對蛋白質的研究比對核酸研究的歷史要長得多，但由于其研究難度較大，與核酸分子生物學相比發展較慢。近年來雖然在認識蛋白質的結構及 1 其與功能關系方面取得了一些進展，但是對其基本規律的認識尚缺乏突破性的進展。

3.細胞信號轉導的分子生物學

細胞信號轉導的分子生物學研究細胞內、細胞間信息傳遞的分子基礎。構成生物體的每一個細胞的分裂與分化及其它各種功能的完成均依賴于外界環境所賦予的各種指示信號。在這些外源信號的刺激下，細胞可以將這些信號轉變為一系列的生物化學變化，例如蛋白質構象的轉變、蛋白質分子的磷酸化以及蛋白與蛋白相互作用的變化等，從而使其增殖、分化及分泌狀態等發生改變以適應內外環境的需要。信號轉導研究的目標是闡明這些變化的分子機理，明確每一種信號轉導與傳遞的途徑及參與該途徑的所有分子的作用和調節方式以及認識各種途徑間的網絡控制系統。信號轉導機理的研究在理論和技術方面與上述核酸及蛋白質分子有著緊密的聯系，是當前分子生物學發展最迅速的領域之一。

三、分子生物學發展簡史

1．準備和醞釀階段

19世紀后期到20世紀50年代初，是現代分子生物學誕生的準備和醞釀階段。在這一階段產生了兩點對生命本質的認識上的重大突破：

確定了蛋白質是生命的主要基礎物質

19世紀末Buchner兄弟證明酵母無細胞提取液能使糖發酵產生酒精，第一次提出酶（enzyme）的名稱，酶是生物催化劑。20世紀20-40年代提純和結晶了一些酶（包括尿素酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、黃酶、細胞色素C、肌動蛋白等），證明酶的本質是蛋白質。隨后陸續發現生命的許多基本現象（物質代謝、能量代謝、消化、呼吸、運動等）都與酶和蛋白質相聯系，可以用提純的酶或蛋白質在體外實驗中重復出來。在此期間對蛋白質結構的認識也有較大的進步。1902年Emil Fisher證明蛋白質結構是多肽；40年代末，Sanger創立二硝基氟苯（DNFB）法、Edman發展異硫氰酸苯酯法分析肽鏈N端氨基酸；1953年Sanger和Thompson完成了第一個

多肽分子--胰島素A鏈和B鏈的氨基全序列分析。由于結晶X-線衍射分析技術的發展，1950年Pauling和Corey提出了α-角蛋白的α-螺旋結構模型。所以在這階段對蛋白質一級結構和空間結構都有了認識。確定了生物遺傳的物質基礎是DNA

雖然1868年F.Miescher就發現了核素（nuclein），但是在此后的半個多世紀中并未引起重視。20世紀20-30年代已確認自然界有DNA和RNA兩類核酸，并闡明了核苷酸的組成。由于當時對核苷酸和堿基的定量分析不夠精確，得出DNA中A、G、C、T含量是大致相等的結果，因而曾長期認為DNA結構只是“四核苷酸”單位的重復，不具有多樣性，不能攜帶更多的信息，當時對攜帶遺傳信息的侯選分子更多的是考慮蛋白質。40年代以后實驗的事實使人們對核酸的功能和結構兩方面的認識都有了長足的進步。1944年O.T.Avery等證明了肺炎球菌轉化因子是DNA；1952年A.D.Hershey和M.Chase用DNA35S和32P分別標記T2噬菌體的蛋白質和核酸，感染大腸桿菌的實驗進一步證明了是遺傳物質。在對DNA結構的研究上，1949-52年S.Furbery等的X-線衍射分析闡明了核苷酸并非平面的空間構像，提出了DNA是螺旋結構；1948-1953年Chargaff等用新的層析和電泳技術分析組成DNA的堿基和核苷酸量，積累了大量的數據，提出了DNA堿基組成A=T、G=C的Chargaff規則，為堿基配對的DNA結構認識打下了基礎。2．現代分子生物學的建立和發展階段

這一階段是從50年代初到70年代初，以1953年Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結構模型作為現代分子生物學誕生的里程碑開創了分子遺傳學基本理論建立和發展的黃金時代。DNA雙螺旋發現的最深刻意義在于：確立了核酸作為信息分子的結構基礎;提出了堿基配對是核酸復制、遺傳信息傳遞的基本方式；從而最后確定了核酸是遺傳的物質基礎，為認識核酸與蛋白質的關系及其在生命中的作用打下了最重要的基礎。在此期間的主要進展包括： 遺傳信息傳遞中心法則的建立

在發現DNA雙螺旋結構同時，Watson和Crick就提出DNA復制的可能模型。其后在1956年A.Kornbery首先發現DNA聚合酶；1958年Meselson及Stahl 用同位素標記和超速離心分離實驗為DNA半保留模型提出了證明；1968年Okazaki（岡畸）提出DNA不連續復制模型；1972年證實了DNA復制開始需要RNA作為引物；70年代初獲得DNA拓撲異構酶，并對真核DNA聚合酶特性做了分析研究；這些都逐漸完善了對DNA復制機理的認識。

在研究DNA復制將遺傳信息傳給子代的同時，提出了RNA在遺傳信息傳到蛋白質過程中起著中介作用的假說。1958年Weiss及Hurwitz等發現依賴于DNA的RNA聚合酶；1961年Hall和Spiege-lman用RNA-DNA雜交證明mRNA與DNA序列互補；逐步闡明了RNA轉錄合成的機理。

在此同時認識到蛋白質是接受RNA的遺傳信息而合成的。50年代初Zamecnik等在形態學和分離的亞細胞組分實驗中已發現微粒體（microsome）是細胞內蛋白質合成的部位；1957年Hoagland、Zamecnik及Stephenson等分離出tRNA并對它們在合成蛋白質中轉運氨基酸的功能提出了假設；1961年Brenner及Gross等觀察了在蛋白質合成過程中mRNA與核糖體的結合；1965年Holley首次測出了酵母丙氨酸tRNA的一級結構；特別是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等幾組科學家的共同努力破譯了RNA上編碼合成蛋白質的遺傳密碼，隨后研究表明這套遺傳密碼在生物界具有通用性，從而認識了蛋白質翻譯合成的基本過程。

上述重要發現共同建立了以中心法則為基礎的分子遺傳學基本理論體系。1970年Temin和Baltimore又同時從雞肉瘤病毒顆粒中發現以RNA為模板合成DNA的反轉錄酶，又進一步補充和完善了遺傳信息傳遞的中心法則。對蛋白質結構與功能的進一步認識

1956-58年Anfinsen和White根據對酶蛋白的變性和復性實驗，提出蛋白質的三維空間結構是由其氨基酸序列來確定的。1958年Ingram證明正常的血紅蛋白與鐮刀狀細胞溶血癥病人的血紅蛋白之間，亞基的肽鏈上僅有一個氨基酸殘基的差別，使人們對蛋白質一級結構影響功能有了深刻的印象。與此同時，對蛋白質研究的手段也有改進，1969年Weber開始應用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質分子量；60年代先后分析得血紅蛋白、核糖核酸酶A等一批蛋白質的一級結構；1973年氨基酸序列自動測定儀問世。中國科學家在1965年人工合成了牛胰島素；4 在1973年用1.8AX-線衍射分析法測定了牛胰島素的空間結構，為認識蛋白質的結構做出了重要貢獻。

3．初步認識生命本質并開始改造生命的深入發展階段

70年代后，以基因工程技術的出現作為新的里程碑，標志著人類深入認識生命本質并能動改造生命的新時期開始。其間的重大成就包括： 重組DNA技術的建立和發展

分子生物學理論和技術發展的積累使得基因工程技術的出現成為必然。1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等發現的限制性核酸內切酶為基因工程提供了有力的工具； 1972年Berg等將SV-40病毒DNA與噬菌體P22DNA在體外重組成功，轉化大腸桿菌，使本來在真核細胞中合成的蛋白質能在細菌中合成，打破了種屬界限；1977年Boyer等首先將人工合成的生長激素釋放抑制因子14肽的基因重組入質粒，成功地在大腸桿菌中合成得到這14肽；1978年Itakura（板倉）等使人生長激素191肽在大腸桿菌中表達成功；1979年美國基因技術公司用人工合成的人胰島素基因重組轉入大腸桿菌中合成人胰島素。至今我國已有人干擾素、人白介素

2、人集落刺激因子、重組人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹瀉疫苗等多種基因工程藥物和疫苗進入生產或臨床試用，世界上還有幾百種基因工程藥物及其它基因工程產品在研制中，成為當今農業和醫藥業發展的重要方向，將對醫學和工農業發展作出新貢獻。

轉基因動植物和基因剔除動植物的成功是基因工程技術發展的結果。1982年Palmiter等將克隆的生長激素基因導入小鼠受精卵細胞核內，培育得到比原小鼠個體大幾倍的“巨鼠”，激起了人們創造優良品系家畜的熱情。我國水生生物研究所將生長激素基因轉入魚受精卵，得到的轉基因魚的生長顯著加快、個體增大；轉基因豬也正在研制中。用轉基因動物還能獲取治療人類疾病的重要蛋白質，導入了凝血因子Ⅸ基因的轉基因綿羊分泌的乳汁中含有豐富的凝血因子Ⅸ，能有效地用于血友病的治療。在轉基因植物方面，1994年能比普通西紅柿保鮮時間更長的轉基因西紅柿投放市場，1996年轉基因玉米、轉基因大豆相繼投入商品生產，美國最早研制得到抗蟲棉花，我國科學家將自己發現的蛋白酶抑制劑基因轉入棉花獲得抗棉鈴蟲的棉花株。到1996年全世界已有250萬公頃土地種植轉基因植物。

基因診斷與基因治療是基因工程在醫學領域發展的一個重要方面。1991年美國向一患先天性免疫缺陷?。ㄟz傳性腺苷脫氨酶ADA基因缺陷）的女孩體內導入 重組的ADA基因，獲得成功。我國也在1994年用導入人凝血因子Ⅸ基因的方法成功治療了乙型血友病的患者。在我國用作基因診斷的試劑盒已有近百種之多?；蛟\斷和基因治療正在發展之中。

這時期基因工程的迅速進步得益于許多分子生物學新技術的不斷涌現。包括：核酸的化學合成從手工發展到全自動合成，1975-1977年Sanger、Maxam和Gilbert先后發明了三種DNA序列的快速測定法；90年代全自動核酸序列測定儀的問世；1985年Cetus公司Mullis等發明的聚合酶鏈式反應（PCR）的特定核酸序列擴增技術，更以其高靈敏度和特異性被廣泛應用，對分子生物學的發展起到了重大的推動作用。

基因組研究的發展

目前分子生物學已經從研究單個基因發展到研究生物整個基因組的結構與功能。1977年Sanger測定了ΦX174-DNA全部5375個核苷酸的序列；1978年Fiers等測出SV-40DNA全部5224對堿基序列；80年代λ噬菌體DNA全部48，502堿基對的序列全部測出；一些小的病毒包括乙型肝炎病毒、艾滋病毒等基因組的全序列也陸續被測定；1996年底許多科學家共同努力測出了大腸桿菌基因組DNA的全序列長4x106堿基對。測定一個生物基因組核酸的全序列無疑對理解這一生物的生命信息及其功能有極大的意義。1990年人類基因組計劃（Human Genome Project）開始實施，這是生命科學領域有史以來全球性最龐大的研究計劃。2002和2003年完成了水稻和人類全基因組。更多的基因組學研究工作正在鋪開。

此外。功能基因組學的研究正在生命各學科快速展開。單克隆抗體及基因工程抗體的建立和發展

1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴細胞雜交瘤技術制備出單克隆抗體以來，人們利用這一細胞工程技術研制出多種單克隆抗體，為許多疾病的診斷和治療提供了有效的手段。80年代以后隨著基因工程抗體技術而相繼出現的單域抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、重構抗體、雙功能抗體等為廣泛和有效的應用單克隆抗體提供了廣闊的前景?；虮磉_調控機理

分子遺傳學基本理論建立者Jacob和Monod最早提出的操縱元學說打開了人類認識基因表達6 調控的窗口，在分子遺傳學基本理論建立的60年代，人們主要認識了原核生物基因表達調控的一些規律，70年代以后才逐漸認識了真核基因組結構和調控的復雜性。1977年最先發現猴SV40病毒和腺病毒中編碼蛋白質的基因序列是不連續的，這種基因內部的間隔區（內含子）在真核基因組中是普遍存在的，揭開了認識真核基因組結構和調控的序幕。1981年Cech等發現四膜蟲rRNA的自我剪接，從而發現核酶（ribozyme）。80-90年代，使人們逐步認識到真核基因的順式調控元件與反式轉錄因子、核酸與蛋白質間的分子識別與相互作用是基因表達調控根本所在。

細胞信號轉導機理研究成為新的前沿領域

細胞信號轉導機理的研究可以追述至50年代。Sutherland1957年發現cAMP、1965年提出第二信使學說，是人們認識受體介導的細胞信號轉導的第一個里程碑。1977年Ross等用重組實驗證實G蛋白的存在和功能，將G蛋白與腺苷環化酶的作用相聯系起來，深化了對G蛋白偶聯信號轉導途徑的認識。70年代中期以后，癌基因和抑癌基因的發現、蛋白酪氨酸激酶的發現及其結構與功能的深入研究、各種受體蛋白基因的克隆和結構功能的探索等，使近10年來細胞信號轉導的研究更有了長足的進步。目前，對于某些細胞中的一些信號轉導途徑已經有了初步的認識，尤其是在免疫活性細胞對抗原的識別及其活化信號的傳遞途徑方面和細胞增殖控制方面等都形成了一些基本的概念，當然要達到最終目標還需相當長時間的努力。

以上簡要介紹了分子生物學的發展過程，可以看到在近半個世紀中它是生命科學范圍發展最為迅速的一個前沿領域，推動著整個生命科學的發展。至今分子生物學仍在迅速發展中，新成果、新技術不斷涌現，這也從另一方面說明分子生物學發展還處在初級階段。分子生物學已建立的基本規律給人們認識生命的本質指出了光明的前景，但分子生物學的歷史還短，積累的資料還不夠，例如：在地球上千姿萬態的生物攜帶龐大的生命信息，迄今人類所了解的只是極少的一部分，還未認識核酸、蛋白質組成生命的許多基本規律；又如人類基因組DNA 3x109 bp的全序列，包括了3萬多個基因的一級結構，但是要徹底搞清楚這些基因產物的功能、調控、基因間的相互關系和協調，要理解近90%不為蛋白質編碼的序列的作用等等，都還要經歷漫長的研究道路。

第五篇：醫學分子生物學與實驗

1.簡述動物組織蛋白質，DNA ,RNA提取的大致過程及原理。

答：共同的第一步都是取動物組織進行清洗剪碎，然后用高速組織搗碎機破碎。

DNA的提?。?/p>

通過勻漿、離心得到細胞核組分，然后用SDS（十二烷基硫酸鈉，sodium dodecyl sulfate）裂解核膜，釋放出DNA-蛋白質復合物，再加入高濃度NaCl，以增加DNP的溶解度，然后加入氯仿—異戊醇混合液，振蕩、乳化，使蛋白質變性，DNP復合物解離，離心后，DNA溶于上層水相，蛋白質沉淀夾在水相和有機相之間得以除去，最后用有機溶劑沉淀出DNA。

RNA的提取:

取組織，剪成小塊，在乳缽種研碎，加20mLSDS-緩沖鹽溶液（見試劑1.）使成均漿，倒入磨口具塞錐形瓶內，再加同樣體積的含水酚液，室溫下劇烈振蕩10分鐘。置冰浴中分層，在0-4℃下，以4000rpmn離心15分鐘。吸出上清液，加等體積氯仿－異戊醇，室溫下劇烈振蕩10分鐘，以4000rpm離心5分鐘，或在室溫下放置10分鐘使分層。吸出上清液（若有必要，該操作可反復多次），加2倍體積2%乙酸鉀的乙醇溶液，在冰浴中放置1小時使RNA沉淀，此沉淀液可在冰箱內較長期存放。若要得到干燥制品，可將沉淀液以4000rpm離心10分鐘，傾去上清液。沉淀用少許75%乙醇、95%乙醇、無水乙醇各洗1次，同上法離心，傾去乙醇后，空氣干燥。

蛋白質的提取:

1.組織稱重，切小塊放入管中。

2.配置含抑制劑的蛋白質抽提試劑（1ml抽提試劑中加入5 μl蛋白酶抑制劑混合液，5 μl PMSF和5ul磷酸酶混合液）。

3.加入預冷的含抑制劑的蛋白質抽提試劑（250mg組織中加入1ml抽提試劑）。

4.用勻漿器每次30秒低速勻漿，每次勻漿間隔冰浴1分鐘，至組織完全裂解。

5.裂解液于預冷的離心機中14，000xg離心15分鐘。上清液立刻轉移入新的離心管中保存待用。

原理：在細胞核內，核酸通常是與某些組織蛋白質結合成復合物，因此在提取和制備DNA或RNA時，首先必須設法將這兩類核蛋白分開。在不同濃度的鹽溶液中，RNP與DNP的溶解度有很大的差別。在低濃度的NaCl溶液中，DNP的溶解度隨著NaCl濃度的增加而逐漸下降，當NaCl 濃度為0.14mol/L時，DNP的溶解度僅為其在純水中溶解度的1%，而當NaCl濃度繼續增加時，DNP的溶解度又漸次增大，當NaCl濃度增至0.5 mol/L時，DNP的溶解度約與其在純水中的溶解度近似，當NaCl濃度繼續增加至1.0 mol/L時，DNP的溶解度約為其在純水中的溶解度的兩倍，且隨著鹽濃度的上升，其溶解度仍繼續呈增大的趨勢。但RNP則與之不同，在0.14 mol/L的鹽溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相當大，因此，通常采用0.14 mol/L的鹽溶液來除去RNP，使DNP仍保持在沉淀中，然后使用濃鹽溶液（1.7 mol/L濃度以上的NaCl）來提取DNP。

提取出DNA或RNA-蛋白質復合體（DNP）后，在將其中的蛋白質除去

2.簡述基因工程的原理及過程。

答：基因工程（genetic engineering）又稱基因拼接技術和DNA重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現代方法為手段，將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外構建雜種DNA分子，然后導入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品?；蚬こ碳夹g為基因的結構和功能的研究提供了有力的手段。

所謂基因工程（genetic engineering）是在分子水平上對基因進行操作的復雜技術。是將外源基因通過體外重組后導入受體細胞內，使這個基因能在受體細胞內復制、轉錄、翻譯表達的操作。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質——DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當的工具酶進行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后與載體一起導入某一更易生長、繁殖的受體細胞中，以讓外源物質在其中“安家落戶”，進行正常的復制和表達，從而獲得新物種的一種嶄新技術。它克服了遠緣雜交的不親和障礙。一般步驟：1克隆重組：提取供體生物目的基因，酶解，連接到另一個DNA分子（克隆載體）上形成重組DNA；2轉化：將重組子轉入受體細胞，并在其中復制保存；3篩選鑒定：已吸收重組子的細胞；4大量培養監測外源性基因是否表達。

3.比較原核生物與真核生物的基因表達調控機制。

答：

原核生物基因表達調控 真核生物基因表達調控

啟動因子：σ因子決定RNA聚合酶識別的特異性TF2D決定RNA聚合酶識別的特異性

轉錄激活：操縱子 調節蛋白順式作用元件轉錄因子

主要機制：操縱子模型具有普遍性順式作用元件具有普遍性

主要為負性調節（阻遏調節）主要為正性調節

特有機制：轉錄衰減染色體結構變化

共同點： 1.基因表達都有時間特異性和空間特異性2.基因調控的多層次性和復雜性3轉錄起始部分是基因表達的基本調控點

4.簡述 PCR的原理及其應用，引物設計的原則。

答：PCR的原理：以擴增的DNA分子為模板，以1對與模板互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，依半保留機制沿模板鏈延伸直至完成2條新鏈合成。通過變性，退火和延伸重復這一過程，即可使目的DNA片段得到擴增。反應體系基本成分有模板DNA，特異引物，耐熱性DNA聚合酶，dNTP和含有 Mg2+的緩沖液。

PCR的主要用途：1目的基因的克??；2.基因的體外突變3.DNA和RNA的微量分析4.DNA序列測定5.基因突變分析

PCRD的衍生技術：1錨定PCR(anchored PCR)2..不對稱PCR(asymmetric PCR)3.反向PCR(inverse PCR)4.多重PCR(multiplex PCR)5.逆轉錄PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)

引物設計的基本原則

①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。②引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。③引物內部不應出現互補序列。④兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。⑤引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個堿基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。⑥引物3?端的堿基，特別是最末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。⑦引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

5.簡southern blot的原理及其應用。

答：原理： 將待檢測的DNA分子用/不用限制性內切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記物標記的DNA或RNA探針進行反應。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小?？捎糜跈z測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態, 如是否有點突變、擴增重排等。

主要應用于1.遺傳病診斷 2.DNA圖譜分析 3.PCR產物分析。例如在研究轉基因的時候，可用于檢測外源基因的插入和整合情況。